01 Fibrosis Quistica

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 1 IV. 1 FIBROSIS QUÍSTICA La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad crónica, degenerativa y hereditaria de carácter recesivo que afecta a casi todas las glándulas exócrinas del organismo, produciendo secreciones viscosas que obstruyen los canales que las transportan. Este estancamiento favorece el desarrollo de infecciones e inflamación que conducen a la destrucción del pulmón, hígado, páncreas y el sistema reproductor. IV.1.1 Biología molecular El gen implicado en la Fibrosis Quística es el CFTR (por “Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator”) que tiene 250kb (189.362pb sin el promotor, según www.ensembl.org) y que se localiza en 7q31.2 (cromosoma 7, brazo largo en 31.2). Este gen está constituido por 27 exones, nombrados según la nomenclatura actualizada con números del 1 a 27. Anteriormente se los nombraba con números del 1 a 24 y números y letras para 6a, 6b, 14a, 14b, 17a, 17b porque algunos fueron descubiertos con posterioridad a la asignación 1-24. Figura 1. CFTR: gen en el cromosoma 7, ARNm de 6129 nt y proteína de 1480 aminoácidos que luego de la glicosilación y el plegamiento se insertará en la membrana plasmática. Los exones se nombran empleando nomenclatura no actualizada.  

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    IV. 1 FIBROSIS QUSTICA

    La Fibrosis Qustica (FQ) es una enfermedad crnica, degenerativa y

    hereditaria de carcter recesivo que afecta a casi todas las glndulas excrinas

    del organismo, produciendo secreciones viscosas que obstruyen los canales

    que las transportan. Este estancamiento favorece el desarrollo de infecciones e

    inflamacin que conducen a la destruccin del pulmn, hgado, pncreas y el

    sistema reproductor.

    IV.1.1 Biologa molecular

    El gen implicado en la Fibrosis Qustica es el CFTR (por Cystic fibrosis

    transmembrane conductance regulator) que tiene 250kb (189.362pb sin el

    promotor, segn www.ensembl.org) y que se localiza en 7q31.2 (cromosoma 7,

    brazo largo en 31.2).

    Este gen est constituido por 27 exones, nombrados segn la nomenclatura

    actualizada con nmeros del 1 a 27. Anteriormente se los nombraba con

    nmeros del 1 a 24 y nmeros y letras para 6a, 6b, 14a, 14b, 17a, 17b porque

    algunos fueron descubiertos con posterioridad a la asignacin 1-24.

    Figura 1. CFTR: gen en el cromosoma 7, ARNm de 6129 nt y protena de 1480 aminocidos que luego de la glicosilacin y el plegamiento se insertar en la membrana plasmtica. Los exones se nombran empleando nomenclatura no actualizada.

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    El ARNm tiene 6.129 nt (www.ensembl.org). La parte codificante corresponde a

    una protena de 1480 aminocidos con un peso molecular de 168kD.

    La protena CFTR se localiza en la parte apical de las clulas, es responsable

    del transporte de cloro entre el citoplasma y el exterior y tiene la siguiente

    estructura:

    o 2 regiones transmembrana hidrofbicas (cada una con 6 hlices alfa) que forman un canal en la membrana plasmtica llamado Transmembrane domain (TMD1 y TMD2 en amarillo) o 2 regiones citoplasmticas hidroflicas, donde se fija el ATP, llamado Nucleotide-Binding Folds (NBF1 y NBF2 en azul). La hidrlisis del ATP produce la energa para la apertura y cierre del canal.

    o una regin de regulacin: llamada Regulator domain o R domain en verde que funciona como un tapn del canal. Est codificada en el exn 13 y

    tiene residuos que pueden ser fosforilados regulando as el funcionamiento.

    Figura 2. CFTR en la membrana plasmtica: regiones transmembrana (en amarillo), regiones citoplasmticas donde se fija el ATP (NBF1 y NBF2 en azul), regin de regulacin (regulator domain o R domain en verde) que funciona como un tapn del canal.

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    Figura 3. Otra representacin de la protena CFTR: a la izquierda el aminocido n1 y a la derecha el n 1.480 donde se ve el orden de las diferentes regiones siguiendo la secuencia en forma lineal.

    Figura 4. Otras representaciones de CFTR. A la izquierda esquema que representa los diferentes dominios y los sitios a los que se une el ATP, la imagen central muestra el plegamiento de la protena y la de la derecha los diferentes dominios, la hidrlisis de ATP a ADP y el pasaje de cloruros.

    Esta protena regula otros canales como el canal ENaC para el transporte de

    sodio y otro para el potasio, el ROMK. La funcin de CFTR est en el centro de

    toda la regulacin homeosttica de las glndulas excrinas del organismo.

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    Figura 5. CFTR ubicado en la membrana apical de la clula. Esta protena regula otros canales como el canal ENaC para el transporte de sodio, el ROMK para potasio y el ORCC tambin para cloruro.

    IV.1.2 Variantes: tipo y frecuencia

    Hasta la fecha se registraron, en la base canadiense de acceso libre

    (www.genet.sickkids.on.ca), 1941 mutaciones diferentes del gen CFTR, de las

    cuales la mayora son mutaciones puntuales.

    Las ms frecuentes son:

    o mutaciones con cambio de significado (40,24%), es decir cambia un aminocido por otro, luego, en orden de frecuencia,

    o microinserciones y microdeleciones que producen un corrimiento del marco de lectura (15,92%);

    o mutaciones que alteran el splicing (11,64%); o mutaciones sin significado (8,24%) que generan un codn de

    terminacin;

    o grandes deleciones o inserciones (2,52%); o deleciones o inserciones que no afectan el marco de lectura 1,96 %); o mutaciones que afectan al promotor (0,77%)

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    o polimorfismos (13,86%) o variantes con significado incierto (4,79%)

    Cabe aclarar que en este mdulo las mutaciones se van a nombrar segn las

    recomendaciones internacionales colocando entre parntesis el nombre

    anteriormente empleado.

    Las mutaciones son clasificadas en 6 categoras en base a las consecuencias

    funcionales que producen. Algunas producen anomalas cualitativas (el CFTR

    no funciona correctamente) y otras cuantitativas (niveles inapropiados) de la

    protena CFTR.

    Figura 6. Protena en la zona apical. Distintos niveles celulares a los que afectan las mutaciones: ncleo (Noyau), retculo endoplsmico, aparato de Golgi, membrana. Clase 1: Mutaciones que modifican la expresin de la protena CFTR. Estas mutaciones resultan en la ausencia total o parcial de la protena. Este tipo

    incluye mutaciones sin significado y aquellas que producen anomalas en el

    splicing y corrimientos del marco de lectura. En ciertos casos el ARNm es

    inestable y no se produce protena. En otros, la protena es inestable y es

    rpidamente degradada por ser una protena truncada o con una secuencia

    aberrante.

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    Clase 2: Mutaciones que perturban el proceso de maduracin celular de la protena CFTR. Por ejemplo la ms frecuente p.Phe508del (F508del). El CFTR

    es una protena glicosilada que es procesada en el retculo endoplsmico y el

    aparato de Golgi para luego ser transportada a la membrana plasmtica. La

    mutacin p.Phe508del (F508del) evita el plegamiento normal de la protena y

    su salida del retculo endoplsmico.

    Clase 3: Mutaciones que alteran la regulacin del canal. Estn localizadas en uno de los dos nucleotide binding domain donde se fija el ATP.

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    Clase 4: Mutaciones que alteran la conduccin del canal cloruro a nivel de los dominios transmembrana que participan a la formacin del poro inico. Las

    mutaciones con cambio de significado (cambio de aminocido) situadas en

    estas regiones producen una protena correctamente localizada con una

    actividad de canal cloro AMPc dependiente. Pero la caracterstica del canal

    mutado es diferente al CFTR normal con una disminucin del transporte de

    iones.

    Clase 5: Mutaciones que reducen el nmero de transcriptos de CFTR (dficit cuantitativo del canal).

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    Clase 6: Mutaciones alterando la estabilidad de la protena madura. La protena es sintetizada normalmente pero es inestable a nivel de la membrana.

    Localizacin de las mutaciones

    Como se ve en las figuras a continuacin, no hay hot-spots (zonas

    calientes), es decir regiones donde se localicen la mayor cantidad de

    mutaciones sino que stas se encuentran distribuidas a lo largo de todo el gen.

    Figura 7. Tipos y distribucin de mutaciones en el gen CFTR, (www.genet.sickkids.on.ca/cftr/PicturePage.html). Arriba los exones se nombran segn nomenclatura anterior (legacy name), abajo empleando la nomenclatura actualizada.

    La Figura 8 representa los exones en funcin de la regin de la protena que

    codifica, por ejemplo el exn 13 corresponde al Regulatory Domain.

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    Figura 8. Dominios de la protena CFTR alineados con los exones y los tipos de mutaciones. Los exones se nombran empleando nomenclatura no actualizada.

    La mutacin ms frecuente es la c.1521_1523delCTT, p.Phe508del (F508del)

    que corresponde a una delecin de 3 bases (CTT) produciendo una delecin

    de la fenilalanina en el codn 508. Esta mutacin, en algunas regiones del

    mundo, es encontrada en 2 de cada 3 casos.

    Figura 9. Mutacin c.1521_1523delCTT, p.Phe508del (F508del). La prdida de CTT involucra a dos codones (507 y 508) pero el 507 conserva su secuencia de bases.

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    En la Figura 10 el gen est representado con los distintos exones, los cuales

    tienen una forma diferente segn la composicin de sus extremos 5 y 3:

    o Para el extremo izquierdo si es vertical el exn comienza con el primer nt del codn, si tiene forma curva comienza con el 2 nt y forma de flecha

    con el 3.

    o Para el extremo derecho si es vertical termina con el ltimo nt del codn, si es curvo termina con el 1 y con forma de flecha termina con el 2 nt.

    Esto significa que, si existen deleciones de exones completos, puedo tener o

    no corrimientos del marco de lectura, dependiendo de cules exones se

    reasocian. Por ejemplo, si se pierden los exones 2 y 3, la unin del 1 con el 4

    generar un corrimiento del marco de lectura, mientras que si se deleciona slo

    el 4 no habr corrimiento.

    Estas miniprotenas, que han perdido alguna porcin pero que el resto de la

    estructura es normal, pueden conservar cierta funcionalidad.

    Figura 10. El gen CFTR con sus 27 exones, sobre cada exn est la denominacin tradicional. Los extremos 5 y 3 estn representados con formas diferentes en funcin de qu nt ocupa cada extremo (ver texto).

    Un tipo de variante gentica que tiene una consideracin especial, es el alelo

    que presenta 5T en el intrn 8. Esta variante se encuentra en cerca del 10% de

    la poblacin general y es especialmente estudiada en infertilidad masculina.

    Estas 5T estn precedidas por un sistema de STRs cuya unidad de repeticin

    es TG.

    El TG11-5T (11 TG seguido de 5T) es una variante considerada no patolgica.

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    En cambio si el paciente tiene una mutacin patolgica y el otro alelo TG12-5T

    o TG13-5T estamos en una zona gris del diagnstico molecular ya que esta

    variante est asociada a infertilidad masculina y formas no clsicas de FQ.

    Estas variantes (TG12-5T o TG13-5T) producen alteraciones en el splicing con

    una disminucin de los transcriptos completos ya que slo el 40-50% de los

    ARNm del CFTR tienen el exn 9.

    IV.1.3 Prevalencia por regiones La elevada prevalencia en la poblacin caucsica y la implementacin de los

    estudios moleculares en Europa hace que este sea el continente con mayor

    informacin sobre incidencia por regiones.

    La distribucin de las mutaciones cambia mucho de un pas europeo a otro.

    Globalmente se puede hablar de un eje de noroeste a sudeste de Europa

    donde por ejemplo, para la mutacin ms frecuente c.1521_1523delCTT

    (F508del), en Dinamarca se encuentra en un 87% y cerca del 50% en Italia

    segn las zonas.

    Figura 11. Distribucin geogrfica de la mutacin c.1521_1523delCTT (F508del) en la poblacin europea. Las mayores frecuencias se localizan al noroeste.

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    Otra clasificacin de las mutaciones del CFTR, es por la frecuencia. Son 3

    categoras en total:

    o Categora 1: contiene slo la c.1521_1523delCTT (F508del) (frecuencia muy importante)

    o Categora 2: frecuencia superior a 1% y contiene las mutaciones c.1624G>T (G542X) (segunda ms importante), c.1652G>A (G551D), c.3909C>G

    (N1303K) y c.3846G>A (W1282X). La mutacin c.1624G>T (G542X) es

    originaria de Grecia, Marruecos y Andaluca.

    Figura 12. Distribucin geogrfica de la mutacin c.1624G>T (G542X) en la poblacin europea.

    La mutacin c.3909C>G (N1303K) es originaria de Tnez.

    Figura 13. Distribucin geogrfica de la mutacin c.3909C>G (N1303K) en la poblacin europea.

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    o Categora 3: la mutacin es rara, excepcional, nicamente encontrada en una poblacin bien precisa o en una familia. Por ejemplo la c.1679G>C,

    (R560T) propia de Escocia.

    Figura 14. Distribucin geogrfica de mutaciones que producen FQ en la poblacin europea. (Geographic distribution and regional origin of 272 cystic fibrosis mutations in European populations. The Biomed CF Mutation Analysis Consortium. Hum Mutat. 1997; 10(2):135-54)

    IV.1.4 Fisiopatologa

    La Fibrosis Qustica se produce cuando los dos alelos del gen CFTR estn

    mutados, produciendo una deficiencia cualitativa o cuantitativa del CFTR,

    modificando los niveles de cloruro extracelular en pulmn, pncreas e hgado.

    Pncreas Las secreciones espesas impiden el movimiento hacia el intestino de las

    enzimas pancreticas que participan en la digestin, como la lipasa y la

    tripsina, generando una auto-digestin del pncreas con posible formacin de

    fibrosis. La deficiencia de enzimas digestivas se traduce en un impedimento

    para absorber los nutrientes, con la subsiguiente excrecin de stos en las

    heces: este trastorno es conocido como malabsorcin. La malabsorcin

    conduce a la desnutricin y al retraso de crecimiento y desarrollo, ambos

    debidos a la baja biodisponibilidad calrica.

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    Tambin se modifica la funcin endcrina por destruccin de los islotes de

    Langerhans con disminucin en la produccin de insulina y la consecuente

    diabetes insulino dependiente. Esta insuficiencia aparece despus de la

    deficiencia excrina.

    Hepato-biliar Estas secreciones tambin pueden causar problemas en el hgado. La bilis,

    producida por esta vscera para facilitar la digestin, bloquea las vas biliares,

    daando los tejidos adyacentes. Con el tiempo, esta situacin conduce a la

    cirrosis. En ese caso, resultan comprometidas funciones de primer orden, tales

    como las implicadas en la neutralizacin de toxinas y en la sntesis de

    importantes protenas como los factores de coagulacin.

    Pulmn El lquido que est en el rbol bronquial est compuesto de mucus y de agua.

    El canal CFTR secreta el cloruro en este lquido. Al mismo tiempo trabajan los

    canales de sodio para mantener el equilibro homeosttico. La evacuacin del

    lquido por las cilias del pulmn permite eliminar el polvo y los agentes

    infecciosos desde el sistema pulmonar hacia el sistema digestivo.

    El dficit del CFTR va a deshidratar el lquido en la superficie muco-ciliar,

    aumentando la viscosidad con obstruccin de los bronquios y la ausencia de

    evacuacin del polvo y microorganismos. La propiedad antibacteriana del

    mucus est disminuida. Este proceso va producir una inflamacin crnica.

    En muestras de broncoscopa, en nios de 2 aos (estudio del ao 2000 en

    ms de 1000 nios), se encontraron los agentes infecciosos:

    29% Haemophilus influenzae

    42% Staphylococcus aureus

    29% Pseudomonas aeruginosa

    7% Stenotrophomonas maltophilia y

    menos de 1% Burkholderia cepacia

    Tambin se han encontrado agentes virales y fngicos (Aspergillus fumigatus).

    Para la infeccin crnica es necesario utilizar antibiticos que van a ir

    generando resistencia bacteriana.

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    La prolongacin de estos procesos en el tiempo conduce a una inflamacin

    bronco-pulmonar obstructiva crnica.

    El moco en los senos paranasales es igualmente denso y pegajoso y tambin

    puede causar oclusin de los orificios por donde los senos habitualmente

    drenan, lo cual hace que se acumulen secreciones que actan como caldo de

    cultivo para los patgenos antes mencionados. En las personas con FQ, a

    menudo se observa crecimiento sobreabundante de tejido nasal (plipos), a

    consecuencia de la inflamacin por infeccin sinusal crnica. Estos plipos

    pueden agravar la obstruccin de las vas respiratorias superiores e intensificar

    las dificultades respiratorias.

    IV.1.5 Clnica La enfermedad de las glndulas excrinas involucra a las vas respiratorias,

    pncreas, hgado y rbol biliar, intestino grueso, canal deferente del rgano

    genital masculino, glndulas sudorparas.

    La severidad depende del tipo de mutacin, de otros factores genticos y de

    factores ambientales.

    Manifestacin pulmonar Adems de las infecciones bacterianas ms comunes, las personas con FQ

    desarrollan con mayor facilidad otros tipos de enfermedades respiratorias. Es la

    causa de mortalidad ms importante. La inflamacin crnica de los bronquios

    por infecciones bacterianas deteriora la funcin pulmonar. Las primeras

    infecciones son por Haemophilus influenzae y Staphylococcus aureus, luego,

    en estados ms avanzados, por Pseudomonas aeruginosa. La afectacin

    pulmonar comienza con tos seca, que se hace crnica con generacin de

    esputo y que culmina con deficiencia pulmonar.

    Otros sntomas incluyen expectoracin de sangre o esputo sanguinolento,

    dilatacin crnica de los bronquios o bronquiolos (bronquiectasia), elevacin de

    la presin sangunea en el pulmn, insuficiencia cardaca, sensacin de falta de

    oxgeno o disnea, insuficiencia respiratoria.

    Manifestacin digestiva A) Intestinal

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    Al estado neonatal se manifiesta por leo meconial que es una oclusin

    intestinal por ausencia de eliminacin del meconio, vmitos e hinchazn

    abdominal. Al estado prenatal 10-20% de los fetos tienen una

    hiperecogenicidad intestinal

    La oclusin intestinal distal de la infancia se asemeja a una crisis de

    apendicitis. El reflujo gastroesofgico es frecuente en el recin nacido y no

    disminuye con la edad.

    El prolapso rectal es frecuente en el recin nacido dando volumen de heces

    mayores, malnutricin y aumento de la presin intra-abdominal.

    B) Hepatobiliar El compromiso heptico se manifiesta en el 30% de los casos por

    hepatomegalia.

    La cirrosis aparece en el 10 a 15% de los casos.

    C) Pancretica La insuficiencia pancretica excrina se da en el 90% de los casos. Produce un

    defecto de absorcin de las grasas (cidos grasos esenciales), protenas y

    vitaminas liposolubles (A, D, E, K). La malabsorcin de grasas produce diarrea

    crnica, hinchazn abdominal, con apetito que contrasta con la prdida de

    peso. Los problemas de absorcin de vitamina D producen una baja

    mineralizacin de los huesos, riesgo de fracturas y raquitismo. En las otras

    manifestaciones de malabsorcin hay insuficiencia de crecimiento, retraso de

    la pubertad, anemia y trastornos carenciales.

    Manifestacin genital A diferencia de las mujeres que slo el 20% est afectada en su fertilidad por

    modificacin del moco cervical, ms del 90% de los hombres son estriles por

    atresia bilateral de los conductos deferentes. Esta va producir una azoospermia

    u oligospermia importante (menos de 5 millones de espermatozoides por ml) y

    cambio en la composicin qumica del esperma.

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    Normal Fibrosis Qustica

    pH >8 2000mg/100ml

    Fosfatasa cida 140-290 g/ml 760-1140g/ml

    Fructosa 250-720mg/100ml 30-80mg/100ml

    Tabla 1. Composicin del esperma de individuos normales y con fibrosis qustica.

    Otras manifestaciones Rinosinusitis infecciosas frecuentes, sinusitis crnicas secundarias a poliposis

    nasal que se presentan con dolor facial, fiebre, secrecin nasal profusa y

    cefaleas.

    La anormalidad de las glndulas sudorparas conduce a un aumento del cloruro

    de sodio en el sudor, esta prdida de sal es responsable de la deshidratacin

    aguda por el esfuerzo o la exposicin a temperaturas ambiente elevadas.

    Las personas con FQ a menudo presentan, en manos y pies, una malformacin

    denominada dedos en palillo de tambor, la cual se debe a los efectos de esta

    enfermedad crnica y a la hipoxia en sus huesos.

    Figura 15. Dedos en palillo de tambor.

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    Algunas manifestaciones de la enfermedad se presentan en forma aislada

    como: pancreatitis idioptica, aspergilosis broncopulmonar alrgica, asma,

    bronquiectasia (dilatacin anormal e irreversible del rbol bronquial).

    Figura 16. rganos afectados por la FQ: vas areas, hgado, pncreas, intestino delgado, tracto reproductivo y piel.

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    IV.1.6 Pronstico Los pacientes que no reciben tratamiento tienen una sobrevida media de 3 a 5

    aos.

    A nivel mundial se observa un importante aumento de la sobrevida, como

    resultado:

    o del diagnstico precoz, o del conocimiento de los mecanismos de la enfermedad, o del tratamiento adecuado basado en la fisiopatologa, la formacin de equipos interdisciplinarios integrados por: neumonlogos, kinesilogos,

    nutricionistas, gastroenterlogos, enfermeras, bioqumicos, trabajadores

    sociales, psicoterapeutas y genetistas,

    o la atencin de los pacientes en unidades de FQ, o las medidas de control de infeccin. Los equipos deben elaborar un informe peridico destinado al pediatra o

    mdico de cabecera con los resultados de la evaluacin del aparato respiratorio

    y el estado nutricional, as como de las conductas teraputicas indicadas.

    El diagnstico precoz y el tratamiento sintomtico permiten incrementar la

    sobrevida a 25-30 aos. Este tratamiento incluye: fisioterapia respiratoria,

    antibiticoterapia, nebulizaciones con broncodilatadores y mucolticos,

    administracin de inhibidores de proteasas para los sntomas pulmonares,

    sustitutos de enzimas pancreticas y vitaminas.

    En estados muy avanzados ha sido necesario el transplante triple de corazn,

    pulmones e hgado.

    Otra rea muy importante para el tratamiento de la FQ es la de desarrollo de

    frmacos mutacin dirigidos. En el 2012 la FDA (Food and Drug Administration)

    seguida por la EMA (European Medicines Agency) aprobaron el uso de

    Ivacaftor (nombre comercial Kalydeco) en pacientes de ms de 6 aos de

    edad que tengan la mutacin c.1652G>A (G551D). El Ivacaftor es un

    medicamento que acta incrementando la actividad del canal CFTR

    defectuoso, mejorando de esta manera la funcin de la protena CFTR.

    La terapia gnica an se encuentra en estado de desarrollo.

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    IV.1.7 Diagnstico A fines de la dcada del 30 cuando Andersen describe la Fibrosis Quistica, su

    diagnstico se basaba en el cuadro clnico caracterizado por enfermedad

    pulmonar crnica, sndrome de malabsorcin y desnutricin. Cuando el

    diagnstico se haca en esta etapa evolutiva de la enfermedad, las

    posibilidades teraputicas para modificar su curso eran muy limitadas y se la

    asociaba con una enfermedad letal en las primeras etapas de la vida.

    Gracias a los avances producidos en las dos ltimas dcadas, la FQ debe ser

    considerada como una enfermedad crnica, cuyo curso evolutivo se ver

    modificado favorablemente si las intervenciones teraputicas se realizan en el

    momento oportuno.

    Por estos motivos resulta necesario jerarquizar la importancia del diagnstico

    temprano, ya que permitir al nio y a su familia recibir las diversas acciones

    mdicas necesarias cuando la enfermedad an no ha producido daos o

    lesiones irreversibles y por otra parte, se les permitir a los padres recibir en

    forma oportuna el asesoramiento gentico necesario para su planificacin

    reproductiva.

    Los factores que retardan el diagnstico son los siguientes:

    o desconocimiento de la enfermedad por parte de los profesionales de la salud y de la comunidad en general

    o falta de informacin para el diagnstico oportuno en los sectores de la salud responsables del primer nivel de atencin

    o inaccesibilidad al diagnstico por las dificultades para realizar la prueba del sudor en los lugares prximos a la residencia del paciente

    En los ltimos aos estos factores han ido mejorando debido a la formacin de

    programas de pesquisa neonatal y unidades interdisciplinarias de diagnstico y

    tratamiento de FQ.

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    Segn el panel de consenso de la Cystic Fibrosis Foundation, el diagnstico de

    FQ debe estar basado en alguna de estas tres situaciones:

    1. presencia de una o ms caracterstica clnica de la enfermedad

    2. historia familiar de FQ

    3. pesquisa neonatal positiva

    ms una evidencia de laboratorio (bioqumica o molecular) que demuestre una

    alteracin del CFTR.

    La alteracin del CFTR puede ser demostrada por el test del sudor, la

    diferencia de potencial nasal o presencia de mutaciones en los dos alelos.

    Para los pacientes a los que no se les efectu la pesquisa neonatal, el

    diagnstico de la enfermedad se realiza cuando comiencen los sntomas y que

    pueden ser muy variables:

    o al nacimiento por obstruccin intestinal, hemorragias, ictericia o en la etapa de lactancia y niez por infecciones respiratorias recurrentes, diarrea y retardo en el desarrollo, prolapso rectal, plipos nasales, obstruccin

    pulmonar e insuficiencia pancretica.

    o en los adolescentes y adultos jvenes por asma atpico, bronquiectasia, insuficiencia pancretica, obstruccin pulmonar progresiva, esterilidad

    masculina.

    Pesquisa (screening) neonatal

    A partir de la demostracin en el 79 por Crossley y cols que los recin nacidos

    con FQ presentaban niveles elevados de Tripsina Inmunorreactiva (TIR) en sangre, se consider factible la realizacin de la pesquisa neonatal (PN) en forma masiva a travs de la medida de TIR.

    La TIR es una familia de molculas formada por tripsina y tripsingeno

    producidas por el pncreas. En circulacin se las encuentran unidas a alfa-1-

    antitripsina y alfa-2- macroglobulina y la va principal de eliminacin es el rin.

    Se reconocen tres mecanismos de aumento de TIR en neonatos con FQ:

    o regurgitacin a sangre por obstruccin de los ductos pancreticos como consecuencia de la acumulacin de secrecin viscosa con incremento de la

    presin intraductal,

  • 22

    o estimulacin persistente y mxima del pncreas durante los primeros das de vida por mecanismos neurales, endcrinos y paracrinos, desencadenada

    por el cambio de alimentacin placentaria a enteral,

    o inhibicin del mecanismo de retroalimentacin negativo sobre la secrecin pancretica de enzimas, regulado por la concentracin de enzimas activas en

    intestino (demostrado en modelos animales).

    El aumento de TIR no se asocia con los sntomas ni signos clnicos y va

    disminuyendo en el tiempo segn el grado de afectacin del pncreas. El

    pncreas va sufriendo un proceso progresivo de acumulacin de secreciones

    viscosas en los ductos y acinos, degradacin del tejido acinar y sustitucin del

    tejido funcional por tejido graso y fibroso, provocando que deje de producir TIR

    con el transcurso de los das. Hecho importante a tener en cuenta al analizar el

    resultado de TIR en la PN.

    El nivel de TIR tambin puede estar aumentado en individuos normales o en

    aquellos que padezcan otras patologas. Podemos mencionar: hipertripsinemia

    neonatal transitoria por causas fisiolgicas o factores relacionados con el estrs

    perinatal, trisomas 13, 18 y 21, infecciones virales congnitas, insuficiencia

    renal, atresia de intestino, hipoxia y mala perfusin del pncreas, portadores

    sanos.

    Actualmente la medida de TIR sigue siendo el marcador de eleccin para la

    prueba inicial en la PN de FQ. Puede efectuarse con distintos tipos de

    inmunoensayos como RIA, ELISA o DELFIA, aunque, como es sabido, los

    inmunoanlisis presentan ciertas limitaciones. Algunos individuos sanos y otras

    patologas especficas, pueden presentar niveles aumentados de TIR en el

    perodo neonatal, lo que tambin puede observarse en individuos portadores

    de una mutacin en el gen CFTR. La sensibilidad de la PN est por debajo de

    los valores ptimos, con lo cual los resultados falsos negativos resultan un

    hallazgo esperable.

    Ante un nio con sntomas compatibles con la enfermedad y resultados

    normales en la pruebas de pesquisa se debe indicar en forma inmediata la

    realizacin de la prueba del sudor.

    Actualmente existen distintas estrategias para llevar a cabo la pesquisa

    neonatal, todas parten de la determinacin de TIR en una primera muestra de

    sangre entera impregnada en papel de filtro (MSPF).

  • 23

    A partir de esta prueba inicial, las diferentes estrategias plantean diversas

    alternativas de deteccin que difieren en su sensibilidad, la especificidad, valor

    predictivo positivo, costo, aplicabilidad y tasa de recitacin.

    Estrategias diagnsticas a partir de la pesquisa neonatal La ms utilizada en nuestro medio es la estrategia TIR/ TIR. Ante un resultado elevado de TIR en la primera muestra, se solicita una

    segunda muestra de sangre antes de cumplir el mes de vida para realizar una

    nueva determinacin. Si se obtiene nuevamente un resultado anormal, se

    procede a indicar la realizacin del Test del sudor (TS) para confirmar o descartar la patologa. Se sugiere adems seguimiento clnico donde, si se

    considera conveniente, se solicita el estudio gentico. Un TS positivo y/o

    presencia de 2 mutaciones confirman el diagnstico.

    Desde el punto de vista de su aplicabilidad la estrategia TIR/ TIR no presenta

    ningn tipo de restricciones en relacin con las caractersticas de la poblacin

    en estudio que limiten la utilizacin de la misma.

    Otras estrategias incluyen la realizacin de estudios moleculares sobre la

    misma muestra MSPF ya sea en la primera (TIR/ADN) o segunda muestra (TIR/TIR/ADN). Si en la estrategia TIR/ADN el resultado de la biologa molecular no es

    concluyente (presencia de una mutacin o mutacin no detectable con

    resultado de TIR muy alto) se cita para realizar prueba del sudor o se solicita

    una segunda muestra para realizar TIR en MSPF (TIR/ADN/TIR),

    procedindose de aqu en ms a lo descripto en TIR/TIR.

    Si en la estrategia TIR/TIR/ADN el resultado de estudio molecular no es

    concluyente, se procede a citar al paciente para TS.

    La ventaja de las tcnicas moleculares en la PN es el acceso al diagnstico en

    forma rpida y un aumento en la sensibilidad, especificad y valor predictivo

    positivo, acompaado de una disminucin en el nmero de recitaciones de

    neonatos para la toma de una segunda muestra. Desde el punto de vista de los

    objetivos perseguidos por la PN, las tcnicas moleculares no slo detectan los

    casos confirmados de FQ sino tambin los individuos portadores, hecho que

    puede ser considerado como un efecto no deseado.

  • 24

    Las muestras de sangre para la PN de FQ se deben recolectar entre las 24

    horas y el 7 da de vida. Se deben tener en cuenta las siguientes

    consideraciones:

    1) estabilidad de la TIR en MSPF: las muestras deben ser analizadas dentro de

    los 15 das de su recoleccin, la TIR comienza a destruirse progresivamente en

    MSPF a temperatura ambiente pasadas dos semanas de efectuada la

    recoleccin, por lo que un valor normal carece de valor predictivo

    2) la recoleccin de la muestra no debe realizarse ms all de los 30 das de

    vida, el pncreas con el transcurso de los das comienza a disminuir la

    produccin de TIR. Un resultado normal no descarta la patologa y carece de

    valor diagnstico.

    3) recin nacidos con leo meconial es por s mismo un indicador de

    diagnstico presuntivo de FQ y, por lo tanto, no afecta la eficiencia diagnstica

    del sistema de pesquisa neonatal.

    Test del sudor

    La determinacin de electrolitos en secrecin de sudor contina siendo la

    prueba ms importante de confirmacin de FQ.

    Se realiza por iontoforesis con pilocarpina y fue introducido por Gibson y Cooke

    en 1959 y posteriormente modificado por Shwachman.

    Consiste en la estimulacin de las glndulas sudorparas de un rea

    determinada de la piel por la introduccin de pilocarpina, que es un estimulador

    de la va colinrgica de las glndulas.

    En el sudor recolectado y cuantificado se procede a la determinacin de cloruro

    y/o sodio.

    Los valores de cloruro se determinan mediante el mtodo de Schales y Schales

    y los de sodio por fotometra de llama.

    Hay otros mtodos cuantitativos de lectura directa como conductividad, in

    selectivo y osmolaridad. Estos mtodos no deben utilizarse como

    confirmatorios, ya que la cantidad de sudor obtenida no es cuantificada, ni se

    previenen los riesgos de condensacin y evaporacin de la muestra.

    Consideraciones a tener en cuenta:

  • 25

    o debe ser realizado en pacientes estables, luego de las 48 horas de vida ya que se pueden encontrar valores transitoriamente elevados,

    o el sitio de eleccin para la recoleccin es el antebrazo, en otros lugares como cabeza o frente son ms factibles las quemaduras,

    o no estimular en la zona del tronco por posible riesgo cardaco, o en caso de cuantificar un nico in, el elegido es el cloruro, o valores superiores a 160 mEq/l no son fisiolgicamente posibles y

    expresan un error.

    Valores de referencia del cloruro para el test del sudor Los pacientes con FQ presentan valores superiores a 60 mEq/l, slo el 3,5%

    valores inferiores a 60 mEq/l y el 1,2% menores a 40 mEq/l.

    Los valores menores de 39 mEq/l son considerados normales para mayores de

    6 meses y valores menores de 30 mEq/l para menores de 6 meses.

    Se debe repetir la prueba siempre que de positiva, cuando el resultado se

    encuentra en el rango intermedio (entre 40-59 mEq/l) y cuando la evolucin

    clnica no es la esperada.

    Valor normal Valor intermedio Valor alto

    Menor de 6 meses Mayor de 6 meses

    < 30 mEq/l < 39 mEq/l 40-59 mEq/l > 60 mEq/l

    Tabla 2. Valores de referencia del cloruro para el test del sudor.

    Las principales fuentes de error que originan falsos positivos o negativos estn

    generalmente relacionados con metodologa no estandarizada y errores

    tcnicos.

    Hay condiciones que estn asociadas a resultados elevados en pacientes sin

    FQ.

  • 26

    Insuficiencia adrenal

    Pseudohipoaldosteronismo

    Hipotiroidismo no tratado

    Diabetes inspida nefrognica

    Hipoparatiroidismo

    Displasia ectodrmica

    Enfermedad por almacenamiento de glucgeno

    Mucopolisacaridosis

    Fucosidosis

    Malnutricin

    Sndrome mauraco

    Anorexia nerviosa

    Sndrome de colestasis familiar

    Pancreatitis

    Administracin de prostaglandina E+

    Tabla 3. Las filas sombreadas indican las patologas en las que la prueba del sudor se normaliza cuando se resuelve la patologa de base.

    Pruebas del sudor falso negativa se pueden dar en pacientes FQ con edema e

    hipoproteinemia. Se debe repetir la prueba cuando se corrija la situacin.

    Algunas mutaciones como c.350G>A (R117H), c.1651G>A (G551S),

    c.3454G>C (D1152H), c.1364C>A (A455E), IVS8-5T dan valores de cloruro

    dudosos.

    Hay estudios adicionales que son tiles en los casos con caractersticas

    clnicas de FQ, pero que los resultados de TS no confirman la enfermedad y se

    detecta una nica mutacin. Estos estudios sirven para demostrar prdida de

    grasas en materia fecal o dficit de enzimas a nivel intestinal:

    o Pruebas que sugieren malabsorcin como citoqumico de materia fecal y esteatocrito

    o Pruebas que confirman malabsorcin como Van de Kamer o Pruebas que evalan funcin pancretica como quimotripsina y elastasa en materia fecal.

  • 27

    La caracterizacin de la flora bacteriana del tracto respiratorio es siempre til,

    especialmente en pacientes con caractersticas atpicas de FQ. Se han hallado

    en estos pacientes Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus,

    Haemophilus influenzae y Burkholderia cepacia.

    En Argentina la deteccin de la Fibrosis Qustica se incorpora a la pesquisa

    neonatal por la Ley Nacional N 24.438 (01/95) y el 04 de septiembre de 2007

    se sanciona la Ley 26.279 que obliga a la deteccin y posterior tratamiento de

    Fenilcetonuria, Hipotiroidismo Neonatal, Fibrosis Qustica, Galactosemia,

    Deficiencia de la Biotinidasa, Hiperplasia Suprarrenal Congnita, Retinopata

    del prematuro, Chagas y Sfilis.

    Al ser este un pas federal, cada provincia sanciona sus propias leyes y puede

    adherir o no a la Ley Nacional. Por este motivo hay algunas provincias donde la

    PN tiene en elevado nivel de organizacin mientras que en otras es parcial o

    inexistente.

    En Santa Fe a partir del 01 de julio 2.009 se realizan las 6 determinaciones

    relacionadas con PN en el Laboratorio de Referencia Provincial de la ciudad de

    Santa Fe.

    Segn datos preliminares aportados por diferentes programas de PN de

    nuestro pas, en Argentina tendramos una incidencia de 1/6.100 recin nacidos

    y se infiere que la prevalencia de portadores en la poblacin es de 1/40.

    Diagnstico molecular

    El diagnstico molecular es la bsqueda de 2 mutaciones responsables de la

    FQ (enfermedad recesiva) que permite confirmar definitivamente el diagnstico

    clnico observado en el paciente. El diagnstico molecular se puede abordar en

    2 etapas:

    o de primera lnea para mutaciones frecuentes: con un nmero bien definido de mutaciones frecuentes para la poblacin en estudio.

    o de segunda lnea: bsqueda de cualquier tipo de mutacin en exones del CFTR.

    La Fibrosis Qustica es una enfermedad de los caucsicos (raza blanca).

  • 28

    Los 2 continentes caucsicos tienen dos mtodos de primera lnea bien

    diferentes, porque las frecuencias de las mutaciones son distintas.

    1. Diagnstico molecular de primera lnea en Europa El diagnstico molecular se realiza con un kit comercial que tiene un nmero

    limitado de mutaciones. Como se ve en las ltimas recomendaciones europeas:

    Referencia: E. Dequeker et al. Best practice guidelines for molecular genetic diagnostic of cystic fibrosis and CFTR-related disorders updated European recommendations; European Journal of Human Genetics (2009) 17, 51-65.

    Actualmente en Europa, varios kits estn disponibles y permiten detectar entre

    20 y 36 mutaciones. Este anlisis corresponde a un diagnstico molecular

    (screening) de primera lnea. La recomendacin es utilizar un kit que presente

    sensibilidad local (en el pas o regin) es decir que cubra un mnimo de 80-90%

    de la mutaciones locales (Referencia: E. Dequeker et al. Recommendations for

    quality improvement in genetic testing For cystic fibrosis European Concerted

    Action on Cystic Fibrosis European Journal of Human Genetics (2000) 8, S2-

    S24)

    2. Diagnstico de primera lnea en EE.UU. ACMG (American College of Medical Genetics) y ACOG (American College of

    Obstetricians and Gynecologists recomiendan utilizar un panel de 23

  • 29

    mutaciones. Anteriormente se evaluaban 24 mutaciones (Grody et al. 2001)

    pero luego la mutacin I148T fue eliminada por ser un polimorfismo (Watson et

    al. 2004).

    Las mutaciones son c.2988+1G>A (3120+1G>A), c.1364C>A (A455E),

    c.254G>A (G85E), c.1000C>T (R334W), c.1585-1G>A (1717-1G>A),

    c.3528delC (3659delC), c.1521_1523delCTT (F508del), c.1040G>C (R347P),

    c.1766+1G>A (1898+1G>A), c.3717+12191C>T (3849+10kbC>T),

    c.1519_1521delATC (I507del), c.3909C>G (N1303K), c.1657C>T (R553X),

    c.2052delA (2184delA), c.489+1G>T (621+1G>T), c.1624G>T (G542X),

    c.3484C>T (R1162X), c.1679G>C (R560T), c.2657+5G>A (2789+5G>A),

    c.579+1G>T (711+1G>T), c.1652G>A (G551D), c.350G>A (R117H) y

    c.3846G>A (W1282X).

    Con este panel la sensibilidad es variable segn el origen tnico:

    Poblacin Sensibilidad

    Judo Ashkenazi 97,0%

    Caucsico No-Hispnico 88,3%

    Afro Americano 69,0%

    Americano-Hispnico 57,0%

    Americano-Astitico Desconocido

    Tabla 4. Sensibilidad del screening en EE.UU. para el panel de 23 mutaciones segn el origen tnico de los individuos. 3. Diagnstico de segunda lnea en Europa y EE.UU.

    Los mtodos de segunda lnea se realizan en laboratorios con mayor

    especializacin en tcnicas de biologa molecular y permiten detectar cualquier

    otra mutacin que no se encuentre en los paneles antes mencionados y

    tambin mutaciones noveles (recordemos que existen ms de 1941 mutaciones

    a la fecha).

    Para un diagnstico de segunda lnea existen varios mtodos, de los cuales el

    mejor es la secuenciacin. Tanto en Europa como en EE.UU. los mtodos de

  • 30

    segunda lnea son los mismos, aunque la tcnica MLPA est menos utilizada

    en EE.UU

    Referencia : E. Dequeker et al. Best practice guidelines for molecular genetic diagnostic of cystic fibrosis and CFTR-related disorders updated European recommendations; European Journal of Human Genetics (2009) 17, 51-65.

    Segn la informacin disponible en www.geneclinics.org, la secuenciacin de

    todo el gen permite una sensibilidad de 98,7%.

    El esquema utilizado comenzando con un test de primera lnea es:

    1. si se encuentran 2 mutaciones el diagnstico molecular est realizado 2. si una sola o ninguna mutacin es descubierta, con un diagnstico clnico claro, seguimos con un test de segunda lnea

    IV.1.8 Herencia, riesgo La Fibrosis Qustica es una enfermedad recesiva. Si ambos miembros de una

    pareja llevan una mutacin (portadores), presentarn:

    - 25% de probabilidad de tener un nio afectado de Fibrosis Qustica

    - 50% de probabilidad de tener un nio portador de una mutacin

    - 25% de probabilidad de tener un nio sin mutacin

  • 31

    Figura 17. Herencia.

    La incidencia de la enfermedad en Europa es de 1/ 2.000 a 1/ 3.000 segn el

    pas.

    Por poblacin la incidencia y probabilidad de ser portador es muy diferente,

    afectando primero a los caucsicos y ltimo a los asiticos.

    Poblacin europea Incidencia Probabilidad de ser portador

    Caucsico 1/2.500 1/25

    Oriente medio 1/4.400 1/33

    Hispnico 1/8.500 1/46

    Afro-americanos y Africanos

    1/20.000 1/70

    Asitico 1/32.400 1/90

    Tabla 5. Probabilidad en Europa de ser portador en relacin al origen de la poblacin. Referencia: Donnes pidemiologiques daprs Monaghan et Feldman, Prenat Diagn 1999; 19: 604-9. Cit par Girodon-Boulandet dans Gntique de la mucovisciodose (Mdecine thrapeutique / Pdiatrie. Volume 8, Number 3, 126-34, mai-juin 2005).

  • 32

    Otras referencias

    Poblacin de EE.UU. Probabilidad de ser

    portador Referencias

    Judo Ashkenazi 1/29 Kerem et al [1997]

    Caucsico Norteamericano 1/28 Hamosh et al [1998]

    Afro Americano 1/61 Hamosh et al [1998] Tabla 6. Probabilidad en EE.UU. de ser portador en relacin al origen de la poblacin. Referencia: www.geneclinics.org

    Si un test de primera lnea tiene una sensibilidad local del 90% (significa que

    sumando la frecuencia de las mutaciones locales llegamos a 90%) y

    obtenemos un resultado normal, queda una probabilidad de ser portador de

    1/200.

    Veamos en la siguiente tabla cul ser la probabilidad a priori de una pareja de

    concebir un nio con FQ en funcin de si tiene o no estudio molecular y si se

    ha encontrado o no una mutacin.

    Por ejemplo, una pareja sin diagnstico molecular, cada uno tiene una

    probabilidad de portar de 1/25 y cada uno tiene una probabilidad de transmitir

    el alelo mutado de 1/2. La probabilidad que la pareja tenga un nio con FQ es

    1/25 (probabilidad hombre) x 1/2 (probabilidad de transmitirlo) x 1/25

    (probabilidad mujer) x 1/2 (probabilidad de transmitirlo) = 1/2.500 (probabilidad

    que el nio tenga FQ) corresponde a la incidencia en caucsicos europeos.

    Hombre Mujer Probabilidad del nio

    Sin estudio Sin estudio 1/25 x 1/2 x 1/25 x 1/2 = 1/2.500

    Estudio normal Sin estudio 1/200 x 1/2 x 1/25 x 1/2 = 1/20.000

    Sin estudio Estudio normal 1/25 x 1/2 x 1/200 x 1/2 = 1/20.000

    Estudio normal Estudio normal 1/200 x 1/2 x 1/200 x 1/2 = 1/160.000

    1 mutacin Sin estudio 1 x 1/2 x 1/25 x 1/2 = 1/100

    Sin estudio 1 mutacin 1/25 x 1/2 x 1 x 1/2 = 1/100

    1 mutacin 1 mutacin 1 x 1/2 x 1 x 1/2 = 1/4

    1 mutacin Estudio normal 1 x 1/2 x 1/200 x 1/2 = 1/800

    Estudio normal 1 mutacin 1/200 x 1/2 x 1 x 1/2 = 1/800

    Tabla 7. Probabilidades

  • 33

    Estudio de Fibrosis Qustica en la ciudad de Rosario, Santa Fe, Argentina. A la fecha se ha finalizado la etapa de diagnstico molecular y se estn

    analizando los resultados de un proyecto de investigacin multicntrico

    realizado por un convenio entre el Instituto Universitario Italiano de Rosario y el

    Centro de Gentica Humana UCL (Universidad Catlica de Lovaina) Bruselas,

    Blgica, para el estudio molecular de pacientes con FQ.

    Ttulo del proyecto:

    Estudio del tipo y de la distribucin de mutaciones responsables de la Fibrosis Qustica en la ciudad de Rosario, provincia de Santa Fe, Argentina y la ciudad de Campinas, estado de Sao Paulo, Brasil El objetivo de este proyecto es efectuar el diagnstico molecular de fibrosis

    qustica mediante el estudio del gen CFTR en una poblacin de 100 nios, sin

    relacin de parentesco, diagnosticados clnicamente en la ciudad de Rosario,

    Argentina y 100 nios, sin relacin de parentesco, diagnosticados clnicamente

    en el estado de Sao Paulo, Brasil.

    Se secuenciarn las regiones codificantes del gen CFTR, incluyendo las

    extremidades intrnicas y se continuar con la determinacin de grandes

    cambios del gen por MLPA.

    El conocimiento de las frecuencias de las diferentes mutaciones contribuir al

    desarrollo metodolgico de un panel de primera lnea adaptado a un contexto

    tnico local que permita la deteccin de mutaciones con una sensibilidad local

    de 80-90%.

    IV.1.9 Presentacin de casos Caso 1: slo dispone de anlisis moleculares de primera lnea. Una pareja consulta a un profesional de una clnica de fertilidad. Despus de

    los anlisis clnicos correspondientes se determina ausencia de

    espermatozoides en el semen.

    El mdico solicita una bsqueda de las principales mutaciones del gen CFTR.

    El anlisis molecular de primera lnea encontr una sola mutacin

    c.1521_1523delCTT (F508del) en el hombre. En el resultado se aconseja

    buscar dicha mutacin en los hermanos y progenitores del mismo.

  • 34

    Para la pareja como la probabilidad de tener un nio con FQ es alta, de 1/100

    (1 x 1/2 x 1/25 x 1/2 Tabla 7) se conseja un anlisis molecular en la mujer.

    Este ltimo, no revela mutacin, significa que disminuye la probabilidad a 1/800

    (1 x 1/2 x 1/200 x1/2).

    Caso 2: J. A. es un nio que naci con leo meconial, tiene diarreas y retraso de

    crecimiento. Es el tercer hijo de un matrimonio. Los otros nios no tienen

    signos ni sntomas relacionados con fibrosis qustica.

    El mdico genetista solicita un anlisis molecular para confirmar el diagnstico

    clnico de Fibrosis Qustica. Los anlisis moleculares de primera lnea sobre el

    ADN del nio descubren la mutacin ms comn, la c.1521_1523delCTT

    (F508del), en estado heterocigoto. Durante los primeros meses de vida los

    sntomas del nio empeoran. El anlisis molecular sobre el ADN de los padres

    de J. A., revela que la mutacin c.1521_1523delCTT (F508del) proviene del

    padre.

    Figura 18. Resultado normal de 71 mutaciones ms comunes en Europa por la tcnica Luminex. Verde presencia del alelo normal, azul presencia de la mutacin

  • 35

    Figura 19. Resultado de J. A.

    Presencia de una relacin de 50% por el alelo normal y un relacin de 50%

    para el alelo con la mutacin c.1521_1523delCTT (F508del) que indica el

    estado heterocigoto de la misma.

    El centro de Gentica decide buscar la segunda mutacin por un anlisis de

    segunda lnea, secuenciando los 27 exones del gen CFTR. Ninguna mutacin

    fue descubierta.

    Como ltima lnea el laboratorio de Gentica decide estudiar el gen CFTR de J.

    A. por MLPA. Esta tcnica permite determinar si todos los exones se

    encuentran en 2 copias, una paterna y otra materna. El ADN de J. A. revela

    una delecin del exn 2.

  • 36

    Figura 20. Resultado de J.A. Flecha a la izquierda, la delecin del exn 2 se ve por disminucin del pico azul de la muestra respecto al pico control en rojo. Flecha de la derecha, aparicin de un pico suplementario correspondiente a la mutacin c.1521_1523delCTT (F508del). A la derecha se ve un punto rojo que corresponde a una delecin del exn 2.

    El estudio de secuenciacin revel un exn 2 normal que corresponda al alelo

    normal de J. A. pero no pudo detectar la ausencia del exn 2 en el otro alelo ya

    que es una gran delecin que no puede ser detectada por este mtodo.

    La utilizacin del MLPA permite confirmar una gran delecin que comienza en

    el intrn 1 y termina en el intrn 2. El estudio del ADN de los padres del nio

    por MLPA revela la misma delecin en la mam.

    Adems la abuela materna de J. A. es originaria de Galicia, comunidad

    autnoma de Espaa que tiene origen cltico como en Irlanda y el sur de

    Inglaterra (zona de grandes deleciones del gen CFTR). Los celtas tienen un

    nmero importante de grandes deleciones que toman un solo o varios exones

    del gen CFTR. La mutacin c.1521_1523delCTT (F508del) del lado paterno y

    la delecin del exn 2 del lado materno permiten confirmar un estado de

    heterocigoto compuesto para J. A. con el genotipo c.1521_1523delCTT

    (F508del)/ delecin del exn 2 y confirmar el diagnstico molecular de la

    enfermedad de Fibrosis Qustica.

    El estudio de la hermana mayor de J. A. slo revela la presencia de la mutacin

    paterna c.1521_1523delCTT (F508del) (estado de portador) y el del hermano

    mayor releva la presencia de la mutacin delecin del exn 2 (estado de

    portado).

    c.1521_1523delCTT /delecin exn 2

  • 37

    Los padres de J. A. son informados del riesgo de FQ de 1/4 para un prximo

    hijo/a. El diagnstico prenatal es una opcin a la que puede acceder la pareja si

    as lo desea.

    La pareja por conviccin religiosa (catlico practicante) decidi no tener ms

    hijos.