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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AGROPECUARIAS Influencia del fósforo sobre la colonización y producción de esporas de hongos micorrízicos vesículo-arbusculares en tres hospederos a diferentes tiempos de desarrollo TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRÍA EN BIOLOGÍA DE LA PRODUCCIÓN ESPECIALIDAD EN MICROBIOLOGÍA PRESENTA: Salvador Guzmán González TECOMAN, COLIMA ASESORES: DRA. MARÍA VALDÉS DR. LUIS FELIPE BOJALIL JABER DR. MIGUEL ARENAS VARGAS AGOSTO DE 1991
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UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AGROPECUARIAS
Influencia del fósforo sobre la colonización y producción de esporasde hongos micorrízicos vesículo-arbusculares en tres hospederos a
diferentes tiempos de desarrollo
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRÍA EN BIOLOGÍA DE LA PRODUCCIÓNESPECIALIDAD EN MICROBIOLOGÍA
PRESENTA:
Salvador Guzmán González
TECOMAN, COLIMA
ASESORES:DRA. MARÍA VALDÉS
DR. LUIS FELIPE BOJALIL JABERDR. MIGUEL ARENAS VARGAS
AGOSTO DE 1991
CONTENIDO
LISTA DE CUADROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l
RESUMEN .................................................................................................. ii
1. INTRODUCCION ...................................................................................... 1
II. REVISION DE LITERATURA .................................. ................................. 6
2.1 Productividad agrícola de los suelos .......................................................... 6
2.1.1 Situación mundial ..........................................................................
2.1.2 Situación en México ....................................................................... 7
2.1.3 Situación en el Estado .................................................................... .
2.2 Necesidades de investigación .................................................................. 9
2.2.1 Alternativas ................................................................................ 9
2.2.2 Investigación biológica en México .................................................... 10
2.3 Las micorrizas .................................................................................. 1 0
2.3.1 Clasificación .............................................................................. 10
2.3.2 Hospederos ................................................................................ l l
2.4 La micorriza vesículo arbuscular .............................................................. 1 1
2.4.1 Distribución geográfica .................................................................. l l
2.4.2 Hospederos ............................................................................... l l
2.4.3 2.4.3 Presencia en el país .............................................................. 1 2
2.4.4 Beneficios .................................................................................. 1 2
2.4.5 Limitantes de la utilización .............................................................. 1 2
2.4.6 Limitantes del desarrollo ................................................................ .13
2.4.7 Relación con hospederos ................................................................ .13
2.4.8 Relación con el fósforo ................................................................... 1 4
2.4.8.1 Colonización ......................................................................... 1 4
2.4.8.2 Esporas ............................................................................... 1 6
2.4.9 Estudios en el país ....................................................................... .176.
2.4.9.1 Nivel nacional ........................................................................ 1 7
2.4.9.2 Nivel estatal .......................................................................... 1 7
III. MATERIALES Y METODOS .................................................................... 1 8
3.1 Lugar de realización ............................................................................. 18
3.2 Suelo .............................................................................................. 1 8
3.3 Inóculo ........................................................................................... .18 o
3.4 Hospederos ...................................................................................... .19
3.5 Inoculación ....................................................................................... 1 9
3 .6 Condiciones experimentales .................................................................. .20
3.7 Medición de variables ........................................................................... 20
3.8 Análisis de datos ................................................................................. 2 2
IV. RESULTADOS
4.1 Condiciones ambientales ....................................................................... 23
4.2 Efecto de factores de estudio .................................................................. 23
4.2 Colonización micorrízica ..................................................................... ..2 3
4.3 Producción de esporas ........................................................................ ..2 6
4 .4 Fósforo en la planta ........................................................................... ..2 7
4.5 Peso de raíces .................................................................................... 28.
4.6 Materia seca ...................................................................................... 28
V. DISCUSIONES ....................................................................................... 2 9
4.1 Colonización micorrízica ....................................................................... 2 9
4.2 Producción de esporas ......................................................................... .30
4.3 Fósforo en la planta ............................................................................. 3 1
4.4 Peso de raíces ................................................................................... .32
VI. CONCLUSIONES .................................................................................. 33
VII. LITERATURA CITADA ......................................................................... 34
,
* LISTA DE CUADROS
1.- Características químicas del suelo empleado y de la mezcla suelo-arena con las ‘adiciones
de fósforo (PzOs) en mg/kg de sustrato.
2.- Composición de la solución de nutrientes Hoagland en un litro de agua destilada (Elias y
Safir, 1987).
3a.- Análisis de varianza de la colonización micorrízica y número de esporas en plantas de
cuatro edades de desarrollo en suelos con adición de niveles de fósforo soluble. Análisis
con datos originales y transformados.
3b.- Análisis de varianza del contenido de fósforo en los tejidos, peso de raíz y materia seca en
plantas de cuatro tiempos de desarrollo en suelos con adición de niveles de fósforo
soluble. Análisis con datos originales y transformados.
4.- Porcentaje de colonización micorrízica en tres especies de plantas de tiempos diferentes de
desarrollo en suelos con adición de niveles de fósforo soluble e inoculadas con hongos
MVA.
5.- Número de esporas en diez gramos de suelo seco de tres especies de plantas en cuatro
tiempos de desarrollo, inoculadas con hongos MVA.
6..- Porcentaje de fósforo en la parte aérea de tres especies de plantas desarrolladas en suelos
con adición de cinco niveles de fósforo e inoculadas con hongos MVA.
7.- Porcentaje de fósforo en la parte aérea de tres especies de plantas en cuatro tiempos de
desarrollo e inoculadas con hongos MVA.
i
8.- Peso fresco de raíces (gramos por recipiente) de tres especies de plåntas en cuatro tiempos
de desarrollo e inoculadas con hongos MVA.
.9.- Porcentaje de materia seca de tres especies de plantas en cuatro tiempos de desarrollo,
inoculadas con hongos MVA.
ii
RESUMEN
Con el objeto de conocer el potencial de algunas especies de plantas propias de la región como.
productoras de hongos nativos micorrízicos vesículo-arbuscular, se probaron plantas de frijol
(Phaseolus vulgaris), sorgo (Sorghum vulgaris) y grama (Cynodon dactylon), en suelos con
adiciones de fósforo (P) a razón de 0, 25, 50, 100 y 200 mg/kg de suelo y cosechadas a 4, 6, 8
y 10 semanas después de la siembra. Yemas de grama, semillas de frijol y sorgo fueron
sembradas en recipientes de 1 litro con mezcla de suelo-arena (12 w/w) estéril tratados con P
y colocando el inóculo de 2 a 3 cm bajo el material sembrado. Las plantas fueron colocadas en
sombreadero al 30% y regadas diariamente, adicionando 15 ml de solución nutritiva cada
semana. La colonización micorrízica fue afectada por la interacción triple del hospedero,
fósforo y tiempo de cosecha, siendo la grama, la especie de planta que mostró el mejor
resultado al nivel de 50 mg de P/kg de suelo a las 8 semanas después de la siembra. La
esporulación sólo fue alterada por el tiempo de cosecha, obteniendo el sorgo el mejor número
de esporas/g de suelo seco, en la loa. semana. La concentración de P en la planta aumentó con
las adiciones al suelo, pero disminuyó en relación al tiempo de desarrollo de la planta. La
colonización micorrízica-VA fue relacionada negativamente con la concentración de P en la
planta para niveles mayores de 50 mg de P adicionado al suelo.
1 INTRODUCCION
Considerando las condiciones de luz y temperatura, los trópicos tienen el potencial más
grande paro la producción de cultivos, sin embargo en extensas áreas el crecimiento de las
plantas es limitado por la escasez del agua y problemas relacionados al suelo, como
deficiencias de nutrientes (N, P, K, Ca, Zn y B), toxicidad por otros elementos (Al, Mn) y alta
capacidad de fijación del fósforo (99). Bajo estas condiciones tropicales y en la necesidad de
producir los alimentos, surge como una alternativa la evaluación y uso de agentes biológicos
existentes en la rizosfera de todas las plantas.
La rizosfera, es el micrositio de interacciones frecuentemente mutualísticas entre las
raíces vivas de las plantas y los microorganismos de suelo. El sitio puede ser, dentro de la raíz,
entre la fase raíz-suelo y dentro el volumen del suelo próximo a la raíz, donde se desarrolla el
fenómeno de transferencia de substratos y circulación de elementos.
Una de las asociaciones simbióticas de raíces de plantas con microorganismos del
suelo, es la de algunos hongos de la clase Zygomicetes que se distribuyen ampliamente en
zonas áridas y semiáridas,la cual es conocida como micorriza vesículo arbuscular (MVA) y
juega un papel de suma importancia en la productividad de los suelos tropicales.
Estos simbiontes MVA, que se caracterizan por sus estructuras vesiculares y
arbusculares a nivel inter e intracelular (14) se presentan en la mayoría de las- especies
agronómicas, generalmente en las familias de cultivos principales, Leguminoseae y
Gramineae, excepto las Cruciferae.
La amplia gama de hospederos de MVA y su particular distribución de suelos arenosos
de los trópicos seco,s, ha determinado que este simbionte reciba una gran atención por los
múltiples beneficios que se han observado, como son: mejorar el crecimiento de las plantas,
incrementar la absorción de nutrientes (N, P, .?n, Cu), incrementar la tolerancia al estrés
hídrico. a suelos salinos y a metales tóxicos pesados, además mejora suelos disturbados y
reduce el efecto del trasplante y las infecciones por nematodos.
Desafortunadamente, uno de los principales obstáculos de la aplicación extksiva de
hongos MVA es el hecho de que son simbiontes obligados, razón por la cual, el método más
común para el crecimiento de este hongo, es la técnica de cultivos en maceta sobre hospederos
susceptibles bajo, condiciones asépticas de invernadero, la que proporciona inóculo
constituido a base de las raíces infectas y suelo infectado con micelio extramatrical y esporas;
sin embargo el producto obtenido es disponible a un grado muy limitado en la agricultura.
Por otro lado, el desarrollo de la infección y la producción de esporas es seriamente
limitada por diversos factores, tales como temperatura luz, nutrientes y otros factores edáficos
y ambientales.
En relación a los nutrientes, la concentración de fósforo (P205) en el suelo es el
principal factor que limita la producción de propágulos infectivos de los hongos MVA; esto ha
sido ampliamente demostrado en diversos estudios de invernadero y campo, cuyos
incrementos en las concentraciones de este elemento normalmente causan la disminución del
porcentaje de colonización y la esporulación de este simbionte.
También la especie y la edad del hospedero tienen una relación muy estrecha con
colonización micorrízica y producción de esporas; debido a que las características
morfológicas y extensión linear de las sistemas radiculares juegan un papel fundamental en la
relación hospedero-parásito (52); se dice que plantas con pobre sistema radicular (cebolla,
papa) o con elevadas demandas de fósforo (leguminosas) son las que responden mejor a la
micorrización. Por otro lado se ha observado que el máximo desarrollo de la colonización
micorrízica ocurre,en la etapa de transición de la fase vegetativa y la fase reproductiva de la
planta (11).
2
Por lo tanto, conociendo los diversos beneficios que se obtienen de estos simbiontes,
presentes en el estado de Colima por las características de región tropical, es necesario
reproducirlos en volúmenes deseados y obtener inóculo disponible para inve:tigaciones
posteriores, sin embargo, como existen factores que limitan la colonización y producción de
esporas, se requiere hacer una evaluación de hospederos de la región bajo diversas condiciones
del sustrato y el ambiente, para seleccionar el que maximice la producción de inóculo, razón
por la cual , este estudio partió de las suposiciones siguientes:
1.- Las plantas de sorgo (Sorahum vulnare), frijol (Phaseolus vulgaris) y grama
[Cvnodon dactvlon) son altamente susceptibles a la infección micorrízica vesículo-arbuscular
y eficientes productoras de esporas
2.- La colonización micorrízica vesículo-arbuscular y producción de esporas en plantas
de sorgo, frijol y grama es limitada por las concentraciones de fósforo soluble en el suelo.
3.- El tiempo de desarrollo de las plantas de sorgo frijol y grama influye sobre la
colonización micorrízica y producción de esporas.
Para probar dichas hipótesis se plantearon los siguientes objetivos:
l.- Evaluar la colonización micorrízica y producción de esporas en plantas de sorgo
(Sorghum vulgare), frijol (Phaseolus vulgaris) y grama (Cynodon dactylon).
2.- Determinar la colonización micorrízica y producción de esporas de plantas de
sorgo, frijol y grama cultivadas en suelos con adiciones de 0, 25, 50, 100 y 200 mg de
fósforo/kg de suelo.
3.- Determinar la colonización micorrízica y producción de esporas de plantas de
<sorgo, frijol y grama a las 4,6, 8 y 10 semanas después de la siembra.
En la realización del experimento se empleó como sustrato una mezcla estéril de suelo
arena en la relación 1:2 (w/w), colocada a razón de 1.2 kg en recipientes de plástico de 1 litro
de volumen. Los niveles de fósforo (P205) a utilizar: 0,25, 50,100 y 200 mg/kg de s+rstrato, se
mezclaron uniformemente en las macetas correspondientes. Para ello se adicionó superfosfato
de calcio triple (46% P205) molido.
La inoculación se realizó colocando una capa de 1OOg de suelo con esporas y raíces
infectadas a una profundidad de 2 a 3 cm. por debajo de la semillas o estolones empleados en
la siembra de los hospederos (frijol, sorgo y grama).
El ensayo se llevó a cabo bajo sombra (30%) con arreglo de tratamientos en bloques al
azar con 4 repeticiones. El riego se realizó diariamente y cada 8 días se aplicó al suelo 15 ml
de solución nutritiva Hoagland.
Las plantas se cosecharon a las 4, 6, 8 y 10 semanas después de la siembra; en cada
ocasión se determinó el porcentaje de colonización micorrízica, la cantidad de esporas por
grama de suelo seco, el peso fresco de las raíces, y el porcentaje de fósforo en la parte aérea de
la planta y de materia seca.
Los datos obtenidos fueron sometidos a la técnica de análisis de varianza con 4 factores
e interacciones de primero y segundo orden, así como prueba de medias Tukey al 5% de error.
La colonización micorrízica fue influenciada por la interacción entre el hospedero,
nivel de fósforo adicionado y el desarrollo de la planta. La medias máximas del porcentaje de
colonización fue igual para las tres hospederos (Tukey P < 0.05), sin embargo el valor mas alto
se presentó en la grama (9 1.73%), a diferencia del sorgo y frijol con medias menores a 62%.
La diferencia entre hospederos se estableció en el tiempo para obtener ,el máximo grado de
colonización; para el frijol fue a la sexta semana, mientras que para el sorgo y la grama ocurrió
a Ja décima semana.
4
.En relación al fósforo adicionado, en el frijol y sorgo la MVA se comportó igual para
todos los niveles dentro de una misma edad de la planta y para la grama a niveles menores de
200 mg, aunque para el frijol y el sorgo se presentó la máxima colonización a 25 mg y para la
grama a 50 mg.
La producción de esporas por 10 g de suelo seco solo fue afectada por la interacción del
hospedero con la edad de la planta. A la sexta y octava semana no existió diferencia entre
hospederos, pero a la décima semana el sorgo fue mejor (34.78 esporas/g de suelo) que el frijol
y la grama.
5
II kEVISION DE LITERATURA
2.1 Productividad agrícola de los suelos
2.1.1 Situación mundial
La apertura e intensificación de áreas de cultivo en el mundo, como una medida para
incrementar la producción agrícola, en un principio mostró resultados satisfactorios, logrando
que durante la década de los cincuentas aumentara a razón de 2/3, sin embargo en los años
sesenta el incremento fue de 1/2 y se prevé que la cifra bajará a 1/4 en los últimos decenios de
este siglo (29).
Estas maneras de la utilización del recurso suelo y principalmente los modos de manejo
del suelo, son sin duda, las causas de la disminución de la productividad agrícola, reportándose
la caída del área cultivada en un 7 % durante el presente decenio (15) debido principalmente
al abandono de las tierras gravemente erosionadas, la utilización de suelos cultivables para
fines no agrícolas y la creación de programas para conservación que no permiten la
explotación de áreas susceptibles a la erosión, como en los Estados Unidos de América.
Ese afán de aumentar la productividad agrícola mundial, mediante la apertura e
intensificación de áreas de cultivo, ha dado como resultado que los bosques desaparezcan en el
mundo a una tasa 1.2% anual con más de once millones de ha perdidas cada año, y la erosión
del suelo junto con la desertifícación lleguen a 50,000 km cuadrados anuales, además de la
salinización actual de cerca de 1 billón de ha debido al uso excesivo del agua subterránea para
riego, que las convierten en inútiles para la producción de cultivos (68).
Por otro lado, la introducción de la tecnología moderna en la intensificación agrícola,
ha ocasionado una fuerte dependencia de la utilización de insumos, tales como semillas
mejoradas, insecticidas, fungicidas, herbicidas y principalmente grandes cantidades de
fertilizantes químicos (82) para satisfacer las altas necesidades de las especies mejoradas y
obtener los mejores rendimientos en la producci& agrícola.
El grado de dependencia de los fertilizantes en el mundo, se refleja por el incremento
del uso de cerca de 7 millones de toneladas métricas (TM) en 1945 a 72 millones de TM en
1975. En relación al fósforo, los americanos utilizaron 4.9 millones de TM en 198 1 y,se estima
que en lo futuro este nutrimento vendría del medio oriente; además la demanda de los
cultivos en el mundo por nitrógeno..está proyectada-set-de -1.45 millones de TM para e!- año_
2000 (68).
Bajo estas premisas implicaría, para muchas naciones, problemas fuertes en su
estabilidad económica, debido a la multiplicación del precio de los fertilizantes por la gran
demanda en todo el mundo y al efecto que produciría en su balanza de pagos las importación
de estos productos (29).
2.1.2 Situación en México
En México, también se ha registrado una disminución en la productividad agrícola
debido a la forma de explotación irracional de los recursos naturales en las actividades
agropecuarias y forestales, resultado de ignorar y separar del proceso productivo y los costos
del abuso de dichos recursos. Tal omisión supone, en última instancia, el sacrificio del futuro a
costa del presente; el detrimento de procesos globales por la operatividad de fenómenos
locales y la supeditación de los intereses de la colectividad a los intereses particulares (110).
También en México, con el propósito de incrementar la producción agropecuaria, aunado a los*.incendios forestales y la expansión urbana; los habitats naturales han sido transformados a un
grado de 1.5 millones de ha de pérdida de vegetación natural al año; trayendo consigo efectos
irreversibles sobre los suelos agrícolas.
Una de las consecuencias más severas de la deforestación es propiciar la pérdida
edáfica, la cual tiende a ser mayor en los terrenos con fuertes pendientes, lluvias torrenciales y
suelos ligeros. Esta pérdida es irreversible y lesiona la potencialidad productiva, provocando
una disminución de los rendimientos y pudiendo llegar al grado de dejar los terrenos inútiles.
Así, se estima que del 30 al 40% del territorio s e encuentra severamente erosionado, en menos
.
del 35% la erosión es poco considerable y cerca del 20% no presenta problemas de erosión
(110).
La salinización de tierras, causada por la sobre explotación de los mantos acuíferos, es
otro de los efectos ecológicos que contrasta negativamente dentro de -la agricultura
especializada, llegando a afectar en 1983, 560,000 ha, mermando los rendimientos agrícolas
considerablemente.
También la contaminación de suelos y aguas constituye otro problema ambiental
sumamente serio que merece atención, tanto por el efecto sobre los microorganismos como en
el mismo hombre, sin embargo la agricultura actual depende estrechamente de los pesticidas y
fertilizantes. que son los principales causantes de dicha contaminación. Se reporta que en
México en 1949-I 950 se utilizaron 8000 toneladas de nutrientes, pero diez anos más tarde el
consumo ascendió a 170,000 toneladas, hasta alcanzar la cifra de 1’825,000 en 1982-83 (29).
Aunado a las alteraciones ecológicas propiciadas por la deforestación e intensificación
de áreas naturales, el régimen de precipitación limita seriamente el aprovechamiento del
18.76% (36.9 millones de ha) del área total de México que es apta para producir (IS), ya que
solo en el 34% de esta (12.54 m de ha), se dispone de una precipitación que va de 600 a 1500
mm anuales; lo que permite la presencia de condiciones favorables para la agricultura de
aceptables y altos rendimientos. En el resto del área, se tienen registros de 0 a 500 mm y de
más de 1500 mm que corresponden a un 50% y 16% respectivamente, lo cual hace incierta,
riesgosa o imposible la cosecha en el primer caso y difícil en el segundo, debido a los
problemas agudos de erosión y drenaje causados por las altas precipitaciones (18).
2.1.3 Situación en el estado
En relacióh al estado de Colima, también es preocupante el comportamiento de la
actividad agropecuaria y forestal, ya que esta proporciona los principales alimentos básicos
para el consumo popular, respecto a los demás sectores económicos, sin embargo, la
agricultura que es la más importante, ocupando el 32.82% (179,000 has.) de la superficie total
.
se encuentra seriamente afectada principalmente por la distribución de la precipitación pluvial,
fertilidad nativa de los suelos y el deterioro creciente de los recursos, vegetación, suelos y
aguas motivado por prácticas agronómicas inadecuadas (23,94).
El comportamiento de la precipitación en esta región tropical seca que es de 1000 mm
anuales en promedio, se caracteriza por que el 65% de la lluvia se presenta en los meses de
julio y septiembre, causando graves problemas en los campos agrícolas; no obstante la
precipitación es mas abundante en la zona Norte (Minatitlán, Comala y Cuauhtémoc) y Centro
(Colima, Coquimatlán, Villa de Alvarez e Ixtlahuacán) (93) con volúmenes mayores a los
1000 mm anuales; sin embargo en la zona Costa (Manzanillo, Armería y Tecomán) que es la
mayor superficie y la de los mejores suelos agrícolas del estado, el régimen de la precipitación
es muy errático (19) con un promedio de 760 mm anuales que limitan la producción frutícola y
la vida económica de las plantaciones (112).
La mayoría de los suelos que es de origen aluvial y presentan texturas muy variadas
con proporción abundante de arena y limo. Su productividad agrícola es limitada debido a su
bajo contenido de nitrógeno, y fósforo aprovechable y por los altos índices de potasio y calcio
(19). No obstante se considera que afecta en mayor proporción, el deterioro creciente de los
recursos naturales, vegetación, suelo y agua, inducido por prácticas agronómicas inadecuadas,
como las que se han mencionado anterior mente. Así se estima que el área ensalitrada en el
distrito de riego de “peñitas” ha llegado a 13,056 has., el 7.29% del área total agrícola en el
estado y con respecto a la erosión, el daño causado a un nivel moderado ascendió a 723.62
Km2, mientras que 1836.88 Km cuadrados tienen un nivel alto de erosión, significando una
lesión de 13.26 % y 33.67% de la superficie estatal respectivamente (110).
2.2 Necesidades de investigación
2.2.1 Alternativas*
Por todo lo anterior, es claro que, a pesar del potencial productivo en el mundo de los4.
ecosistemas tropicales, gracias al equilibrio resultante de su alta diversidad genética y
estructural; el incremento de la población humana no podría sobrevivir mediante el uso de la
tecnología moderna en la producción agrícola, si ello conduce a la disminución del inventario
de la productividad de los suelos (68).
Ante la problemática anterior, en muchos países, se ha venido desarrollando e
implementando la evaluación y el uso de agentes biológicos y materiales en ia producción de
bienes y servicios, como alternativa para incrementar el aprovechamiento de los recursos
naturales y mejorar la productividad de alimentos (37,43), con resultados alentadores.
2.2.2 Investigación biológica en México
En nuestro país, dentro del rubro agrícola, tienen gran relevancia las investigaciones
sobre la producción de fertilizantes orgánicos y biológicos, así como de insecticidas
microbianos, ya que representan líneas prioritarias para el país, tanto por orientarse a mejorar
la producción de cultivos, como a sustituir importaciones y disminuir la contaminación por el
empleo de insumos químicos (16. 17); además el mejoramiento genético de plantas, también
ocupa un renglón importante.
En relación a la producción de fertilizantes orgánicos y biológicos, es una de las
promesas que vendría a terminar con la dependencia de los fertilizantes químicos y con los
problemas que estos ocasionan en las tierras agrícolas. Razón por la cual la atención se ha
centrado en la búsqueda y estudio de microorganismos capaces de formar asociaciones
simbióticas mutualísticas con las plantas, de tal manera que fijen el nitrógeno y el fósforo en el
hospedero, como lo son, bacterias nitrificantes del género Rhizobium y los hongos
micorrízicos vesículo-arbusculares respectivamente (17).
2.3 las Micorrizas
2.3.1 Clasificación
Las micorr@as, son estructuras que resultan de una asociación simbiótica entre las
raíces de las plantas y de. hongos especializados que habitan en los suelos (49, 57, 90,). Estos
kmbiontes han sido originalmente agrupados en ecto, endo y ectoendomicorrizas, según el
tipo de estructuras formadas en el sistema hongo-raíz (75). Mientras el primer grupo, forma un
.manto que encierra las raíces y las hifas penetran entre las células de la raíz para formar una
red intercelular, conocida como “red de Harting”, las endomicorrizas no presentan el manto
hifal. pero las hifas penetran dentro de las células corticales de la ra’iz sin causar dañ? visible a
la raíz invadida. Las ectoendomicorrizas muestran características de los dos grupos descritos.
2.3.2 Hospederos
Con respecto a los hospederos, se menciona que alrededor del 95 % de las plantas del
mundo pertenecen a familias que son típicamente micorrizables (57, 62, ll 1) la excepción la
constituyen las familias Cruciferae (44): Chenopodiaceae (4) Fumariacea, Cyperaceae,
Commelianaceae, Urticaceae, Poligonaceae, que en general no forman ningún tipo de
asociación micorrízica (7, 54).
Alrededor del 80 % de las plantas que presentan la simbiosis en cuestión, forman el
tipo de asociación endomicorrízica conocida como micorriza vesículo-arbuscular (MVA)
reportándose en más de 200 familias y más de 1000 géneros de plantas, distribuidas en el
grupo de las Briofitas, Pteridofitas, Angiospermas y Gimnospermas (7,67).
2.4 La micorriza vesiculo-arbuscular
2.4.1 Distribución geográfica
Los hongos de la clase Zygomicetes incluidos en la familia Endogonaceae del género
Endogone (78, 79), son causantes de las infecciones endomicorrízicas y se encuentran
ampliamente distribuidas en todos los continentes salvo la Antártida (7). Se les encuentra
especialmente en suelos áridos y semiáridos de las zonas tropicales (69, ll 1, 99),
principalmente en lugares pobres en fósforo o con elevada capacidad de retención de ‘este
nutriente (90, 99).
2.4.2 Hospederos
Estos simbiontes MVA, que se caracterizan por sus estructuras vesiculares y
: arbusculares a nivel inter e intracelular (56: 14557) se presentan en la mayoría de las especies
agronómicas, excepto en las Brassicas y caña de azúcar y está generalmente en 2 familias de
cultivos principales, la Leguminoseae y Grnmineae (49,90).
.2.4.2 Presencia en el país
En nuestro país, la presencia de las MVA se ha detectado en diversos cultivos de
importancia económica, tales como maíz, frijol, papa, jícama, chile, pimienta, cafeto, frijol de
cuerno, frijol alado y ayocote (33) reportándose en la actualidad 21 especies de estas o
- estructuras, distribuídas en orden de importancia en los géneros Glomus, Acaulospora,
Sclerocystis, Gigaspora y Scutellospora (113); también el género Entrophospora es observado
en el cultivo del limón mexicano (Citrus aurantzj¿dia Swingle) (35).
En el estado de Colima, por sus características ecológicas de trópico seco, la existencia
de la MVA no es la excepción; se han encontrado Glomus, Gigaspora, Sclerosystis,
Acaulospora y Entrophospora, colonizando raíces de plantas de limón mexicano, ya sea en
monocultivo o asociado con palma de coco (3,35).
2.4.4 Beneficios
La amplia gama de hospederos de la MVA y su particular distribución en suelos
arenosos de los trópicos secos (65, ll 1,99) ha determinado que este simbionte reciba una gran
atención por los múltiples beneficios que se han observado, como son, mejorar el crecimiento
de las plantas (47), incrementar la absorción de nutrientes, principalmente N, P, Zn, y Cu (2 1,
72) así mismo aumenta la tolerancia al stress hídrico (51) a suelos salinos (48) y a metales
tóxicos pesados (49), ademas mejora suelos disturbados (103, 30), muestra efectos de
sinergismo co11 Rhizobium (1 I5), reduce el efecto del transplante (70) y disminuye las
* infecciones por nemátodos en la raíz (55).
2.4.5 Limitantes de la utilización
Los beneficios anteriores, muestran el amplio potencial de estos habitantes naturales
del suelo para su uso en la agricultura. Desafortunadamente uno de los principales obstáculos
de la aplicación extensiva del MVA, es el hecho de que son simbiontes obligados, y hasta
ahora muy pobres crecimientos han sido obtenidos bajo condiciones axénicas (60,66,40). Por
esta razón el método más comúnmente usado &ra el crecimiento de este hongo es la técnica
de cultivo en botes sobre hospederos susceptibles bajo condiciones asépticas en invernadero,
12
.los cuales producen inóculo, constituido de las raíces infectadas y suelo infectado con micelio
extra-matrical y esporas (73). No obstante, el procedimiento mencionado, utilizado en
Inglaterra y Estados Unidos, proporciona inóculo disponible a un grado limitapo en la.agricultura, empleado solo en situaciones donde las MVA han sido destruidas o dañadas por
0agroquímicos, en invernaderos y suelos labrados (68, 73). *.
2.4.6 Limitantes de desarrollo
Por otro lado, el desarrollo de la infección y la producción de esporas es seriamente
limitada por diversos factores, tales como la temperatura (50,96,98), luz (3 l), nivel de fósforo
en el suelo (36,106), humedad (24,88), textura (24), microorganismos (8), pH (48) y
disturbios del suelo (28).
2.4.7 Relación con hospederos
También el tipo de hospedero influye sobre la colonización micorrízica y producción
de esporas, siendo generalmente las plantas con elevadas demanda de fósforo como las
leguminosas, o con pobre sistema radicular (cebolla, papa), las que responden mejor a la
micorrización, de tal manera que las plantas con pocos o cortos pelos radicales dependerán
más de la formación de micorrizas que las dotadas de pelos bien desarrollados (7). Se
menciona que las gramíneas son menos micorrizadas que las leguminosas, debido a que
poseen un sistema radical mejor desarrollado, que les permite obtener más fácilmente los
nutrientes del suelo y hacerlas menos dependientes de las micorriza (90).
En un estudio realizado por Giovannetti et al (39), al inócular con Glomus
monosporum las plantas de trébol, vid, cebolla y pasto heno, que se caracterizan por la
diversidad en la morfología y la extensión linear de sus sistemas radiculares, encontraron a los
4 meses de la inoculación, la mayor respuesta en la colonización y producción de esporas en
plantas de vid y trébol, y la más baja en pasto de heno. Esto prueba la correlación inversa entre
la colonización de MVA y plantas que poseen escasos o cortos pelos radicales, que es la
característica de los hospederos más sobresaliktes en este trabajo.
13\
‘. .;
._ ‘^: .I
Sin embargo, cuando plantas de trébol fuerón inoculadas con los hongos Gigaspora
gigantea y Glomus mosseae en invernadero, por un período de 10 semanas, no se presentó la
infección con ninguno de los dos simbiontes, en cambio Gigaspora Gigantea y Glomus?
fasciculatum mostrar& una infección moderada en plantas de maíz, al igual que Glomus9
calospora en sorgo (46).
Los reportes anteriores ponen de manifiesto muestran que el comportamiento del
desarrollo de la infección y la producción de esporas es influenciado por la especie de planta
hospedera y la especie de hongo micorrízico y no necesariamente las plantas con escasos pelos
radiculares, son las que tienen una mayor respuesta a los endofitos MVA.
Los resultados obtenidos de inocular plantas de maíz, pasto bahía, sorgo y soya con
Glomus claroideum, Glomus etunicatum, Glomus mosseae y Gigaspora margarita, verifican
lo antes mencionado, ya que la soya, que se caracteriza por la presencia de pocos pelos
absorbentes, no fué apta para obtener una adecuada esporulación para cualquiera de las
especies de hongos MVA. En cambio, el maíz después de 12 semanas de la inoculación,
presentó la mejor respuesta a la producción de esporas, siendo superado a las 14 semanas por
el pasto bahía, el cual mostró incrementos de 1 OO-5 19 % en las dos últimas semanas de
incubación (105). También la cebolla es reportada como hospedero altamente susceptible a la
micorrización y productor de esporas, obteniendo resultados satisfactorios con Glomus
macrocarpus var. geosporus, Glomus facicdatus, Gigaspora margarita y Gigaspora gigantea
2.4.8 Relación con el fósforo
2.4.8.1 Colonización
En relación a los nutrientes, la concentración de fósforo (P) soluble del suelo es el
principal factor limitante de la producción de propágulos infectivos del endofito MVA; siendo
ampliamente demostrado en diversos estudios de invernadero y campo, que incrementos en las
’ concentraciones de este elemento, normalmkrte causan la disminución del porcentaje de
infección y la esporulación de este simbionte.
Así. cuando plantas de centeno, inoculadas con Acaulospora laevis y Glomus
monosparum y cultivadas en bote, fuerón sometidas a los niveles crecientes de P,soluble 0,.0.5, 1. 2,4 y ’ 8 grs/maceta conteniendo 3 kg de suelo, la respuesta del desarrollo micorrízico de
ambos endotitos fué asociada inversamente con los incrementos del P disponible en el suelo
(58) tal co1110 se comportó Glomus jksciculatum en trébol subterráneo, en suelos a
concentraciones desde 0 as 3 grImaceta (92). De la misma manera en 4 cultivares de chícharo
de vaca. sembrados en botes con suelo que contenían inicialmente 13 ppm de P disponible, la
colonización de Glomus fasciculatum mostró una correlación negativa con el contenido de P
teniendo su máxima micorrización a 0 ppm de P adicionado y siendo totalmente inhibido,
cuando se agregó 30 ppm (84). Un comportamiento similar fué observado en plantas de
lechuga, sembradas en suelo con un contenido inicial de 5 mg de fosfato soluble/kg, estas
mostraron un decremento de la infección micorrhizal con el aumento de fosfato soluble desde
0.05 a 6 g/kg de suelo (9).
No obstante, algunos endofitos MVA, responden positivamente en la infección a
ciertos interv.alos de incremento de P de la solución del suelo, como sucedió con Glomus sp
asociado a plantas de garbanzo desarrolladas en botes, en los cuáles, la infección fué
estimulada en forma creciente a las concentraciones menores de 200 mg de P/bote con 800 grs
de suelo, llegando a alcanzar 38 % de la colonización después de 39 días de la siembra, sin
embargo para niveles mayores de 200 mg la infección decreció hasta ser severamente inhibida
en 2000 mg de P/bote (53). Resultados similares son reportados de Glomus mosseae sobre el
cultivo del puerro, disminuyendo la micorrización para niveles mayores de 200 mg de P/kg y
declinando drásticamente desde 300 mg de P/kg de suelo (5).
En otros reportes, mientras Acaulospora leavis causó la máxima infección de 85%, en
plantas de trébol subterráneo desarrolladas en suelos con adiciones de 100 mg de P/bote, el,cuál contenía inicialmente 0.62 mg de P/g de suelo (13), el porcentaje más alto de infección de
<plantas de té en campo por hongos nativos, fué’registrado en lugares cuyas muestras de suelo
contuvierón alrededor de 200 mg de P total y 20 mg de P aprovechable, observándose una
respuesta dos veces más alta en suelos pobremente fertilizados que los pesadamente tratados
(77). En plantas de cebolla, expuestas a los hongos infectivos MVA sp E3, G. faciculatum, G.
caledonium, G. macrocarpum, G. mosseae3 G. clarum y Gigaspora margartta, fueron
sembrados en botes de 480 ml., conteniendo suelo con cantidades de P soluble de 0,25,50,100 :
y 150 mg/kg de suelo, y después- de--14.semanas;.la infección no fué alterada para todos los
endofitos sometidos a 25 mg/kg, excepto G. margarita que no excedió del 10 %, pero a partir
del nivel de 50 mg/kg la micorrización se redujo para todos los hongos, siendo más intensa
para los valores más altos (97).
2.4.8.2 Esporas
Con respecto a la esporulación en los simbiontes MVA se reporta que Glomus
fasciculatum inoculado en naranjo Troyer y naranjo agrio, se expuso a concentraciones de 0,6,
28, 56 278 y 556 ppm de P en suelos que contenían inicialmente 4.6 ppm de P, dando como
resultado la máxima producción de esporas de lO.l/cm cúbico de suelo a 28 ppm en naranjo
Troyer; después de esos niveles de P la producción decreció hasta llegar a 0 con 556 ppm de P
en naranjo agrio y con 56 ppm de P en naranjo Troyer (70). Sin embargo se menciona que el
naranjo agrio inoculado con Glomus intraradices registró un incremento mayor de número de
esporas en las células corticales de la raíz, a niveles de 100 mg de P aprovechable/kg de suelo
VW.
Otro estudio, menciona que los simbiontes G. clurum, G. mosseae, G. etunicatum, G.
macrocarpum. G. margarita, G. heterogamu y G. gigantea dieron mejor respuesta en la
colonización y producción de esporas en raíces de pasto bahía sembrados en suelos que
contenían 98 mg de P/kg y se les adicionó un 20 % de P20~ (pentóxido de fósforo) en 2.5 kg
de suelo, comparado con suelos que contenían inicialmente 199 mg de P/kg (1,06).
También Con la finalidad de investigar el comportamiento de las poblaciones de la
MVA en campo, un suelo sembrado con pasto, asociado con trébol subterráneo y habiendo
sido fertilizado con 150 kg de superfosfatoiha/iíio por 15 años fué tratado con 0, 56, 112, 168,
y 224 kg/ha/año a través de 10 años y al término de los mismos se encontró que la máxima
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16
.
cantidad de esporas (77/50 g de suelo), ocurrido en el tratamiento de 56 kg/ha/año, superando
en un 40 % al nivel cero; en los tratamientos mayores los resultados fuerón similares que los
no tratados (83). t
2.4~9 Estudios en el país
2.4.9.1 Nivel nacional
t
.. --. ._.. -.. _..
En México, en los últimos años se han iniciado estudios del MVA relativos a la
colonización y efecto en diversas especies de plantas, entre ellas, algunas leguminosas; tal es el
caso de 3 cepas Glomus sp en 5 variedades de frijol, obteniendo colonizaciones micorrízicas
desde el 53-89 % con la cepa M2 en todas las variedades (89). De la misma manera se reportan
colonizaciones del 20-70 % en plantas de mezquite, en la prueba de 9 cepas de Glomnus sp y 4
de Gigaspora sp, siendo Glomus sp la más sobresaliente (24); no obstante se reporta a
Gigaspora sp Zac. como el endofito que causó la máxima micorrización en la leucaena,
mientras que los demás, 6 Glomus sp y 2 Gigaspora sp., mostraron infecciones entre el 15 y
90 % (64).
2.4.9.2 Nivel estatal
En el estado de Colima, de las investigaciones realizadas hasta la fecha acerca del
hongo MVA, solo se tienen reportes del estatus de este simbionte en 5 agroecosistemas del
cultivo del limón mexicano como unicultivo y asociado con palma de coco, encontrándose los
géneros, en orden de abundancia: Glomus, Gigaspora, Sclerosystis, Acaulospora y
Entróyhospora, colonizando hasta el 98.8 % de los árboles con un promedio de 9.68 esp./g de
suelo seco, en la época de secas (3, 35). Por lo tanto, conociendo los diversos beneficios que se
obtienen de estos simbiontes y su presencia en los suelos del estado de Colima, característicos
de regiones tropicales secas, es necesario hacer una colección de los géneros de MVA de la
región y reproducirlos en volúmenes adecuados, para obtener inóculo disponible para
investigaciones posteriores en invernadero. Sin embargo, como ya se mencionó ampliamente,
el hospedero y la concentración de P en la solución del suelo, son 2 factores fundamentales
que limitan la colonización y producción de esPoras de MVA, razón, por la cual se realizó este
estudio.
17
III MATERIALESYMET~DOS
3.1 Lugar de realización t
Este estudio se llevó a cabo en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Biológicas y o
Agropecuarias de la Universidad de Colima, localizada en-el-valle- de Tecománj Col-/-a- 18 54’. -.. .--
L.N. y a los 103 52’ L.W. con 33 msnm. El clima se considera cálido seco con precipitación,
temperatura y humedad relativa media de 710 mm, 26 “C y 7 1.33 % respectivamente.
3.2 Suelo
Como sustrato para el crecimiento de las plantas del ensayo, se empleó una mezcla de
arena de río (partículas de 1 a 2.5 mm de diámetro) y suelo limoso en relación 2:l (w/w). La
arena se lavó con agua corriente y se esterilizó en calor seco a 120 “C por 24 horas, mientras
que el suelo se sometió a esterilización tres veces en calor húmedo a 12 1 “C y presión de 1 .O 1
kg/cm2 por 1 hora, con intervalo de 1 día entre esterilización (109).
La mezcla se colocó a razón de 1.2 kg en recipientes de plástico de ll .5 cm de
diámetro por 13.5 cm de altura (32) en los que se mezclaron uniformemente los niveles de
fósforo (58) a utilizar : 0, 25, 50, 100, y 200 mg de PzOs/kg. Para ello se adicionó superfosfato
de calcio triple (46% P205), previamente molido y tamizado a través de un tamíz de 50 mallas.
Se determinaron algunas características químicas del suelo y el sustrato tratado con los
diferentes niveles de fósforo, al inicio del experimento (cuadro 1).
3.3 Inóculo
Como inóculo se utilizó suelo con esporas y raíces infectadas con MVA, obtenido
directamente de campo en cultivos de limón mexicano (Citrus aurantifolia S.). Dicho inóculo
se caracterizó por tener en promedio 14 esporas por gramo de suelo seco y la presencia
frecuente del géneko Glomus, además por la gran variedad de colores de esporas, siendo más
abundantes las negras y las cafés; en cuanto a, las raíces, estas presentaron un porcentaje de
colonización promedio de 18.5%.
‘..,.I”.
.cI ‘.
IS\
.-: .,
.Cuadro 1. Características químicas del suelo empleado y de la mezcla suelo-arena con las
adiciones de fósforo (PzO,) en mg/kg de sustrato.Característica Adiciones de fósforo en mg de P&química Suelo 0 25 50 100 ? 200P H 7.23 7.38 7.09 7.01 6.99 6.91Cond. eléc. (mmhos/cm) 0.57 0.64 0.64 0.64 0.63 0.61 ’Materia orgánica (%) 0.56 0.28 0.28 0.29 0.29 0.29Calcio (meq/lt) 2.63 3.94 3.94 3.94 3.85 3.86Magnesio (meq/lt) 5.26 5.26 5.10 5.20 5.26 5.00Carbonatos (meq/lt) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00Bicarbonatos (meq/lt) 3 .69 3.72 3.69 3.63 3.65 3.69Cloruros (meq/lt) 8.89 8.89 8.89 8.60 8.80 8.80Fósforo (ppm) 5.00 - - -
3.4 Hospederos
El frijol (Phuscolus vulgaris L. CV. Peruano), el sorgo (Sorghum vulgare L. CV. Blanco
86) y grama (C’notlor~ &C@OM L- Pers.) fueron empleadas como plantas hospederas,
seleccionadas por sus diversas características morfológicas y extensión linear del sistema
radicular, al igual que el ciclo de vida. El frijol tiene raíz pivotante con muchas raíces laterales
cortas y escasos pelos radicales, con un periódo aproximado de 60 días de vida; el sorgo se
caracteriza por su sistema radicular fibroso y fasciculado, con numerosas y largas raíces
laterales, con ciclo de vida alrededor de 105 días; mientras que la grama tiene raíz estolonífera
fasciculada y ramifícada y su ciclo de vida cercano a 45 días.
El material de reproducción, consistió de semillas para el frijol y sorgo; para la grama,
estolones libres de raíces, colectadas de campo. Dicho material se desinfectó por inmersión en
hipoclorito de sodio al l%, durante tres minutos, e inmediatamente se lavó tres veces en agua
destilada estéril.
3.5 Inoculación I
Para la inoculación, se utilizó 100 g de suelo y dos gramos de raíces en segmentos de 1a.
a 2 mm, dando un total de 1,400 esporas por maceta (12,20, 32); este se colocó en capa, a una
profundidad de 2 a 3 cm por debajo de las semillas o estolones (1,2, 74) que fueron sembradas
.en cada maceta con el tratamiento de fósforo respectivo. En la siembra de los hospederos, se
utilizaron cinco semillas de frijol, diez de sorgo y ocho yemas de estolones de zacate grama.
colocadas entre 2 o 3 cm bajo la superficie del suelo de cada maceta tratada. Después de 10
días de emergidas se raleó a dos plantas de frijol y cuatro de sorgo por recipiente, excepto para t
la grama.
3.6 Condiciones experimentales
El experimento se llevó a cabo bajo sombra al 30%, con arreglo de tratamientos en
bloques al azar con cuatro repeticiones, considerando 2 macetas como unidad experimental. Se
regaron diariamente a 70% de la capacidad de campo con agua destilada y cada ocho días se
aplicó al suelo 15 ml de solución nutritiva Hoagland (Cuadro 2) carente de fósforo; además se
registró la temperatura y la humedad relativa diariamente, a las 7:00, 13:00, y 19:OO horas.
Cuadro 2. Composición de la solución de nutrientes Hoagland en un litro de agua destilada(Elias y Safír, 1987).
Compuesto Fórmula Cantidad (mg)Nitrato de potasio KN03 606.6Nitrato de calcio tetrahidratado Ca(N0&.4H20 656.4Sulfato de magnesio heptahidratado MgS04.7H20 240.8Fosfato ácido de amonio NH4H2P04 110.0 *Acido bórico I-W03 2.86Cloruro manganoso tetrahidratado MnC12.4HIO 1.81Sulfato de zinc heptahidratado ZnS04.7H20 0.22Sulfato de cobre pentahidratado CuS04.5Hz0 0.08Acido molíbdico H2Mo04 0.22 _Tartrato de hierro5.0* Este compuesto fue omitido
3.7 Medición de variables -
Las plantas se cosecharon a las 4, 6, 8 y 10 semanas después de la siembra; en cada
ocasión se detehinó, el porcentaje de colonización micorrízica mediante la técnica de
< Kormanik et al, (63), utilizando la fucsina á,cida como colorante; la cantidad de esporas por
gramo de suelo seco de diámetro entre 0.044 y 0.149 mm, colectadas de los tamices de 100,
200 y 325 mallas, con la técnica de extracción del tamizado en húmedo (39) y centrifugación
-*n.-.
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20 ._ .- : .\
(59); el peso fresco de raíces; el porcentaje de fósforo en la parte aérea, utilizando el
molibdovanadato de amonio como solución extractora y determinado por espectrofotometría
(8 1) y el porcentaje de materia seca.c
Para determinar la colonización micorrízica de las raíces primero fueron cortadas en’
segmentos de 1 cm de longitud y conservadas en solución AFA (900 ml de alcohol etílico, 50
ml formaldehído y 50 ml de ácido acético glacial) hasta su procesamiento.
Para clarear las raíces se colocaron en la solución de hidróxido de potasio al 10% (KOH)
y sometidas a temperaturas de 12 1 “C y presión de 1 .O 1 kg/cm2 , por un periodo de 10 minutos
para el sorgo y la grama y 15 para el frijol. Después fueron escurridas y lavadas perfectamente
con 4 cambios de agua corriente. Una vez clareadas las raíces, se les aplicó peróxido alcalino
(30 ml de peróxido al 10%. 3 ml de hidróxido de amonio y 567 ml de agua destilada) por un
periodo de 20 minutos hasta lograr blanquearlas. Inmediatamente después, se escurrieron de
nuevo y se lavaron minuciosamente con 4 cambios de agua corriente, para luego ser tratadas
con ácido clorhídrico al l’% por 3 minutos para neutralizar el peróxido. Para la tinción, las
raíces se colocaron en la solución fucsina ácida-ácido láctico (875 ml de ácido láctico, 63 ml
de glicerina y 62 ml de agua destilada) a una concentración de 0.06% de colorante bajo las
mismas condiciones a que se sometieron en KOH, esto con el objeto de lograr una eficiente
tinción de las estructuras del hongo MVA . El exceso de colorante se eliminó con el lavado en
ácido láctico y se procedió a preparar laminillas con 30 segmentos teñidos, distribuidos
uniformemente sobre un potaobjetos, para luego ser cubiertos con glicerol y un cubreobjetos.
Finalmente, la estimación del porcentaje de colonización micorrízica, se llevó a cabo con
la ayuda del microscopio con el aumento 40X, realizando tres pasajes equidistantes sobre cada
segmento montado en la laminilla y registrando el número de campos de la raíz observados
con la presencia de hifas, arbúsculos o vesículas, los cuales divididos entre el numero total de
campos observados determinó el resultado de la variable en cuestión (42).
, 1.
% micorrización = número de campos con estructuras micorrízicas X 1 OOnúmero de campos observados
.
. ..w.I -2 21 \ *. : .,
Para determinar el núméro de esporas, se inició por mezclar 50 gramos de suelo en 1
litro de agua J’ se agitó mecánicamente durante 5 minutos; después se dejó reposar 10 minutos
y se decantó la suspensión a través de una columna de tamices de graduaciones de 50, 100,t
200 y 325 mallas, colocados en orden decreciente de abajo hacia arriba. Este lavado y
tamizado se realizó Cos veces para cada muestra. La fracción obtenida de los tamices de 100, ’
200 y 325 mallas se centrifugó a 1800 rpm por un tiempo de 4 minutos. En seguida se decantó
el agua de cada tubo y al precipitado se le adicionó una solución azucarada al 50%, para ser
centrifugado por dos minutos a 1800 rpm. Después la solución de los tubos se decantó en el
tamíz correspondiente y se lavó cuidadosamente con agua corriente (59). Finalmente, el
residuo obtenido se filtró a través de papel filtro Whattman número 2, y se colocó en cajas
petri para ser observado al microscopio estereoscópico y cuantificar el número de esporas para
cada tamaño de tamíz.
3.8 Análisis de datos
Los datos obtenidos fueron sometidos a la técnica de análisis de varianza con 4 factores
(bloque, hospedero, nivel de fósforo y tiempo de cosecha) e interacciones de primero y
segundo orden. El análisis se desarrolló en unidades originales y con datos transformados en
arco seno dY, 41 -Y, dY+1/2 y log (Y+l), para el porcentaje de micorrización, de materia seca,
de fósforo en la parte aérea y el número de esporas respectivamente (95,104). También se
realizó prueba de medias Tukey al 5% de error y correlación simple entre variables.
22
IV RESULTADOS
4.1 Condiciones ambientales ?
El comportamiento de la temperatura y la humedad relativa, que se presentó durante el o
desarrollo del experimento, fue variable durante el día y el período de realización, de
septiembre a noviembre. La temperatura, por lo general siempre fué menor a las 7:00 horas
con promedio de 23.8 “C y ligeramente mayor a las 19:OO horas (27.9 “C), pero a las 13:00
horas se registraron las más altas temperaturas con valor promedio de 35.6 OC, sin embargo
hubo ocasiones en que descendió a 26 y 29 “C. La humedad relativa mostró una relación
inversa con temperatura, el mayor porcentaje en promedio (90.3%) se registró a las 7:00 horas
y el más bajo (6 1.34%) a las 13:OO horas. También se presentaron casos en los que la humedad
relativa a las 13:00 horas, ascendió a 87 y 90%.
4.2 Efecto de factores de estudio
El análisis de varianza (cuadro 3a y 3b), muestra en general que hubo efectos
significativos de los factores de variación estudiados, sobre todas las variables con datos
originales y transformados. Solo la colonización micorrízica fue influenciada por la
interacción entre la especie de hospedero, nivel de fósforo adicionado y tiempo de desarrollo
de la planta (cuadro 3a).
La interacción del hospedero con el tiempo afectó al número de esporas, el contenido
de P en la parte aérea, peso fresco de raíces y porcentaje de materia seca. Unicamente el
porcentaje de P contenido en la parte aérea, además de la colonización micorrízica, fueron
influenciados por el hospedero y la adición de P al suelo, pero ninguna de las variables fue
modificada por la acción conjunta del P adicionado y la edad de la planta (cuadro 3a y 3b).
4.3 Colonización’micorrízica
Respecto a los hospederos, las medi,as del porcentaje de colonización micorrízica
(cuadro 4) indican que fue igual en las tres especies de plantas (Tukey P < 0.05), sin embargo
el valor más alto se presentó’en la grama (91.73%), a diferencia del sorgo y frijol con medias
menores de 62%.
Cuadro 3a Análisis de varianza de la colonización micorrízica y número de esporas en tresespecies de plantas de cuatro edades de de.sarrollo en suelos con adición de nivelesde fósforo soluble. Análisis con datos originales y transformados.
Factor Grados F calculadade de Colonización micorrízica Esporas en 10 gss
variación libertad Porcentaje asen hó Número (N) Log (N+l )Bloque (B) 3 0.54 NS 0.86 NS 2.12 1.90 NSHospedero (H) 2 45.75*** 52.77*** 7.19*** 8.83***Fósforo (P) 4 8.85*** 11.99*** 0.23 NS 0.19 NSTiempo (T) 3 71.62*** 91.81*** 9.54*** 6.10***H * P 8 2.66** 2.98** 0.83 1.21 NSH * T 6 30.76*** 36.31*** 3.s4** 3.57**P * T 1 2 1.80 NS 1.71 NS 0.54 NS 0.61 NSH * P * T 2 4 1.7s* 1.75* 0.46 NS 0.72 NSC M E. 177 236.4024 0.0312 135.7835 0.0484R 2 0.7761 0.8061 0.3553 0.4197C.V.(%) 54.8272 34.5932 68.0293 18.5674* PcO.05, ** P<O.Ol y *** P < 0.001. gss = gramos de suelo seco. NS = no significativo.
Cuadro 3b Análisis de varianza del contenido de fósforo en los tejidos aéreos, peso de raíz ymateria seca en tres especies de plantas de cuatro edades de desarrollo en sueloscon adición de niveles de fósforo soluble. Análisis con datos originales ytransformados.
Factor Grados F calculadade de Fósforo en tejido Peso de Materia seca
variación libertad Porcentaje Asen $??+ 1/2 raíz (g) Porcenta je dl-%Bloque (B) 3 13.08*** 13.21*** 4.42 NS 7.03*** 6.95***Hospedro (H) 2 146.35*** 147.33*** 94.00*** 92.73*** 97.16***Fósforo (P) 4 9.29*** 9.28*** 2.94* 0.58 NS 0.59 NSTiempo (T) 3 5.19** 5.18** 22.s2*** 38.44*** 43.67***H * P 8 2.90** 2.91** 1.41 1.17 NS 1.21 NSH * T 6 2.94** 2.98** 103.22*** 3.00** 2.76*P*T ) 1 2 0.39 NS 0.39 NS 1.31 NS 0.85 NS 0.75 NSH * P * T 2 4 0.66 NS 0.68 NS 1.13 NS 1.04 NS 1.06 NS
: C.M.E. 177 0.0235 O.OQOO 2.0290 1.0748 0.0003R2 0.5179 0.7173 0.8436 0.6859 0.6980C.V.(%) 38.5540 0.1511 5.5701 1.1241 6.3238* P < 0.05, ** P < 0.01 y * * * P < 0.00 1. NS = no significativo.
71 .UI
‘2 \ *. ‘: - _ :_
24 __ ,^.
La edad de la planta resultó un factor importante en el desarrollo de MVA, ya que
mientras en la cuarta semana fué igual para los 3 hospederos, en la sexta el sorgo fue superado
por la grama y el frijol, mostrando este último su máximo valor (61.60%); eq la octava
semana, la colonización decreció para el frijol, y la grama registró su valor más alto (9 1.73%), ‘ .lo mismo que el sorgo (6 1.68%), sin embargo no existió diferencia del frijol con el sorgo, pero
sí con la grama; a la décima semana el frijol mostró los valores más bajos fue ampliamente
superado por el sorgo y la grama (cuadro 4).
Cuadro 4. Porcentaje de colonización micorrízica en tres especies de plantas en tiemposdiferentes de desarrollo en suelos con adición de niveles de fósforo soluble e inoculadas conhongos MVA.
HospederoSorgo
Adición de P(mg/kg suelo)
0255 0
-100200
43.80 a7.70 a12.45 a3.30 a2.23 a
Semanas después de la siembra6 8 1 0
14.37 be 14.88 f 54.80 abc10.05 ce 6 1.68 abcde 50.30 abc12.10 ce 37.80 bcdef 48.55 abc3.30 de 3 1.63 cdef 35.83 bcd2.48 e 23.88 e f 26.63 c
Grama 0 7.63 a25 ll.87 a5 0 5.47 a
100 2.25 a200 1.13 a
Frijol 0 1.08 a25 13.27 a5 0 7.60 a
100 2.55 a200 2.80 a
30.63 abcde52.08 ab40.05 abcde12.00 cde9.58 cde41.42 abcd61.60 a41.70 abcd47.10 abc35.43 abcde
65.45 abcd69.72 abc91.73 a
70.48 ab58.95 abcde27.23 def37.33 bcdef25.85 e f24.15 e f33.05 bcdef
73.85 ab74.63 a
64.05 abc64.18 abc29.28 c
4.55 d4.05 d3.58 d2.93 d1.35 d
Medias con letra diferente dentro de columna son diferentes (Tukey P < 0.05 y n = 4, DMS=38.51%)
En general, en el frijol la MVA se incrementó de manera muy notoria de la cuarta a la
sexta semana, ocurriendo una disminución gradual en la octava y una clara ausencia en la
última etapa de muestreo; en el sorgo se observó un aumento gradual hasta la sexta semana y
un ascenso súbito en la octava, para posteriormente permanecer constant; la grama mostró
siempre un aumento gradual hasta la octava semana y después una constancia similar que el
sorgo.
De acuerdo a los resultados, el efecto de los niveles de P adicionado al suelo sobre la *
colonización fué diferente .en relación a la especie de planta (Cuadro 4): En el frijol y sorgo se
comportó igual para todos los niveles a cualquier edad (P<O.O5), aunque el mejor nivel de
colonización para ambos hospederos fue a 25 mg, mientras que para la grama ocurrió a 50 mg,
sin existir diferencia entre los niveles de 0 a 100 mg. a las 6 y 10 semanas de edad.
Generalmente, para los tres hospederos, adiciones de P mayores de 25 mg afectaron
negativamente la colonización micorrízica en cualquier edad de la planta, siendo esto más
claro con el nivel de 200 mg.
Cuadro 5. Número de esporas en diez gramos de suelo seco de tres especies de plantas decuatro tiempos de desarrollo, inoculadas con hongos MVA.
Semanas después de la siembraHospedero 4 6 8 10Sorgo 13.908 ab 16,620 a 15.909 a 34.787 a
(1.057) (1.189) (1.190) (1.461)Grama 15.574 a 16.046 a 20.189 a 18.960 b
(1.194) (1.177) (1.274) (1.277)Frijol 7.329 b 13.972 a 15.969 a 16.284 b
(0.868) . (1.148) (1.184) (1.204)Medias con letra diferente dentro de columna son diferentes (Tukey PcO.05 y n=20,DMS=12.04). ( ) = Valores transformados a log (Y+l).
4.4 Producción de esporas
El comportamiento del ‘número de esporas por 10 gramos de suelo seco (cuadro 5)
fluctúo de 7.3 a 34.8 entre hospederos, para los cuales no existió diferencia en la sexta y
octava semana, sin embargo en la décima el sorgo supera ampliamente al frijol y la grama,
,incrementándose 118% la producción de esporns con respecto a la octava semana, mientras
que en los otros 2 hospederos tendió a estabilizarse.
-..‘.c
‘- -c< ,
, J
\ ‘\ : 1;>.- . . - r,.. ‘I
26
l
3.5 Fósforo en la planta
En relación al porciento de fósforo en la parte aérea, el frijol mostró los resultados
mayores en todos los niveles de P adicionado y en todos los tiempos de desarrollo, se&uido por
la grama y el sorgo con resultados similares (cuadros 6 y 7). t
Cuadro 6. Porcentaje de fósforo en la parte aérea de tres especies de plantas desarrolladas ensuelos con adición de cinco niveles de fósforo e inoculadas con hongos MVA.
Nivel de superfosfato en mg de P/kg sueloHospedero 0 25 5 0 100 200Sorgo 0.265 b 0.344 b ..-0.390 b 0.371 b 0.407 b
(0.7089) (0.7095) (0.7098) (0.7097) (0.7099)Grama 0.193 b 0.217 b 0.205 b 0.213 b 0.244 b
(0.7084) (0.7086) (0.7085) (0.7086) (0.7088)Frijol 0.475 a 0.575 a 0.589 a 0.628 a 0.845 a
(0.7104) (0.7111) (0.7112) (0.7115) (0.7130)Medias con letra diferente dentro de columna son diferentes (Tukey PcO.05 y n=16,DMS=O. 184). ( ) Valores transformados a dY+1/2.
En los tres hospederos, aumentos de P en el suelo, incrementó el contenido de P en la
parte aérea y conforme transcurrió el tiempo de desarrollo sucedió de manera inversa. Los
contenidos de P en los tejidos siempre fueron mayores en frijol, a diferencia de las dos
gramíneas. (Cuadros 6 y 7).
Cuadro 7. Porcentaje de fósforo en la parte aérea de tres especies de plantas de cuatro tiemposde desarrollo, inoculadas con hongos MVA.
Semanas después de la siembraHospedero - 4 6 8 10Sorgo 0.444 b 0.377 b 0.311 b 0.290 b
t (0.7102) (0.7097) (0.7092) (0.7091)Grama 0.256 c 0.221 b 0.198 b 0.183 b
(0.7089) (0.7086) 0.7085) (0.7084)’ Frijol 0.659 a c598 a 0.518 a 0.716 a
(0.7117) (0.7113) (0.7107) ( 0 . 7 1 2 1 )Medias con letra diferente dentro de columna son diferentes (Tukey P=<O.O5 y ni20,DMS=O. 158) ( )=Valores transformados a dY+1/2.
-.eo-.LY< , \ ‘-. ‘: < .; I27
, ..L’Y
4.6 Peso de raíces.
El peso fresco de raíces por recipiente fue mayor en frijol (13.725 g), seguido por el
sorgo (12.250 g) y el mas bajo en la grama (10.07 g). Mientras que el frijol mostró a 1~s cuatro
semanas, el máximo peso de raíces y decreció con el tiempo, en el sorgo se incrementó hasta la (
octava semana y en la grama siempre se mostró un ascenso, hasta alcanzar el máximo peso a
las diez semanas (Cuadro 8).
Cuadro 8. Peso fresco de raíces (gm.rnos por recipiente) de tres especies de plantas de cuatrotiempos de desarrollo e inoculadas con hongos MVA.
Semanas después de la siembraHospedero 4 6 8 10Sorgo 7.195 b 10.575 a 12.250 a 9.770 aGrama 3.653 c 7.103 b 8.650 b 10.070 aFrijol 13.725 a ll.748 a 9.025 b 6.020 bMedias con letra diferente dentro de columna, son diferentes (Tukey PcO.05 y n=20,DMS= 1.47)
4.7 Materia seca
En general el sorgo y la grama superaron al frijol en el porciento de materia seca en
todas las etapas de desarrollo, obteniendo valores de 91.9% a 94.3%. Por otro lado los tres
hospederos mostraron la tendencia de incrementar la materia seca conforme al tiempo de
desarrollo (cuadro 9).
Cuadro 9. Porcentaje de materia seca de tres especies de plantas de cuatro tiempos dedesarrollo e inoculadas con hongos MVA.
Semanas después de la siembraHospedero .4 6 8 10Sorgo 92.655 a 93.025 a 92.765 a 94.260 a ’
(0.270) (0.264) (0.268) (0.239)Grama , 92.535 a 92.195 a 91.940 a 93.340 ab
(0.273) (0.279) (0.283) (0.258)Frij 01 90.080 b 90.910 b 90.260 b 92.735 b
(0.3 14) (0.300) (0.3 ll) 0.269)Medias con letra diferente dentro de columna son diferentes (Tukey PcO.05. y n=20,DMS=l.O7), ( )=Valores transformados a 41-Y
1
V DISCUSIONES
5.1 Colonización micorrízica tDe acuerdo a los resultados obtenidos, se comprueba que el comportamiento de la (
infección es influenciado por la especie de planta, ya que se menc&na_que plantas con pobre
sistema radicular, tales como el frijol son altamente micorrizables, a diferencia del sorgo y
grama que poseen un sistema radical mejor desarrollado (7), sin embargo en este estudio, la
grama que se caracteriza por su raíces fasciculadas y extremadamente ramificadas obtuvo la
más alta colonización, coincidiendo con los reportes realizados sobre las plantas de trébol
maíz y sorgo al ser inoculadas por diversas cepas de hongos endomicorrízicos (46). En
cambio en otro estudio se muestró que el pasto heno fué uno de los hospederos que registró la
más baja colonización a diferencia del trébol la vid y cebolla (41).
Con respecto al nivel de fósforo adicionado al suelo se mostró que el efecto sobre
colonización micorrízica, está relacionado con la especie y variedad del hospedero. En este
trabajo, se observó que mientras en el frijol y el sorgo, el porcentaje de micorrización
disminuye para los niveles mayores de 25 mg de P/kg de suelo en la grama ocurrió para las
mayores de 50 mg/kg, así por ejemplo, se reporta que la alfalfa y el zacate raygrass la
colonización no se afectó por la adición de P hasta 375 mg /kg, de suelo (lo), al igual que en 2
genotipos de sorgo (85, 86), sin embargo (76) en sorgo obtiene un incremento en la infección
de raíz al adicionar 25 mg P/kg de suelo.
Lo anterior indica que puede haber un nivel óptimo de P soluble en suelo para
estimular fuertemente la colonización para cada especie de planta (53), ya que la mayor
disponibilidad de P, no solo aumenta las concentraciones de azúcares y ácidos orgánicos en las.células corticales de las raíces, sino la penetración y/o crecimiento del hongo en el córtex,
reduciendo de esta,manera el grado de colonización (1 OO).
, El tiempo de cosecha después de la ino&tlación, también fué un factor fundamental el
comportamiento del grado de infección, ya que en general el frijol registró su máxima
29
micorrización en la sexta semana de cosecha, la grama en la octava y el sorgo en la décima. Un
comportamiento similar es reportado en plantas de chícharo, sorgo y maíz en los cuales, de la
séptima a la novena semana se incrementó significativamente el % de colonización, mostrando
posteriormente un decremento en el caso de chícharo y una estabilidad en sorgo y’maíz (102).(
Esto muestra que existe una relacción estrecha entre el estado fenológico de la planta y el_ --..-.desarrollo del hongo micorrízico-va tal como se demostró en plantas de soya, que registraron
la máxima producción de micelio extramatrical cuando la planta inició su re productiva (ll).
5.2 Producción de esporas
Bajo las condiciones de este estudio, el número de esporas por gramo de suelo seco, no
fué afectada por la adicción de los niveles de P utilizados, para ninguno de los 3 hospederos
probados, debido probablemente a que no fueron las cantidades suficientes para provocar la
inhibición de la esporulación, tal como ocurrió en plantas de avena forrajera con adiciones de
P hasta 25 mg/kg de suelo (22), sin embargo en plantas de sorgo se obtuvo, la máxima
producción de esporas a los niveles de 25 mg/kg de suelo (76).
El tiempo pareció ser un factor importante en el comportamiento de la esporulación, la
cuál en las primeras 8 semanas de cosecha resultó no ser diferente para los hospederos sin
embargo a las 10 semanas después de la siembra el sorgo incremento en un 118% el número
de esporas mostrando ser el mejor productor (35 esp/lO g) el cual ya ha sido reportado en
estudios anteriores como una planta con potencialidad para ser utilizada en la producción de
esporas, registrando promedios alrededor de LOO esp/gramo de suelo seco a las 21.5 semanas
(101, 102). Probablemente a tiempos de cosecha mas largos el sorgo y la grama se hubiera
incrementado la formación esporas, y éste último hospedero podría superar el sorgo; tal como
se observó en plantas de zacate popollote, sorgo y maíz inoculadas con diferentes hongos.
MVA, en los cuales, generalmente el maíz superó al sorgo y popollote a las 6, 8, y 10 semanas,
sin embargo a 19 14 semanas después de la plantación el popollote se incrementó de 100 a
5 19%, superando ampliamente al maíz y sorgo (105).
30
De acuerdo con lo anterior, es necesario, continuar probando hospederos de diferentes
características radiculares a tiempos de cosecha periódicos durante todo su ciclo, para poder
seleccionar el más adecuado que nos permita obtener la mayor cantidad de esporas ep un corto
tiempo (41) y no caer en el error de aceptar una especie de planta como el hospedero mas (
efectivo. . . . . . ._ -... ~~..
5.3 Fósforo en la planta
En grama para las tres especies de plantas la concentración de P en la parte aérea se
incrementó a medida que se adicionó el fósforo al suelo, lo cual ha sido demostrado en
diversos trabajos sobre varios hospederos de la MVA (6, 84, 114). Tal parece que la
concentración de P en la planta es determinante en la asociación simbiótica con los hongos
MVA, ya que el frijol fué el que mostró la mayor cantidad de P en la planta y obtuvo la más
baja colonización, además, esto permite decir que cada hospedero tiene su óptima
concentración para la mejor colonización, la cual está determinada por la adición de P al suelo,
así para la grama se tiene que es aproximadamente 0.205%, para sorgo alrededor de 0.350% y
para el frijol 0.575%.
Por otro lado a medida que transcurrió el tiempo, el contenido de P en la planta
disminuyó y se fué dando el grado de infección hasta lograr su óptimo, cuando el P decreció en
la planta a los valores necesarios, antes mencionados.
Estas observaciones sugieren un mecanismo de control del fósforo para la simbiosis
MVA en raíces de gramíneas y leguminosas para determinar la especie de planta, nivel de P
del suelo y el tiempo de cosecha óptimas para maximizar la cantidad de inóculo, dados por
raíces infectadas y esporas. Existen evidencias de que la concentración de P en las diferentes
especies de plantas es un factor que determina el comportamiento de la colonización y
producción de esporas de hongos MVA (71), debido a que bajas cantidades de P en la planta
disminuye la acumulación de fosfolípidos en las células y una mayor exudación de metabolitosI
tales como azúcares reducidos y aminoácidos: los cuales guardan una relación muy estrecha
con la infección y desarrollo de la MVA (87, 107, 108) así como la formación de esporas (26).
l5.4 Peso fresco de raíces
El fósforo adicionado no influyó sobre el peso fresco de las raíces, pero se comportó de
manera muy variada entre los hospederos, a través del tiempo, probablemente relaciopado con
las etapas de desarrollo de las plantas. Esta variable es importante analizarla con respecto a la ~
colonización ocurrida en cada uno de los hospederos, porque en cu.a.nto a canjndad-cll_inóculo _
de raíces infectadas, podría seleccionarse en un momento dado la especie de planta que
produzca el mayor peso de raíces en un corto tiempo con porciento de infección adecuados.
En este estudio la grama fue la que presentó la mejor colonización (70%) en la octava
semana, con un peso de raíces de 8.65 g/recipiente; en cambio el frijol mostró ser mejor a la
sexta semana con 40% de colonización y peso fresco de raíces de ll .74 gkecipiente.
Con respecto a las esporas, en sorgo se observó una relación directa con el peso fresco
de raíces a través del tiempo de cosecha, el cual ha sido reportado como un buen productor de
esporas por la rápida tasa de crecimiento de su raíz, de tal manera que pueden permitir un
contacto temprano entre el hongo y el eospedero (25).
32
l VI CONCLUSIONES
La mejor colonización micorrízica ocurrió en la grama a la octava semana después dela siembra (7 1.3%).
f
Las adiciones de P al suelo de 0 a 100 mgkg de suelo no afectaron la colonización qmicorrizíca del hospedero, sin embargo, el máximo porcentaje (50%) se observó a los nivelesde 25 y 50 mg de fósforo. .-‘- - .. --- ---- --- Te------- _._ _- . ----- --- -..-._---. -.
El contenido de fósforo óptimo en la planta hospedera, para la mejor colonizaciónMVA, fue de 0.1925 a 0.2135%.
Las adiciones de P al suelo de 0 a 200 mgkg de suelo, no afectaron la producción deesporas 8 16-20/10 g de suelo seco de hongos MVA en grama.
La producción de esporas de hongos MVA fue mejor en plantas de sorgo (34esporas/10 g de suelo).
33
Vi1 LITERATURA CITADA
l.- Afek, U., Rinaldelli, E., Menge, J.A. y Johnson, E.L.V.,“the effect of root age and positiónof mycorrhizal inoculum on colonizatión of cotton, onion and pepper”. Phytqpathology79: 1138. (Abstr). 1989.
*2.- Afek, U., Rinaldelli, E., Menge, J.A., Johnson, E.L.V. y. ?ond,..E.,. IMycorrhizal Species,
root age, Positión of mycorrhizal inoculum influente colonization of cotton, onion yPepper seedlings. ” J Amer Soc Hort Sei 115 (6): 938 - 942. 1990.L’Ad--
3.- Aguilar, E.S. “Caracterización de la micorriza vesículo-arbuscular en limón Citrusaurantifolia Swin., asociado con palma de coco Cocus nucifera L. en cincoagroecosistemas en el estado de Colima”. Tesis de maestría FCBA, Univ. de Colima,México. 71 p. 1988.
4.- Allen, M. F. y Allen, E.B., “Carbon source of va mycorrhizal fung: associated withchenopodiaceae from a semiarid shrub - steppe” Ecology 7 1 (5) ; 20 19 -202 1. 1990.
5.- Amijee, F., Tinker, P.B. y Strubley, D.P. “The development of endomycorrhizal rootsystems. VII. A detailed study of effects of soil phosphorus on colonization”. New Phvtol&l: 435-446. 1989.
6.- Arines, J. y Vilariño, A. Use of Nutrient: phosphorus ratios to evaluate the effects ofvesicular-arbuscular mycorrhiza on nutrient uptake in unsterilized soils. Biol. Fertil Soils8: 293-297. 1989.
7.- Azcón- G. de Aguilar, C. y Barea, J.M.,” Micorrizas”. Investigación y Ciencia. 15 (47): 8-16. 1980.
8.- Azcón- G. de Aguilar, C. and Barea, J.M. “Effect of soil micro-organisms on formation ofvesicular-arbuscular mycorrizas”. Notes and brief articles. Trans. Br. Mycol. Soc. 84 (3):536 - 537. 1985.
9.- Azcón, R., Marin, A.D. y Barea, J.M. “Comparative role of phosphate in soil or inside thehost on the formation and effects of endomycorrhiza”. Plant and Soil49: 561- 567. 1978.
lo.- Barea, J.M., El-Atrach, F. y Azcon, R. Mycorrhiza and Phosphate Interactions as affectingplant Development, N2-Fixation, N-Transfer and N-Uptake from soil in Legume-GrassMixtures by Using A 15N Dilution technique. Soil. Biol. Biochem. x(4): 581-589. 1989.
1 l.- Bethlenfalva;, G.J., Brown M.S. and Pacovsky, R.S. “Relationships between host andendophyte development in mycorrhizal soybeans” New Phvtol90: 537-543. 1982.4.
34
.12.- Biermann, B y Linderman, R.G., “Use of vesicular- arbuscular mycorrhizal roots,
intraradical vesicles and extraradical vesicles as inoculum”. New Phvtol. 95 ; 97 -105.1983.
13.- Bolan, N.S. y Robson, A.D. “Increasing phosphorus supply can increase the infection ofplant roots by vesicular- arbuscular mycorrhizal fungi”. Short Comunication. Soil Biol. *Biochem. 16 (4): 419-420. 1984. -
14.- Bonfante-Fasolo, P., “Vesicular-arbuscular micorrhizae :Fungus plant interactions at thecellular level”. Symbiosis 3: 249-268. 1987.
15.- Brown, L. ” Empeora la situación alimentaría mundial”. Agricultura de las Américas, 37(6): 12 - 14. 1988.
16.- Casas, C.C. “Alternativas tecnológicas”. Conseio Nacional & Ciencia y Tecnología.México, 1986. pp 247 - 250.
17.- Casas, R. “Potencial de la investigación biotecnológica agrícola en México”. Rev. Mex.& SocioloPía. 50 (1): 121 -146. 1988.
18.- Cienfuegos, I.F. “Producción de alimentos en condiciones naturales adversas”. Public.ESP. 118. SARH-INIFAP. México. 1986. 19 p.
19.: COLIMA-SARH-CONAFRUT. “Programa de desarrollo frutícola del estado de Colima”.Parte 1. México. 94 p.
20.- Coltman, R.R., Waterer, D.R. y Huang, R.S., “A simple method for Production of Glomusaggregatum Inoculum Using controlled-release Ferti1izeY.m Science 23 (1): 2 13-2 15.1988.
21.- Cooper, KM. and Tinker, PB. “Translocation and transfer of nutrients in vesicular-arbuscular mycorrhizas. II Uptake and tramlocation of phosphorus, zinc and sulphur”.New Phvtol. 81: 43-52. 1978.
22.- Costa, N.de L., Dionisio, J.A., y Anghinoni, I., “Influencia de fungus micorrízicosvesículo-arbusculares, fontes e doses de fósforo o crescimento de aveia forrageira. PesoAgropec. Bras., Brasilia, 24 (8): 979-986. 1989.
23.- Cuanalo, De La C.H. y Ponce, H.R. “Agrohabitat y agrosistema”. Analisis de losaqroecosistem. d~!&tic~. &Se.tiKaiQ. C&c$.++ de PQ*~Y&x&Q~. 46~. X%1.
24.- Dakessian, S., Brown, M.S. y BethlenfaJvay, G.L. “Relationship of mycorrhizal growthenhan cement and plant growth with scil water and texture”. Plant and Soil 94: 493-443.1986.
35
25.-Daniels Hetrick, B.A. y ‘Bloom, J. The influente of Host Plant on production andcolonization ability of vesicular- arbuscular mycorrhizal spores. Mitología, 78 (I): 32- 36.1986.
26.- Douds, D.D. y Schenck, N.C. Relationship of colonization and sporulat;on by VAmycorrhizal fungi to plant nutrient and carbohydrate contents. New Phvtol. 116: 621-627. *1990.
27.- Elias, KS. y Safir G.R. “Hiphal elongation of Glomus faciculatus in response to rootexudates”. Appl. Environ Microbiol. 53 (8): 1928-1933. 1987.
28.- Evans, D.G. & Miller, M.H. “Vesicular-arbuscular mycorrhyzas and the soil-disturbance-induced reduction of nutrient absorption in maize”. New Phvtol. 110: 67-74. 1988.
29.- FAO.“Los primeros 40 a-nos”. Italia. 155~. 1985.
30.- Fairchild, G.L. y Miller, M.H. Vesicular-arbuscular Mycorrhizas and the Soil-disturbance-induced reduction of nutrient absorption in maize. III. Influente of Pamendments to soil.New Phvtol 114: 641-650. 1990.
31.- Ferguson, J.J. & Menge, J.A. “Factors that affect production of endomycorrhizalinoculum”. Proc. Fla. State Hort Soc 95. 37- 39. 1982.-AAL
32.- Ferguson, J. J. y Woodhead, S. H. “Production of endomycorrhizal inoculum”. pp 47-54.In: Methods & principies gf Mvcorrhvzal Research. Ed. N.C. Schenck. Amer. Phytopath.Soc., St. Paul, M.N. 1982.
33.- Ferrera-Cerrato,R. “La micorriza vesiculo-arbuscular en los diferentes agroecosistemas”.& Sipmosium de la Sequía y su Impacto en la Agricultura. U.A.CH., M’exico.1983. 43P.
34.- Ferrera-Cerrato, R y Lara-Fernándes, V. “Asociación de la micorriza V-A con Prosopiss, una leguminosa del antiplano potosino - zacatecano, en México”. XIV Congreso eNacional & Fitopatología (Memoria). Sociedad Mexicana de Fitopatología, Michoacán,México. p 63. 1987.
35.- Flores, B. Ma del R.. “Caracterización de la micorriza vesículo-arbuscular en limónCitrus aurantzjblia Swín. en cinco agroecosistemas en el estado de Colima”. Tesis de- -maestría. FCBA, U de C., México. 1988. 72 p.
36.- Furlan, V. y Bemier-Cardou, M. “Effects of N, P and K on formation of vesicular-arbuscular micorrhizae, growth and mineral content of onion”. Plant and Soil 113: 167-.174. 1989.
37.-Galindo, F.E. “Biotecnología : oportunidades y amenazas”. Ciencia y Desarrollo 14 (80):20-40. 1988.
38.- García E. R. “Importancia de la fitopatología tropical”. Apuntes del PrimeI; Taller de- -Fitopatología Tropical. CRECIDATH. CONACYT. MEXICO. 1985. 240 P.
939.- Gerdenmann, J.W. y Nicolson, T.H. “Spores of micorrhizal Endogone species extracted ~.
from soil by wet sieving and decanting”. Trans. Brit Mvcol. Soc. 46: 243-244. 1963.
40.- Gianinazzi, S., Trouvelot, A. y Gianimazzi -Pearson, “Conceptual approaches for therational use of va endomycorrhizae in agriculture: possibilities ‘and limitations”Agriculture, Ecosystems & Environent 29: 153 - 16 1. 1989.
41.- Giovannetti, M., Schubert, A., Cravero, M.C. y Salutini, L. “Spore production by thevesicular-arbuscular mycorrhizal fungus Glomus monosporum as related to host species,root colonization and plant growth enhancement”. Biol Fertil Soils 6- 120-124. 1988.A---*
42.- Giovannetti, M. y Mosse, B. “An evaluation of techniques for measuring vesiculararbuscular mycorrhizal infection in roots”. New Phytol. 84: 489-500. 1980.
43.- Giron, H.E. “Biotecnología Alimentaria”. ICYT ll (154): 32- 34. 1989.
44.- Glenn, M.G., Chew, F.S. y Williams, P.H. “Hyphal penetration of brassica (cruciferae)roots by a vesicular- arbuscular mycorrhizal fungus.” New Phvtol 99: 463-472. 1985.
45.- González, S. y Barrios, S.R.A. “Producción de inóculo de micorrízas arbusculares”. Rev.Latinoamer. Microbiol. 25: 181 - 187. 1983.
46.- Grada-Yautentzi, R. y Valdés, M. “Desarrollo de micorríza vesículo arbuscular enalgunos cultivos”. Biol Soc Mex Mic 13. 47-53. 1979.AAL1-*,
47.-Graham, J.H., Leonard, R.T. y Menge, J.A. “Interaction of the light intensity and soiltemperature with phosphorus inhibition of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation”.New Phytol91: 683-690.1982
48.- Graw, D. “The influente of soil pH on vesicular-arbuscular mycorrhiza”. New Phvtol.82: 687-695. 1979. .
49.-Hayman, D.S. “Micorrhiza and crep production”. Nature 287 (5782): 487-488.1980.8
50.- Hetrick, B.A.D. & Bloom, J. “The influente of temperature on colonization of winterwheat by vesicular-arbuscular mycorrhyzai Iüngi”. Mvcologia 76 (5): 953-956. 1984.
5 1 .- Hetrick, B.A.D., Kitt,D.G. & Wilson.G.T.“Effects of drought on growth response in com,sudangrass, and big blues- tem to Glomus etunicatum”. New Phvtol. 105: 403-410. 1987.
52.- Hetrick, B.A.D., Wilson, D.G. y Leslie, J.F., ” Root architecture of warm-and ccol- seaso:relationship to mycorrhizal dependence”. Can J Bot 69. 112-l 18. 1990.‘LL-.
53 .-Hirata, H., Masunaga, T. y Koiwa, H. “Respose of chickpea grown on apdo-soil tovesicular-arbuscular mycorrhizal infection in relation to the leve1 of phophorusapplication”. Soil Sci. Plant Nutr 34 (3): 441-449.1988.-I-
54.- Howeler, R.H., Sieverding, E. y Saif, S. “Practica1 aspects of mycorrhizal technology insome tropical crops and pastures”. Plant and Soil 100.249-283. 1987.----*
55.- Ingham, R.E. “Interactions between nematodes and vesicular- arbuscular mycorrhizae”.Anriculture. Ecosvstems & Environment, 24: 169- 182. 1988.
56.- Jackson, R.M. y Mason, P.A. “Mycorrhiza”. The Inst of Bioloav”. Studies in Biology-L-No. 159. Great Britain. 1984. 61 p.
57.- Janerette, C.A. An Introduction to mycorrhizae. TheAmerican Biology Teacher 53 (1):13-19. 1991.
58.- Jasper, D.A., Robson, A.D. and Abbott, L.K. “Phosphorus and the formation of vesicular-arbuscular mycorrhizas”. Soil, Biol. Biochem. 11: 501-505. 1979.
59.- Jenkins, W.R. “A rapid centrifuga1 flotation technique for separating nematodes fromsoil”. Plant Disease Rep. 48: 692. 1964.
60.- John, T.V.ST. y Hays, R.I. “A new method for produsing pure vesicular-arbuscularmyucorrhiza-Host cultures”. New Phvtol89: 8 l-86. 198 1.
61.- Johnson, C.R. “Phosphorus nutrition on mycorrhizal colonization photosyntesis, growthand nutrient composition of Citrus aurantium”. Plant and Soil SO* 35-42. 1984.----*
62.- Khan, A.G. “The ocurrence of mycorrhizas in halophytes, hydrophytes and xerophytes,and endogone spores in adjacent soils”. Journal Lf General Microbiologv 81: 7- 14. 1974.
63.- Kormanik, P.P., Bryan, W.C. y Schultz, R.C.“Procedures and equipment for staininglarge numbers of plant root samples for endomicorrhizal assay”. Can. J. Microbiol. 26:536-538. 1980.
64.- Lara-Fernández, V. y Ferrera-Cerrato, R. “Inoculación de Leucaena leucocephala con 9cepas de micorriza vesículo- arbuscular de los g’eneros Glomus y Gigaspora’l, XIIICongreso Nacional”. Sociedad Mexicana de Fitopatología. Chiapas, México. p 96. 1986.
65.- Louis, 1 y Lim, G. “Differential response in growth and mycorrhizal colonizationisolates of GZomus clarum in soils of different P availlability”. Plant and Soil 112. 37-43.- - - - -1988.
38
66.-Macdonald, R.M. “Routine production of axenic vesicular- arbuscular myconhizas” New*-Phytol. 89: 87-93. 1981.
67.- Malloch, D.W., Pirozynski, KA. y Raven, P.H. “Ecological and evolutionary,signifícanceof mycorrhizal symbiosis in vascular plants (A Review)“. Proc Natl Atad Sci 77 (4):LLAL-2113-2118. USA, 1980. 9
.~ _68.- Marx, D.H. y Schenck, N.C. “Potential of mycorrhizal symbiosis in agricultura1 and
forest productivity”. Pages 334-347 in Chanllenging Problems in Plant Health,TKommendhl and P.H. Williams, eds. 75 th Anniv. Publ. ot.Am Phytopathol Soc. 538 p.1983.
69.- McGee, P.A. “Variation in propagule numbers of vesicular- arbuscular mycorrhizal fungiin a semi-arid soil”. Mycol. Res. 92 (1): 28-33. 1989.
70.- Menge, J.A., Davis, R.M., Johnson, E.L.V. y Zenimyer, G.A. “Micorrhizal fungi increasegrowth and reduce transplant injury in avocado”. Californie Agriculture 32 (4): 6-7.1978a.
7 1 .- Menge, J.A., Steirle, D., Bagyraj, D.J., Johnson, E.L.V. y Leonard, R.T., “Phosphorusconcentrations in plants responsible for inhibition of mycorrhizal infection.“New Phvtol80: 575-578. 1978b. -
72.- Menge, J.A., LaRue, J., Labanauskas, C.K. y Johnson, E.L.V. “The effect of twomycorrhizal fungi upon growth and nutrition of avocado seedlings grown with sixfertilizer treatments”. J. Amer Soc Hort Sci 105 (3): 400-404. 1980.-LLdd-
73.- Menge, J.A.” Utilization of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in agriculture”. Can. J.Bot. 61: 1015-1024. 1983.
74.- Menge, J.A. y Timmer, L. W. “Procedures for inoculation of plants with vesicular-arbuscular mycorrhizae in the laboratory, greenhouse and field”. pp. 59 - 68.b Methods& principies Ef mvcorrhizal Research. Éd. N.C. Schenck. Amer. Phytopath. Soc. St Paul,M.N. 1982.
75.- Miller, Jr. J.C., Rajapakse, S. y Garber R.K. “Vesicular- arbuscular mycorrhizae invegetable crops”.Hort. Science 2l(4): 974-984. 1986.
76.- Miranda, J.C.C., Harris, P.J. y Wild, A. Effects of soil and plant phosphorusConcentratioas on vesicular- arbuscular mycorrhiza in sorghum plants. New Phvtol. 112:405-410. 1989.
77.- Morita, A. y Konishi, S. “Relationship between vesicular- arbuscular mycorrhizalinfection and soil phosphorus concentration in tea fíelds”. Short Communications. soil.Sci Plant Nutr 35 (1): 139-143. 1989.L-d-
39
78.- Morton, J.B., “Species’ and clones of arbuscular mycorrhizal fungi (Glomales,Zygomycetes): their role in macro and microevolutionary processes”. Mvcotaxon 37: 493-515 1990aAA
79.- Morton, J. B., “Evolutionary relationship among arbuscular mycorrhizal fdngi in theendogonacea”. Mvcología 82 (2): 192-207. 1990b.
80.- Mosse, B. y Thompson, J.P., “Vesicular- arbuscular endomycorrhizal inoculumproduction. 1. Exploratory experiments with beans (Phaseoulus vulgaris) in nutrient flowculture”. Can J Bot 62. 1523-1530. 1984.AL’L
8 1 .- Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 13a. ed.USA. 1018~. 1980
82.- Perez-Gil, R.F., Grande, C.D. y Aguilera B.A. “Tecnologías y ’ modernizaciónagropecuaria en México”. Nutrición 12 (3): 17-32. 1989.
83.- Porter, W.M., Abbott, L.K. y Robson, A.D.“Effect of rate of application ofsuperphosphate on populations of vesicular - arbuscular endophytes”.Aust J of Exp.d-t-Anricul. and Animal Husb. 18: 573-578. 1978.
84.- Rajapakse, S., Zuberer, D.A. and Miller Jr. J.C. “Influente of phosphorus leve1 on VAmycorrhizal colonisation growth of cowpea cultivars”. Plant and Soil 114. 45-52. 1989.- - - - -
85.- Raju, P.S., Clark, R.B., Ellis, J.R. y Maranville, J.W. mineral uptake and growth ofsorghum colonized with VA mycorrhiza at varied soil phosphorus levels. Journal of Plant- -Nutrition, 13 (7): 843-859. 1990a.
86.- Raju, P.S., Clark, R.B., Ellis, J.R., Duncan, R.R. y Maranville, J. W., “Benefit and costanalysis and phosphorus eficiency of VA mycorrhizal fungi colonizations with sorghum(Sorghum bicolor genotypes grown at varied phosphorus levels. Plant Nutrition-Physiolorry and Applications, Academic Publisher, USA. pp 165- 170. 1990b.
87.- Ratnayake, B. y M. Leonard, R.T. y Menge, J.A. “Root exudation in relation to supply ofphosphorus and its possible relevance to mycorrhizal formation.” New Phytol. 8 1.: 543-552. 1978.
88.- Reid, C.P.P. and Bowen, G.D. “Effects of soil moisture on V-A mycorrhiza formationand root develpment ín medicago”. En:The Soil Root Interfase. Academic Press Inc.(London) L. D, E. pp 211-219.1979.
89.- Reyes-Solis, M.G. y Ferrera-Cerrato, R. “Afinidad de la micorríza versículo arbuscularcon el cultivo de frijol de diferente hbito de crecimiento”. Memorias del XV CongresoNacional & Fitopatología. Sociedad Mexicana de Fitopatología. Veracruz, México. p 14.1988.
40
90.- Sainz, Ma.J., Fabregas, R. y Arines, J. ” Micorrízas vesículo arbuscular en praderas deGalicia”. Ecología 43: 651- 658. 1984.
91.- Sallih, Z., Bottner, P., Billés, G. y Soto, P., “Interaction racines- microorganismes:carbone et azote de la biomasse microbienne développé en présience de racines. “&Eco1 Biol Sol 24 (3): 459-471. 1987. tLLd
92.- Same, B.I., Robson, A.D. and Abbott, L.K. “Phosphorus, soluble carbohydrates andendomycorrhizal infection”. Soil Biol. Biochem. 15 (5): 593-597. 1983.
93.-SARH-INIA-CIAPAC-CAETECO. “Logros y aportaciones de la investigación agrícola enestado de Colima”. México. 46 P. 1981.
94.- SARH-INIFAP-COLIMA. “Primera reunión científica forestal y agropecuaria”.Resumenes. México. sp. 1988.
95.-SAS Institute Inc. SAS user’s guide; Statistics. 1985 edition. SAS Institute, Inc., Cary,MC. 1985.
96.- Schenck, N.C. y Smith, G.S. “Responses of six species of vesicular-arbuscularmycorrhizal fungi and their effects on soybean at four soil temperatures”. New Phvtol. 92:193 - 201. 1982.
97.-Schubert, A. and Hayman, D.S. “Plant Growth Responses to vesicular-arbuscularmicorrhiza. XVI Effectiveness of different endophytes at different levels of soil ’phophate”. New Phvtol 103: 79-90. 1986.
98.- Sieverding, E. “Effect of soil temperature on performance of the diferent VA mycorrhizalisolates with cassava”. Angew Bot. 62: 295-300. 1988.
99.- Sieverding, E., “Ecology of VAM fungi in tropical Agrosystems.” _ Awiculture,Ecosystems & Environment 29 ; 369-390. 1989.
lOO.- Siqueira, J.O.; Hubbel, D.H. y Schenck, N.C. Spore germination and germ tube growthof a vesicular- arbuscular fungus in vitro. Mycol. 74: 952-959. 1982.
101 .- Simpson, D. y Dafi, M.J. Interactions between water-stress and different nycorrhizalinocula on plant growth and mycorrhizal development in maize and sorghum. Plant andSoil 121: 179-186. 1990a.
102.- Simpson, D. y Da& M.J. Spore Production and mycorrhizal development in varioustropical crep hosts infected with Glomus clarum. Plant and Soil 121: 171-l 78.1990b.
41
103.- Stahl, P.D., Williams, SE. y Christensen, M. “Efficacy of nativevesicular-arbuscularmycorrhizal fungi afier severe soil disturbance”. New Phvtol. 110: 347-354. 1988.
104.- Steel, R.G.A. y Torrie, J.H. Bioestadística, Principios y Procedimentos. Tr. la. ed., Ed.McGraw Hill. 622 p. 1985. t
105.- Struble, J.E. and Skipper, H.D. “Vesicular-arbuscular mycorrhizal fungal sporeproduction as influenced by plant species”. Plant and Soil 109. 277-280. 1988.p---O
106.- Sylvia, D.M. y Schecnck, N.C.“Aplication of superphosphate tomycorrhizal plantsstimulates sporulation of phosphorus-tolerant vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi”.New Phytol. 95: 655-661. 1983.
107.- Thomson, V.D., Robson, A.D. y Abbott, L.K. Mycorrhizas formed by Gigasporacalospora and Glomus fasciculatum on subterranean clover in relation to solubblecarbohydrate concentrations inroots. New.Phvtol. 114: 217-224. 1990.
108.- Thomson, B.D.; Robson, A.D. y Abbott, L.K. Effects of phosphorus on the formation ofmycorrhizas by Gigasporn cnlospora and Glomus fasciculatum in relation to rootcarbohydrates. New Phvtolonist 103: 75 l-765. 1986.
109.- Thompson, J.P., “Soil sterilization methods to show VA- mycorrhizae aid P and ZnNutrition of wheat in versisols.” Soil Biol. Biochem. 22 (2): 229-240. 1990.
1 lo.- Toledo, V.M., Carabias, J., Toledo, C. y González-Pacheco, C. “La producción rural enMéxico : Alternativas ecológicas”. la. ed. Fundación Universo Veintiuno. México, 1989.402 P.
ll 1.- Trappe, J.M. “Mycorrhizae and productivity of arid and semiarid rangelands”.~advances in food producing systeme for arid and semiarid lands. Atad. Press, Inc. New- - - - -York. pp 581-599. 1981.
112.- Valdéz, V.J. “Marco de referencia de limón mexicano en los estados de Colima yJalisco”. En II Simposium sobre la agroindustria del limón mexicano, SARI-I, INIA,CIAPAC, CAETECO, México. pp 37-5 1. 1984.
113.- Varela, L. “Contribución al conocimiento de los hongos MVA de México”. En:Resúmenes & Ecología Integrada en Defensa & b Naturaleza. Cuba, p 2 13. 1988.
114.-Vejsadova, H., Hrselová H., Prikryl, Z. y Vancura, V. Effect of different phosphorus andnitrogen leveis on development of VA mycorrhiza, rhizobial activity and soybean growth.Agriculture, Ecosvstems and Environment, z:429-434. 1989.
42
115.-Young, C.C., Juang, T.C: and Chao, C.C.“Effects of Rhizobiurn and vesicular-arbuscularmycorrhiza inoculations on nodulation, symbiotic nitrogen fíxation and soybean yield insubtropical-tropical fields”. Biol Fertil Soils 6. 165-169. 1988./d-e.
43
