ALERGIA MECANISMOS INMUNOLOGICOS

METODOS DE DIAGNOSTICO

Dr. Edgar Matos BenavidesInmunologo Alergologo

PREVALENCIA DE LAS ENFERMEDADES ALERGICASPREVALENCIA DE LAS ENFERMEDADES ALERGICASEN LA POBLACION PEDIATRICA GENERALEN LA POBLACION PEDIATRICA GENERAL

En la actualidad se estima que:En la actualidad se estima que:• un 3% de los niños son alérgicos a alimentosun 3% de los niños son alérgicos a alimentos• un 8 % presentan dermatitis atópicaun 8 % presentan dermatitis atópica• entre un 8 % y un 10% padecen asma entre un 8 % y un 10% padecen asma • casi un 20 % sufren de rinitis o rinoconjuntivitis.casi un 20 % sufren de rinitis o rinoconjuntivitis.

La mitad de la población mundial será alérgica en 2050

La mitad de la población mundial será alérgica en 2050

El País, martes 24 de junio de 2003El País, martes 24 de junio de 2003

ENFERMEDAD ALERGICA: ETIOLOGIA

PredisposiciónGENETICA

Exposición aALERGENOS

ENFERMEDAD ALERGICA

CONTAMINACION

HUMO TABACO

VIRUS-BACTERIAS

ALERGIA

“ “ Reacción exagerada de defensa a Reacción exagerada de defensa a una sustancia particular, que puede una sustancia particular, que puede ser inhalada, ingerida o inoculada en ser inhalada, ingerida o inoculada en nuestro cuerpo y provocar una nuestro cuerpo y provocar una respuesta inmunológica de tipo respuesta inmunológica de tipo inflamatorio. ” inflamatorio. ”

Alergia una Enfermedad Sistémica RINITIS ALERGICA

CONJUNTIVITISSINUSITISOTITISRGE

ALERGIA ALIMENTARIA

DERMATITIS ATOPICA

ASMA BRONQUIAL

Alergia

URTICARIAANGIOEDEMAPRURIGO PORINSECTOS

histamina,factor quimiotáctico de los eosinófilosfactor quimiotáctico de los neutrófilos

leucotrienos prostaglandinas y tromboxanos

factor activador de las plaquetas IL- 4 e IL- 5

• vasodilatación• aumento de la permeabilidad vascular postcapilar• edema• contracción de la musculatura lisa• aumento de la secreción de las glándulas mucosas

Componentes principales que se requieren para que la reacción alérgica se desencadene

IgEIgEALERGENOSALERGENOS

MastocitosMastocitos HistaminaHistamina

LeucotrienosLeucotrienos

1ªIdentificar y relacionar la clínica

del paciente con los posibles alérgenos: HISTORIA CLÍNICA

Etapas diagnósticas

2ªDemostración de sensibilización mediada por IgE

para el o los alergenos sospechoso:Pª CUTÁNEA, IgE SÉRICA ESPECÍFICA

3ªConfirmación de que el alérgeno es el responsable de

la clínica:Pª de PROVOCACION o EXPOSICIÓN CONTROLADA

TEST DE ACTIBACION DE BASOFILOS

PRUEBA CUTANEA INTRAEPIDERMICA

PRUEBA CUTANEA INTRAEPIDERMICA

+ Diámetro 3 mm

15 minutos

solo están indicadas en el estudio de la alergia medicamentosa y venenos

Prick-Film. Lectura de prick test con Escáner

Prick-Film. Lectura de prick test con Escáner

Aplicación Alergenos  Punción con LancetaSecado Piel  Espera de Reacción

Contorneado de Habones Traslado a Hoja Codificada Lectura Escáner Impresión Resultados

FUNDAMENTO RIDA.pdf

La prueba se basa en el principio del análisis del immunoblot. Los alérgenos especiales están pegados a la superficie de las membranas de la nitrocelulosa que se colocan en un canal de reacción.

.

B

NBT

B

B NBT

 

Comparación con el método de referencia (IgE):

Comparación con el skin-prick test:

Sensibilidad: 84.3 % Sensibilidad: 95.1 %

FUNDAMENTO immulite.pdf

•IMMULITE 2500 3gAllergy™ IgE Específica es un análisis enzimoinmunométrico quimioluminiscente en fase sólida, en dos pasos,

•Se basa en cinéticas en fase líquida en formato de bola10,11 .

• Representa un avance significativo sobre los métodos convencionales basados en la unión de los alérgenos a un soporte sólido, como los discos de papel.

•Los alérgenos se unen covalentemente a una matriz polímero/copolímero soluble, la cual a su vez está marcada con un ligando. El uso de un copolímero aminoacídico aumenta la cantidad de alérgeno que puede soportar la matriz.

FA

FA

FA

S

FUNDAMENTOUNICAPSYSTEM.doc

UniCAP IgE total es un análisis cuantitativo in vitro para la medida de IgE total en muestras humanas del suero o del plasma.

Anti-IgE, covalente unida a ImmunoCAP, reacciona con el IgE total en el espécimen paciente.

Se los anticuerpos contra IgE marcados con una enzima se agregan para formar un complejo.

Se agrega una solución de desarrollo y una para parar la reacción.

Después de parar la reacción, la fluorescencia se mide. La fluorescencia es directamente proporcional con la concentración de IgE en la muestra..

E

E4MUP

E4MUP

Tecnología ImmunoCAP CAP System™

ImmunoCAP®

ImmunoCAP™

Capacidad de ligando: tubo recubierto; disco papel; esponja celulosa

Tuborecubierto

ImmunoCAP

Disco papelactivado

Esponja celulosaactivada

1 50 150

™

Fases sólidas:

IgE del paciente

Alergenos (Anti-IgE acoplado al ImmunoCAP)

Anti-IgE paciente unido a enzima β-GalactosidasaComplejo: Alergeno-IgE paciente

Sustrato de la enzima β-GalactosidasaComplejo: Alergeno-IgE paciente-Anti-IgE

Reacción enzimática: β-Galactosidasa

Sustrato no fluorescente Sustrato fluorescente Detección

FEIA: FluoroenzimoimmunoensayoFEIA: Fluoroenzimoimmunoensayo

N. Liappis, A. Starke, Allergologie, Jahrgang 20; no 6/1997: 291-295

Reproducibilidad del Sistema ImmunoCAPReproducibilidad del Sistema ImmunoCAP

Patrón WHO 75/502 Tecnología Patrón WHO 75/502 Tecnología ImmunoCAPImmunoCAP™™

W HO

El primer test alergológico del mundo con calibracióndirecta según patrones 2º IRP WHO 75/502 pera IgE.

Similitudes y diferencias entre la tecnología Phadia ImmunoCAP™

in vitro y la prueba cutánea in vivo

Características Tecnología Phadia ImmunoCAP

Prueba cutánea in vivo

Alta sensibilidad Sí SíAlta especificidad Sí Sí /NoAlta reproducibilidad Sí NoResultados cuantitativos Sí Sí /NoCalibrado según la OMS Sí NoPrograma con garantía de calidad Sí No

Prueba utilizable con independencia Sí Nodel tratamiento farmacéuticoPrueba utilizable con independencia Sí Nodel estado cutáneo del paciente(es decir, dermatitis atópica)

Referencia: From In Vitro Veritas Broschyre

IG E Especifica

Tests de screening

Tests de screening

Tests de screening

Tests de screening

Tests de screening

1.-La identificación precoz de los niños que padecerán asma persistente es de capital importancia2.-La atopia es el principal factor de riesgo en el padecimiento de asma

3.-Es posible reconocer la atopia, desde muy temprana edad, identificando la sensibilización a alimentos y a inhalantes4.-En niños con dermatitis atópica, la presencia de esta sensibilización tiene un alto valor pronóstico de evolución futura a asma

Conclusiones

1ªIdentificar y relacionar la clínica

del paciente con los posibles alérgenos: HISTORIA CLÍNICA

Etapas diagnósticas

2ªDemostración de sensibilización mediada por IgE

para el o los alergenos sospechoso:Pª CUTÁNEA, IgE SÉRICA ESPECÍFICA

3ªConfirmación de que el alérgeno es el responsable de

la clínica:Pª de PROVOCACION o EXPOSICIÓN CONTROLADA

TEST DE ACTIBACION DE BASOFILOS

COMO SE Dx ALERGIAS22°PRUEBAS °PRUEBAS CUTANEASCUTANEAS

Ig E SéricaIg E Sérica

1° HISTORIA 1° HISTORIA

CLINICACLINICA

3°PRUEBAS DE PROVOCACION3°PRUEBAS DE PROVOCACIONTEST DE ACTIVACION BASOFILOSTEST DE ACTIVACION BASOFILOS

BASOFILOSBASOFILOS

TABTAB

CITOMETRIA DE FLUJO

CITOMETRIA DE FLUJOProcedimiento que mide características de dispersión y fluorescencia que poseen las células conforme pasan por un rayo de luzLas células interaccionan con un rayo de luz causando dispersión dependiendo del tamaño y la complejidad

CITOMETRIA DE FLUJO

DIGITALIZACION

REPRESENTACION GRAFICA

ANALISIS

LABORATORIO DE CITOMETRIA DE FLUJO Y BIOLOGIA MOLECULAR

IHEMATEC

Test de Activacion de Basofilos (TAB)Es una herramienta útil en el

diagnóstico in vitro de las reacciones de hipersensibilidad inmediata a los Alergenos, Medicamentos, si estas son causados por mecanismos dependientes de IgE u otros mecanismos que conduzcan a la liberación de histamina.

MARCADORES CELULARES

CD63 CD203c

•Es una proteína granular tetraespan de 53 Kda •Está anclada en los gránulos de la membrana de los basófilos •Por CM se detecta Anti CD63 PE y anti IgE FITC

•Es un Ag de superficie, expresado en basófilos humanos recientemente reconocida por el Acm 97A6•Es una ectoenzima multifuncional llamada pirofosfatasa ectonucleotide phophodiesterase 3 (E-NPP3)

La población celular de interés se marca con anticuerpos monoclonales en presencia del alérgeno. Previamente al análisis por citometría de flujo, los eritrocitos se someten a lisis. A continuación se excluyen los linfocitos T (células positivas CD3) y después se analizan los basófilos utilizando la expresión de CRTH2 y CD203c. Los basófilos no activados y en reposo se identifican como CRTH2posCD203cdimCD3neg, mientras que los basófilos activados in vitro se identifican como CRTH2posCD203cbrightCD3neg.

FUNDAMENTO

muestraHISTOGRAMA DE MUESTRA

SANGUINEAMUESTRA CON METAMIZOL

1mg/2ml

CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO

MODELO DE RESULTADO DE TAB

TEST DE ACTIVACIÓN DE BASÓFILOS USANDO CD203C VERSUS PRUEBAS

CUTANEAS EN LA DETERMINACION DE REACCIONES ADVERSAS A METAMIZOL: UN

ESTUDIO PILOTOMatos Edgar1, Loyola-Sosa Steev1,2, Paredes José1,

Inocente Rosario1, Paiva Mario1, Ríos Hugo1, Álvarez Marco1

1 Instituto de Hemaféresis y Terapia Celular (IHEMATEC)2 Universidad Peruana Cayetano Heredia

Métodos y Materiales• Participaron 40 pacientes: 75.0% (30/40) con

historia clínica positiva.

Historia Clínica de RAM AINE

AINE no MetamizolMetamizol

Pruebas CutáneasTest de Activación de

Basófilos CD203c

Prick Test

Intradermorreacción

ResultadosPRUEBAS CUTÁNEAS

Prick Test IntradermorreaciónTAB

CD203cPositivo Negativo Positivo Negativo

Positivo 0 4 (FN) 1 3 (FN)Negativo 0 36 0 36

TOTAL 0 40 1 39

% sensibilización por RAM a Metamizol (30/40) según:Prick Test: 0.0% (0/30)Intradermorreación: 3.3% (1/30)TAB CD203c: 13.3% (4/30)

Resultados• PT vs. TAB-CD203c:

– Sensibilidad: 0.0%– Especificidad: 100.00% – Valor Predictivo Negativo: 90.0%

• IR vs. TAC-CD203c:– Sensibilidad: 25.0%– Especificidad: 100.00% – Valor Predictivo Negativo: 92.3%– Valor Predictivo Positivo: 100.0%

Conclusiones• Se tiene exitosamente una primera fase de

evaluación de desempeño del TAB-CD203c.• TAB-CD203c presenta mejor performance

para determinar alergia a fármacos; tipo Metamizol, frente a pruebas cutáneas.

• Es necesario realizar estudios que evalúen el costo-beneficio del uso del TAB-CD203c.

DISCUSION

• La BAT constituye una herramienta diagnóstica valiosa de interés en el estudio de reacciones de hipersensibilidad inmediata a los medicamentos.

• Reproduce in vitro mecanismos de hipersensibilidad involucrados en reacciones alérgicas inmediatas.

• También permite el diagnóstico de reacciones alérgicas y pseudoalérgicas, particularmente por medicamentos que a menudo no son detectables por técnicas serológicas como la determinación de IgE específica.

DISCUSION

La reproducibilidad intra-ensayo es muy notable en la alergia a medicamentos con coeficiente de variación intra-ensayo de 0.89 (P <0.0001) para beta-lactámicos, 0.99 (P <0.0001) para metamizol y 0.92 (P <0.0001) para determinados AINES

DISCUSION

Además, varios medicamentos pueden ser probados simultáneamente, con una pequeña cantidad de sangre La colaboración internacional será útil para facilitar un consenso sobre el uso de BAT en la evaluación de alergia inmediata a medicamentos.

59

Mérida, 22 Noviembre 2012

AUTOINMUNIDADDiagnostico “in vitro”

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ENFERMEDADES AUTOINMUNES Primeros síntomas muy genéricos Síntomas clínicos similares Múltiples órganos afectados Diferentes facultativos implicados (médicos de atención

primaria, reumatólogos, medicina interna, gastroenterólogos, ginecólogos, etc.)

DIAGNÓSTICO DIFICIL

PRUEBAS DE LABORATORIO ESPECÍFICAS Y FIABLES COMO AYUDA

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AUTOANTICUERPOS Pruebas de laboratorio: técnicas de detección de

autoanticuerpos- Técnicas de Precipitación:

* Inmunoprecipitación* Inmunodifusión* Contrainmuno-electroforesis

- Técnicas de Aglutinación: Hemaglutinación- Inmunoensayos:

* Inmunoblotting* Radioinmunoensayo (RIA)* Inmunofluorescencia (IFI)* Enzimoinmunoensayo (ELISA)* Tecnología multiplex

61

Reacciones antígeno-anticuerpo

antígenosautoanticuerpos

2º anticuerpos marcado

62 62

EQUIPOS

Phadia 100 Phadia 250

AUTOINMUNIDAD DE PHADIA

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MARCAS

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TECNOLOGÍA EliA- Enzimoinmunoensayo por fluorescencia.- Pocillos individualizados EliA wells

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COLORIMETRÍA FLUORESCENCIA

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TECNOLOGÍA EliA Tecnología EliA

- Antígenos recombinantes o purificados producidos bajo condiciones controladas según las normas GMP (Good Manufacturing practice) e ISO.- Sistema de baculovirus- Diferentes analitos en el mismo ensayo- Sistema de calibración único e independiente del analito

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Analitos enfermedades autoinmunes

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GRACIAS|