UNIVERSIDAD DE COLIMA -...

UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA

“DETERMINACIÓN DE LA CARGA VIRAL DEL PAPILOMA

HUMANO DE ALTO RIESGO (TIPOS 16 Y 18), MEDIANTE

RCP TIEMPO REAL, EN MUJERES CON NEOPLASIA

INTRAEPITELIAL CERVICAL DE BAJO RIESGO (NIC I),

DEL ESTADO DE COLIMA”.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS MÉDICAS

PRESENTA

Q.F.B. MARIO RAMÍREZ FLORES

ASESORES

DRA. LUZ MARGARITA BALTAZAR RODRIGUEZ

DR. IVÁN DELGADO ENCISO

COLIMA, COLIMA. NOVIEMBRE DE 2006.

AGRADECIMIENTOS

AL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (CONACYT), quien a

través de su Programa de Becas para la formación de Científicos y Tecnólogos me ha

facilitado la realización de la Maestría en Ciencias Médicas, así como para la

realización de la presente tesis

*

A la Maestría en Ciencias Médicas y al Centro Universitario de Investigaciones

Biomédicas (C.U.I.B) por el desarrollo experimental que se llevo a cabo en estas

instituciones.

*

A MIS ASESORES: Dra. Luz Margarita Baltazar Rodríguez y al Dr. Iván Delgado

Enciso por sus colaboraciones en la redacción y en la parte experimental del

desarrollo de esta tesis.

DEDICATORIAS

A mi esposa Ángeles, Por su amor y lecciones de constancia y apego al trabajo, por

sus consejos y apoyo que a diario me ofrece de manera incondicional.

A mi hija Karla por su cariño y ternura que a cada momento me da.

A cada una las mujeres Colimenses que hicieron posible el presente trabajo,

participando como pacientes.

INDICE

Pág.

I. Tablas y Figuras…………………...………………….………………………….………1

II. Resumen…………………………...………………………….…………………………2

Abstract………………………………………...……………………………..…………3

III. Introducción…………………………………………….………………….……………4

IV. Marco Teórico…………………………………….………………………………...…..6

IV.1 Cáncer…………………………………………………………………………………6

IV.2 Cáncer Cervicouterino………………………………………………………….……..7

IV.2.1 Definiciones y clasificación……………………..……………………..………..8

IV.2.2 Neoplasia Intraepitelial Cervical………………………………………...………8

IV.2.3 Epidemiología………………..………………………………...……………….9

IV.2.4 Etiología………...…………...……………………………………………..…..10

IV.2.5 Fisiopatología…………………………………………..…………………..…..11

IV.3 Papiloma Virus Humano………….………………………………………………….11

IV.3.1 Epidemiología del VPH…..…………………………………………………....12

IV.3.2 Virología…………..…….…………...………………………...………………13

IV.3.3 Configuración Genómica………..…………...…………………………..…….14

IV.4 Virus del Papiloma Humano y Cáncer Cervicouterino………………………..……15

IV.5 Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real……...………………………15

IV.6 Carga Viral y Virus del Papiloma Humano……...…….………………………...….18

V. Objetivo General……….……………………………….…………………...……...….19

V.1 Objetivos específicos…...……………………………………………………..…..19

VI. Tipo de Estudio…..……………………………………………………………......…..20

VII. Universo de Estudio...………………………………………………………………...21

VII.1 Tamaño de la Muestra…….……………………………………………………..21

VII.2 Criterios de Captación de Pacientes……...…..……………………………...…..22

VIII. Justificación…...……………………………………………………………………..23

IX. Materiales y Métodos………..……………………………….……………….……….24

X. Resultados………….…………………………………………………………………..30

XI. Discusión……...……………………………………………………………………….38

XII. Conclusión…..…………………………………………………………………..……40

XIII. Perspectivas..……………………………………………………………………..….41

XIV. Glosario………………………………………………………………………..…….42

XV. Referencias….………………………………………………………………..………49

Anexos……………………………………………………………………………………..54

1

I. TABLAS Y FIGURAS

Pág.

Tabla 1. Tipos de VPH asociados con lesiones en el

Tracto genital……………………………………………………….…...…………..12

Tabla 2. Secuencia de primers utilizados para la

Identificación de los VPHs………………………………………….……...……….25

Tabla 3. Secuencia de primers utilizados en la RCP en tiempo real………………….………28

Tabla 4. Sondas utilizadas en la RCP en tiempo real……………………………..…………..28

Tabla 5. Características Generales de la población

estudiada según tipo de VPH…………………………………….…...……………..30

Tabla 6. Carga viral del VPH-16 en pacientes con NIC I………………..………….………..32

Tabla 7. Carga Viral de VPH-18 en pacientes con NIC I…………….……………………....33

Tabla 8. Diferencia significativa entre carga viral del VPH-16 y VPH-18………….….……36

Tabla 9. Comparación de carga viral del VPH-16 y VPH-18

según diferentes factores de riesgo………………………………………...……….37

Figura 1. Correlación de las nomenclaturas para las

Lesiones premalignas y Cáncer in situ del cervix………………………..…………...9

Figura 2. Organización genómica del VPH…………………………………….…………….14

Figura 3. Pasos de la RCP en tiempo real…………………………………………………….17

Figura 4. Identificación del VPH-18 en gel de poliacrilamida al 6%.......................................26

Figura 5. Identificación del VPH-16 en gel de poliacrilamida al 6%.......................................27

Figura 6. Frecuencia del VPH-16 y VPH-18............................................................................31

Figura 7. Distribución General de las muestras según su carga viral………………….……..34

Figura 8. Distribución de las muestras según tipo de VPH y Carga Viral……………...……35

2

II. RESUMEN

La carga viral de los virus del papiloma humano (VPH) de alto riesgo (tipos 16 y 18) ha sido

asociada con la prevalencia de neoplasia cervical y algunos investigadores sugieren que una

alta carga viral en el epitelio citológicamente normal es un factor de riesgo para la progresión

neoplásica. OBJETIVO: Determinar la carga viral del Papiloma Humano de alto riesgo (tipos

16 y 18), en pacientes con neoplasia intraepitelial de bajo grado (NIC I) del Estado de

Colima. MÉTODO: Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (RCP ) en tiempo

real para cuantificación del VPH-16 y VPH-18, estos tipos de VPH se analizaron en diferentes

reacciones, permitiendo una cuantificación independiente. Una reacción separada se utilizó

para estimar el número de una sola copia de un gen nuclear, el cual se utilizó para calcular el

numero equivalente de VPH por DNA genómico de la muestra. RESULTADOS: El tipo de

ADN de VPH más común encontrado fue el VPH- 18, con una prevalencia del 23%, seguido

por el VPH-16 con una prevalencia del 22%. Encontramos que existe una diferencia

significativa entre la carga viral del VPH-16 y VPH-18 (p = 0.030).CONCLUSIONES: La

frecuencia del VPH-16 y VPH-18 en pacientes con NIC I es alta, en el estado de Colima. La

carga viral del VPH-16, es mayor significativamente con respecto al VPH-18 con un valor de

p de 0.030. Una carga viral de 102 genomas de VPH-18 es capaz de producir NIC I.

3

ABSTRACT

Viral load of high risk human papilloma virus (HPV) ‹types 16 and 18›, has been associated

with prevalent cervical intraepithelial neoplasia (CIN), and some researches suggested that

high viral load in citologically normal epithelium is a risk factor for neoplastic progression.

OBJETIVE: To determinate the viral load of human papilloma virus (types 16 and 18), in

patients with low-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN I), in Colima State.

METHODS: We made a real-time Polymerase Chain Reaction (real-time PCR) for the

quantification of HPV-16 and HPV-18, These HPV types are analyzed in different reactions,

allowing for independent quantification. A separate reaction is used for estimating the number

of a nuclear single-copy gene and is used to calculate the HPV copy number per genomic

DNA in the sample. RESULTS: The most common HPV DNA type found was the HPV-18

with a prevalence of 23%, followed by the HPV-16 with a prevalence of 22%.We found a

significant difference between the viral load of HPV-16 and HPV-18. CONCLUSIONS: The

frequency of HPV-16 and HPV-18 in patients with CIN I is high, in State of Colima. The viral

load of the HPV-16 is greater significantly with respect to the HPV-18 with a value of p of

0.030. This could reflect that a smaller viral load is needed HPV-18 than of HPV-16 to cause

CIN I.

4

III. INTRODUCCIÓN

El cáncer cervicouterino (CaCU) constituye una de las primeras causas de muerte en

mujeres mayores de 25 años de edad, siendo un problema importante de Salud Pública a

nivel mundial [1]. En la Republica Mexicana, en el 2005, se registraron 51,221 casos nuevos

de displasia leve y moderada, y 8,163 casos nuevos de displasia severa y CaCU in situ, siendo

los tumores más notificados de cervix (24%), y de mama (11%).[2]

En la actualidad y de acuerdo con las investigaciones más recientes, se acepta que el

CaCU es el tumor sólido más importante inducido por virus, [3]. El virus del papiloma

humano (VPH) se ha encontrado en el 95% de todos los casos de cáncer invasor, por lo que se

considera a la infección por este virus como el factor de riesgo más importante [4]. El VPH

(causante de verrugas genitales) es la enfermedad sexual viral más común en el mundo. Se

estima que hay un millón de casos nuevos cada año. Aunque muchas de estas infecciones son

benignas, algunas con ciertos tipos oncogénicos de VPH son fuertemente relacionadas con el

desarrollo de CaCU. Estudios epidemiológicos han demostrado que el riesgo de desarrollar

CaCU es mayor en mujeres que sufren frecuentemente infecciones con papilomavirus de tipo

oncogénico comparado con las que padecieron infecciones ocasionales. La infección puede ser

ocasionada por cualquiera de los más de 100 diferentes cepas (tipos) de VPH existentes [5]

sin embargo, sólo 35 de ellos infectan el cervix uterino, y de éstos sólo la mitad se han

asociado con lesiones precursoras o CaCU invasor.[6] de los cuales el VPH 16 representa la

mayor proporción (50%) seguido por el VPH 18 (12%), el VPH 45 (8%) y el VPH 31 (5%).

La asociación con estos tipos de VPH son bastantes fuertes y consistentes en todos los

estudios de casos y controles en los países con alto y bajo riesgo de CaCU. [1]

No obstante, la presencia del VPH no constituye una causa suficiente de esta

enfermedad, son necesarios ciertos cofactores como número de parejas sexuales, edad de

inicio de vida sexual activa, edad durante el primer embarazo, multiparidad, y el propio fondo

genético del huésped, entre otros, para que un porcentaje de infecciones persistentes por VPH

logre progresar y desarrollar cáncer. [5] Sin embargo existen estudios que sugieren que la

cantidad de carga viral del VPH en el epitelio citológicamente normal es un factor importante

para la progresión neoplásica.[7]

5

El estudio de la carga viral del VPH en pacientes con CaCU, esta adquiriendo mayor

importancia médica ya el análisis de la cantidad de DNA del VPH parece tener una

especificidad más alta que la tipificación de ausencia o presencia de VPH, aúnado a que

actualmente el VPH es considerado el principal factor etiológico del CaCU. [8]

Debido a esto, actualmente en nuestro país se están realizando avances importantes

para entender tanto la interacción papilomavirus-célula huésped como los mecanismos

involucrados en el desarrollo del cáncer, para desarrollar nuevas técnicas inmunológicas y de

genética molecular útiles en el diagnóstico y terapia de esta neoplasia.

En el presente estudio se cuantifico la carga viral (cantidad de partículas víricas

encontradas por cada 10 000 células <copias/103celulas>) del VPH de alto riesgo en muestras

de ADN de mujeres con Neoplasia Intraepitelial de bajo grado (NIC I), procedentes del Estado

de Colima, mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) en Tiempo

Real.

6

IV. MARCO TEORICO

IV.1 CÁNCER

El Cáncer es una enfermedad caracterizada por el crecimiento anormal y diseminado

de células que al desarrollarse en forma incontrolada avanzan entre los tejidos normales y los

destruyen, alterando así el funcionamiento del organismo [9].

Su habilidad para crecer en localizaciones inapropiadas o propagarse indefinidamente

puede ser letal para el organismo individual en que se produce. Se describen tres tipos de

cambios que tienen lugar cuando una célula se vuelve cancerosa:

a) Inmortalización: Describe la propiedad de crecimiento indefinido.

b) Transformación: Describe el fallo de observación de los límites normales de

crecimiento.

c) Metástasis: Describe la etapa en la que la célula cancerígena desarrolla la habilidad

de invadir el tejido normal, moviéndose así desde su lugar de origen y

estableciendo una nueva colonia en cualquier parte del cuerpo.[10]

El riesgo de desarrollar cáncer es influenciado por muchos factores incluyendo

genéticos, edad, etiología, sexo, sistema inmune, enfermedad pre-existente y desnutrición

[11]; convirtiendo las células normales en células transformadas que dan lugar a procesos

implicados en la formación de tumores.

Algunas veces los tumores incrementan su malignidad como resultado de una serie de

cambios progresivos, la incidencia de cánceres humanos con la edad sugiere que típicamente

se requieren 6 - 7 acontecimientos en un período de 20 - 40 años para provocar el cáncer. Para

los factores genéticos se sabe que en algunos casos se hereda como un rasgo mendeliano,

implicando que un cambio genético se convierte en un componente necesario o cuando

menos, importante. Existen dos clases de genes en los que mutaciones causan transformación:

a) Supresores de tumores, se detectan mediante deleciones que conducen a la aparición de

tumores. Como los cánceres hereditarios, en los que los pacientes desarrollan tumores que han

perdido ambos alelos, y por lo tanto carecen de un gen activo. b) Oncogenes, inicialmente

identificados como genes transportados por virus que causan la transformación de sus

objetivos celulares. Los genes celulares se denominan protooncogenes, y en ciertos casos su

mutación o activación aberrante en la célula se asocian con formación de tumor, actuando ya

7

sea en las proteínas de membrana hasta los factores de transcripción. Esto puede involucrar un

cambio mutacional en la proteína, o su activación constitutiva, sobreexpresión, o fallo en la

interrupción de la expresión en el momento adecuado.[10]

Existen una variedad de agentes que pueden incrementar la frecuencia con la que las

células se convierten en células transformadas; se dice que estos agentes son carcinogénicos.

El diagnóstico puede ser histopatológico y/o citológico. En el diagnóstico

histopatológico de las neoplásias se basan en un fenotipo de acuerdo a su origen blastodérmico

y a su morfología citológica, con amplia correlación anatomoclínica, o sea, de la experiencia

que se tiene de su comportamiento. Por otra parte, está el diagnóstico citológico el cual se

basa en su contenido nuclear y a su capacidad para duplicarse.[12]

La transformación de las células neoplásicas malignas puede ocurrir espontáneamente,

puede ser resultado de infecciones con virus tumorales o cancerígenos.[10] El criterio de

malignidad es aumento del tamaño nuclear lo que determina una desproporción núcleo-

citoplásmica; hipercromasia y con frecuencia gigantismo celular debido a hiperdiploidia o

poliploidia el cual se debe a una síntesis descontrolada de ácido desoxirribonucleico (ADN)

[10]. Estos virus se consideran como la segunda causa de cáncer en humanos, siendo sólo

superados por el tabaquismo, los cuáles contribuyen al desarrollo de 10 al 20% de todas las

neoplasias malignas del mundo. Los virus involucrados en cáncer son de 2 tipos los de

genoma de ADN y los de genomas de ARN. Los virus tumorigénos alteran la maquinaria de la

célula infectada para promover su propia supervivencia y crecimiento. En este proceso, los

virus interfieren con los mecanismos de control celular, originando un crecimiento anormal,

alteraciones genéticas y finalmente malignidad.[13]

IV.2 CANCER CERVICO UTERINO

El CaCU es una neoplasia muy frecuente en la población femenina; constituye el 30%

de los tumores malignos que se presentan en los habitantes de los países en desarrollo y es la

segunda causa de muerte en mujeres de todo el mundo.[14]

El CaCU suele crecer lentamente por un período de tiempo. Antes de que se encuentre

células cancerosas en el cuello uterino, sus tejidos experimentan cambios y empiezan a

aparecer células anormales (proceso conocido como displasia). La prueba de papanicolau

8

generalmente encuentra estas células. Posteriormente, Las células cancerosas comienzan a

crecer y se diseminan con mayor profundidad en el cuello uterino y en las áreas circundantes,

actualmente la frecuencia de Neoplasia intraepitelial cervical (NIC), se refiere a los cambios

neoplásicos del cuello uterino con finados al epitelio superficial sin invasión del estroma, se

considera como la lesión precursora del CaCU.[15] Se considera que estos cambios

neoplásicos son causados por VPH.[16]

IV.2.1 Definiciones y Clasificación

La presente tesis hace uso de la nomenclatura propuesta por Richard en 1967, el cual

propuso el término neoplasia intraepitelial cervical (NIC), con tres grados progresivos (1, 2,

3), la ventaja principal de esta nomenclatura es el reconocimiento de la unidad del proceso

patológico lo cual conlleva una relación con las técnicas terapéuticas. Esta clasificación ha

sido bastante adecuada durante más de 20 años y por lo tanto la más utilizada

internacionalmente.

IV.2.2 Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC).

La displasia implica una anormalidad en el crecimiento y desarrollo celular. Su uso en

una descripción patológica sugiere una anormalidad premaligna. La asociación del VPH con

el crecimiento displásico ha sido la más estudiada en el cervix. La NIC, es comúnmente usada

para describir estas anormalidades celulares. La NIC es graduada dependiendo del grueso de la

proporción del epitelio que ha sido reemplazado por células anormales. De acuerdo a este

sistema, lesiones con menos de un tercio del epitelio remplazado por células inmaduras son

graduadas como NIC I, las lesiones que van de un tercio a dos tercios del epitelio remplazado

son graduadas como NIC II, y aquellas lesiones que van de dos tercios o más del epitelio

remplazado son graduadas como NIC III, incluyendo carcinoma in situ (figura 1), numerosos

estudios mostraron una asociación entre la infección por VPH y NIC. La NIC puede ocurrir en

ausencia de características citológicas de infección por VPH, aunque muchas de estas lesiones

han demostrado tener DNA de VPH. El hecho que la displasia es considerada como una lesión

premaligna, y el VPH el factor etiológico más importantes para el desarrollo hacia CaCU, la

asociación entre el VPH y displasia es lógica.[17].Pero la asociación entre la caga viral del

DNA de VPH y la severidad de NIC es controversial.[18]

9

Cabe mencionar que ninguna de las nomenclaturas existentes hace mención al grado

de infección por VPH.

IV.2.3 Epidemiología

El CaCU es el segundo más común en el mundo, después del cáncer de mama en la

mujer. Constituyendo así un problema importante de salud pública, cada año se estima, que se

diagnostican 500 000 casos nuevos en el ámbito mundial.[20]Aproximadamente el 80 % de

ellos corresponden a los países en desarrollo. Entre las poblaciones existen grandes diferencias

de incidencia y grado de invasividad del cáncer, esto refleja la influencia de los factores

ambientales, su detección con pruebas de papanicolaou y el tratamiento de las lesiones

Figura 1. Correlación de las nomenclaturas para las lesiones premalignas y cáncer in

situ.[19]

10

preinvasoras.[20] El CaCU es un problema prioritario de Salud Pública en México. En el

Estado de Colima, en el año 2005, se reportaron 48 defunciones por CaCU, 468 casos nuevos

de displasia leve con una tasa de 219,30 por 100 000 habitantes femeninos mayores de 14 años

ocupando el séptimo lugar a nivel nacional, solo por debajo de Quintana Roo, Nayarit, Jalisco,

Guerrero, Durango y Veracruz.[2]

IV.2.4 Etiología.

Actualmente se considera que el origen de esta enfermedad es multifactorial, con

factores conocidos como el inicio temprano de la vida sexual activa (antes de los 18 años),

primer embarazo antes de los 20 años de edad, multiparidad

[21], número de compañeros sexuales, infecciones cérvico vaginales donde se involucran

algunos virus y protozoos, tales como trichomonas vaginalis, entre otros el tabaquismo.[21,

22] Sin embargo, la infección por el VPH es considerado como agente causal para CaCU.[21,

23]

Arriba de 100 genotipos de VPH han sido identificados [24, 25]. Más de 35 tipos de

VPH infectan el tracto genital, donde cerca de 20 están asociados a cáncer.[26]

Las que tienen expresión clínica pueden ser lesiones verrugosas y son causadas por

virus de bajo riesgo, principalmente por los tipos 6, 11, 42, 43 y 44. Las lesiones premalignas

pueden expresarse clínicamente como un NIC y los virus de alto riesgo más frecuentemente

involucrados son el 16, 18, 45 y 56, pero también pueden ser ocasionadas por virus de riesgo

intermedio como el 31, 33, 35, 39, 51, 52, 58, 65 y 66.[27, 26, 28]

La asociación del VPH, en displasia y carcinomas está bien establecido y se sabe que

los agentes tales como actividad sexual, inmunidad deficiente, factores demográficos y

sociales, o agentes biológicos están implicados en los múltiples estadios de progresión de la

infección viral al cáncer, la inactivación de los productos de los genes supresores de tumores

(p53, Gen Rb), activación de oncogenes (c-myc, c-ras), aneuploidía, anormalidades

cariotípicas son la llave de los eventos de la progresión tumoral.[29]

11

IV.2.5 Fisiopatología.

Los VPH oncogénicos tienen tendencia a transformarse de monoméricos a variantes

multiméricas. Cuando el ADN viral se incorpora en el genoma humano puede iniciarse la

evolución hacia una neoplasia, que es activa cuando el contenido de ADN diploide cambia a

poliploide y por último se transforma en aneuploide.[30]

La progresión de displasia leve a severa y a cáncer invasivo esta asociado con el

incremento de expresión de los oncogenes vírales los cuales con cofactores adicionales

contribuyen a la progresión de algunas displasias a carcinomas hablándose que la

predisposición genética, reacción inmune celular y expresión de citoquinas son importantes

[31], así el mecanismo molecular oncogénico del virus se basa en la acción de las

oncoproteínas E6 y E7 viral.

IV.3 PAPILOMAVIRUS HUMANO

El VPH pertenece al grupo Papovaviridae, en el que están varios virus que infectan

tanto animales como al hombre, produciéndole lesiones neoplásicas. Este grupo es

heterogéneo cuyos diversos genotipos son capaces de producir cambios celulares tanto en piel

como en mucosas (epitelio escamoso); su desarrollo depende del genoma viral y de las

condiciones del tejido infectado.[32]

Algunos de los tipos de VPH causan varias lesiones en el tracto genital femenino y

masculino.(ver tabla 2)

La infección por VPH se inicia en células básales del epitelio y se integra en sitios

cercanos a secuencias de proto-oncogenes o en sitios frágiles de los cromosomas.[33]

El VPH tiene importancia en salud pública por ser una de las infecciones de

transmisión sexual más frecuentes a nivel mundial, esta asociada con cáncer anogenital, de

tratamiento complejo, no existe antiviral específico y todas las modalidades terapéuticas tienen

alto índice de recidivas y muy probablemente no se erradica.[34]

12

IV.3.1 Epidemiología de VPH

La infección por VPH es la más frecuente de las trasmitidas sexualmente debido quizá

a los cambios en la conducta sexual. Se considera que 2% de todas las mujeres en edad fértil

tienen VPH, mientras que mujeres con actividad sexual el 30% de ellas están infectadas,

alrededor de 25 a 65 % de las personas que han tenido contacto sexual con personas infectadas

la adquieren. La transmisión es generalmente de tipo sexual aunque se sugieren otros como la

auto–inoculación, fómites, iatrogénica durante la exploración ginecológica y anal con el

mismo guante, instrumental mal esterilizado y en mujeres núbiles.[34] La edad más frecuente

TIPO

VPH LESIÓN CLÍNICA

6 Neoplasia intraepitelial cervical(NIC), condiloma,verrugas cancerosas

11 NIC, Condiloma

16 NIC, Cancer cervical

18 NIC, Cáncer cervical

30 NIC


33 NIC

35 NIC

39 NIC

40 NIC

42 NIC, Neoplasia intarepitelial peneana

43 NIC

44 NIC







61 NIC

TABLA 1. Tipos de VPH asociados con Lesiones en el tracto genital [35]

13

en que se presentan los condilomas es entre los 16 y 25 años, con predominio en mujeres

blancas en relación con negras de 2:1, en los hombres no hay diferencias.[36]

El intervalo entre la exposición y la detección de condilomas es entre tres semanas a 8

meses (Media: 3 meses), los condilomas acuminados afecta a ambos sexos, pero el papiloma

plano rara vez da origen al condiloma florido en el hombre, la piel del pene parece menos

susceptible a la aparición de neoplasia intraepitelial, a diferencia de la zona de transformación

(ZT) cervical que puede llegar a evolucionar a carcinoma. [36]

IV.3.2 Virología

La clasificación de los VPH se basa en el análisis serológico de determinantes

antigénicas u homología de nucleótidos.[34]

La familia de los papovaviridae comprende 2 géneros: poliomavirus y papilomavirus ( y el

virus simio 40 ), [31], los papovavirus son virus que poseen un genoma circular de ADN de

doble tira encerrado en una cápside, sin cubierta, con simetría icosaédrica, las histonas

celulares sirven para condensar el DNA viral dentro de la partícula. [37]

Características de los papovavirus.

Estimulan la síntesis de ADN celular. Los poliomavirus son modelos importantes de

virus tumorales, los papilomavirus son causa importante de enfermedad humana, las

oncoproteínas virales interactúan con proteínas supresoras de células tumorales [37].

Los VPH miden 55 nanometros de diámetro, con un peso molecular de

aproximadamente 5 x 106 daltons [34]. Tienen una estructura de icosaédro compuesta de 72

capsómeros proteínicos que rodea al ADN viral, la principal proteína capsídica posee un PM

de 54 Kilodaltons, dentro de la cápside también está una especie menor con peso molecular de

76 Kilodaltons.[31]

14

IV.3.3 Configuración genómica

Figura 2. Organización genómica del VPH.

El ADN de VPH es de doble banda y se presenta en forma de círculo cerrado con 8000

pares de bases.[15] En VPH se han identificado genes de expresión tempranas (E-early) o

tardía (L-late) y son:

Regiones tempranas ( E )

Esta región consiste de 6 a 8 estructuras para lectura abierta, el producto de ambas

estructuras de la lectura abierta del E1 y E2 son necesarias para la replicación y

mantenimiento episomal de los genomas virales, la proteína E2 juega un papel adicional en la

regulación de la transcripción, y es el mayor activador de la expresión viral de los papiloma

virus bovinos.

En los papilomas humanos la función primaria de transcripción de E2 parece ser un

represor de la expresión. Otros genes importantes son el E5, el cual codifica para una proteína

de membrana con actividad transformadora débil, el E4, el cual cuando es expresado como

una proteína de fusión con el E1 destruye el ensamblaje de la queratina en las células

estratificadas suprabásales permitiendo el ingreso viral.[15, 33, 36]

Los genes E6 y E7 codifican oncoproteínas nucleares transformadoras, las cuales

interactúan con proteínas del ciclo celular. E6 se une a la proteína tumoral supresora p53 :

15

fosfoproteína Mr 53 000, producto del gen p53, y la E7 se une al gen Rb : fosfoproteína MR

105 000, producto del gen del retinoblastoma. Ambas proteínas celulares supresoras de tumor.

Provocando que el crecimiento celular no se inhiba en la célula huésped. [15, 33, 36]

Frecuentemente se ha encontrado en suero de pacientes con CaCU anticuerpos contra la

proteína E7 del VPH 16 o el VPH 18. También se encontraron anticuerpos contra las proteínas

E2 del VPH 16 y del VPH 18,11,12 E4, 13, 14 y E6 del VPH 16. Igualmente se han

descubierto que los niveles de anticuerpos aumentan con el estadio clínico y varían de acuerdo

con la manera en que es tratada la enfermedad.[15]

Región tardía ( L ) , codifica proteínas estructurales, L1 y L2 codifican proteínas de la

cápside. [15, 33, 36]

Infección: El epitelio escamoso está compuesto de 20 a 30 capas de células de la cuales

únicamente la capa basal más interna está continuamente dividiéndose, la infección por VPH

se piensa que ocurre a través de pequeñas heridas del epitelio, con respuesta de la células

basales a la entrada el virus. El curso natural de la infección es muy variable suele observarse

regresión espontánea de las lesiones proliferativas papilomatosas, el traumatismo puede hacer

que se diseminen los antígenos vírales y con ello se refuerza la inmunidad del huésped.[31,

37]

IV.4 VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Y CANCER CERVICOUTERINO

La mayoría de los estudios epidemiológicos han demostrado que el CaCU es una

enfermedad de transmisión sexual y que la asociación con el VPH es la principal causa de

Neoplasia cervical. [38]

IV.5 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN TIEMPO REAL.

En la RCP en tiempo real, el proceso de amplificación y detección se producen de

manera simultánea en el mismo capilar cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior.

Además, mediante detección de fluorescencia se puede medir durante la amplificación la

cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida

en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar

en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.

16

El termociclador para llevar a cabo la RCP a tiempo real incorpora un lector de

fluorescencia y esta diseñado para poder medir, en cualquier momento la fluorescencia

emitida en cada uno de los capilares donde se realiza la amplificación.

Sondas de hibridación específicas.

La sonda es indispensable en la reacción, debido a que es la responsable de emitir la

fluorescencia ya que se encuentran marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un

aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia

entre dos moléculas. Las sondas más utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas

también sondas Taqman.

Sonda de hidrólisis (sondas Taqman):

Son oligonucleotidos marcados con un fluorocromo donador en el extremo 5’ que emite

fluorescencia al ser excitado y un apagador en el extremo 3’ que absorbe la fluorescencia

liberada por el reportero. Para que esto ocurra, las moléculas reportera y apagadora deben estar

espacialmente próximas. Además, el espectro de emisión de la primera se ha de solapar con el

espectro de absorción de la segunda. Mientras la sonda esta intacta, la fluorescencia emitida

por el reportero es absorbida por el apagador. Sin embargo, durante la amplificación de ADN

diana, la sonda se hibrida con su cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la

cadena, en su acción de síntesis, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, que tiene actividad

5’ exonucleasa, hidroliza el extremo libre 5’ de la sonda, produciendo la liberación del

fluorocromo reportero.[39] Como el reportero y apagador están ahora espacialmente alejados,

la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector. (Figura 3, paso 4)

17

Figura 3. Pasos de la RCP en Tiempo Real

1. Polimerización: Un reportero fluorescente (R) y un apagador son unidos al extremo 5’

y 3’ de una sonda Taqman respectivamente.

2. Desplazamiento de la cadena: cuando la sonda esta intacta la emisión del

reportero esta apagada.

3. Corte: Durante cada ciclo de extensión, la DNA polimerasa corta al reportero de

la sonda.

18

Figura 3. continuación…

4. Polimerización Completa: Una vez separado del apagador el reportero emite su

fluorescencia característica.

IV.6 CARGA VIRAL Y VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO.

La carga viral de los VPH’s de alto riesgo ha sido asociada con la prevalencia de

neoplasia cervical y algunos investigadores sugieren que la una alta carga viral en el epitelio

citológicamente normal es un factor de riesgo para la progresión neoplásica. Sin embargo no

ha sido identificado y validado un método Standard de oro para la medida de la carga viral. Y

una amplia variedad de medidas han sido utilizadas. Estudios previos muestran una asociación

positiva con la carga viral del VPH y neoplasia cervical .[39, 40]

La RCP en tiempo real provee la mejor medida de la carga viral de los VPHs. Y así

poder investigar el role de la carga viral del VPH en la historia natural de la asociación VPH-

carcinogenesis cervical. [39, 40]

La determinación de la carga viral, esta adquiriendo mayor importancia clínica debido

a que las terapias encaminadas a la eliminación de las lesiones provocadas por VPH están

asociadas con altas tasas de recurrencia, no así donde se emplea la terapia antiviral, se piensa

que esto se debe a una reducción de la carga viral y a la estimulación de la inmunidad local

gracias a la liberación de antígenos virales, permitiendo una inmunidad celular para todo el

VPH residual. De esta manera la cuantificación de la carga viral esta permitiendo visualizar la

efectividad de los tratamientos y así desarrollar tratamientos antivirales más efectivos.[41]

19

V. OBJETIVO GENERAL:

Determinar la carga viral del Papiloma Humano de alto riesgo (tipos 16 y 18), en

pacientes con Neoplasia Intraepitelial cervical de bajo grado (NIC I) del estado de Colima.

V. 1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Describir la frecuencia del VPH-16 y VPH-18 en pacientes con NIC I del Estado de

Colima.

Comparar la frecuencia del VPH-16 y VPH-18 en pacientes con NIC I del Estado de

Colima.

Conocer el número de copias del VPH -16 y VPH -18 en pacientes con NIC I del

Estado de Colima.

Comparar las cargas virales del VPH-16 y VPH-18 de pacientes con NIC I del Estado

de Colima.

20

VI. Tipo de estudio

Descriptivo Comparativo

Variables

a) Independiente:

Neoplasia Intraepitelial de bajo grado (NIC I)

b) Dependiente

Numero de copias de VPH-16 y VPH-18

Definición conceptual y operativa de las variables independientes:

Son pacientes con diagnóstico, histopatológico de NIC I y que además conste en el

expediente clínico del Hospital.

Clasificación

La variable independiente esta clasificada de acuerdo a su naturaleza y escala de medición

como cualitativa, nominal.

El indicador para la variable independiente son: Neoplasia intraepitelial cervical grado I,

Definición conceptual y operativa de las variables dependientes.

Es la determinación de las cargas virales de los tipos en que se encuentra clasificado

en VPH en la literatura como de alto riesgo (Tipos 16 y 18), y además que se identifiquen

mediante la utilización del método de la RCP en tiempo Real.

Clasificación.

La variable dependiente se clasifica de acuerdo a su naturaleza y escala de medición como

cuantitativa.

Los indicadores para la variable dependiente son: copias/células

21

VII. Universo de Estudio.

Pacientes con NIC I del Hospital Universitario de Colima y del Instituto Mexicano

del seguro Social del estado de Colima.

VI. 1. Tamaño de la muestra:

VPH-18

El tamaño de muestra fue calculado a través del programa estadístico Epi Info 2000.

Versión 6.04., con los datos siguientes:

Tamaño de la población: 311 casos de NIC I en 2004. [2]

Frecuencia esperada: 23% (0.23)

Error relativo: 10%

N = 36

VPH-16

El tamaño de muestra fue calculado a través del programa estadístico Epi Info 2000.

Versión 6.04., con los datos siguientes:

Tamaño de la población: 311 casos de NIC I en 2004. [2]

Frecuencia esperada: 22% (0.22)

Error relativo: 10%

N = 40

22

VII. 2 CRITERIOS DE CAPTACIÓN DE PACIENTES.

Criterio de Inclusión.

a) Pacientes con diagnóstico NIC I, procedentes del Hospital Regional Universitario de

Colima, y del Instituto Mexicano del Seguro Social, de la ciudad de Colima y que sean

positivos para VPH-16 y VPH-18, diagnosticados por RCP.

b) Que acepten participar en el estudio.

Criterio de Exclusión.

a).Mujeres con tratamiento antiviral.

Criterio de Eliminación.

Aquellas personas cuya información fue incompleta tanto clínica como laboratorialmente, así

como las que ya no quisieron seguir participando en el proyecto.

23

VIII. JUSTIFICACIÓN

El CaCU es un problema prioritario de Salud Pública en México. En el Estado de

Colima, en el año 2005, se reportaron 48 defunciones por CaCU, 468 casos nuevos de

displasia leve con una tasa de 21,93 por 10 000 habitantes femeninos mayores de 14 años

ocupando el séptimo lugar a nivel nacional, solo por debajo de Quintana Roo, Nayarit, Jalisco,

Guerrero, Durango y Veracruz.[2]

En esta investigación se identifico el tipo de VPH y se midió su carga viral por medio

de RCP Tiempo Real en muestras cervicales (citología exfoliativa) de mujeres con NIC I, de

esta forma contribuir a un mayor conocimiento del VPH de alto riesgo en el Estado de

Colima, que pueda servir de base para estrategias de manejo de la paciente y convertirse en un

pequeño paso que pretende ayudar a resolver el problema concreto en las mujeres con

lesiones premalignas de esta región.

.

24

IX. MATERIALES Y MÉTODOS

Captación de Muestras: Se captaron muestras por citología exfoliativa (citocepillo) del

cervix de mujeres con diagnóstico histopatológico de NIC I, correspondientes a los Servicios

de la clínica de displasia del Hospital Regional Universitario y del Instituto Mexicano del

Seguro Social de la Ciudad de Colima. Los citocepillos se depositaron en microtubos de 1.5

ml conteniendo PBS (3.56gr Na2HPO4.H2O, 0.52gr NaH2PO4.2H2O, 8.5gr NaCl, por litro)

como medio de transporte. Se elaboró un cuestionario (anexo 2) para obtener información

sobre la historia sexual, y reproductiva de las pacientes así como su estado civil, y conocer las

características generales de la población (tabla 5)

Extracción del ADN: Se centrifugaron las muestras con el citocepillo, por 20 seg. A 10 000

rpm., con movimientos circulares se sacó el citocepillo, se centrifugó de nuevo a 10 000 por

25 min. Y se quitó el sobrenadante con el cuidado de no tirar el botón, se agregó a las

muestras 100 µl de buffer de digestión que contiene 200 µg/ml de Proteinasa K. Si la cantidad

de muestra era mucha se agregó 200 µl, se dejó en baño maría a 37º C de 48 hr, se inactivó la

Proteinasa K a 98º C por 8 min. Y se agregó 300 µl de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico

(25:24:1), se mezcló bien, y se separó las dos fases por centrifugación a 10 000 rpm por 10

min. A 4º C. se tomó la fase acuosa superior y la pasé a otro tubo, cuidando de no tomar la

interfase. Se agregó 300 µl) de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Se Mezcló bien. Se

centrifugó a 10 000 rpm por 10 min. A 4º C. se tomó la fase acuosa cuidando no tomar la

interfase, transfiriendo a otro tubo, se agregaron dos volúmenes de alcohol absoluto frío y una

décima de volumen de acetato de sodio 3 M a un pH 5.2. se permitió que el ADN precipitará

a -20º C por una hora, se centrifugó a 7 000 rpm por 10 minutos, y se eliminó el exceso de

alcohol, cuidando de no tirar el botón, se adicionó 50 µl de Alcohol al 70 %, se centrifugó a

7 000 rpm por 10 min. Y se decantó con el cuidado de no tira el botón, se secó el botón con el

tubo destapado por lo menos 2 horas, y posteriormente se disolvió el botón con 100 µl de

Buffer TE 1X (10mM Tris-HCL pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0) estéril a 70 °C durante 15

minutos.

25

Cuantificación del ADN: Se colocaron en una celda de cuarzo 5 µl de ADN extraído y se

disolvieron en 495 µl de Buffer TE 1X estéril, se midió la absorbancia a 260 nm con un

espectrofotómetro para conocer su concentración, mientras que la pureza con respecto a

proteínas se determinó por la relación de absorbancia entre 260/280 nm. Considerándose

como aceptables muestras con una concentración mayor de 50 ng/ul y una de pureza de 1.5-2.

IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VPH.

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP): Las reacciones se desarrollaron en un

volumen total de 10 µl, conteniendo 1X de Buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl),

1.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de cada dATP, dGTP, dCTP y dTTP, 10 µM de cada uno de los

primers, 0.25 U de Taq DNA polimerasa, 100 ng ADN genómico y la cantidad de H2O

inyectable necesaria para completar 10 µl.

Todas las reacciones fueron amplificadas usando el termociclador Stratagene Gradient

40, usando las siguientes condiciones, para la desnaturalización inicial 1 ciclo de 94 °C, 5

min; para la amplificación 35 ciclos de 94 °C, 20 seg., 55 °C, 50 seg., 72 °C, 20 seg.; para la

extensión final se llevo a cabo 1 ciclo de 72 °C, 5 min. Finalmente, los productos se separaron

por electroforesis, utilizando geles de poliacrilamida al 6% en TBE (T+ris base 89mM. Ácido

Bórico 89 mM y EDTA 20 mM, pH 8.0), los geles fueron teñidos con nitrato de plata y

analizados para la identificación del VPH-16 (figura 4) y VPH-18 (figura 5) respectivamente.

Los iniciadores utilizados (tabla 2) para la amplificación e identificación para el VPH-

16 y VPH-18 fueron los siguientes:

Primer Especificidad Secuencia (5’ a 3’) Producto

16 E6U VPH-16 ATgACTTTgCTTTTCgggAT 235 pb

16 E6L VPH-16 CTTTgCTTTTCTTCAggACA

18 E7U VPH-18 ATgTCACgAgCAATTAAgC 139 pb

18 E7L VPH-18 TTCTggCTTCACACTTACAACA

TABLA 2. Secuencia de primers utilizados para la identificación de los VPHs.[42]

GEL DE POLIACRILAMIDA AL 6 %. Mezcla acrilamida-bisacrilamida (29%-1%) 12 ml.

Buffer TBE (1X) 48 ml, Persulfato de Amonio (APS) al 10 % 600 µl, TEMED (N,N,N’,N’-

tetramethyl-ethylendiamina) 60 µl.

26

Tinción del gel de poliacrilamida con AgNO3 : Se colocó el gel por 20 minutos en solución

fijadora (ver parte inferior), se desecho la solución y se agregó AgNO3 al 0.2% durante 7-10

minutos, se lavó de 1 a 2 veces con H2O desionizada, se eliminó el exceso de AgNO3 con

solución reveladora (ver parte inferior), posteriormente se agregó solución reveladora recién

preparada y 600 µl de formaldehído y se esperó hasta que aparecieran las bandas. Se eliminó

la solución reveladora y el formaldehído y se agrego H2O para facilitar la recolección del gel.

Solución fijadora (1000 ml): Etanol absoluto 10%, ácido acético 0.5 % y se aforo con H2O

desionizada a 1000 ml.

Solución de AgNO3 (100 ml): AgNO3 0.2 %, aforada a 100 ml con solución fijadora.

Solución reveladora (1000 ml): NaOH 3 %, formaldehído 0.5 5, aforada con H2O desionizada

a 1000 ml.

MPM 25 pb

HeLa Ctrl (-)

100pb

125pb

150pb

175pb

200pb

225pb

250pb

139pb

Carril 1

2 4 3 5 6 7 8 9 10

(+) (+) (+) (+)

Figura 4. Identificación del VPH-18 en gel de poliacrilamida al 6 %. Se obtuvieron productos de

amplificación para VPH-18 de 139pb , se utilizo marcador de peso molecular (MPM) de 25 pb , mientras

que ADN de HeLa fue utilizado como control positivo para VPH-18.

27

DETERMINACIÓN DE LA CARGA VIRAL DE LOS VPHs

Preparación de las Curvas Estadáres: Con la finalidad de realizar la estandarización de

nuestros resultados Se prepararon diluciones de 108 a 10

2 copias tanto para VPH-16, VPH-18

así como de HMBS Homo Sapiens Hydroxymethylbilane synthase; GenBank No. M95623)

[anexo 1.] para la realización de curvas estándares que nos sirvieron para determinar la carga

viral de cada una de las muestras.

Se realizo la técnica de RCP en tiempo real para el HMBS para conocer el número de

células presentes en cada una de las muestras con el fin de normalizar los resultados. (Expresar

los resultados en copias/células)

Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo Real (RCP-Tiempo Real): El sistema de

tipificación esta diseñado para determinar la carga viral de los tipos de VPH-16 y VPH-18

encontrados en NIC I.[39] El ensayo está basado en 3 reacciones en paralelo de RCP en

MPM 25 pb

SiHa Ctrl (-)

100pb

125pb

150pb

175pb

200pb

225pb

250pb

275pb

300pb

235pb

Carril 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10

(+) (+) (+) (+) (+)

Figura 5. Identificación del VPH-16 en gel de poliacrilamida al 6 %. Se obtuvieron productos de

amplificación para VPH-16 de 235pb , se utilizo marcador de peso molecular (MPM) de 25 pb , mientras

que ADN de SiHa fue utilizado como control positivopara VPH-16

28

tiempo real de cada muestra. La reacción 1: Permitió amplificar y cuantificar los VPH 16

que fueron detectados y cuantificados juntos), en el cual se utilizan 2 iniciadores y 1 sondas

(ver tablas 3 y 4), la reacción 2: Nos permitió amplificar y cuantificar el VPH 18, en el cual

se utilizan 2 iniciadores y 1 sondas. (ver tablas 3 y 4).mientras que la reacción 3 nos permitió

amplificar y cuantificar la cantidad de una simple copia del gen humano (HMBS), en el cual

se utilizaran 2 iniciadores y 1 sonda. (ver tablas 3 y 4).

Iniciador Especificidad Secuencia (5’ a 3’)

F16E7 VPH16 AGCTCAGAGGAGGAGGATGAA

R16E7 VPH16 GGTTACAATATTGTAATGGGCTC

F18E1 VPH18 CATTTTGTGAACAGGCAGAGC

R18E1 VPH18 ACTTGTGCATCATTGTGGACC

HMBS F HMBS GCCTGCAGTTTGAAATCAGTG

HMBS R HMBS CGGGACGGGCTTTAGCTA

Tabla 3. Secuencia de primers utilizados en la RCP en tiempo Real.[45 ]

Sonda Especificidad 5’ fluoroforo Secuencia (5’ a 3’) 3’ fluoroforo

S1.1 VPH16 FAM CCAGCTGGACAAGCAGA

ACCGG

TAMRA

S1.2 VPH18 FAM AGAGACAGCACAGGCAT

TGTTCCATG

TAMRA

S3 HMBS FAM TGGAAGCTAATGGGAAG

CCCAGTACC

TAMRA

Tabla 4. Sondas utilizadas en la RCP en Tiempo Real. [45]

29

La amplificación de la RCP en tiempo real fue desarrollada a un volumen total de 10

µl, conteniendo: 1X de Master Mix (FastStar Taq DNA polimerasa, buffer de reacción, MgCl2

y una mezcla de los dNTPs), 0.5 µM de cada primer, 0.1 µM de la sonda, 2 µl de ADN

genómico y la cantidad de H20 inyectable necesaria para completar 10 µl de mezcla total.

La amplificación y detección fue desarrollada usando el termociclador Lightcycler

versión 1.5 de Roche Diagnostics de la siguiente manera: pre-incubación 1 ciclo a 95 °C , 10

min; amplificación y cuantificación 45 ciclos a 95 °C, 10 seg., 57 °C, 20 seg., 72 °C, 1 seg.;

Enfriamiento 1 ciclo 40 °C, 30 seg.

Análisis de los datos de RCP en Tiempo Real: Se utilizó el Lightcycler software versión 4.0,

para la detección de la secuencia, y se produjo un archivo con datos crudos. El software fue

desarrollado y utilizado para el cálculo del ciclo umbral y conversión en números de las copia

de VPH por célula.

Análisis Estadístico: Se realizó la determinación de frecuencias y proporciones de cada uno de

los tipos de papilomavirus humano, para el análisis estadístico de comparación se utilizo U. de

Mann Whitney , el nivel de significancia fue considerado de p< 0.05.

30

X. RESULTADOS

Características generales de la población estudiada

Como resultado del cuestionario practicado a las pacientes, se obtuvo información acerca

de los factores de riesgo para el desarrollo de CaCU.(tabla 5)

Mínimo Mediana Máximo

Edad (años)

GENERAL

VPH-16

VPH-18

17

18

17

36.5

37

36

65

65

64

IVSexual(años)

GENERAL

VPH-16

VPH-18

12

14

12

18

18

17

35

35

26

No. de PSVida GENERAL

VPH-16

VPH-18

1

1

1

1

1

1

8

8

8

Paridad

GENERAL

VPH-16

VPH-18

0

0

0

3

3

3

14

14

10

No. de Gestaciones

GENERAL

VPH-16

VPH-18

0

0

1

3.5

4

3

15

15

10

No. De PSAño

GENERAL

VPH-16

VPH-18

0

0

0

1

1

1

4

4

4

TABLA 5. Características Generales de la población estudiada según tipo de

VPH.

IVSexual = Edad que inicio su vida sexual.

No. de PSVida = Número de parejas sexuales en su vida.

No. de PSaño = Número de parejas sexuales el último año.

31

Identificación y tipificación de los VPHs

Un total de 245 muestras se analizaron para identificar el VPH-16 (figura 5) de las cuales

54 muestras resultaron ser positivas para este tipo de VPH, representado una frecuencia

del 22%.(figura 6)

Mientras que para el VPH-18 se analizaron 196 muestras de las cuales solo 45 muestras

resultó ser positiva para este tipo de VPH (figura 4), Obteniéndose el 23 % de frecuencia.

(figura 6)

Con respecto a coinfección solo 11 muestras resultaron ser positivas para ambos tipos de

VPH , representando el 11.11% de las 99 muestras positivas para el VPH (54 muestras

VPH-16 y 45 muestras VPH-18),.(figura 6)

191

54

11

45

151

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Fre

cu

en

cia

( n

)

Negativas Positivas co-

infeccion

Positivas Negativas

VPH-16

VPH-18

22%

23%

78%

77%

Figura 6 . Frecuencia del VPH-16 y VPH-18. Las muestras positivas de VPH se identificaron mediante la

técnica de RCP de punto final. Nótese que el porcentaje encontrado del VPH-18 es mayor que del VPH-16.

32

Cuantificación de la carga Viral de los VPHs.

La determinación de la carga viral del VPH-16, mediante la técnica de RCP en tiempo

real. Se llevo a cabo en un total de 54 muestras, de las cuales solo en 47 de ellas se pudo

determinar la cantidad de copias de ADN del VPH presente, en las otras 7 muestras

restantes no se determino el número de copias probablemente por la degradación del ADN.

(tabla 6)

No.

Paciente

Carga Viral

(copias/103Células)

No.

Paciente

Carga Viral


1a 1,60E+04 25a 4,10E+06

2a 1,60E+03 26a 2,50E+01

3a 5,20E+05 27a 1,10E+01

4a 1,90E+04 28a 1,60E+04

5a 5,30E+01 29a 3,20E+02

6a 3,40E+01 30a 5,60E+01

7a 1,40E+01 31a 3,10E+02

8a 2,20E+05 32a 1,00E+03

9a 5,80E+00 33a 1,30E+01

10a 1,10E+03 34a 2,70E+01

11a 2,40E+02 35a 4,10E+01

12a 1,20E+02 36a 1,10E+01

13a 1,50E+01 37a 5,80E-01

14a 8,70E+01 38a 8,30E+01

15a 5,30E+00 39a 1,10E+00

16a 6,00E+02 40a 1,10E+00

17a 1,20E+03 41a 1,20E+05

18a 1,00E+04 42a 3,80E+01

19a 1,70E+02 43a 1,00E+04

20a 2,30E+03 44a 2,80E+01

21a 2,60E+00 45a 4,30E+00

22a 1,00E+02 46a 5,80E+03

23a 1,30E+01 47a 3,60E+04

24a 4,40E+01

Tabla 6. Carga Viral del VPH-16 en pacientes con NIC I. Se muestra de manera individual la carga

viral del VPH- 16 obtenidas para cada uno de las muestras.

33

Debido a que en la RCP en tiempo real algunos resultados no fueron satisfactorios, se

eliminaron 7 muestras de VPH-16. Mientras que se toman en cuenta para la prevalencia

debido a que cuando se hizo el escrutinio para VPH-16 dichas muestras fueron positivas.

Con respecto a la cuantificación del VPH-18, se determinó la carga viral en un total de 45

muestras cuyas cargas obtenidas se pueden ver en la tabla 7.

No.

Paciente

Carga Viral


No.

Paciente

Carga Viral


1b 2,51E+02 24b 5,49E+00

2b 5,90E+01 25b 4,50E+02

3b 5,02E+01 26b 2,87E+02

4b 2,94E+02 27b 6,60E+01

5b 1,43E+02 28b 2,23E+01

6b 5,67E+02 29b 2,96E+02

7b 1,95E+02 30b 3,01E+03

8b 2,17E+01 31b 2,54E+02

9b 2,58E+01 32b 1,04E+02

10b 3,81E+01 33b 2,50E+02

11b 1,04E+02 34b 1,47E+01

12b 1,01E+02 35b 1,63E+02

13b 1,00E+02 36b 9,58E+00

14b 2,28E+01 37b 1,74E+01

15b 9,44E+00 38b 3,61E+00

16b 1,90E+01 39b 4,72E+00

17b 1,26E+00 40b 2,64E+01

18b 2,11E+00 41b 8,88E+03

19b 7,58E+01 42b 4,81E+01

20b 5,19E+00 43b 1,76E+01

21b 1,44E+00 44b 1,51E+01

22b 1,12E+01 45b 4,73E+00

23b 1,11E+02

Tabla 7. Carga Viral del VPH-18 en pacientes con NIC I. Se muestra de manera individual la

carga viral del VPH- 18 obtenidas para cada uno de las muestras.

34

Con la finalidad de visualizar de una manera general las cargas virales obtenidas, se

realizo una agrupación de dichas cargas virales en intervalos según su log 10. resultando

con un mayor porcentaje el intervalo de 1.0E+01

con un 37%, seguido por el intervalo

1.0E+02

con un 25 %,(figura 7). De igual manera se realizo esta distribución para cada uno

de los tipos de VPH ( 16 y 18). De manera general se observa que el VPH-18 tiene una

menor carga viral con respecto al VPH-16. (figura 8)

17

34

23

86

31

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1.0E+00 1.0E+01 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06

Carga Viral (Copias/103 Celulas)

No

. d

e M

uestr

as (

n )

Figura 7 . Distribución General de las Muestras según su Carga Viral. Las cargas virales se

agruparon en intervalos según su log 10. Nótese la distribución del número de muestras

correspondiente en cada uno de los intervalos así como su porcentaje.

18% 37% 25%

9%

7%

3% 1%

35

6

18

76 6

3

1

11

16 16

2

0 0 00

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

1.0E+00 1.0E+01 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06

Carga Viral (Copias/103

Células)

No

. d

e M

uestr

as (

n )

VPH-16

VPH-18

Análisis Estadístico.

Al analizar los datos obtenidos para la carga viral con la prueba de Kolmogorov-Smirnov

para verificar su normalidad, se concluyo que su distribución no era normal por tal

motivo para la estadística inferencial se utilizo la prueba no parametrica de U. de Mann

Whitney.

Se compararon las cargas virales obtenidas del VPH-16 y las del VPH-18 con la prueba de

U. de Mann Whitney teniendo una p = 0.030, por tal motivo se considera que la

diferencia entre las cargas virales del VPH-16 y VPH-18 tiene significancia

estadística.(tabla 9)

13% 13%

13% 6%

38%

15%

2%

24%

36% 36%

4%

Figura 8 . Distribución de las Muestras según Tipo de VPH y Carga Viral. Las cargas virales se

agruparon en intervalos según su log 10. Nótese el tipo de VPH y la distribución del número de

muestras correspondiente en cada uno de los intervalos así como su porcentaje.

36

Grupo Mínimo

(copias/103celulas)

Mediana

(copias/103celulas)

Máximo

(copias/103celulas)

Valor de

p

VPH-16

(N=47)

1.05E+00 8.70E+01 4.05E+06 0.030

VPH-18

(N=45)

1.26E+00 4.80E+01 8.88E+03

Se analizaron las carga virales según los factores de riesgo para el desarrollo de CaCU

mediante la prueba de U. de Mann Whitney la mayoría de los grupos formados no

tuvieron significancia estadística y solo el grupo de “mayor parejas sexuales el ultimo año”

del VPH-16 vs. del VPH-18 tuvo una p de 0.021. por lo cual se consideró dicha diferencia

significativa. Algunos de estos grupos estuvieron cerca de tener significancia estadística

como lo muestra la tabla 9.

Tabla 8. Diferencia significativa entre carga Viral de VPH-16 y VPH-18. Nótese el resultado de la

prueba de U. de Mann Whitney tuvo una p de 0.030.

37

Grupo Tipo de

VPH

Mínimo

(copias/103celulas)

Mediana

(copias/103celulas)

Máximo

(copias/103celulas)

Valor

de p

PSAño

≥ 1

VPH16

(N=42)

1.08E+00 1.35E+02 4.10E+06 0.021

VPH18

(N=40)

1.26E+00 4.40E+01 8.88E+03

Casadas VPH16

(N=30)

1.08E+00 1.02E+02 4.10E+06 0.068

VPH18

(N=27)

1.26E+00 3.80E+01 8.88E+03

Edad ≥

17 años

VPH16

(N=23)

1.05E+00 5.60E+01 4.10E+06 0.063

VPH18

(N=19)

1.44E+00 2.60E+01 3.01E+03

Gestas

≥ 1

VPH16

(N=31)

1.05E+00 8.30E+01 2.20E+05 0.081

VPH18

(N=28)

1.26E+00 2.45E+01 8.88E+03

Paridad

≥ 1

VPH18

(N=15)

5.19E+00 1.00E+02 8.88E+03 0.060

VPH18

(N=23)

1.26E+00 2.30E+01 4.50E+02

Tabla 9. Comparación de carga viral del VPH-16 y VPH-18 según diferentes factores de riesgo. Se indica

el valor de p obtenido según factores de riesgo, teniendo significancia estadística el grupo de mayor de 1

pareja sexual el ultimo año. Y demás grupos que estuvieron cerca de tener significancia estadística.

38

XI. DISCUSION

Observamos que la frecuencia de positividad para el VPH-18 en pacientes con NIC I del

Estado de Colima es muy alta (23%), mientras que para el VPH-16 (22%), la consideramos

alta. En comparación con la reportada con Taesook Hwang, quien detecto y tipifico el VPH,

en mujeres coreanas, sin encontrar evidencia de infección por el VPH-18 (0%), en contraste

para el VPH-16, reporto una frecuencia mayor (29%). [43] O bien se reportan frecuencias muy

bajas para VPH-18, del 2%, encontrada por Anderson y Cols, que estudiaron el tipo de

distribución del VPH en pre-estados de cáncer cervical en mujeres suecas, mientras que para

el VPH-16, reportaron una frecuencia del 20%, siendo muy similar a la encontrada por

nosotros.[44] En un estudio hecho en Texas (Estados Unidos) por Swan y Cols mostraron una

frecuencia para el VPH-18 de 5.7%, mientras que para el VPH-16 fue de 8.5 %[45], ambas

frecuencias menores a las encontradas en el presente tesis. Cabe recordar que las frecuencias

descritas anteriormente corresponden únicamente a las encontradas en relación con NIC I.

Piña-Sánchez y cols analizaron la prevalencia de los tipos de VPH y determinaron su

asociación con lesión cervical en población mexicana, reportando una frecuencia de VPH-16

de 25.3%, y para el VPH-18 de 4.2% en pacientes con LIE de bajo grado.[46] Un estudio

previo en el Estado de Colima, realizado por Tamayo y Cols, donde se clasificaron los

pacientes con LIE de bajo grado se encontró una prevalencia alta de VPH-18 (44.7%), Sin

embargo las frecuencias encontradas para el VPH-16, fue del 76.7%.[47]

Estas diferencias pueden ser explicadas por las poblaciones estudiadas. En la población

de mujeres mexicanas son pocos los estudios que hacen referencia a la frecuencia entre la

infección por el VPH y NIC I. Dichos estudios no pudieron ser comparados con los nuestros,

porque utilizaron primers consensos y reportan una frecuencia general del VPH, si mencionar

los diferentes tipos.[48] O bien por la metodología utilizada en la detección del VPH, como

es el caso del estudio previo realizado en el mismo Estado, así como la nomenclatura en la

clasificación de las lesiones utilizada fue diferente.

La RCP en tiempo real en el diagnóstico molecular ha sido muy bien aceptada a nivel

mundial, por su alta especificidad y sensibilidad por lo tanto su uso se ha incrementando.[49]

Al tratar de comparar la carga viral encontrada en el presente trabajo con otros estudios nos

percatamos que la bibliografía en la cual se apoyo principalmente nuestro trabajo

39

experimental solo se evaluó la reproducibilidad para cuantificar la carga viral del VPH-16 y

VPH-18 , la cual sus resultados no sirvieron como referencia. [42] Ninguno de los estudios

encontrados realizo una comparación entre la carga viral del VPH 16 vs VPH-18 en lesiones

premalignas en especial NIC I.

La comparación de la carga viral, se rescato al encontrar un estudio en la cual se basa

en la variación del ciclo umbral (Ct), el cual su valor es considerado inversamente

proporcional a la cantidad inicial del ADN del VPH, al comparar el Ct medio del VPH-16

(28.70) el estudio la considera dentro intervalo de 103

de genoma de VPH mientras que para el

valor medio de Ct del VPH-18 (29.77) el estudio la considera dentro del intervalo de 102

de

genoma de VPH y ambos intervalos (103 y 10

2) son considerados como de baja carga viral, de

acuerdo con las respectivas curvas estándares que ellos hicieron para VPH-16 y VPH-18.[39]

No existe un parámetro validado que nos diga los intervalos en los cuales se considera que la

carga viral sea alta, media o baja, la mayoría de los estudios encontrados realizan ellos mismos

sus intervalos de acuerdo a las cargas virales que cada uno de ellos encuentra difiriendo de un

estudio a otro. La baja carga viral encontrada en esta tesis se podría explicar a las muestras

que son de pacientes con NIC I. Al no encontrar estudios previos que nos hallan servido de

comparación esto se puede explicar debido a que, para la determinación de la carga viral en

especial del VPH, han sido utilizadas una amplia variedad de químicas para su detección así

como de unidades de medición, pero aún no ha sido identificado y validado un método que

sea considerado como el estándar de oro.[42]

Nuestros resultados demuestran que en pacientes con NIC I, la carga viral normalizada del

VPH-16 (copias/103

células) es más alta en comparación con la carga viral obtenida

normalizada del VPH-18, siendo una diferencia significativa con un valor de p de 0.030.

Diversos estudios sugieren que el DNA del VPH-18 es aproximadamente de 10 a 50 veces

más eficiente que el DNA del VPH-16 en la inmortalización de células epiteliales haciéndole

más agresivo.[50] Otros investigadores reportan que el HPV-18 puede estar asociado a con

una forma más agresiva de cáncer cervical que otros tipos de VPHs.[51] O bien se reporta que

el DNA del VPH-18 fue 5 veces más eficiente que el ADN del VPH-16 para la transformación

de queratinocitos in vitro.[52] Inclusive un estudio sugiere que la expresión de proteínas

virales tempranas incluyendo los oncogenes pueden ser directamente de un segundo promotor,

localizado dentro del LCR del VPH-18. [53] o bien que el VPH-18 puede estar asociado con

40

el desarrollo de la progresión hacia cáncer cervicouterino más rápidamente. [54] Lo anterior

puede ser debido a que la LCR, principal promotor de E6 y E7 de VPH-18 es más potente que

el de VPH-16. Al tener el VPH-18 un promotor más potente, esto podría explicar el porque

una infección con baja carga viral del VPH-18 podría ser suficiente para alterar al epitelio

cervical y provocar una NIC I con una menor carga viral que el VPH-16.

Al comparar los grupos de carga viral que se formaron en base a características

epidemiológicas, en la mayoría la diferencia entre la carga viral del VPH-18 y VPH-16 no

hubo significancia estadística, a excepción de un solo grupo (tabla 6). Esto es probable a que

se deba a nuestro tamaño muestral pues los grupos que se formaron quedaron muy pequeños,

con un tamaño insuficiente para hacer un análisis confiable.

XII. CONCLUSION

La frecuencia del VPH-18 en mujeres con NIC I, en el Estado de Colima es muy alta.

La frecuencia del VPH-16 en mujeres con NIC es alta en el Estado de Colima.

La frecuencia del VPH-18 es mayor con respecto a la frecuencia del VPH-16, en el Estado

de Colima.

La Carga Viral, del VPH-16 es mayor significativamente con respecto al VPH-18, en

pacientes con NIC I. (p = 0.030)

Una carga viral de 102 genomas de VPH-18, es capaz de producir NIC I.

En base a los resultados presentados en esta tesis se concluye que se realizó

satisfactoriamente la determinación de la carga viral del VPH tipos 16 y 18, mediante

RCP en tiempo real en mujeres con NIC I del estado de Colima.

41

XIII. PERSPECTIVAS

Los resultados de esta tesis demuestran que la frecuencia del VPH-18 es poco mayor que

la del VPH-16, dichas frecuencias las consideramos altas, para el Estado de Colima. La carga

viral del VPH-16 cuantificada es significativamente mayor que la del VPH-18. La

contribución experimental de la presente tesis consistió en la determinación de la carga viral

del VPH-16 y VPH-18, esta determinación por el momento en pacientes con NIC I, es

suficiente para tomar de base la presente metodología para en lo futuro determinar la carga

viral en lesiones premalignas más avanzadas como NIC II, NIC III, Cáncer in situ y cáncer

invasor. Eventualmente estos estudios combinados con estudios del factor de metilación del

DNA del VPH, que indican que una eficiente metilación del DNA del VPH, podría estar

asociada con la progresión y desarrollo de cáncer cervical, contribuirán a un conocimiento más

completo del VPH-16 y 18 en el Estado de Colima.

42

XIV. GLOSARIO

Ácido desoxirribonucleico: Ácido nucleico de los cromosomas; contiene codificada la

información genética de la célula.

Acido nucleico: ADN o ARN. Polímero formado por nucleótidos que contiene las bases

purínicas adenina y guanina y las bases pirimidínicas, citosina, timina y uracilo.

Alelo: Forma alternativa de un gen situado en un locus particular en un par de cromosomas

homólogo. Se segregan durante la meiosis y el hijo sólo recibe uno de cada par de

alelos de cada progenitor.

Amplificación: Tratamiento indicado para incrementar la proporción de ADN plasmídico

frente al ADN bacteriano; 2. Replicación de un banco genómico en bulto; 3.

Generación de múltiples copias de un gen.

Anticuerpos (Inmunoglobulinas): El tipo de inmunoglobulina se determina por medio de la

región constante de la cadena pesada y está asociada con las propiedades genéricas del

anticuerpo: localización tisular y celular, unión del complemento y otras. Es

independiente de la región variable y de la cadena ligera.

Anticuerpos monoclonares: Anticuerpo que se puede obtener en el laboratorio y que tienen

la propiedad de ser altamente específicas contra un epitope. Los anticuerpos

monoclonares pueden producirse por un hibridoma o por una célula productora de

anticuerpos específicos contra un antígeno en particular.

Antígeno: Sustancia o agente que el organismo reconoce como ajena, tales como toxinas,

bacterias o virus y produce una respuesta inmune. El antígeno es capaz de provocar

una respuesta del sistema inmunológico, ya sea por medio de anticuerpos o de células

inmunes, es decir por medio de la respuesta humoral o celular. Un antígeno contiene

varias subunidades llamadas epitopes, que son el objetivo de los anticuerpos

específicos y de los linfocitos T Citotóxicos. Los antígenos pueden circular en el

organismo a través de los vasos linfáticos o sanguíneos, tanto la linfa como la sangre

contienen glóbulos bancos que los atacan y destruyen, para ser finalmente eliminados a

través de los nódulos linfáticos o del bazo respectivamente.

43

Cápside: Cubierta proteica de un virión celular. Un antígeno contiene varias subunidades

llamadas epitopes, que son el objetivo de los anticuerpos específicos y de los linfocitos

T Citotóxicos. Los antígenos pueden circular en el organismo a través de los vasos

linfáticos o sanguíneos, tanto la linfa como la sangre contienen glóbulos bancos que los

atacan y destruyen, para ser finalmente eliminados a través de los nódulos linfáticos o

del bazo respectivamente.

Carcinogénico: Agente o sustancia química que produce cáncer o que acelera su desarrollo.

Carcinoma: Neoplasia Intraepitelial maligna que tiende a invadir los tejidos circundantes y

metastatizar en regiones circundantes del organismo.

Carcinoma in situ: Neoplasia premaligna que no ha invadido la membrana basal, pero que

presenta características histológicas de un cáncer invasivo, generalmente se dan en

epitelio glandular o escamoso estratificado.

Cariotipo: Constitución cromosómica de un individuo. Por lo común, el cariotipo se realiza

fotografiando los cromosomas y ordenando las pares homólogos por tamaño y posición

del centrómero.

Célula basal: Células que proceden de la capa basal o germinal (la más profunda). A partir de

éstas se origina por división (mitosis) el resto del epitelio.

Células intermedias: Células que proceden del estrato medio del epitelio cervicovaginal.

Poseen citoplasmas ligeramente más pequeños que las superficiales y núcleos

discretamente más grandes.

Cérvix: es el cuello y la apertura del utero que conecta con el canal de la vagina.

Citología: Parte de la biología que estudia a las células y sus funciones.

Citomegalovirus: Virus que ocasiona una infección oportunista. Es un virus de la familia de

los herpes. Las infecciones por CMV pueden ser sin síntomas o con síntomas

inespecíficos como fiebre, irritación de la garganta, debilidad, escalofríos y

crecimiento ganglionar. El virus se elimina a través de la orina, semen, saliva, heces y

sudor. Una citomegalovirosis se puede manifestar como retinitis, esofagitis, hepatitis,

mononucleosis, polirradiculopatía, pancreatitis, colitis o afección del pulmón pudiendo

44

llegar a ocasionar la muerte. Su tratamiento es con ganciclovir o foscarnet. Un nuevo

medicamento llamado cidofovir, cuyo nombre comercial es Vistide, sus iniciales

químicas HPMPC y conocido como GS-504, está en proceso de aprobación.

Coilocito: célula intermedia-superficial con gran halo claro perinuclear citoplasmático y

núcleos hipercromáticos agrandados

Coilocitosis silenciosa: Es cuando los coilocitos no siempre se observan y, además,

disminuyen progresivamente en número conforme se incrementa la severidad de la

displasia (aunque está ligada a dicha infección), siendo excepcionales en casos de

cáncer invasivo.

Colposcópico (Estudio): consiste en la evaluación directa del Cuello Uterino, con un lente

binocular de gran aumento denominado Colposcopio, el cual permite visualizar las

llamadas atipias epiteliales (tejido de aspecto anormal), de encontrarse ésta presente, se

tomará de inmediato una pequeña muestra del tejido (biopsia), la cual se enviará al

laboratorio para su estudio histológico y determinar dentro de que categoría se

encuentra la lesión.

Condiloma: Elevación verrugosa que se localiza en el ano, vulva o glande peneano.

Condiloma acumuminado: Elevación verrugosa o papilomatosa de consistencia blanda,

propia de las zonas de la piel caliente y húmeda y las mucosas genitales. Denominada

también verrugas acuminadas y verrugas venérea.

Condiloma plano: Elevación papulosa plana y húmeda que aparece en el periné o glande

peneano.

Correlacionar: Relación reciproca entre dos o más cosas.

Cromosomas: Estructura compuesta de una larga molécula de ADN y proteínas asociadas,

que contiene la información hereditaria de un organismo.

Delación: Forma de aberración de los genes o cromosomas, en la que se pierde una parte de

éstos.

45

Desnaturalización: Cambio dramático en la conformación de ácidos nucleicos causados por

calentamiento o por exposición a químicos y resultando usualmente en la pérdida de

la función biológica.

Diploide: Número cromosómico equivalente al doble del número presente en los gametos, que

tiene dos juegos cromosómicos.

Diseminación: Acción y efecto de esparcir.

Displasia: Desarrollo anormal.

Electroforesis: Método que permite separar determinados constituyentes de una solución,

sometiéndolos a la acción de un campo eléctrico. Este método es utilizado por las

pruebas Western Blot y RIPA.

Elongación: Diferencia de longitud.

Endonucleasas de restricción: Endodesoxirribonucleasa que corta en sitios específicos al

reconocer secuencias específicas de nucleótidos. Ambas cadenas son cortadas.

Usualmente son aisladas a partir de bacterias.

Episoma: Elemento genético circular. Existe en forma independiente del material genético

principal de la célula.

Erradica: Terminar con una enfermedad.

Estudio Descriptivo: El estudio incluye sólo una población, cuyo objetivo es sistematizar y

cuantificar hechos con el fin de conocer con mayor precisión el fenómeno, algunos

autores lo denominan con exploratorio, estudio piloto “Pesquisas”.

Etiología: Parte de la medicina que estudia la causa de las enfermedades. Agente causal de las

enfermedades.

Fenotipo: Conjunto de características observacionales de un organismo o grupo, incluidos los

rasgos anatómicos, fisiológicos, bioquímicos y de comportamiento que son

determinados por la interacción de la base genética y los factores ambientales.

Frecuencia: Repetición de un suceso que pasa muy a menudo.

Gen: Unidad de ADN que codifica un cierto producto, usualmente una proteína.

46

Gen supresor: Gen que puede revertir el efecto de una mutación específica en otros genes.

Genoma: Dotación completa de genes existentes en los cromosomas de cada célula de un

organismo particular.

Genotipo: Constitución genética completa de un organismo o grupo, determinada por la

combinación y localización particulares de los genes en los cromosomas. Alelos

situados en uno o mas loci de cromosomas homólogos. La información genética

contenida en un par de alelos determina un carácter específico.

Heterogeneidad genética: Término amplio utilizado para indicar que un mismo cuadro

clínico puede tener causas genéticas diferentes.

Hipercromasia: Aumento de la coloración de la célula.

Hiperplasia: Aumento del número de células.

Lesiones proliferativas papilomatosas: No siempre se observan dichas células y, además,

disminuyen progresivamente en número conforme se incrementa la severidad de la

displasia (aunque está ligada a dicha infección), siendo excepcionales en casos de

cáncer invasivo.

Locus (plural: loci): Localización exacta del gen de un cromosoma. Las diferentes formas del

gen (alelos) ocupan siempre la misma posición o locus en el cromosomas.

Membrana basal: Capa de tejido conectivo subyacente al epitelio de los vertebrados.

Metaplasia: Es la sustitución del epitelio glandular endocervical por otro de tipo escamoso en

respuesta a diversos estímulos (pH, endocrinos, trauma, inflamación, etc.).

Metástasis: Proceso por el que las células tumorales se discriminan hacia partes distantes del

organismo.

Mortalidad: Número proporcional de defunciones en población o tiempo determinado.

Mucosas: Membrana que tapiza cavidades del cuerpo que tienen comunicación con el

exterior.

Multifactorial: Determinada por múltiples factores tanto genéticos como no genéticos, cada

uno con efecto mínimo.

47

Mutación: Cambio permanente y hereditario del material genético. Definida comúnmente

como el cambio en un solo gen (mutación en un punto), aún cuando el término se

emplea también para designar un cambio en el número o en la disposición de los

cromosomas.

Neoplasia: Crecimiento anormal de un tejido nuevo puede ser benigno o maligno.

Neoplasia maligna: Tumor que tiende a crecer, invadir, metastatizar en forma irregular, está

compuesto por células poco diferenciadas.

Oligonucleótido: Secuencia lineal de nucleótidos unidos por enlaces fosfo-diéster,

habitualmente no mayor de 50 nucleótidos.

Oncogénico: Que es capaz de causar el desarrollo de una enfermedad neoplásica maligna.

Oncogén: Gen que induce una proliferación celular incontrolada.

Oncogenes: Un largo numero de genes que pueden ayudar hacer una célula cancerosa.

Típicamente, muta el gen norma (protooncogen) perdiendo el control del crecimiento

o la división celular.

Oncología: Parte de la medicina que estudia los tumores, entre ellos los cancerosos y su

tratamiento.

Polimerasa: Enzima que cataliza la unión de nucleótidos para formar ARN y de

desoxirribonucleótidos para formar ADN.

Polimorfismo: Variante que se encuentra presente al más del 1% de la población en general.

Pólipo: Pequeño crecimiento de aspecto tumoral que sobresale de una mucosa superficial.

Poliploide: Célula o individuo que tiene tres o más complementos cromosómicos (3N, 4N,

etc.).

Poliploidia: Posesión de más de dos juegos de cromosomas por núcleo.

Pólipo cervical: Tumoración del tejido epitelial columnar que aparece en el canal

endocervical, por lo general está unido a su pared por un pedículo muy delgado.

http://www.geocities.com/maorera/hglnes2n.html#nuc

http://www.geocities.com/maorera/hglges2n.html#gen

48

Protooncogenes: Gen normal, concierne usualmente con la regulación de la proliferación de

células, que pueden iniciar promoviendo el cáncer por medio de la mutación del

oncogen.

Queratina: Proteína córnea, insoluble de agua, presente en la epidermis, uñas, plumas, pelo y

cuerno de los vertebrados.

Reacción en Cadena de la Polimerasa: Técnica de amplificación de una región especifica

del ADN con múltiples ciclos con polimerización de ADN.

Región tardía: Parte de la región viral que contiene genes para las proteínas estructurales,

como los antígenos de la cápside.

Región temprana: Parte del genoma viral que contiene genes que se expresan de inmediato

en las infectadas transformadas.

Represor transcripcional: Proteína celular o viral que evita la trascripción de un gen al unirse

al promotor asociado.

Transformación: Adquisición de las células de alguna o todas las propiedades de las células

neoplásicas.

Trichomonas vaginalis: Protozoo de 8-30 de tamaño, que produce picor y leucorrea

verdosa. Destacar que puede simular fácilmente displasias de bajo grado.

Tumor: Masa de tejido que crece de modo descontrolado; neoplasma.

Virus: Patógeno minúsculo formado por un núcleo de ácido nucleico, generalmente envuelto

por proteína, capas de infectar células vivas. Y se caracterizan por su total

dependencia de un hospedero viviente.

Zona de transformacion (epitelio endocervical): sitio donde se van a originar la gran mayoría

de los carcinomas escamosos

49

XV. REFERENCIAS

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54

ANEXOS

55

ANEXO 1. CALCULOS PARA LA PREPARACIÓN DE LAS CURVAS ESTANDARES

VPH-16 Peso Molecular de una molécula de ADN = (No. de pares de base) x (650 daltons/pares de base)

PM = (80 pb) x (650 daltons/pb)= 52 000 Daltons

Moles Finales de una Molécula de ADN= 2 X (gramos de ADN) / (PM en daltons)

1 x 10-9

gr 66 ng = 6.6 x 10-8

gr

1 ng

Moles = 2 x (6.6 x 10-8

gr) = 2.53 x 10-12

moles

52 000 Daltons

1 mol = 6.023 x 1023

moléculas

6.023 x 1023

moléculas 2.53 x 10-12

= 1.52 x 1012

moléculas /ul de ADN

1 mol

VPH-18 Peso Molecular de una molécula de ADN = (No. de pares de base) x (650 daltons/pares de base)



1 x 10-9

gr 53 ng = 5.3 x 10-8

gr

1 ng

Moles = 2 x (5.3 x 10-8

gr) = 2.09 x 10-12

moles

52 000 Daltons

1 mol = 6.023 x 1023

moléculas

6.023 x 1023


moles = 1.52 x 1012


1 mol

56

HMBS Peso Molecular de una molécula de ADN = (No. de pares de base) x (650 daltons/pares de base)



1 x 10-9

gr 59 ng = 5.9 x 10-8

gr

1 ng

Moles = 2 x (5.9 x 10-8

gr) = 1.50x 10-12

moles

78 650 Daltons

1 mol = 6.023 x 1023

moléculas

6.023 x 1023


moles = 9.03 x 1011


1 mol

De esa manera y a partir de las concentraciones anteriores se prepararon diluciones de 108

a 102 copias tanto para VPH-16, VPH-18 así como de HMBS. Obteniendose las curvas

estándares.

HMBS

Figura 5. Curva Estándar para el HMBS. Muestra la curva obtenida de diluciones 108-10

2 referente a Homo

Sapiens Hydroxymethylbilane synthase. Muestra una eficiencia de 1.87 (eficiencia optima 1.8-2.0).

57

VPH-16

Figura 6. Curva Estándar para VPH 16. Muestra la curva obtenida de diluciones 108-10

2 correspondiente a Virus

del Papiloma Humano tipo 16. Muestra una eficiencia de 1.86 (eficiencia optima 1.8-2.0).

VPH-18

Figura 7. Curva Estándar para VPH 18. Muestra la curva obtenida de diluciones 108-10

2 correspondiente a Virus del

Papiloma Humano tipo 18. Muestra una eficiencia de 1.99 (eficiencia optima 1.8-2.0).

58

ANEXO 2. UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA. CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN

BIOMÉDICA

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.

IDENTIFICACIÓN-ENCUESTA.

Nombre del encuestador: ____________________________________________ Fecha: ________________

I. Nombre de la paciente: ______________________________________________ Edad: _______________

Afiliación: _______________________________________ No. Consultorio _______ Turno M ( ) V ( )

Domicilio: _______________________________________ Colonia: _________________________________

C.P. ________________ Municipio: __________________________ Estado: ___________________________

Ocupación: _______________________________________ Estado Civil: S ( ) C ( ) UL ( ) D ( ) V ( )

II. SINTOMATOLOGÍA: marque con una X

(1) ASINTOMÁTICA (2) DOLOR PÉLVICO (3) SANGRADO GENITAL ANORMAL (4) SANGRADO

POSTCOITO

(5) FLUJO (6) DISPAREUNIA (7) CITOLOGÍA ANORMAL (8) OTRO:

_______________________________

III. CÉRVIX (al momento de la toma de la muestra con citocepillo y/o biopsia):

9.- LEUCORREA SI ( ) NO ( ) 10.- ASPECTO: (a) sano (b) congestivo/inflamatorio (c) ectoprión

(d) pseudoerosión (e) leucoplaquia (f) mosaico (g) puntilleo (h) otro: _________________________

11.- SANGRA a la toma con citocepillo: SI ( ) NO ( )

IV. FACTORES DE RIESGO:

12.- ESCOLARIDAD: (1) analfabeta (2) primaria (3) secundaria (4) técnica (5) universitario (6) otro: _______

13.- A que edad inició relaciones sexuales? ________

14.- Cuántas parejas sexuales ha tenido durante toda su vida: ______

15.- Cuántas parejas sexuales ha tenido el último año: _______

16.- Con que frecuencia ha tenido relaciones sexuales el último año? 1) diario 2) cada tercer día 3) 2 o 3

veces por semana 4) cada semana 5) cada 15 días 6) cada mes 7) ocasional 8) sin relaciones

17.- ANTECEDENTES OBSTÉTRICOS: G ___ P ___ A ____ C ___ EDAD PRIMER HIJO: ________ FUP

_______

FUA _____ FUC ______ EDAD MENARCA: ______ EDAD MENOPAUSIA: _____ FUM ________

18.- Antecedentes familiares CaCU: 1) Madre 2) Abuela materna 3) Hermana 4) Tía materna 5) Otra: ______

6) Otro tipo de cáncer:

19.- Que métodos ANTICONCEPTIVOS ha usado en toda su vida? 1) Hormonales cuanto tiempo: _____

2) DIU cuánto tiempo _________ 3) Barrera 4) OTB/Vasectomía 5) Otros _______________________

20.- Enfermedades de transmisión sexual (ETS): SI ( ) cuál: _________________________________ NO ( )

21.- Fuma o fumó: NO ( ) SI ( ) Cuántos cigarrillos fuma al día? _____ A que edad comenzó a fumar? _____

a que edad dejó de fumar? _______ FUMADORA PASIVA: NO ( ) SI ( ) por cuánto tiempo? __________

V. EXÁMENES, DIAGNÓSTICOS Y RESULTADOS:

22.- Se ha realizado citologías anteriores a esta? NO ( ) SI ( ) Cuántas? ________ FUDOC _______________

23.- Ha tenido tratamientos vaginales anteriores? NO ( ) SI ( ) hace cuanto? FUTto. ____________________

Óvulos/cremas vaginales ____ Conización ________ Electrocauterización _______ Congelación _________

Biopsia _________ Otro: __________________________________________________________________

24.- REPORTE POR CITOLOGÍA: ____________________ REPORTE POR COLPOSCOPÍA:

__________________

25.- REPORTE POR BIOPSIA: _______________________________________________________________

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