FACULTAD DE MEDICINA -...

FACULTAD DE MEDICINA

CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS

El óxido nítrico en el núcleo del tracto solitario modula el reflejo

hiperglucemiante con retención de glucosa cerebral y la

expresión de la proteína Fos post-estimulación quimiorreceptora

en ratas.

TESIS

Que para obtener el grado de

DOCTORA EN CIENCIAS MÉDICAS

Presenta

M. en C. Mónica Lemus Vidal

ASESORES:

BIÓL. Elena Roces de Álvarez-Buylla

DR. Sergio Adrián Montero Cruz

COASESOR CLÍNICO

DR. Benjamín Trujillo Hernández

Colima, Col., Nov. de 2007.

INDICE

CONTENIDO Págs.

INTRODUCCIÓN 1

ANTECEDENTES 2

JUSTIFICACIÓN 8

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 9

HIPÓTESIS 10

OBJETIVOS GENERAL Y ESPECIFICOS 10

MATRIAL Y METODOS 11

Diseño de estudio 11

Universo de estudio 11

Tamaño muestral 12

Criterios de selección 12

Variables 12

Animales y procedimientos quirúrgicos 13

Análisis estadístico 15

INFRAESTRUCTURA Y APOYO DISPONIBLE 16

RESULTADOS PRELIMINARES 17

CRONOGRAMA DE TRABAJO 20

BIBLIOGRAFÍA 21

ABREVIATURAS

SNC: Sistema nervioso central

NTS: Núcleo del tracto solitario

AVP: Arginina vasopresina

IVC: Intracerebroventricular

GLUT: Glutamato

GABA: Ácido gamma-aminobutirico

NO: Óxido Nítrico

nNOS

NSO: Núcleo supraóptico

NPV: Núcleo paraventrícular

RSCC: Receptores del seno cuerpo carotídeo

PO2: Presión parcial e oxigeno

PCO2 Presión parcial de bióxido de carbono

NaCN: Cianuro de sódio

ip: Intraperitoneal

LCRa: Líquido cefalorraquídeo artificial

Sol. sal: Solución salina

INTRODUCCIÓN

Los estudios de Álvarez-Buylla demuestran que los receptores del seno–cuerpo carotídeo

(RSCC) participan en la homeostasis de la glucosa, no sólo como receptores sensibles a los

niveles de glucosa en la sangre que los irriga (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla, 1988;

Obeso y col., 1998; Pardal y López-Barneo, 2002; López-Barneo, 2003), sino además,

induciendo respuestas reflejas en el sistema nervioso central (SNC) que dependen de los

niveless de glucosa que llegan a los RSCC. Por otro lado, los RSCC juegan también un

papel importante en la respuesta contra-regulatoria insulino-independiente a la

hipoglucemia (Koyama y col., 2000). Las vías eferentes de dichos reflejos no están bien

definidas, pero experimentos previos de este laboratorio, identifican que la neurohipófisis y

las glándulas adrenales participan, por vía humoral, como parte fundamental en el reflejo

hiperglucémico con retención de glucosa por cerebro iniciado por estimulación de los

RSCC con cianuro de sodio (NaCN) (Álvarez-Buylla y col., 1997). Las aferencias de los

quimiorreceptores llegan al núcleo del tracto solitario (NTS) a través del nervio del seno

carotídeo (Housley y Sinclair, 1988). Trabajos previos señalan la importancia del NTS en

la homeostasis de la glucosa, con la participación de la arginina vasopresina (AVP)

(Montero y col., 2000; Yarkov y col., 2001). Existen evidencias que indican que el óxido

nítrico (NO) en SNC estimula a las neuronas vasopresinérgicas (Rivier, 2003; Yamaguchi

y Hama, 2003). Un gran acúmulo de evidencias sugieren que el óxido nítrico (NO)

funciona como un neurotransmisor en el NTS (Lewis y col., 1991; Ogawa y col., 1995).

Esto queda demostrado en trabajos previos en los cuales las microinyecciones de un

donador de NO o un precursor de NO en el NTS producen una respuesta ventilatoria y

cardiovascular (Lewis y col., 1991; Lipton y col., 2001; Lo y col., 1997). De la misma

manera, ha sido demostrado la presencia de la enzima NO sintetasa neuronal (nNOS) en

fibras nerviosas y terminales en el NTS, lo que demuestra que esta enzima es responsable

de la síntesis neural del NO, (Krowicki y col., 1997; Lin y col., 1997) la cual puede ser

importante en la transmisión de señales cardiovasculares en el NTS (Lin y col., 1999;

Talman y col., 2001). Además de la acción directa del NO en el NTS sobre dichas señales,

también se ha observado que este neurotransmisor actúa de manera indirecta inhibiendo los

efectos depresores cardiovasculares producidos por el glutamato (Lo y col., 1997; Di Paola

y col., 1991; Talman y col., 2001). Se tienen evidencias anatómicas que demuestran la

relación estrecha entre neuronas glutamatérgicas y nitrinérgicas en NTS, además en

algunas neuronas se ha demostrado co-localización de nNOS y glutamato (Lin y col.,

2000; Lin y col., 2004En experimentos in vitro se demuestra que neuronale). Por

otro lado, Chan, Chang, Ou y Chan, 2004, encuentran que el NO derivado de la nNOS en

el NTS después de la activación de los barorreceptores carotídeos puede participar en la

expresión de c-fos vía fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta del

AMP cíclico (CREB) en un proceso que involucra a la cascada de señales: guanilato

ciclasa soluble/GMP cíclico/proteína kinasa dependiente de GMP cíclico

(sGC/cGMP/PKG-I).

En otros trabajos se encuentra que la activación de los

barorreceptores carotídeos induce la síntesis de Fos en el NTS (Chan y Sawchenko, 1998;

Chan y col., 1998), el sitio principal de las aferencias baro (Ciriello, 1983) y

quimiorreceptoras (Finley y Katz, 1992). El motivo principal de este estudio fue

analizarin vivo las vías centrales que participan en el reflejo hiperglucemiante con

retención de glucosa por el cerebro inducido por la estimulación de los RSCC,

ndo.

ANTECEDENTES

La homeostasis de la glucosa es un proceso fundamental para el mantenimiento de la vida,

su control se ejerce a múltiples niveles. ; Levin, Routh, Kang, Sanders y Dunn-Meynel,

2004,en las condiciones experimentales Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-

Buylla, 1975; ; Rajasekar y Anuradha, 2007los astrocitosde las . ; Levin, Routh,

Kang, Sanders y Dunn-Meynel, 2004Existen receptores glucosensibles en cerebro

(Ritter y col., 2000) vena porta (Hevener y col, 2001), hígado (Niijima, 1969), páncreas

(Malaisse y Sener 1985), cuerpos carotídeos (Álvarez-Buylla, 1975; Álvarez-Buylla y col.,

1997; Obeso y col, 1998; Pardal y López-Barneo, 2002; López-Barneo, 2003) y NTS

(oomura y, yoshimatsu h. 1984) del hipotálamo,; Levin y col., 2004 (fig. 1). Estos

receptores informan al SNC de los niveles de glucosa en las distintas regiones del

organismo y dicha información se integra principalmente a nivel del núcleo del NTS y del

hipotálamo (Schwartz y Porte, 2005)..

En contraste con la mayoría de los tejidos, que muestran una gran flexibilidad con

respecto a la naturaleza de los sustratos energéticos utilizados, el cerebro depende casi

exclusivamente de la glucosa como fuente de energía. Bajo condiciones normales, el

proceso glucolítico en el cerebro excede al proceso oxidativo, es decir se consume mayor

cantidad de glucosa que la utilizada únicamente para la respiración (Sokoloff, 1984, 1991).

La glucosa es la fuente primaria de energía para las actividades celulares, y en

particular, para las funciones del sistema nervioso central (SNC). Este carbohidrato

constituye el 98% del metabolismo oxidativo del cerebro (Ruderman y Goodman, 1980) y

es su principal combustible metabólico. En el humano el cerebro representa

aproximadamente el 2% del peso corporal, pero en condiciones basales consume el 24% de

la glucosa total (Sokoloff, 1984). Las neuronas necesitan esta energía para mantener los

gradientes iónicos a través de sus membranas por medio de mecanismos de transporte

activo (Fray y col., 1996). Desde los estudios clásicos de Claudio Bernard (1857),

numerosos experimentos fisiológicos señalan la participación del SNC en la homeostasis

de la glucosa (Álvarez-Buylla y Carrasco-Zanini, 1960; Oomura, 1983), pero aún no se

conoce la participación precisa del SNC en el mantenimiento de los niveles de glucosa

(periféricos y centrales). El SNC juega un papel esencial para dirigir la respuesta endógena

compensadora en la alteración de la normoglucemia (Cryer y Gerich, 1986), en la rata se

han descrito valores normales desde 70 a 120 mg/dl (Shinde y Goyal, 2003). Con pocas

excepciones, no existen reservas de glucosa en SNC, y no se conocen los mecanismos

homeostáticos que aseguren el aporte de este carbohidrato al cerebro (Fray y col., 1996).

Utilizando técnicas de microdiálisis, que permiten medir la concentración de glucosa en el

espacio extracelular del cerebro, algunos autores consideran que los astrocitos (glías)

podrían ser el lugar inicial de captación de glucosa del plasma, antes de pasar a las

neuronas, lo que representaría un almacén de glucógeno para SNC (Forsyth, 1996).. 1 y

GLUT 3os

Fig. 1- Modelo hipotético de la relación entre las neuronas glucosensibles, los astrocitos, y los capilares en el SNC. La glucosa se transporta desde los capilares hasta los astrocitos por los GLUT 1; dentro de los astrocitos la glucosa se almacena como glucógeno o induce la formación de lactato que sale al espacio extracelular para entrar a la neurona por los canales MCT. El lactato en la neurona se transforma otra vez en piruvato por la LDH para regular la formación de ATP. La glucosa extracelular también entra a las neuronas directamente por los GLUT3 y sintetiza ATP a través del piruvato y de la glucocinasa. El ATP formado se enlaza a los canales de KATP para cerrarlos y despolarizar la membrana neuronal, con entrada de Ca+2 y glutamato. HKI, hexocinasa I;

LDH, deshidrogenasa láctica; MCT, canal de monocarboxilato; VDCC, canal de Ca+2 dependiente de voltaje. (Modificado de Levin y col., 2004)

La insulina, sustrato clave para mantener los niveles estables de glucosa en plasma,

controlando la entrada de glucosa a la célula blanco y su utilización posterior (Sokoloff,

1984), tiene una pobre penetración a través de la barrera hematoencefálica (LeMay y col.,

1988) por lo que su acceso al cerebro es muy limitado astrocitos (fig. 1).

Se sabe que eventos neuroquímicos en el hipotálamo regulan el metabolismo

basal (Woods y col., 1980), y Las neuronas glucosensibles en áreas hipotalámicas como

el núcleo arcuato, y en el tallo cerebral, como el NTS constituyen el primer centro de

relevo para las funciones viscerales, capaces de influir sobre la activación diferencial del

sistema nervioso simpático y la médula adrenal, estructuras importantes en la homeostasis

de la glucosa (Mizuno y Oomura, 1984)2. El SNC participa en la homeostasis de la

glucosa modulando la glucogenolisis hepática por distintas vías:

22 s

ecreción de catecolaminas, estimulación esplácnica por las neuronas glucosensibles en el

hipotálamo y secreción de AVP (Frohman, 1983). La hipoglucemia inicia mecanismos

nerviosos que aumentan la producción de glucosa y por el contrario la hiperglucemia

activa mecanismos que la inhiben (Rohner-Jeanrenaud y col., 1983) (fig.1).

2-3

La glucosa es la fuente primaria de energía para las funciones del SNC. No se conocen los

mecanismos homeostáticos que aseguren el aporte de este carbohidrato al cerebro (Fray y

col., 1996). En los últimos años se han realizado estudios sobre la correlación entre

concentración de glucosa y actividad de los RSCC (Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla,

1988;). 4

Fig.31 La presentación esquemática de los mecanismos de control neural y hormonal

desencadenados por los cambios en los niveles de glucosa en la sangre que irriga al SNC.

La hipoglucemia (poca glucosa en SNC estimula la producción de glucosa a través del

sistema simpático (nervio esplácnico); la hiperglucemia (exceso de glucosa en SNC) inhibe

la producción de glucosa debido a la estimulación del sistema parasimpático (nervio vago),

que produce un incremento en la secreción de insulina para aumentar la captación de

glucosa sistémica. Flechas continuas, estimulación; flechas discontinuas, inhibición.

(Tomado de Rohner-Jeanrenaud y col., 1983)

4

seve55 55

Los RSCC estratégicamente localizados en la bifurcación de la carótida común

informan al cerebro de los niveles de pO2, pCO2, pH, temperatura, osmolaridad

(Eyzaguirre y Zapata, 1984) y glucosa (Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla, 1988) de la

sangre que lo irriga. Las aferencias de los quimiorreceptores llegan al NTS a través del

nervio del seno carotídeo (Housley y Sinclair, 1988). El ácido -aminobutírico (GABA) en

el NTS participa en la regulación respiratoria y cardiovascular, (Ito y Sved, 1997;

Wasserman y col., 2002; Ciriello y col, 1981; Nosaka y col., 1995). Por otro lado,

trabajos previos señalan la importancia del NTS en la homeostasis de la glucosa, con la

participación de la arginina vasopresina (AVP) (Montero y col., 2000; Yarkov y col.,

2001). En trabajos previos estudiamos el efecto del GABA en el NTS sobre este

mecanismo y encontramos que un antagonista de los receptores GABA-B (phaclofen)

produjo un aumento en la respuesta hiperglucemiante y en la retención de glucosa por

cerebro después de la estimulación de los RSCC con NaCN.

Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla en 1994 plantean el estudio de los mecanismos

reguladores en el suministro de glucosa al SNC estableciendo la participación de los RCC

en esta función. El SNC al recibir la información procedente de las zonas reflexogénicas

de las alteraciones en los niveles de glucemia, inicia respuestas para asegurar el consumo

de este importante carbohidrato por el cerebro (Ensinck y Williams, 1972). En los últimos

años se han realizado estudios sobre la correlación entre concentración de glucosa y

actividad quimiorreceptora de los RCC (Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla, 1988; Obeso y

col., 1998; Pardal y López-Barneo, 2002). Los RCC estratégicamente localizados en la

bifurcación de la carótida común informan al cerebro de los niveles de pO2, pCO2, pH,

temperatura, osmolalidad y glucosa de la sangre que lo irriga (Eyzaguirre y Zapata, 1984;

Alvarez-Buylla y Alvarez-Buylla, 1988; Pardal y López-Barneo, 2002). La disminución

de la descarga barorreceptora por oclusión carotídea o la estimulación quimiorreceptora

con microdosis de cianuro (NaCN) aumenta los niveles de glucosa arterial e incrementa la

captación de glucosa por el encéfalo. El mecanismo preciso mediante el cual se lleva a

cabo esta regulación se desconoce todavía, pero recientemente se ha propuesto la

participación de la neurohipófisis y las glándulas adrenales en la vía eferente del reflejo

hiperglucemiante iniciado por la estimulación RCC con NaCN (Alvarez-Buylla y col.,

1997).

Las aferencias de los quimiorreceptores llegan al NTS a través del nervio del seno

carotídeo (Housley y Sinclair, 1988). El NTS es el primer núcleo de relevo de la regulación

respiratoria, cardiovascular, y otros nervios autonómicos (Ito y Sved, 1997; Wasserman y

Col., 2002; Ciriello y col, 1981; Nosaka y col., 1995).

Fig. 2. Representación esquemática de la zona de la bifurcación carotídea en la rata.

(ACC) arteria carótida común; (ACE) arteria carótida externa; (ACI) arteria corótida

interna; (AO) arteria occipital; (AL) arteria lingual; (SC) seno carotídeo; (CC) cuerpo

carotídeo; (NSC) nervio del seno carotídeo o nervio de hering; (NGF) nervio glosifaringeo

(Modificado de Shoukas y col., 1991)

Se sabe que las fibras que llevan información de baro y quimiorreceptores carotídeos

entran al núcleo del tracto solitario (NTS) vía nervio del seno carotídeo, rama del

glosofaríngeo. Sin embargo, las vías neuroanatómicas posteriores para alcanzar el

hipotálamo, así como su procesamiento central están poco estudiados. Los estudios de

Jhamandas y Renaud (1987) describen una vía excitatoria directa desde la médula

vetrolateral caudal (CVLM) que puede mediar la entrada quimiorreceptora (QUIMIO) a las

neuronas vasopresinérgicas del núcleo supraóptico (NSO) que llega a las neuronas

secretoras de AVP del NSO estimulando la liberación de AVP por la neurohipófisis.

Por otro lado, Chan y col., (2004), encuentran que el NO derivado de la nNOS en el NTS

proliferadoractivadordelaexpresi

66después

77

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En trabajos anteriores se demuestra la participación de los quimiorreceptores y

del SNC en la homeostasis de la glucosa. Por otro lado se describe que las aferencias

baro y quimiorreceptores llegan al NTS (Finley y Katz, 1992). Se sabe que los

mecanismos nitroxidérgicos en el NTS son importantes Otros estudiosen la

regulación de la presión arterial sistémica y ventilación pulmonar. En efecto, la

estimulación barorreceptora induce la expresión Además, Chan y col., (2004)

demuestran que elinmediata del gen temprano c-fos en el NTS, l.Con los antecedentes

descritos podemos¿La utilización de fármacos inductores y/o inhibidores del

NO en el NTS ante un estímulo anóxico en los RSCC, modificará el reflejo

hiperglucémico con retención de glucosa por el SNC; induciendo cambios

en la expresión dede manera diferencial este núcleo, e indicando la

participación de mecanismos nitroxidérgicos en la homeostasis de la

glucosa?

de la activación de los barorreceptores carotídeos puede participar en la expresión

de c-fos vía fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta del AMP cíclico

(CREB) en un proceso que involucra a la cascada de señales: guanilato ciclasa

soluble/GMP cíclico/proteína kinasa dependiente de GMP cíclico (sGC/cGMP/PKG-I). En

otros trabajos se encuentra que la activación de los barorreceptores carotídeos induce la

síntesis de Fos en el NTS (Chan y Sawchenko, 1998; Chan y col., 1998) el sitio principal

de las aferencias baro (Ciriello, 1983) y quimiorreceptoras (Finley y Katz, 1992). El factor

de transcripción celular, Fos, es la proteína producto del gen temprano inmediato, c-fos.

La inducción de la expresión del Fos representa un evento intracelular temprano que lleva

a una modulación inhibitoria de la respuesta refleja barorreceptora a largo plazo (Shih y

col., 1996; Chan y col., 1997). La cascada de señalización celular iniciada por las

aferencias barorreceptoras empieza con la activación de los receptores del glutamato en

NTS (Chan y col., 1998b), termina con la activación del CRE en la región promotora del c-

fos por la fosforilación del CREB (pCREB) (Chan y col., 1999). Estudios previos

muestran que el NO, es sintetizado a partir de la L-arginina en el SNC y en otros tejidos

como células endoteliales y macrófagos. El NO juega un papel fisiológico en la

comunicación transcelular facilitando la formación de GMPc en células adyacentes a

través de la activación de la guanilato ciclasa soluble (GC) (Lo, Jan, Wu, Tseng, 1998). El

NO es una molécula gaseosa que juega un papel importante en la regulación cardiovascular

central ya que ha sido reportado que la vía de señalización cGMP/PKG está involucrada en

la regulación de la expresión del c-fos en neuronas del NTS (Haby y col., 1994). En el

NTS el NO induce hipotensión y bradicardía (Tseng y col., 1996; Lin y col., 1999; Paton y

col., 2001) y participa en la respuesta cardiovascular inducida por la activación de los

receptores al glutamato (Lin y col., 1999).

La Calcio/calmodulina también activa a la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) (Bredt

and Snyder,

1990) para producir NO en el NTS después de la activación de los

barorreceptores carotídeos, con la expresión del c-fos via fosforilación del CREB de

manera dependiente de sGC/cGMP/PKG. Chan y col., 2004 demuestran que el NO

derivado del nNOS regula la inducción inmediata del gen temprano c-fos en el NTS

después de la estimulación barorreceptora. En otros trabajos encuentran que durante y

después de la oclusión bilateral de la arteria carótida común provoca liberación de NO en

el NTS e incremento en la presión arterial sistémica (Wu y Chai, 2004). Por el contrario,

Lo y col., (1998) reportan que la microinyección unilateral de L-arginina (donador de NO)

en el NTS producen un decremento en la presión arterial media y en la frecuencia cardiaca

en ratas anestesiadas.

Tagawa y col. (1994) demuestran que el NO incrementa la actividad de neuronas

adyacentes en el NTS a través de un incremento de GMPc. Además, Shuai y Xie

(2004), encuentran una relación entre la producción de NO y de la expresión de c-

fos en el NTS y otras estructuras del SNC. Estos antecedentes refuerzan la idea

de que un estímulo de los quimiorreceptores carotídeos provoca un aumento en la

liberación de NO y de la expresión de c-fos por el NTS modificando la

homeostasis de la glucosa. Por lo tanto, el objetivo de este proyecto es conocer

la participación del NO en el NTS sobre el reflejo hiperglucemiante y la retención

de glucosa cerebral después de la estimulación de los RSCC en ratas.

JUSTIFICACIÓN

los anterioresa tesisa, con objeto deExisten trabajos que encuentran un efecto

modulador de la respuesta cardiovascular y respiratoria del NO en el NTS después de

la estimulación de los baro y quimiorreceptores carotídeosde los mecanismos que

regulan las fuentes de energía en el SNC, y será importante para orientarnos en las

estrategias que se tomarán en las enfermedades con alteraciones de glucosa y en los

síndromes de hipoxia cerebral.

HIPÓTESIS GENERAL

El NO en el NTS modula la expresión del gen c-fos, el reflejo hiperglucemiante y el

aumento en la retención de glucosa cerebral después de la estimulación de los

quimiorreceptores carotídeos con NaCN en ratas.

HIPÓTESIS ESTADÍSTICAS.

Hipótesis alterna:

El NO en el NTS modula la expresión del gen c-fos, el reflejo hiperglucemiante y la

retención de glucosa cerebral después de la estimulación de los RCC con NaCN.

Hipótesis nula:

El NO en el NTS no influye en la modulación de la expresión del gen c-fos, en el reflejo

hiperglucemiante ni en el aumento en la retención de glucosa cerebral después de la

estimulación de los RCC con NaCN.

OBJETIVO GENERAL

Estudiar el papel del NO en el NTS sobre la expresión del gen c-fos, el reflejo

hiperglucemiante y la retención de glucosa por el cerebro después de la estimulación de los

receptores del cuerpo carotídeo con NaCN.

Oobjetivo específicos

:

Cuantificar los niveles de glucosa en plasma, la retención de glucosa cerebral y la

expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección de LCRa en NTS y estimulación de los

RSCC con NaCN.


expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección de un donador de NO, Nitroprusiato de

sodio (NPS), en NTS y estimulación de los RSCC con NaCN.


expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección del inhibidor de la NOS, N-nitro-L-

arginina metil ester (L-NAME), en NTS y estimulación de los RSCC con NaCN.

MATERIAL Y METODOS

Diseño de estudio: Experimental

Universo de estudio: Ratas Wistar. Actualmente uno de los animales de mayor

preferencia para las intervenciones quirúrgicas complejas es la rata. Además, se utiliza

esta especie porque son fácilmente manipulables, por su alta capacidad de reproducción y

por su semejanza en sus aparatos y sistemas con los humanos (Chousleb y col., 1997)

Tamaño muestral: Mediante la fórmula para medias de muestras independientes se

consideró un tamaño muestral de 6 ratas para cada grupo, considerando estudios previos

que evaluaron la actividad del NO en el NTS .

Criterios de selección:

Inclusión: ratas wistar de 280-300 g de peso, 4 meses de edad, mantenidas en condiciones

de luz-obscuridad 12h/12h, a temperatura de 24o C y en ayuno de 12h antes del

experimento.

No inclusión: Los que no cumplan los criterios de inclusión

Eliminación: Ratas que se desangren, niveles basales de glucosa mayores de 150 mg/dl,

que el sitio de la inyección no esté en el NTS, que no esté bien regulada la respiración o

que el procedimiento quirúrgico no sea el adecuado.

Variables:

Independiente:

La aplicación de drogas en el NTS y la estimulación de los RSCC.

Clasificación de la variable independiente por su naturaleza, escala de medición:

Cualitativa, nominal.

Operacionalización de la variable independiente

Las inyecciones de LCRa, NPS y L-NAME en NTS y la inyección de NaCN en el seno

carotídeo circulatoriamente aislado.

Dependiente:

La expresión de c-fos, la respuesta glucémica y la retención de glucosa por cerebro

Clasificación de la variable por su naturaleza, escala de medición:

Cuantitativa, continua.

Operacionalización de la variable

Es la cantidad de glucosa circulante en la sangre arterial y venosa, así como su retención

por el cerebro, en ratas sometidas al estudio experimental. La unidad de medición será

mg/dL. La retención de glucosa por cerebro se determinará de manera indirecta, tomando

como referencia las diferencias de glucosa en la arteria femoral (como indicador de la

glucosa que entra al cerebro) y en el seno yugular (como indicador de la glucosa que sale

del cerebro). Respecto al c-fos, se considerará inmunoreactividad positiva, la aparición de

núcleos con marcas fluorescentes correspondientes a la presencia del anticuerpo unido a c-

fos. El promedio de células positivas a c-fos será registrado como el resultado para cada

grupo experimental y control.

Animales y procedimientos quirúrgicos:

Los experimentos se realizarán en ratas Wistar de 250-300 g de peso (se consideró un

tamaño muestral de 6 ratas para cada grupo, considerando los estudios previos que

evaluaron la actividad del NO en el NTS, mantenidas en condiciones de luz-obscuridad

12h/12h, a temperatura de 24 oC, en ayuno de 12h con libre acceso a agua.Todos los

procedimientos experimentales se llevarán a cabo de acuerdo a la Guía para el Cuidado y

Uso de Animales de Laboratorio (National Research Council, 1997). Las ratas se

anestesiarán con pentobarbital sódico (3 mg/ml) por vía intraperitoneal. El nivel de

anestesia se mantendrá constante durante todo el experimento, por goteo i.p. continuo del

anestésico diluido en solución salina (63 mg/100 mL), es decir 0.063 mg/min. La

profundidad de la anestesia se vigilará mediante el reflejo palpebral. Bajo estas

condiciones no se observan reacciones dolorosas pero se conserva el reflejo palpebral.

Las ratas se ventilarán artificialmente con un respirador Ugo Basile (Stoelting) conectado

a una cánula endotraqueal (intubación por vía bucal), con frecuencia de 50

respiraciones/min y presión positiva hasta evitar los movimientos respiratorios

espontáneos de la rata. La temperatura se mantendrá constante a 37oC por medio de un

cojín eléctrico (Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-Buylla, 1988).

El seno carotídeo izquierdo se aislará temporalmente de la circulación (preparación

de seno carotídeo aislado) (Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-Buylla, 1975, 1994) durante

las inyecciones de cianuro de sodio al seno. Tanto la carótida externa (por encima de la

arteria lingual) como la carótida interna izquierda (cerca del foramen yugular) se ocluirán

temporalmente (40 s) durante las inyecciones de NaCN para evitar su paso a la circulación

cefálica y/o circulación general. Serían necesarios más de 5 min para producir isquemia

cerebral (Wu y col., 2003). Con esta técnica únicamente el área del seno-cuerpo carotídeo

izquierdo queda expuesta al cianuro. 8La estimulación quimiorreceptora se efectuará

inyectando lentamente cianuro (5 µg/100 g en 0.25 ml de sol. salina) a través de una aguja

del No 27, con objeto de evitar la estimulación barorreceptora (Álvarez-Buylla, 1954).

Para las inyecciones en NTS:

Se fijará la cabeza de la rata en un aparato estereotáxico (Stoelting), se realizará una

craneotomía occipital por donde se introducirá una cánula de vidrio preparada por

estiramiento de un tubo especial (Microcaps 0.7 mm) o una aguja de 200 µm 8de diámetro

conectada a una microjeringa (Hamilton, de 0.1 a 0.5 µl) para las inyecciones de las drogas

en un volumen de 200 nL durante 20-30 s (Montero y col., 2000) para la inyección de los

donadores e inhibidores del NO (Yarkov y col., 1994), siguiendo las coordenadas

adecuadas del atlas (Paxinos y Watson,1986) para NTS. Las inyecciones se realizarán con

microjeringas de 1-10 µl (Microliter 800 Sigma). Para verificar el lugar de las inyecciones

en NTS, después de obtener la última muestra de sangre o LCR, se inyectará azul de

metileno. Una vez terminados los experimentos las ratas se decapitarán para extraer los

cerebros. Se sacrificarán las ratas por decapitación con guillotina (Waynforth y Flecknell,

1992), removiendo los cerebros que se congelarán en ultracongelador (Revco) para

después realizar los cortes en criomicrotomo (Leica), en secciones coronales de 40 µm

para verificar histológicamente el lugar de la inyección (Bures y col., 1983).

8

Administración de donadores e inhibidores del NO en NTS:

Las drogas que utilizaremos son nitroprusiato de sodio (Sigma), L-arginina (Sigma), L-

NAME (N-nitro-L-arginina metil ester, Sigma); Las drogas estarán disueltas en 200 nL de

líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) (Yarkov y col., 1994). En los experimentos control

se inyectará solamente LCRa (NaCl 145 mM, KCl 2.7 mM, MgCl2 1.0 mM, CaCl2 1.2 mM,

ascorbato 2mM, NaH2PO4 2mM, pH 7.3-7.4, J.T. Baker y Hycel). El LCRa se preparará

cada 48 horas y se conservará en refrigeración.

En los experimentos control se inyectará LCRa solo.

Obtención de muestras de sangre para análisis de glucosa.

Se obtendrán muestras de sangre arterial (arteria femoral) y venosa del cerebro (seno

yugular) por medio de catéteres permanentes en estos vasos (tubo de polietileno, Clay

Adams PE-10, y tubo de silastic, Dow Corning 602-135) sin interrumpir la circulación

normal en los vasos 8(Álvarez-Buylla y Bencosme, 1981). Al final de cada experimento

se verificará la posición correcta de los catéteres. Después de una muestra basal, el tiempo

de colección de sangre será a los 5, 10, 20 y 30 min después de la estimulación de los

RSCC en ratas con previa inyección de drogas en NTS. Las muestras de sangre se

centrifugarán en centrífuga refrigerada a 3000 xg durante 5 min y se guardarán a -70 °C

hasta su análisis. La concentración de glucosa en plasma se determinará por el método de

glucosa-oxidasa (analizador Beckman). Para la determinación c-fos, se harán cortes del

NTS, se incubarán con antisuero policlonal anti-c-fos, a una dilución de 1:4000, durante

una hora a 4 °C en cámara húmeda. Después de quitar el exceso de anticuerpo no unido,

lavando con un buffer, se incubará con un anticuerpo secundario marcado con fitc durante

30 min a 4 ° en cámara húmeda y en obscuridad. Una laminilla de corte histológico similar

se utilizará como control negativo, incubando sólo con suero normal de cabra. Se

considerará inmunoreactividad positiva, la aparición de núcleos con marcas fluorescentes

correspondientes a la presencia del anticuerpo unido a c-fos. El promedio de células

positivas a c-fos será registrado como el resultado para cada grupo experimental y control.

Inmunohistoquímica para detección de c-fos OJO CUAL DE LAS DOS TECNICAS

Cinco min después de concluir, cinco min después,9 L s Fos-ir positivas

manualmenteobservadores (Brunton, Meddle, Ma, Ochedalski, Douglas y Russell,

2005); la diferencia en el conteo realizado por los dos observadores no fue

estadísticamente significativa (P>0.05, t de Student) f4

9

)protocolo experimental:

Después de tomar una basal, el tiempo de colección de sangre será a los 5, 10, 20,

30 min. después la administración de las drogas en el NTS o de la estimulación RCC. Las

muestras de sangre se centrifugarán a 3000 g durante 5 min para determinar la

concentración de glucosa en plasma por el método de glucosa-oxidasa en un analizador de

glucosa (Beckman). Y se realizará inmunocitoquìmica para determinar expresión del gen

c-fos.

Experimento No. 1


expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección de LCRa en NTS y estimulación de los

RSCC con NaCN.

Experimento No.2


expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección de un donador de NO, Nitroprusiato de

sodio (NPS), en NTS y estimulación de los RSCC con NaCN.

Experimento No.3


expresión de c-fos en NTS en ratas con inyección del inhibidor de la NOS, N-nitro-L-

arginina metil ester (L-NAME), en NTS y estimulación de los RSCC con NaCN.

Fig. 5. Diseño experimental. A) Se aisló temporalmente el seno carotídeo de la

circulación general durante las inyecciones de NaCN, para estimular los quimiorreceptores

carotídeos. Las tomas de sangre se obtendrán del seno yugular (venosa encefálica) y la

arteria femoral (arterial). B) Se introducirá una cánula en NTS (estereotáxico) para hacer

las microinyecciones de sustancias químicas.

análisis estadístico:Se utilizó las pruebas t de Student (t-pareada) para

medir los cambios en las concentraciones de glucosaexpresadas en promedios,

desviación estándar y porcentajes. La comparación de entre los grupos se realizará

con ANOVA o Kruskall-Wallis, así comopara comparar los promedios antes y

después de la aplicación de las drogass; la misma prueba se utilizó para

comparar el conteo de las célula positivas a la proteína Fos realizado por

dos observadoresSe utilizó la prueba de de una vía y medidas repetidaso de

Wilcoxon según se requiera. phacer y para analizar las diferencias en laEl

intervalo de confianza que se utilizará será del 95% y se considerará significancia

estadística cuando P<0.05.(Brunton y col., 2005). y la

-10 0 10 20 30

0

10

20

30

40

80

100

120

140

160

180

200

*

***

*

***

**B

*

*NaCN(SC)

LCRa(NTS)

30201050BASAL

RE

TE

NC

IÓN

(m

g/d

L)

G

LU

CE

MIA

(m

g/d

L)

MIN

a

v

a-v

10, t-pareada, t-pareada10, t-pareada

10promedios, t-pareada, t-pareada11, t-pareada1, t-pareada11

-10 0 10 20 30

0

10

20

30

40

80

100

120

140

160

180

200

****

***

B

30201050BASAL

RE

TEN

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N (m

g/dL

)

G

LUC

EM

IA (m

g/dL

)

NaCN(SC)NPS(NTS)

*

MIN

a

v

a-v

1promedios2, t-pareada, t-pareada2

2promedios33 de medidas repetidas, 2 grupos3de medidas repetidas, 2 grupos3

3 promedios de medidas repetidas.

trabajoun incremento significativo en la en estas ratas, en comparación con las

ratas del grupo control que sólo recibieron LCRa (P = 0.050, ANOVA de una vía

para muestras independientes); a los 40 min (tiempo transcurrido entre la

-10 0 10 20 30

0

10

20

30

40

80

100

120

140

160

180

200B

*

30201050BASAL

NaCN (SC)

RE

TEN

CIÓ

N (m

g/dL

)

GLU

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(mg/

dL)

MINUTOS

LCRa

NPS

L-NAME

LCRa

NPS

L-NAME

-10 0 10 20 30

0

10

20

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100

120

140

160

180

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*

*

*

*

***

B

30201050BASAL

L-NAME(NTS)

NaCN(SC)

RE

TE

NC

IÓN

(m

g/d

L)

G

LU

CE

MIA

(m

g/d

L)

MIN

a

v

a-v

estimulación RSCC y el inicio de la perfusión con la solución de

paraformaldehido)de la estimulación; [] (P = 0.000001 ANOVA, de una vía para

muestras independientes) con la obtenida(P =0.00000000003 ANOVA, de una vía

para muestras independientes)

45

4

2 4 6 8 10121416

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

*0.001

0.05

*NaCN

SC

400-10

NÚ

MM

ER

O D

E C

ÉL

UL

AS

FO

S P

OS

ITIV

AS

EN

EL

NT

S

MIN

LCRa

NPS

L-NAME

NTS

5promedios con LCRa+ P<0.05 con NPS, de una vía.

En esta tesis se analizó la interacción de las vías nitroxidérgicas en el NTS con los

cambios en la homeostasis de la glucosa después de estimular los RSCC con

NaCN. En estas condiciones, se determinó la expresión de la proteína Fos-ir en el

NTS. como un indicador de la actividad neuronal que tiene lugar en dicho núcleo

durante las distintas variables experimentales. aguda con fármacos que inhiben

todas las isoformas de la NOS, como el L-NAME, npor aumento en la resistencia a

la insulina y de su ante una carga de glucosa o arginina se deben cambios en las

concentraciones de catecolaminas circulantes, sino a vías centrales eferentes,

como serían las vías nitroxidérgicas secundarias a la nNOS Uemura, Tamagawa,

Chen, Maeda, Yoshioka, Ito, Miura, Iguchi y Hotta, 1997; 10113en experimentos in

vitro elevandodirecto in vivocomo señalábamos antes, estudios anteriores indican

que el bloqueo de todas las NOS por el L-NAME i.p. durante cuatro días aumenta

los niveles de glucosa plasmática en ratas hipertensas por encima del incremento

observado en ratas normotensas, a pesar de que los niveles de insulina en sangre

son semejantes en ambos grupos de ratas; indicando que el NO juega un papel en

la homeostasis de la glucosa compensando los niveles de este carbohidrato (Lyla

estimulación de los RSCC con NaCN; efecto debido, probablemente, al efecto

vasodilatador del NO derivado del NPS, con un incremento en el aporte de

oxígeno al NTS y disminución del estrés metabólico ocasionado por el cianuro en

el seno carotídeo (Schwenke, Bolter y Cragg) con la consecuente disminución de

la actividad neuronal. Es decir, el efecto vasodilatador del NPS contrarresta el

efecto anóxico del cianuro.

E210deduceExperimentos anteriores indican atenúa los reflejos baro y

cardiopulmonares sugiriendo la participación de NO como un neuromodulador

fisiológico importante en la función cardiovascular. 2;a

,L,importanteien el NTS de este núcleo

.

significativasos-ir -ir,con la participación de la vasopresina, en respuesta a un

estímulo hipóxico o hipoglucémico de los es carotídeos Con los resultados

obtenidos hasta ahora se propone un modelo de trabajo que permitirá continuar el

estudio de la homeostasis de la glucosa (fig. 16). Lsustancial .

Fig. 16. Esquema tentativo que propone las vías que participarían en la regulación glucémica.

analizar la participación del NO en el reflejo hiperglucémico con retención de

glucosa por el cerebro en ratas normales sometidas a ejercicio, y en ratas obesas.

El ode , proporcionará datos adicionales para identificar las vías del SNC que

participan en la homeostasis glucémica

CRONOGRAMA DE TRABAJO:

2005

2006

2007

Actividades En Fe Mz Ab Ma Ju Jul Ag Se Oc No DI En Fe Mz Ab Ma Ju Jul Ag Se Oc No Di En Fe

Revisión

Bibliográfica

☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼

Elaboración

Anteproyecto

☼ ☼ ☼

Correcciones

Anteproyecto

☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼

Realización

Experimentos

☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼

Obtención

datos prelim.

☼ ☼ ☼ ☼

Análisis de

datos

☼ ☼ ☼

Conclusiones ☼

Escritura de

tesis

☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼ ☼

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▓ Realizado

☼ Programado

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