Medición de antibióticos en fluidos corporales.

JUANDO BACTER.

Introducción

La designación de antibióticos actualmente se realiza teniendo en cuenta sus propiedades particulares de distribución.

Con la disponibilidad de las pruebas rápidas la medición en sangre y otros fluidos es factible, conveniente y ampliamente practicables.

acceso a

Vida media mas largaPenetración de la barrera hemato-encefálica

Aminoglucósidos

Absorción vía oral: NSAUnión a proteínas plasmáticas: baja

(10%-50%) Ototoxicidad

Nefrotoxicidad

Black et al. La Ototoxicidad se relaciona tanto con niveles picos como valle, valor de p <0.05

Diferentes estudios demuestran que la eficacia se correlaciona con el nivel

pico de los antibióticos en suero.

La toxicidad se ha correlacionado tanto con los niveles pico como el

valle de los niveles en suero.

Es difícil probar la que toxicidad ocurre a un nivel particular en

sangre.

Toxicidad/relación Terapéutica de los Aminoglucósidos masUtilizados.

Como elegir un pruebaLa FDA publica los métodos oficiales para las

preparaciones farmacéuticas. No existe una guía para la determinación clínica de antibióticos en sangre y

tejidos. Como resultado, hay un grupo heterogéneo de ensayos y condiciones para que cada laboratorio elija.

• The American Society for Clinical Pathology (chicago IL) tiene controles de calidad que son enviados periódicamente.

• La técnica de difusión en agar es sencilla, el único parámetro que necesita un rígido control es la preparación del estándar de antibiótico.

Ventajas y desventajas de las distintas pruebas para cuantificar antibióticos en fluidos corporales.

Elección del método

• Tipo de laboratorio• Numero de muestras procesadas• Equipos disponibles• Facilidad del laboratorio• >10 muestras por día : automatizado

Manipulación de las muestras

procesar lo antes posible

Tejidos

Obtención de las muestras

Cada antibiótico pierde su potencia de forma

diferente.

AG>estables que penicilinas

Almacenamiento

< 4°C mismo día

-20°C, 4 días

-70°C

2-3 horas -20°C >24 h -70°C

Fluidos diferentes a sangre

No están estandarizados. • Diferentes tipos y cantidades de proteínas• Valores de pH diferentes• Componentes químicos• Componentes celulares

No hay un método para analizar antibióticos en todos los fluidos.

Ensayos microbiológicos

Se basa en la determinación del nivel de un antibiótico, por una respuesta microbiológica

definida a una serie de concentraciones de antibióticos por una cepa de un

microorganismo analizado.

Método en agar 3 categorías generales. Uni, bi y tridimensional.• Unidimensional: usa un tubo capilar, se

vierte el agar y se deja secar. La suspensión del antibiótico se pipetea dentro de la superficie del agar endurecido, y se forman zonas de inhibición en una dimensión.

Ideal para bacterias aerobias. Muy usado en Japón, poco conocido en

los laboratorios clínicos del mundo. o Desventajas: no puede automatizarse,

consume mucho tiempo, compleja preparación.

Es usado en población pediátrica donde la muestra obtenida es muy poca. Se usa poco, se usa mas bi o tridimensional.

Bidimensional: el antibiótico se difunde directamente contra la pared de la bacteria analizada. • Se considera bidireccional porque la cantidad de antibiótico

que se difunde desde la fuente es igual en todo el agar. Tridimensional: el antibiótico viaja directamente bajo el botón

de la placa de petri así como a largo de la superficie del agar

La mayor desventaja de los ensayos microbiológicos es que genera una pendiente empinada, especialmente para los

ensayos con antibióticos Aminoglucósidos.

Elementos que influyen en los ensayos microbiológicos

Deben contralarse las condiciones que afectan la acción de los antibióticos y el crecimiento de los microorganismos.

• Diseño: debe asegurarse que la producción de los halos de inhibición alrededor del disco es directamente proporcional a la cantidad de antibiótico presente en esta fuente. Debería tenerse certeza que la respuesta es lineal dentro de los rangos normales encontrados en muestras clínicas.

• Medio: existen 11 medios diferentes, lo cual no es un factor independiente, pero se relaciona con el método de ensayo y el organismo analizado. Un medio que presenta bueno resultados para un organismo, puedo no ser el optimo para otro microorganismo.

• Estándar de antibióticos: es el factor mas critico en los ensayos. Cada antibiótico tiene diferente actividad a diferentes valores de pH.

Los antibióticos son disueltos en los buffer apropiados a altas concentraciones, se almacenan en alícuotas de 1 ml a (-20°C) no por mas de 3 meses.

o Aminoglucósidos: estables o Penicilinas: lábiles

• La dilución del buffer se hace en el fluido apropiado para su uso. • Los antibióticos deben ser pesados en balanza analítica y calcular la potencia en mg del

polvo. • Es importante también que no halla una segunda sustancia antibiótica en el estándar de

antibióticos, porque los materiales farmacéuticos pueden contener conservantes que no son recomendados, se usa solo en emergencias.

• Para la determinación de niveles de antibióticos en sangre, debe ser usada sangre o suero.

Otros fluidoso Suero equinoo Suero bovino

o Suero humano normalo Suero humano inactivado a 56°C por 30 min

o Suero bovino albumina SBAo Suero fetal de ternero.

• Factores físicos: el tamaño del disco puede afectar la eficiencia del ensayo. Si se usa el disco recomendado 740-E se debe añadir 20 µl de muestra. El máximo crecimiento de este disco es de 25 µl.

• Técnica es 5 a 6 veces mas sensible que la que usa discos de papel.

Elección del organismo

Es simple la búsqueda de un solo antibiótico, pero cuando se buscan varios debe tenerse mas precaución, se debe tener en

cuenta el sinergismo y antagonismo. La forma optima seria separar los compuestos químicos por

electroforesis o cromatografía. • Los organismos mas comúnmente usados para la medición de

antibióticos en sangre son:

Bacillus sp. S.aureus

Providencia sp. Klebsiella sp. Clostridium sp.

Sarcina lutea. Streptococcus sp.

Hongos y bacterias Bacterias bioluminiscentes

Ensayo unidimensional. • Bacterias aeróbicas, poco crecimiento para el ensayo. Medio: agar nutritivo 1% de peptona, pH 7.8 (varia dependiendo del antibiótico)

19 ml se dispensa para almacenamiento. Procedimiento: se incuba toda la noche en tripticasa soya, se diluye 1:100 y se

agita bien. Antes de usar se calienta a 48°C.Se añade 1ml de la suspensión bacteriana a 19 ml del agar, agitar bien. Pipetear el

agar dentro de tubo cónico de 3mm, se deja secar (cada estándar se deposita en un tubo diferente).

Se repite 3 veces cada estándar igual que el suero del paciente. El crecimiento debe ser de 1.5 mm por encima de las capas del agar. Se incuban los tubos a 37°C toda la noche.

Interpretación: se mide la distancia donde el punto de crecimiento del paciente y el agar se encuentran (meñisco) en mm. Los resultados se calculan en las graficas de dosis-respuesta. En el eje Y se traza la concentración del antibiótico y en el X la distancia de inhibición.

Ensayo tridimensional. Se ajusta el medio Difco al pH 7.9. puede ser

almacenado en 25 ml de crecimiento por 1 mes. Antes del ensayo, se descongelan alícuotas de 0.4 ml a 50°C, se añade crecimiento de Klebsiella en agar tripticasa soya. Se mezcla la solución y se sirve en 2 placas de petri plásticas.

Procedimiento: se pipetea 0.002 ml (2µl) de suero del paciente con pipetas estériles desechables, sobre discos 740-E.

Calculo de los resultados: se usan cálculos de curvas de dosis respuesta (diámetro vs concentración), sin embargo, si el rango de concentración es 4 veces mayor, se grafica la concentración del antibiótico vs el cuadrado del diámetro.

Resultado de los métodos microbiológicos: 4 horas o menos.

Método en caldo

• Método turbidimetria.Turbidimetria se refiere a cualquier técnica que

dependa de los cambios de crecimiento de la bacteria en el medio liquido como medida de

crecimiento en solución antibiótica.

El cambio en el numero de bacterias es medido directamente por fotometría o por la producción

de cambios en el pH o la relación de CO2.

Formula de crecimiento por unidad vs porcentaje de transmisión de la densidad óptica de la suspensión

bacteriana.

Log (I0/I): OD: (N) [Eab)/2.3]

I0: cantidad de luz que sale de la suspensión

OD: densidad ópticaN: masa bacterianaE: coeficiente de extinción de las partículasa: área de efectividad óptica de la partículab: densidad de la suspensión

Abbott MS-2

Dispositivo que monitorea continuamente el crecimiento bacteriano en unidades de densidad óptica. Usado para

determinar niveles de antibióticos en sangre bajo condiciones clínicas usando el análisis de curva de crecimiento.

Diodos de luz roja

El medio se inocula dentro de las cubetas.

Fase logarítmica, sembrado bajo los compartimientos donde c/u

tiene un disco.

3 h, DO se grafica.

Ensayo de cambio de pH

• Los antibióticos actúan interfiriendo el crecimiento y/o metabolismos de las bacterias.

• Los cambios en la actividad metabólica de la bacteria bajo la influencia de los antibióticos puede ser usada para medir la concentración de antibióticos.

• P.pio: >antibióticos en contacto con la población bacteriana > será la modificación de las vías metabólicas.

• Si no esta el antibiótico presente, la bacteria crece y habrá cambio de pH por metabolización de un componente (azúcar, urea..etc.), si el antibiótico se añade se afecta el sistema del microorganismo y los cambios en el pH son mínimos.

Ensayo de medición de ATP.

• Utiliza ATP endógeno de una cepa de Klebsiella edwardsii.

• Se inocula el estándar con la cepa analizada en paralelo con el suero de los pacientes. Después de 2 horas de incubación a 37°C, se extraen los tubos con una solución de EDTA/H2S04 y la cantidad de ATP bacteriano es determinado en un espectrofotómetro. Una grafica de concentración de antibiótico vs cantidad relativa de ATP es usada para calcular la cantidad de antibiótico en sangre.

Bioluminiscencia Envuelve el uso de la luminiscencia bacteriana

para determinar la actividad antibiótica en suero.

Procedimiento: la actividad bacteriana en el suero es inactivado por calentamiento a 56°C por 30 minutos. Se añade 0.8 ml de suero, 0.2 ml de NaCl al 10% y buffer 1.5% . El pH final es de 7.9. después de 10 minutos de pre incubación a 30°C, se añade proflavina para una concentración final de 1.5 µg/ml a un pH de 7.9 o 25 µg/ml a pH 6.0. se incuban los viales con movimientos suaves a 30°C. se lee la luminiscencia con un fotómetro/fotomultiplicador que es universalmente proporcional a la concentración del antibiótico.

Proflavina se intercala en el ADN e induce el sistema de

luminiscencia de bacterias mutantes en la oscuridad.

Concentración inhibitoria en suero, y concentración bactericida en suero.

• Procedimiento: se ajusta la concentración entre 105 106 UFC/ml en cada tubo. 0.1 ml de cada dilución 1:100 y 1:1000 son inoculadas en la superficie del agar apropiado. Después de incubar toda la noche se calcula el inoculo de el numero de UFC entre 20-200 colonias. El resto del procedimiento se maneja muy parecido a la CIM/CBM.

• Se añade 1ml de suero al primer tubo, se mezcla bien, se añade 1 ml del tubo 1 al 2 y se mezcla, 1 ml del tubo 2 se añade al tubo 3. esto continua hasta el ultimo tubo 12, que recibe 2 ml de caldo. Se remueve entonces 1 ml de este tubo a uno estéril para el control de esterilidad del medio. La concentración de la bacteria queda entre 105 106 UFC/ml.

• Se incuba 18-24 horas a 35 °C. • La menor concentración del suero del paciente que presente una completa inhibición

visible de crecimiento será el SIC. • La concentración se convierte a títulos por esta formula. Titulo: 1/dilución. • La SBC es la menor concentración del suero que mata el 99.9%. • No es muy usado por la dificultad de calibrar el inoculo, el medio de cultivo, tiempo de

incubación…etc.

Ensayos químicos directos

• Sirven para determinar sustancias químicas,

sustancias activas y los subproductos. Ya que reacciona con grupos

químicos específicos de la molécula antibiótica. Es útil en farmacéutica cuando se analizan sustancias puras,

pero in vivo mas del 95% no conservan su estado nativo.

• No son realizados de rutina el los laboratorios clínicos.

Ensayos radio-enzimáticos

• La adenilación y la acetilación son las bases de los ensayos

radio-enzimáticos. • La cantidad de adenilación y

acetilación producida en el caldo es directamente proporcional a la cantidad de antibiótico en la

solución. • La sonicación es una técnica

rápida y sencilla para obtener las enzimas tan eficiente como el

shock osmótico. • Las enzimas son estables por 24

horas a 4°C y 30 días a (-20°C) con BSA.

Análisis químico de la fluorescencia directa

• Una molécula es fluorescente cuando puede recibir luz en una

longitud de onda y la emite en otra longitud de onda.

Ventajas y desventajas Los otras sustancias usadas para el

ensayo pueden también producir fluorescencia.

Son mucho mas sensibles que los ensayos químicos y es capaz de dar resultados no solo en nanogramos,

sino también en picogramos por mililitros. Puede distinguirse entre

antibióticos activos e inactivos.

Procedimiento • 0.2 ml de la muestra (sangre o

no) se mezcla con 0.4 ml de buffer fosfato y se extrae

completamente con 2.5 ml de acetato de amilo. Se centrifuga. Se transfiere el sobrenadante a una cubeta de Fluorometría. Se

añade 0.6 ml de el reactivo fluorescente. Se agita por 5

min. La fluorescencia es color turquesa. Se montan también

estándares y controles.

Ensayos inmunológicos Los altos costos de los equipos para realizar RIA a retrasado mucho estas

técnicas, además, debe mantenerse grandes cantidades de stock de isótopos radioactivos, lo que impulso el uso de isótopos no

radioactivos. Todas las RIAs para antibióticos emplean 2 pasos en general:

1. Envuelve 3 componentes: Ag radiomarcado (Antib), Ac alta avidez contra Ag y Ag radiomarcado (Antib px)

2. Cuando se alcanza el equilibrio se debe determinar la cantidad de anticuerpos ligados. La medición de estas uniones determina la

cantidad de antibiótico. Tiene como ventaja la alta especificidad, se presentan algunas reacciones

cruzadas entre antibióticos de la misma familia pero nunca entre diferentes.

Inmunoensayos no radioactivos. La enzima o la sustancia fluorescente se une al antígeno o anticuerpo de

tal manera que la actividad del compuesto original no es afectado sensiblemente.

La diferencia entre RIA y ensayos no radioactivos es la manera como se evidencia la aglutinación. Se mide la velocidad de reacción de la enzima y no mide la actividad radioactiva.

v: V [S/(S + Km)]v: medida de la velocidad de reacciónS: concentración del sustrato Km: constante

Mucho mas sensible que los métodos espectofotométricos.

La base de estos ensayos es la preparación de un conjugado hapteno-proteína, donde el hapteno (Antib) y la proteína (enzima) funcionan naturalmente.

Técnica de inmunoensayo de enzimas múltiples.

Fue desarrollado del método de radicales libres que emplea un

conjugado para detectar medicamentos por

espectrofotometría y resonancia de electrones.

Requiere equipo muy especializado. La principal reacción es la alteración

de la actividad de una enzima cuando el conjugado

medicamento-enzima es ligado al anticuerpo. Esto causa un

cambio medible en la cantidad de productos liberados.

• VentajasPequeño volumen de muestraAnaliza todos los antibióticos

No se requiere mucha habilidadAutomatizable

Resultados rápidos• Desventajas

Altos costosAnaliza los medicamentos uno a

uno Puede tener interferencia con otros

metabolitos Puede medir metabolitos inactivos

Análisis cromatográficos• Utilizan la habilidad de un

compuesto en un tipo de solución para ser

selectivamente removido de esta solución dentro de un

ensayo absorbente y cuantitativo.

• Ventajas: analiza los compuestos por separado, es

rápido y sensible (0.5-1 μg/ml) • Desventajas: personal experto,

caro, uso de varios procedimientos de extracción.

Cromatografía liquida de alto rendimiento

Método de referencia de aplicación en clínica.

De elección para análisis de penicilinas y cefalosporinas. Es usado en laboratorios

modernos para medir agentes anticonvulsivantes y

antiarrítmicos

Pasos básicos HPLC

• Extracción del medicamento con un solvente especifico.

• Separación de el medicamento en la fase sólida por HPLC.

• Detección del efluente de fase sólida por fotometría.

• Cuantificación de la cantidad de antibiótico presente por análisis de picos altos o picos de

área de análisis.

Cromatografía de gases-liquido.

Fue usada para realizar ensayos de antibióticos que pueden

ser volátiles. Pasos:

• Extraer el medicamento del suero

• Conversión del medicamento a su forma volátil.

• Separación por GLC• Detección por ionización,

captura de electrones…etc. • Detección del medicamentos

por altos picos o picos de área.

Cromatografía de capa delgada.

• Es usado en laboratorios clínicos para separar compuestos de

alto peso molecular en compuestos biológicamente

activos.

Resonancia magnética espectroscópica nuclear.

No están disponibles en clínica pero están bajo investigación.

Cuando los núcleos giran en un campo magnético son irradiados

por un segundo campo magnético perpendicular, que cambia sus alineaciones a un

nuevo campo.

Mycobacterium tuberculosis

Para que se miden niveles de medicamentos antituberculosos en los fluidos??

• Prevenir reacciones toxicas que ocurren en medicamentos como cicloserina y Aminoglucósidos

• Determinar si la concentración en tejidos o fluidos es adecuada para una terapia efectiva

• Monitorear el cumplimiento de los pacientes• Monitorizar el metabolismo de ciertas drogas, como el

fenotipo acetilador de Isoniazida. • Para investigación. • Daño renal, mala absorción, problemas hepáticos…etc.

Mycobacterium tuberculosis

• El monitoreo de los medicamentos antituberculosos es realizado en todos los casos de aislamientos MDR en el NJCIRM, por la necesidad de asegurar que la concentración máxima del medicamento exceda al MIC de la cepa MDR

• Se usan 3 técnicas para detectar los niveles de medicamentos antituberculosos en materiales biológicos:

1. Bioensayos2. Métodos fluorométricos y espectofotometricos 3. Métodos cromatográficos

Las muestra de suero deben ser recolectadas en las horas picos de acción del medicamento antituberculoso.

También otros factores pueden interferir en la absorción y en la biodisponibilidad del

medicamento:

Preparación de la muestra • La incorrecta preparación de la

muestra puede resultar en la perdida de la actividad de l

medicamento como consecuencia de un combinación con una proteína o conversión del

medicamentos a formas inactivas o a derivados lábiles.

• es necesario estabilizar la Isoniazida a (-20°C) porque, el

compuesto se pierde rápidamente por la Activación de proteínas. Estas proteínas generalmente

interfieren en los métodos fluorometricos.

• Dependiendo del método de análisis, las proteínas pueden ser

removidas por tratamiento con 5 o 10% acido tricloroacetato o sulfato

de amonio. Se almacenan a 4 °C por 2 semanas o congeladas a (-20°C)

por tiempo indefinido.• Las muestras recolectadas para

análisis de Rifampicina deben ser tratadas con acido ascórbico y

almacenadas a (-20°C) por hasta 3 meses.

• ETB, PIZ, PAS, ETH, PTH no son afectados por otras proteínas u

oxidación.

Los bioensayos son sensibles, no tan caros, pero requieren experiencia, puede demorarse algunos días y son relativamente imprecisos. No pueden

distinguir entre los metabolitos activos e inactivos.

Isoniazida • La acetilación de Isoniazida es la principal y

clínicamente mas importante vía metabólica de su metabolismo. El producto principal que del

metabolismo de la Isoniazida es N-acetil-isoniazida que es catabolizada por la N-acetil-transferasa en el

hígado e intestino. • Los niveles de N-acetil-transferasa en un paciente

influyen en la concentración de monoacetil-hidrazona y diacetil-hidrazona en la orina, y esta es la base para

determinar los ensayos del estado acetilador de pacientes.

• El ensayo espectrofluorometrico puede medir isoniazida y acetilisoniazida y solo requiere un

volumen de 200 µl. • Se ha descrito también HPLC para medir la

concentración de isoniazida y acetilisoniazida en fluidos y tejidos.

• El método El-Sayed and Islam fue usado para medir específicamente la concentración de Isoniazida y

acetilisoniazida para el fenotipo acetilador.

Rifampicina • Es un compuesto relativamente

inestable en agua , y a un pH de 2-3 la Rifampicina es fácilmente hidrolizado

a 3-formil-rifampicina y 1-amino-4-metilpiperazina. En pH alcalino, en presencia de aire atmosférico, la Rifampicina se oxida fácilmente a

rifampicina-quinona. • Sin embargo, la solución de Rifampicina puede ser estabilizado por la adición de ascorbato de sodio (200 µg/ml) y soluciones de Rifampicina en

dimetilsulfoxido (10 mg/ml) son estables por varias semanas.

Pirazinamida

• Cuando los pacientes están siendo tratados con

Pirazinamida , se pueden monitorear los valores de la

concentración tanto de Pirazinamida como de acido

pirazinoico para prevenir efectos adversos, principalmente hiperuricemia.

Etambutol

• El ensayo espectrofotométrico ha sido descrito para la

cuantificación de Etambutol en liquido cerebro espinal y orina. Las muestras son extraídas con cloroformo y reveladas con azul

de bromotimol. • Se ha descrito bioensayos para

determinar Etambutol en suero. • Una variedad de cromatografía

de gases y cromatografía de masa fueron descritos para medir la concentración de

Etambutol en fluidos biológicos.

Aminoglucósidos

Estreptomicina, Capreomicina y kanamicina pueden ser

medidos de fluidos biológicos y tejidos usando un bioensayo descrito por

McClatchy. Estreptomicina y kanamicina

pueden ser medidos por inmunoensayo de

polarización de fluorescencia (FPI) usando el sistema comercial Abbott TDX.

Etionamida

• Se describe un método HPLC que distingue entre

Etionamida, protionamida y los metabolitos sulfoxido. se observo que estos método

son capaces de medir concentraciones menores

de 10-50 ng/ml.