Efectos antiinflamatorios in vivo y Mecanismos

relacionados de la yema de huevo procesada, un

potencial Suplemento dietético antiinflamatorio Joan Cunill 1,*, Clara Babot 1 , Liliana Santos 2 , José C. E. Serrano 2, Mariona Jové 2, Meritxell Martin-Garí 2 and Manuel Portero-Otín 2,* 1 Ovivity Group, c/Angli 66 (torre), E08017 Barcelona, Spain; clarababot@ovivity.com 2 Metabolic Pathophysiology Research Group/Nutren-Nutrigenomics, University of Lleida-Lleida Biomedical Research Institute’s Pifarré Foundation (IRBLleida), Avda Rovira Roure, 80 E-25196 Lleida, Spain; ltsantos@ua.pt (L.S.); jceserrano@udl.cat (J.C.E.S.); mariona.jove@udl.cat (M.J.); meritxell.martin@udl.cat (M.M.-G.) * Correspondence: joancunill@excelvit.com (J.C.); manuel.portero@udl.cat (M.P.-O.); Tel.: +34-69-641-9428 (J.C.); +34-97-370-2408 (M.P.-O.); Fax: +34-93-212-0130 (J.C.); +34-97-370-2426 (M.P.-O.) Received: 28 July 2020; Accepted: 30 August 2020; Published: 4 September 2020

Abstract: Los suplementos a base de yema de huevo han demostrado tener efectos biológicos. Hemos

desarrollado un nuevo complemento de yema de huevo (PEY) procesada, y hemos llevado a cabo un experimento

científico para comprobar si tiene propiedades moduladoras de la inflamación. Estas propiedades fueron

evaluadas en un lipopolisacárido (LPS)- en ratas macho de 1 mes de edad, por medio de los perfiles de citoquinas

en sangre in vivo medido con técnicas de “multiplexing”. Los cultivos celulares fueron usados para explorar las

propiedades ex vivo de las muestras de suero extraídas. Hemos explorado la composición de PEY en cuanto a los

factores de crecimiento, metaboloma y lipidoma mediante análisis de espectrometría de masa para caracterizarlo.

PEY previno significativamente el incremento inducido por LPS de IL-1 β, TNF-α, y MCP-1. Además, el suero de los

animales tratados con PEY anuló la acumulación iNOS 7 inducida por LPS de la célula tipo macrófago Raw 264.

Análisis inmunoquímicos han demostrado concentraciones de factores de crecimiento insulínico (IGF-1), factor de

crecimiento de tejido conectivo (CTGF) y factor de crecimiento plaquetario(PDGF) en el extracto. Análisis

metabolómicos comparativos entre PEY y yema de huevo, han mostrado diferencias significativas en

concentraciones de al menos 140 moléculas y de 357 en análisis lipodómicos, demostrando la complejidad del PEY.

Globalmente, PEY actúa como un extracto inmunomodulador oralmente biodisponible que puede ser de interés en

las condiciones asociadas a desajustes inflamatorios, como el inflammaging.

Keywords: fecundación; inflamación; citoquina; factores de crecimiento; metabolómica; lipidómica.

1. Introducción

El Inflammaging es un incremento crónico en la respuesta proinflamatoria del cuerpo con el avance de la

edad en algunos tejidos. A medida que las reacciones inflamatorias incrementan, las señales neuro hormonales

(e.g., renina-angiotensina, adrenérgico, señalización de insulina-IGF1) tienden a desregularse, la inmuno vigilancia

contra patógenos y células premalignas desciende y la composición del entorno peri- y extracelular cambia, por

consecuencia afectando las propiedades mecánicas y funcionales de los tejidos involucrados. Con el incremento

de esta característica del envejecimiento, se ha propuesto el nuevo concepto “anti-inflammaging”, que influye

sobres los cambios progresivos pato fisiológicos y la esperanza de vida que cursan junto al inflammaging. En

condiciones fisiológicas, el sistema inmune ayuda mantener la homeostasis mediante el conjunto de respuestas no

específicas innatas y específicas activas, contra potenciales agresiones. La respuesta inflamatoria está dirigida por

una compleja red de mediadores y rutas de señales, y es el efecto neto entre interacciones de moléculas

(citoquinas) pro-inflamatorias y anti-inflamatorias que determinan la respuesta inmune. Un sistema inmune en

buenas condiciones es esencial para mantener una buena salud. Cuando la expresión de las citoquinas es alterada

crónicamente, puede llevar a inflamación crónica, tumurogénesis y enfermedades autoinmunes. El inflammaging

consiste en los fenómenos que explican la tendencia hacia un incremento de la concentración de citoquinas pro-

inflamatorios que ocurre durante el envejecimiento, sobre todo de IL-6, IL-8, IL-2, IFN-γ y TNF-α, que son

indicadores de inflamación. Es lógico pensar que por tanto corrigiendo el perfil de citoquinas podemos prevenir o

ralentizar las consecuencias dañinas del proceso de envejecimiento. Entre las medidas propuestas para esta

reorganización se encontrarían los tratamientos farmacológicos (p.e. estatinas para para mejorar la salud

cardíaca); o abordajes nutricionales del problema como la restricción calórica. También, los suplementos

alimenticios, han emergido como un potencial tratamiento anti-aging, como los antioxidantes (curcumina,

polifenoles), vitaminas y probióticos. La NIH define los suplementos alimentarios como “sustancias que puedes

usar para añadir nutrientes a tu dieta para reducir el riesgo de problemas de salud como la osteoporosis o la

artritis”. El aumento de concienciación en la salud, los estilos de vida cambiantes y los hábitos alimenticios, están

atrayendo más atención a estos productos. Hay una amplia evidencia científica de que los huevos contienen

compuestos biológicamente activos que pueden tener un papel en la terapia de prevención de enfermedades

crónicas e infecciosas. Varios suplementos derivados del huevo pueden ser encontrados en el mercado, divididos

entre no fertilizados (comercializados) y fertilizados. Los huevos de gallina comercializados son altamente

nutricionales, su contenido en macronutrientes incluye bajos carbohidratos y unos 12 g por cada 100 g de

proteínas y lípidos (en su mayor parte monoinsaturados) además de varios nutrientes como el zinc, selenio, retinol

y tocoferoles.

Se sabe que la yema de los huevos comercializados contiene proteínas y péptidos biológicamente activos. Por

ejemplo, se ha visto que la yema de huevo entera, en su forma nativa como una potencial fuente de péptidos

inhibidores de enzimas convertidoras de angiotensina, o que las lipoproteínas de la yema son importantes para la

actividad antimicrobiana mediada por lípidos; también, una proteína llamada γ-livetina, también conocida como

inmunoglobulina Y, ejerce la misma actividad inmuno moduladora que la inmunoglobulina G y se ha demostrado

que tiene efectos inmuno reguladores. De hecho, han sido reportados efectos antiinflamatorios y analgésicos in

vivo de la yema de huevo no fertilizada. Basado en estudios preclínicos, la fosfatidilcolina y esfingomielina parecen

regular la absorción del colesterol y la inflamación; en estudios clínicos, la ingesta de fosfolípidos de huevo está

asociada a cambios beneficiosos en los biomarcadores relacionados al transporte inveso de HDL. Los huevos

fertilizados contienen todos y cada uno de los nutrientes esenciales para sustentar una nueva forma de vida, en

una pequeña cáscara que solo permite el intercambio de los gases O2, CO2 y H2O y su composición cambia

mientras el embrión se desarrolla. La evaluación de los componentes bioactivos en las diferentes etapas de

desarrollo han atraído la atención de los científicos y se han observado diferencias significativas, demostrando

potenciales aplicaciones muy interesantes. Sin embargo, los estudios de los mecanismos inmunes y los

componentes bioactivos relacionados son limitados.

Además, según nuestro conocimiento, no hay estudios respecto a los efectos de la ingesta de

huevos fertilizados in vivo. Hemos obtenido, mediante un proceso patentado, un extracto de huevos fertilizados

aquí nombrado “patented egg yolk” (PEY). Para revelar sus efectos en el contexto del inflammaging, hemos

explorado sus potenciales efectos antiinflamatorios en comparación con la yema de huevo comercial y hemos

caracterizado su composición para establecer protocolos adicionales de evaluación de los potenciales mecanismos

de acción, con el fin de establecer la base para potenciales estudios intervencionales del inflammaging.

2. Materiales y Métodos

2.1 Químicos

A menos que se mencione lo contrario, todos los químicos fueron obtenidos de grandes proveedores

comerciales. El PEY consiste en un preparado de huevo obtenido mediante un proceso patentado. Consta de una

mezcla de yema y clara extraídas de huevos que han sido calentados por un corto plazo de tiempo, que luego es

liofilizado para obtener un producto comercial llamado Excelvit®.

2.2 Animales

Ratas Wistar macho de un mes de edad (peso inicial 75-100 g, n =10 por grupo en el régimen de

tratamiento y n=5 en el régimen de tratamiento de uno o dos días) obtenidas de Laboratorios Harlan (Catalunya,

España) fueron mantenidas a 23 ± 2 ◦C bajo un ciclo 12:12 h de luz-oscuridad (luces encendidas de 7:00 a 19:00).

Todas las ratas tuvieron acceso ilimitado a una dieta de mantenimiento de roedores Harlan Teklad 14% proteína

durante todo el periodo experimental. Después de una semana de aclimatación a las instalaciones animales, los

animales fueron pesados y separados en dos grupos (grupo PEY y grupo de yema convencional) con pesos iguales.

El tratamiento experimental consistió en un ayuno de 4h (8:00-12:00), seguido de una dosis diaria de 2000 mg/kg

de PEY o yema de huevo durante uno, dos o cinco días administrada por sonda orogástrica. El peso corporal y

signos de toxicidad fueron monitoreados diariamente durante el periodo de tratamiento, en el que todos los

animales mostraron una salud correcta. Después de la duración designada (uno, tres o cinco días) 2h después de la

dosis de PEY o yema de huevo administrada por sonda orogástrica, todos los animales fueron inyectados con una

dosis de 2.5 mg/kg de lipopolisacáridos (LPS, Sigma-Aldrich, Sant Louis, MO, USA). Una hora después de la

inyección de LPS, todos los animales fueron sacrificados por desplazamiento cervical y muestras de sangre fueron

tomadas por punción cardíaca. El suero de las muestras de sangre fue recogido en los 30 min siguientes por

centrifugación y fueron inmediatamente congelados con nitrógeno líquido y guardado a -80 ◦C para ser analizado

más tarde. El estudio fue llevado a cabo acorde a la Declaración de Helsinki y el protocolo fue aprobado por el

Comité de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Lleida (Código de Proyecto CEEA 03/03-12).

2.3 Análisis de Citoquinas

Las citoquinas fueron determinadas por un ensayo inmunológico múltiple de perlas magnéticas Milliplex

RECYMAG65K27PMX (Merck-Millipore, Burlington, MA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

2.4 Cultivo Celular y Tratamientos

Macrófagos RAW 264.7 (ATCC TIB-71) de ratón fueron cultivados en una incubadora humidificada que

contenía 5% CO2 y 95% aire a 37 ◦C. Las células fueron cultivadas en un medio DMEM suplementado con un 10%

de suero fetal bovino inactivado por calor, 100 UI/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. En todos los

experimentos las células fueron cultivadas hasta alcanzar la confluencia y luego transferidas a platos de 6 pocillos.

En el día del ensayo, el medio fue cambiado a un medio libre de suero durante 4h y más células fueron expuestas a

un medio DMEM suplementado con un 10% de suero de rata obtenido de ratas alimentadas con 2000 mg/día

(durante cinco días) de PEY, yema de huevo o suero fetal bovino. Para la activación del iNOS, una dosis de 0.1

microgramos/mL de LPS fue añadido a pocillos determinados. Tras 24h, las células fueron recolectadas y lisadas

usando buffer RIPA con inhibidores de proteasa y fosfatasa. Las concentraciones de proteínas fueron medidas

usando el ensayo Bradford (BioRad Laboratories, Munchen, Germany) con albumina de suero bovino como

estándar y además los lisados celulares fueron congelados a -80 ◦C para análisis adicionales.

2.5 Análisis Western Blot

Las proteínas totales (15-40 μg) fueron determinadas por SDS-PAGE y electro-transferidas sobre

membranas de difluoruro de polivinilideno (Immobilon-P Millipore, Bedford, MA, USA). Inmunodetección fue

llevada a cabo usando anticuerpos primarios anti-iNOS (Cell Signaling Technologies #2977), PDGF (RD Systems,

AB23NA), NGF (Abcam Ab6199), CTGF (Genetex, GTX37727), and IGF-1 (Abcam, Ab106838). Un anticuerpo

monoclonal a β-actina (Sigma, Saint Louis, MO, USA) fue utilizado para controlar la carga de proteínas de los

cultivos celulares. Las bandas de proteínas fueron visualizadas con el método de quimioluminiscencia ECL®

(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). La luminiscencia fue registrada y cuantificada en un equipo Lumi-

Imager (Boehringer, Mannheim, Germany), usando el software Quantity One 4.6.5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

2.6 Análisis Lipidómico y Metabolómico

Los metabolitos y lípidos del PEY y la yema de huevo fueron analizados por cromatografía de líquidos

junto a espectrometría de masas como se ha descrito anteriormente. Para el análisis metabolómico, las muestras

fueron liberadas de proteínas por adición de metanol. Los metabolitos resultantes fueron separados usando una

columna de fase inversa (Zorbax SB-Aq 1.8 μm 2.1 × 50 mm; Agilent Technologies, Barcelona, Spain). Utilizamos un

gradiente de agua a metanol (todos con 0.2% de ácido acético) en cromatógrafo (LC Agilent 1290) acoplado a un

sistema de espectrometría de masas (time of flight (TOF) mass spectrometer Agilent 6520). Espectros de masa

fueron recogidos en modos de ionización tanto positivos como negativos, escaneando los valores m/z desde 50

hasta 1600 a 1.5 escaneos/s. Para el análisis lipidómico, los lípidos fueron obtenidos por extracción

cloroformo:metanol, criterios internos añadidos y procesados como se ha descrito [14,15] utilizando el mismo

sistema utilizado anteriormente (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) con los disolventes adecuados. Este

método permite la caracterización ortogonal (basado en la masa exacta (<10ppm) y en tiempo de retención) de los

lípidos. Cuando es combinado con los criterios internos, esta estrategia es muy útil para proponer potenciales

identidades con baja incertidumbre [14,16]. En este caso, la información fue recogida en modo análisis completo

tanto de ionización de electro pulverización positiva como negativa a 100-3000 m/z un rango dinámico extendido

(2 GHz).

2.7 Análisis Estadísticos y Anotación de Datos

Cálculos estadísticos fueron realizados utilizando SPSS (IBM SPSS v 25, Armonk, NY, USA) y GraphPad

Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). El test Kolmogorov–Smirnov comprobó la normalidad de la

distribución de los variables. Para los estudios metabolómicos y lipidómicos, solamente las características comunes

(presentes en un ≥75% de las réplicas de las muestras de PEY y yema de huevo) fueron tomadas en cuenta para

corregir la parcialidad individual. Análisis de componentes principales (PCA), análisis de discriminación de mínimos

cuadrados parciales (PLS-DA) y análisis de agrupamiento jerárquico fueron realizados utilizando MassHunter Mass

Profiler Professional (Agilent Technologies, Barcelona, Spain) después de la transformación de los resultados

cromatográficos a formato CEF®. Los análisis (parcelas Volcano, PCA y PLS-DA reportados aquí) fueron realizados

utilizando la plataforma Metaboanalyst 3.0.

Anotaciones de metabolitos fueron producidas basadas en un preciso algoritmo de tiempo de retención

de masas (Agilent®, MassHunter Mass Profiler Professional) y para los lípidos en la comparación con el tiempo de

retención de estándares internos. Por lo tanto, el nivel de evidencia de la anotación es 2 (es decir, compuestos

putativamente anotados, sin estándares químicos de referencia, basados en propiedades fisicoquímicas y similitud

espectral con bibliotecas espectrales públicas/comerciales), de acuerdo con [18]. Un nivel de p < 0.05 fue

seleccionado como el punto de mínima significación estadística en todas las comparaciones. Análisis de vías fueron

producidos de acuerdo con estos compuestos putativamente anotados utilizando la plataforma

ConsensusPathDataBase.

3. Resultados

Como era esperado, la inyección de LPS indujo un incremento en los niveles de citoquinas en plasma

(Figura Suplementaria S1A), incrementando un 43% los niveles de TNF-α en circulación después de 2h. Para

estudiar los efectos antiinflamatorios sistémicos del PEY, las concentraciones plasmáticas de citoquinas de los

animales alimentados con PEY durante cinco días fueron medidas después de 2h de realizar el estímulo

inflamatorio (inyección de LPS) (Figura 1A). Comparado con la yema de huevo, el grupo de PEY presentó una

reducción significativa en las concentraciones plasmáticas de IL-1 β (Figura 1B), TNF-α (Figura 1C) y MCP-1 (Figura

1D). Curiosamente, se necesitó menos tiempo de tratamiento para abrogar la acumulación de citoquinas en

circulación inducidas por LPS (1 día, Figura Suplementaria S1A; o 2 días, Figura Suplementaria S1B).

Demostrando la biodisponibilidad del PEY y la solubilidad de los efectos inducidos por PEY, el efecto

antiinflamatorio fue confirmado en ex-vivo utilizando células Raw 264.7 tratadas con el suero de animales

expuestos durante cinco días a PEY o yema de huevo (Figura 1E). Las células RAW 264.7 fueron tratadas con LPS

para estimular la respuesta inflamatoria y el contenido de i-NOS fue medido. Se observó una diferencia

significativa en la inmuno reactividad de iNOS entre el grupo de LPS y los demás grupos, mostrando las diferentes

respuestas inflamatorias de las células que fueron observadas (Figura 1E). La producción de iNOS de las células

tratadas con suero del grupo de la yema de huevo fue significativamente más bajo que la del grupo de control y el

suero de las ratas tratadas con PEY mostraron el efecto antiinflamatorio más elevado, con una producción de iNOS

significativamente más baja que el grupo de la yema de huevo.

Figura 1. Caracterización de los efectos anti-inflamatorios del PEY in vivo. (A). Administración oral de PEY durante cinco días y aplicación de

estímulo inflamatorio al quinto día por LPS. (B-D). Concentraciones plasmáticas de citoquinas IL-1 β, TNF-α y MCP-1 en el grupo de control

(yema de huevo) y en el grupo tratado (PEY) 2 horas después de la administración de LPS (* p < 0.05, *** p < 0.001). (E) Inmunorreactividad de

iNOS del cultivo celular Raw 264.7 expuesto a 0.1 μg/mL de LPS tras la aplicación de un medio celular estándar (sin tratamiento), suero

sanguíneo de las ratas tratadas con yema de huevo (control) y suero de las ratas tratadas con PEY; a **** diferencia significativa con medio

celular LPS− p < 0.001; b **** diferencia significativa con medio celular LPS+ p < 0.0001; c * diferencia significativa con suero del grupo de yema

de huevo LPS+ p < 0.05. Test ANOVA de sentido único o Student’s t-test fue utilizado para los análisis estadísticos. Experimentos in vitro fueron

llevados a cabo en triplicado, mientras que los tratamientos fueron entregados a n = 10 animales por grupo.

La composición del PEY fue estudiada para explorar el origen de los efectos antiinflamatorios observados.

Evaluamos la presencia de factores de crecimiento (Figura 2) tanto como el análisis comparativo metabolómico y

lipidómico de la yema de huevo y el PEY.

Fue observado que el PEY contenía 2.5 veces más factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), 1.7

veces más factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), 1.3 veces más factor de crecimiento nervioso

(NGF) y 8.6 veces más factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) que la yema de huevo (mire Figura 2).

Todos los incrementos fueron significativos excepto el de NGF. La presencia de factores de crecimiento ha sido

descrita anteriormente [20]. Los resultados de la cromatografía de líquidos acoplado a la espectrometría de masas

indican (Figura 3) que el PEY contiene un número significativo de solubles en metanol (metabolitos) y solubles en

solvente orgánicos (lípidos) diferentes a la yema de huevo. Curiosamente, los perfiles lipidómicos permiten ver una

diferenciación más completa en comparación con los metabolómicos (Figura 3A,E). Incluso aplicando una

corrección por tasa de descubrimiento falso Benjamini-Hochberg, un total de 357 lípidos diferenciales fueron

encontrados (231 más en PEY y 126 más en PEY, FDR = 0.05; Supplemental Dataset). Un total de 140 metabolitos

diferencialmente presentes en el extracto también fueron encontrados (16 más en la yema de huevo y 124 más en

PEY, FDR = 0.05; Supplemental Dataset). Colectivamente, respecto a identificaciones, estos lípidos se agruparon

entre diferentes vías relacionadas con los esfingolípidos, así como algunas vías relacionadas al sistema inmune

(Figura 3D). Curiosamente metabolitos diferenciales también estaban presentes en vías relacionadas a los ácidos

grasos omega-3, entre muchos otros nodos metabólicos (Figura 3H). Todos los metabolitos y lípidos diferenciales

incluyendo masa exacta, comportamiento cromatográfico (tiempo de retención en los respectivos sistemas),

espectro compuesto, la diferencia de veces mayor y los valores p (tanto en bruto como ajustados para la tasa de

descubrimiento falso) están disponibles como Supplemental Dataset en un archivo Excel® en material

Supplemental que se puede encontrar online. De manera similar, los niveles individuales de metabolitos y lípidos

empleados para el análisis de vías (Figura 3D,H) puede ser encontrado en una web diseñada en ad-hoc

(https://excelv.herokuapp.com/).

Figure 2. (A). Connective tissue growth factor (CTGF) immunoreactivity in egg yolk and PEY, showing a difference between them with a p < 0.0001 significance. (B). Platelet-derived growth factor (PDGF) immunoreactivity in egg yolk and PEY, showing the difference between them with a p < 0.01 significance. (C). Nerve growth factor (NGF) immunoreactivity in egg yolk and PEY, showing no significant difference between them. (D). Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) immunoreactivity in egg yolk and PEY, showing a significant difference between them (* p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001).

Figure 3. PEY exhibe un perfil lipidómico y metabolómico diferencial. Lipidoma (A – D) y metaboloma (F – H) perfiles de PEY y yema de huevo se analizaron mediante cromatografía líquida acoplada a masa espectrometría. Como se muestra en los gráficos de análisis de componentes principales, el PEY y la yema de huevo muestran diferentes firmas lipidoma (A) y metaboloma (E). Esto se ve reforzado por análisis de agrupamiento jerárquico que muestran un agrupamiento perfecto en lipidómica (B), pero no en metabolómica (F). Estadísticas univariadas como como un diagrama de volcán, lo que indica que hay marcadas diferencias en un gran número de moléculas tanto en el lipidoma (C) como en el metaboloma (G). Análisis de vías, que se muestran en (D) para lipidómica y en H para la metabolómica, indique las vías donde se encuentran las moléculas supuestamente anotadas: red conjuntos de entidades basadas en vecindarios de diferencias lipidómicas y metabolómicas entre PEY y yema de huevo. Los lípidos diferenciales (D) y metabolitos (H) (ver texto principal) se ingresaron en ConsensusPathDB plataforma, y nodos, que representan conjuntos de entidades basadas en vecindarios (cuyo tamaño es proporcional al número de metabolitos / lípidos del conjunto, y la intensidad del color denota el valor p para las pruebas hipergeométricas) son vinculados por interacciones que consisten en el número de metabolitos compartidos por los nodos. El tipo de red elegido fue 2 vecinos siguientes, con un número mínimo de superposición de 1 metabolito con miembros de la conjunto de entidades (y una p <0.05 para lipidómica y una p <0.01 para metabolómica como el corte). Los decorados fueron obtenido, considerando solo los basados en Wikipathway. Los lípidos incluidos fueron C21480, C21481, C00350, C02737, C13883, C00195, C12126, C00550, C01190 y C02686. Los metabolitos utilizados fueron C01179, C06104, C06425, C00239, C00364, C00984, C14214, C02043, C06429, C08491, C00256, C05332, C00410, C05441, y C02477 (nomenclatura KEGG). Niveles individuales de metabolitos y lípidos empleados para la vía Los análisis están disponibles en https://excelv.herokuapp.com/

4. Discusión

Es sabido que la nutrición puede afectar al funcionamiento de varios parámetros inmunes y la

inmunomodulación a través de suplementos alimentarios no es nueva; p.ej., el ácido linoleico promueve la

producción de leucotrienos y prostaglandinas, o que la arginina y la glutamina aumentan la capacidad de

fagocitosis de los macrófagos [21]. También, estudios epidemiológicos demuestran que tanto la dieta en general

como componentes alimentarios específicos como los polifenoles pueden reducir la cantidad de citoquinas

inflamatorias en modelos animales y de cultivos celulares. Entonces, era esperado que un componente alimentario

tan rico en biomoléculas como la yema de huevo tuviera efectos en el sistema inmune. Lo que no era predecible

es el hecho de que el PEY mejorara significativamente estos efectos.

En nuestra opinión el PEY optimiza la respuesta inmune. Este efecto significa que más que regular a la

baja las funciones inmunes hiperactivas o regular al alza las funciones inmuno supresoras, el PEY fortalece la

resiliencia de las funciones inmunes para responder a los factores estresantes externos. Los resultados de este

trabajo demuestran que la ingesta de PEY indujo cambios a nivel sistémico que llevaron a una respuesta

inmunológica menos agresiva en los roedores ya que una menor cantidad de citoquinas proinflamatorias fue

observada tras el estímulo inflamatorio. El PEY, como cualquier extracto biológico, es una compleja matriz que

contiene miles de moléculas biológicamente activas, en un amplio rango de concentraciones; así que dilucidar su

mecanismo de acción no es un trabajo fácil. Los efectos individuales de componentes individuales pueden ser

fácilmente estudiados in vitro. Sin embargo, los sinergismos y antagonismos, al igual que las reacciones

metabólicas, ocurren cuando la comida, una matriz compleja, es ingerida, digerida y procesada por un organismo

vivo. Teniendo en cuenta los niveles de citoquinas en sangre, fue evidente que existen diferencias en la

composición entre el PEY y la yema de huevo y analizar las diferencias podría darnos pistas.

La mayor presencia de factores de crecimiento (CTGF, PDGF, IGF-I and NGF) en el PEY, en comparación

con la yema de huevo, no es sorprendente desde un punto de vista biológico. Los factores de crecimiento

desempeñan un papel vital en la evolución y resolución de reacciones inflamatorias [22]. Por lo tanto, la presencia

de estas proteínas lleva a pensar que podrían estar relacionadas con las diferentes respuestas inmunológicas

observadas in vivo. El CTGF desempeña una función crítica en la homeostasis del tejido conectivo ya que ayuda a

mantener el remodedo de la matriz extracelular en procesos fisiológicos como la cicatrización de las heridas y

también se ha demostrado que tiene propiedades apoptóticas y no mitogénicas [23]. El PDGF tiene un papel vital

en la diferenciación temprana de precursores hematopoyéticos/endoteliales; ha sido utilizado en estudios clínicos

como tratamiento tópico para curar la neuropatía crónica, al igual que para mejorar la regeneración periodontal

en casos de enfermedad periodontal grave. El factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-I) es una hormona

polipeptídica secretada por múltiples tejidos en respuesta a la hormona de crecimiento (GH). Es parcialmente

responsable de la actividad de la GH y también tiene efectos anabólicos. La NGF es un factor neurotrófico que

promueve el crecimiento y supervivencia de células nerviosas sensoriales y simpáticas periféricas. Es un factor

pleiotrópico ya que es producido y utilizado por varios tipos de células, incluyendo células estructurales (células

epiteliales, fibroblastos/miofibroblastos, células endoteliales, células de músculo liso y hepatocitos), accesorias

(células gliales, astrocitos y células de Muller) e inmunes (células presentadoras de antígenos, linfocitos,

granulocitos, mastocitos y eosinófilos) [25], teniendo propiedades neuroprotectoras y reparadoras de tejidos.

Sorprendentemente, como el PEY es administrado por vía oral, debe ser asumido que existe biodisponibilidad de

estas moléculas. Los efectos del PEY podrían explicarse a través de la absorción en el tracto digestivo por

interacción indirecta con la microbiota del anfitrión. Estudios previos demostraron cómo el Platelet-Rich Plasma

(plasma rico en plaquetas) rico en factores de crecimiento (PDGF, IGF, VEGF, TGFb) promovió el proceso

regenerativo inhibiendo la activación de los macrófagos y la liberación de citoquinas (TNFa, MCP-1, and RANTES)

[26] in vitro. Sin embargo, otro estudio demostró que el IGF-I administrado oralmente actúa principalmente en el

intestino, una porción del IGF-I ingerido es absorbido a la circulación general para potenciar el crecimiento de

órganos/tejidos selectivos [27]. Como ha sido indicado, la interacción con la microbiota no puede ser excluida—

por ejemplo, Padlyia et al. [28] analizó huevos fertilizados, descubriendo que las proteínas que incrementaron en

abundancia tienen un papel en la angiogénesis (pleiotrofina, glicoproteína rica en histidina), en defender al

embrión en desarrollo contra patógenos microbianos (β-defensina 11 aviar, receptor de inmunoglobulina

polimérico, componente P amiloide sérico, ligando de unión a ovostatina y manosa) y en aumentar la integridad

estructural de la cáscara de huevo (ovo-calixin-32), necesaria para proporcionar una barrera sustancial contra

infecciones microbianas.

La acción del PEY no se debe solamente a la presencia de factores de crecimiento. Los lípidos y

metabolitos que fueron visto incrementados en el PEY agrupados entre diferentes vías relacionadas con

esfingolípidos y vías relacionadas al sistema inmunológico. Una plétora de procesos biológicos celulares es

críticamente modulados por esfingolípidos bioactivos, incluyendo la regulación del crecimiento, la migración

celular, adhesión, apoptosis, senescencia y las respuestas inflamatorias [29]. Similarmente, Duan et al. [30] reportó

que los huevos fertilizados exhibieron una mayor cantidad de ácidos grasos esenciales (EFAA) y ácidos grasos

insaturados (MUFA) que los no fertilizados y menores concentraciones de colesterol, teniendo el potencial de ser

utilizado como un suplemento alimentario rico en EFAA/MUFA y bajo en colesterol para personas de edad

avanzada y personas con requerimientos dietéticos especiales. También hay experimentos in vitro que demuestran

los efectos farmacológicos de estas moléculas bioactivas; Xi Li et al. [31] observó que extractos de embrión de

gallina de 12 días potenciaron la proliferación de linfocitos del bazo (y producción de IL-2 ) y la función de los

macrófagos (la fagocitosis y la producción de NO). Considerando la alta biodisponibilidad de los lípidos, no

podemos descartar el papel de los lípidos del PEY en la optimización inmunológica.

Globalmente, la disminución del incremento de TNFa, IL1b, y MCP-1 inducido por LPS podría estar

relacionado con la compleja composición del PEY. Los factores de crecimiento, junto a una matriz vibrante de

lípidos y metabolitos bioactivos, promueven una respuesta inmune menos agresiva, eso significa un mejor

mantenimiento de la homeostasis. Además, estas respuestas pueden ser atribuidas a un cambio en el estado M1-

M2 de los macrófagos, favoreciendo la fase resolutiva (M2), un tema que será el foco de futuros estudios.

En cuanto a las limitaciones de nuestro estudio, reconocemos que un solo nutriente no puede explicar los

efectos observados; que la biodisponibilidad de los compuestos presentes en PEY puede ser limitada; y que quizás

el sistema se limita a estudios preclínicos. Además, creemos que las mediciones de la información de citoquinas

sistémicas inducidas por el tratamiento con PEY, al igual que sus cambios sucedáneos del metaboloma y del

lipidoma, el foco de futuros estudios podría esclarecer los potenciales mecanismos detrás de esto. Sin embargo,

creemos que la prueba de que el PEY es un complejo de moléculas bioactivas (factores de crecimiento, lípidos,

metabolitos) que contiene las moléculas que un embrión necesita para desarrollar un organismo completo y que

afecta a la inmunidad del anfitrión es clara. Es razonable pensar que estos componentes activos son biodisponibles

incluso administrados por vía oral ya que ha sido observado un efecto sistémico. Estas moléculas activas

probablemente actúen juntas; esto lo diferencia de un solo ingrediente activo ya que posiblemente este grupo de

moléculas producen una serie de efectos simultáneos que incluyen sinergias y antagonismos, promoviendo un

microambiente anti-inflamatorio y conduciendo al organismo a un estado de homeostasis. Ya que la inflamación

crónica contribuye al desarrollo de enfermedades crónicas (cáncer, enfermedades cardiovasculares y diabetes) y al

envejecimiento, el consumo de PEY podría reducir de forma eficaz la incidencia y progresión de estos procesos.

Supplementary Materials: The following are available online at http://www.mdpi.com/2072-6643/12/9/2699/s1, Supplemental Dataset, which is an Excel® file containing di_erential molecules between PEY and egg yolk in the metabolomics and lipidomics analyses, and Supplemental Figure S1. Individual levels of metabolites and lipids employed for pathway analyses are present in https://excelv.herokuapp.com/. Author Contributions: Conceptualization, J.C., C.B. and J.C.E.S.; Methodology, J.C.E.S., M.M.-G., L.S., M.J. and C.B.; Validation, M.M.-G., J.C.E.S., L.S., M.J. and M.P.-O.; Formal analysis, M.M.-G., J.C.E.S., C.B. and J.C.; Investigation, J.C. and M.P.-O.; Resources, J.C.; Data curation, M.M.-G. and J.C.E.S.; Writing—original draft preparation, C.B. and J.C.E.S.; Writing—review and editing, M.P.-O., C.B. and J.C.; Visualization and supervision, J.C.E.S.; Project administration and funding acquisition, J.C. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. Funding: This research received no external funding. Acknowledgments: Support from Generalitat de Catalunya, 2017SGR696. Conflicts of Interest: Authors J.C.E.S., M.J., L.S. and M.P.-O. declare no conflict of interest. J.C. is the inventor of the patent protecting PEY obtention. J.C. and C.B. are employees of Ovovity s.l., which is the owner of the patent protecting PEY obtention. The funders (Ovovity s.l.) had no role in the design of the study; in the collection, analyses, or interpretation of data; in the writing of the manuscript, or in the decision to publish the results.

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