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DETECCIÓN MOLECULAR DE CARBAPENEMASAS Dra. Lucía Martínez Lamas. Servicio de Microbiologí a, Complejo Hospitalario Universitario de Vigo. En los aislados de Klebsiella nosocomial se ha detectado un aumento del grado de

resistencia antibiótica durante los últimos 20 años; este

proceso se ha visto facilitado por el hecho de que los genes

que codifican los determinantes de resistencia a antibióticos a

menudo se encuentran en plásmidos transferidos con alta

frecuencia entre las cepas de K. pneumoniae y otros géneros

de enterobacterias, como sucede con las β-lactamasas de

espectro extendido (BLEE) (1).

Dra. Lucia Martínez Lamas

Hasta 1995, la resistencia carbapenem era resultado alteraciones en la

permeabilidad de la pared y/o desrepresiones de AmpC. Desde la descripción de la

primera carbapenemasa cromosómica en 1995 en Japón (Serratia marcescens IMP-1)

(2), hasta la aparición en 2001 de la primera carbapenemasa plasmídica (Klebsiella

pneumoniae KPC) (3) la dispersión de estos determinantes de resistencia se mantuvo

controlada.

Desde la aparición de las enzimas KPC, el número de carbapenemasas plasmídicas

ha proliferado y se han difundido rápidamente hasta convertirse en un problema

global, dispersándose por todo el mundo y siendo responsables de numerosos brotes

nosocomiales (4). Estas enzimas poseen la capacidad de hidrolizar una amplia

variedad de β-lactámicos, incluyendo los carbapenems y cefalosporinas de tercera

generación (5) Lo que supone un aumento el perfil de resistencia de BGNs y la

1991 P. aeruginosa Japón

1995 Serratia IMP-1 codificación plasmídica

R carbapenem: porinas/ AmpC desreprimida, carbapenemasas cromosómicas

2001 K. pneumoniae KPC codificación plasmídica

DISPERSIÓN GLOBAL DE

CARBAPENEMASAS PLASMÍDICAS

2

limitación de la utilidad clínica de los carbapenems, considerados antimicrobianos de

última línea en el tratamiento de BGN multirresistentes.

Clasificación general de las carbapenemasas

Los carbapenemasas se han organizado sobre la base de homología de

aminoácidos en el sistema de clasificación molecular de Ambler. Las β-lactamasas de

clase A, C, y D, todos comparten un residuo de serina en el sitio activo, mientras que

las enzimas de clase B requieren la presencia de zinc para la actividad (y por lo tanto

se conocen como metalo-beta-lactamasas). Las clases A, B y D son las de la mayor

importancia clínica entre los patógenos nosocomiales.

Carbapenemasas clase A:

� Primera identificada en 1982 (SME cromosómica en S.marcenscens)

� Inhibidas ác. borónico, no por EDTA.

� Hidrólisis eficiente de todos los beta-lactámicos (incluido aztreonam, menor

hidrólisis de las cefamicinas).

3

� Codificación cromosómica: Serratia marcescens enzyme (SME-1, -2 y -3), no

metalloenzyme carbapenemases (NMC-A), imipenem-hydrolyzing β-

lactamases (IMI-1 Y -2)

� Codificación plasmídica: Guiana Extended-Spectrum (GES): variante de BLEE

hidrolian débilmente carbapenémicos.

Klebsiella pneumoniae carabapenemases (KPC)

� Codificación plasmídica (transposón Tn4401)

� Asociada a resistencia a otros antibióticos (aminoglucósidos,

fluoroquinolonas)

� Altamente transferible

� Once variantes, mayor diseminación: KPC-2 y KPC-3, tipo ST-258.

� Descrita en Enterobacterias, P. aeruginosa, A. baumanii.

� Primera descrita en 1996 en EEUU.

Distribución mundial de carbapenemasa KPC (4)

4

Carbapenemasas clase B: metalo-betalactamasas

� Primera identificada en 1991 Japón (Pseudomonas IMP-1)

� Dependencia de Zn para la hidrólisis eficiente de β-lactámicos

� Inhibición por EDTA, no inhibición por inhibidores de β -lactamasas.

� Hidrolizan todos β -lactámicos excepto aztreonam.

� Identificados numerosos grupos: IMP,

VIM, GIM, SPM y SIM y numerosas

variantes.

� Codificación cromosómica (Aeromonas

hydrophila, Chryseobacterium spp. y

Stenotrophomonas maltophilia).

� Transmisión por integrones y plásmidos (Serratia, Klebsiella,

Pseudomonas, Escherichia, Acinetobacter, Citrobacter y Enterobacter).

Distribución mundial de carbapenemasa IMP,VIM (4)

5

� NDM-1:

� Primera identificada en paciente sueco hospitalizado en India (K.

pneumoniae) 2008.

� Gen localizado en un elemento genético (blaNDM-1 gen) muy

móvil, patrón de difusión más complejo y más impredecible que

KPC.

� Asociado a numerosos determinates de resistencia, sólo

sensible a colistina y tigeciclina.

� Identificada en Enterobacterias (K. pneumoniae, E.coli y E.

cloacae) y Acinetobacter spp.

� Identificada en agua en Nueva Delhi, ¿Balcanes, Reino Unido

reservorios endémicos?

Carbapenemasas clase D: OXACILINASAS

� OXA-40 primera identificada en EEUU en A. baumannii.

� Más de 100 enzimas, hidrólisis preferente oxacilina.

� Inhibición débil por ácido clavulánico, sulbactam o tazobactam, no

existen inhibidores efectivos.

� Hidrólisis poco eficiente de carbapenemes, prácticamente inexistente en

cefalosporinas de tercera y cuarta generación.

� Mayoría codificación cromosómica.

� Enterobacterias (OXA-48, OXA-181), A. baumanii (OXA-23, OXA 24,

OXA-58, OXA-143), P.aeruginosa (OXA-40, OXA-50).

La descripción de la primera OXA-48 se hizo en el 2003 en Turquía,

produciéndose desde entonces la diseminación endémica Europa, Sudeste

mediterráneo y África, se cree que su introducción en Europa está relacionada con los

refugiados de Libia. La primera identificada e España fue en Barcelona en 2009.

Para ver la situación actual y distibución de las distintas

carbapenemasas en Europa, ver “Glasner C, et al.

Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Europe: a

survey among national experts from 39 countries, February 2013.

Eurosurveillance 2013; 18, 28 (7). Todos los países, en este

estudio de vigilancia, indicaron que el estado epidemiológico era peor que en el 2010,

aumentando el número de países con brotes.

6

Carbapernemasas en España (2012) (8, 9)

Estudios recientes reflejan el aumento en los aislamientos de enterobacterias

productoras de carbapenemasas en nuestro país:

Las NDM-1 en España:

� 2011 cuadro diarreico paciente español tras viaje y asistencia sanitaria

en India: coprocultivo E. coli (CTXM-15 + NDM-1).

� 2012 paciente español apendicitis perforada en India: absceso

abdominal K.pneumoniae NDM-1.

� 2012 colonización rectal gemelos nacidos en Bombay K.pneumoniae

SHV-31 y NDM-1.

Detección de carbapenemasas:

Desde el punto de vista del laboratorio clínico la detección de carbapenemasas es

compleja, debido fundamentalmente a: el grado de expresión de carbapenemasas

variable in vitro y la expresión de fenotipos resultado de varios mecanismos de

resistencia superponibles (4, 9)

Ejemplos de intervalos de CMI variables en cepas productoras de distintas clases

de carbapenemasas:

7

TIPO CARBAPENEMASA AB

RANGO

(µg/Ml) % S*

ETP 2-4 0

IMP <1->8 66,3 OXA-48 (n=163)

MEM <1->8 30

ETP 1->4 0

IMP <1->8 15 VIM-1 (n=60)

MEM <1->8 18,3

ETP 4->4 0

IMP <1-2 100 IMP (n=5)

MEM 2->8 20

ETP >4->4 0

IMP 4->8 0 KPC (n=8)

MEM 2->8 25

Enzima MIC (mg/L)

Imipenem Meropenem Ertapenem

KPC 0.5 - >32 0.5 - >32 0.5- >32

IMP/VIM/NDM 0.5- >32 0.5 - >64 0.38 ->32

OXA48/OXA181 0.25 - 64 0.38 -64 0.38 - >32

Perfiles de resistencia resultado de la superposición de varios mecanismos de

forma conjunta:

8

A.- Métodos fenotípicos de detección:

A.1.-Recomendaciones de la SEIMC detección fenotípica de resistencias en

bacilos gramnegativos (2011)

*Excepciones: Proteus / Providencia / Morganella, sólo valorar meropenem y/o ertapenem; Enterobacter,

sólo valorar imipenem y meropenem.

Problemas del el test de Hodge:

- Falta de especificidad: falsos positivos en

aislados hiper-AmpC, sobre todo con discos de IPM

o ERT / CTX-M-15 / pérdida de porinas.

- Falta de sensibilidad falsos negativos en

productores de NDM / OXA

EUCAST DESACONSEJA SU USO DESDE 2013

Enterobacterias* Meropenem CMI > 0,5 mg/l Ertapenem CMI > 0,5 mg/l Imipenem CMI > 2 mg/l

Test de Hogde modificado

+ -

No carbapenemasa Estudio de sinergia con inhibidores

9

A.2.- Recomendaciones EUCAST 2013:

Algoritmo detección de carbapenemasas

B.- Medios diferenciales / cromogénicos

� Uso sobre colonia o muestra directa (hisopo rectal)

� Medios “caseros”:

� MAC + IMP (1mg/L)

� MAC + disco 10µg ETP / MP/ IMP

� Medios cromogénicos comerciales:

� CHROMagar KPC: Meropenem alta concentración + moléculas

cromogénicas. (S: 43%, E: 67,8%)

� Brilliance CRE (Oxoid): carbapenem + componente cromogénico.

� Chrom ID CARBA (bioMérieux): carbapenem + componente cromogénico.

Limitaciones del uso de medio cromogénicos: baja sensibilidad (límite: 102-103/ml de

UFC en muestra directa), detectan resistentes por cualquier mecanismo, se afectan

por el tiempo de incubación y pérdida de detección de carbapenemasas con débil

hidrólisis (KPC / OXA-48).

.

En los estudios comparativos (10, 11):

� Las tres placas mostraron el mismo límite de detección para KPC y NDM.

� ChromID ESBL y CHROMagar KPC fallaron en la detección de OXA-48

Meropenem, diámetro < 25 mm o CMI > 0,12 mgL en todas las

Enterobacteriaceae

Sinergia solo con APBA / PBA

KPC u otra clase de carbapenemas A

Metala-beta-lactamasas

AmpC (cromo o plas) más pérdida de porinas

Sin sinergia Sinergia solo con DPA /

EDTA Sinergia con APBA /

PBA y cloxacilina

BLEE más pérdida porinas y OXA-48

10

� ChromID ESBL fue el único medio para detectar VIM

� Tienen utilidad en brotes.

Estudios de comparación de los métodos descritos:

Cuando se comparan los medios selectivos en agar, MALDI-TOF, PCR y métodos

fenotípicos para la detección de carbapenemasas en enterobacterias, todos los

métodos mostraron deficiencias en la detección, ratificando la necesidad del uso de

métodos genotípicos en los casos negativos o discrepantes para asegurar el resultado.

C.- Detección génica: “GOLD STANDART”

La detección de carbapenemasas por métodos genotípicos puede llevarse a cabo por:

� PCR- multiplex“caseras”: Partiendo de colonias, usando varios juegos de

plásmidos para detectar las principales carbapenemasas.

� PCR multiplex comerciales: Muestra directa/colonia. PCR en tiempo-real

� Micromatrices (microarrays): Partiendo de colonia.

ALTERNATIVA COMERCIAL:

PCR tiempo-real: Microarray:

Experiencia de los autores

En la tabla siguiente se puede apreciar una serie de datos de 10 enterobacterias

productoras de carbapenemasas: 6 K. pneumoniae y 4 Enterobacter cloacae, el origen

de la muestra donde fueron aisladas, las diferentes CMI a tres carbapenemes, los

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resultados del test de Hodge, de dos medios cromogénicos y sus diferencias, y las

enzimas detectadas por PCR casera. (La KPC de control en la PCR fue positiva.)

Organismo Muestra ETP MP IMP Hodge

MEDIO

ChromID

carba

MEDIO

Brilliance

CRE

PCR

K. pneumoniae Orina 8 2 1,5 + + + OXA48

K. pneumoniae Esputo 3 0,5 1,5 + + + OXA48

K. pneumoniae Sangre 32 2 4 + + + OXA48

E. cloacae Orina 0,38 0,094 0,38 ? - + NDM?

E. cloacae Orina 0,75 0,064 0,79 ? - - NDM?

K. pneumoniae Orina >8 >32 >32 + + + OXA-48

K. pneumoniae Catéter >8 NR 2 + + + OXA-48

E. cloacae Orina 4 NR 0,5 ? - + BIC?

K. pneumoniae Fístula 4 2 >16 + + + ??

E. cloacae Orina NR >32 >32 + + + VIM?

La técnica de microarray permitió detectar mecanismos de resistencia que creaban

confusión en los sistemas fenotípicos empleados:

Presencia

CARBA AMPC ESBL gen CARBA gen AMPC grupo CTX-M

NA NA NA NA NA NA

Y Y Y OXA-48 DHA 1,type-15 like*

Y - - OXA-48 - -

Y Y Y OXA-48 DHA 1,type-15 like*

- Y - - ACT/MIR -

- Y - - ACT/MIR -

Y - Y OXA-48 - 1,type-15 like*

Y - - OXA-48 - -

- Y - - ACT/MIR -

Y - Y VIM - -

Y - Y VIM - 9

Y - Y VIM - 9

ORGANISMO PCR RT-PCR MICROARRAY

K. pneumoniae OXA48 OXA CMTX-15, DHA,OXA-48

K. pneumoniae OXA48 OXA OXA-48

K. pneumoniae OXA48 OXA CMTX-15, DHA,OXA-48

E. cloacae NDM? NEGATIVA ACT/MIR

12

E. cloacae NDM? NEGATIVA ACT/MIR

K. pneumoniae OXA-48 OXA CMTX-15, OXA-48

K. pneumoniae OXA-48 OXA OXA-48

E. cloacae BIC? NEGATIVA ACT/MIR

K. pneumoniae ?? VIM/NDM SHV+VIM

E. cloacae VIM NR VIM

KPC POSITIVO KPC NR

Comparando los resultados obtenidos por PCR casera (PCR) y RT-PCR (CPE

Checkpoints) todas las K. pneumoniae productoras de carbapenemasas resultaron

concordantes por ambos sistemas. Los resultados de difícil interpretación mediante la

PCR casera se confirmaron como negativos por el sistema a tiempo real, siendo estos

mismos los aislados los productores de cefamicinasa de tipo AmpC detectados por el

microarray.

Conclusiones

� En España estamos asistiendo a un aumento significativo en los últimos años

de bacterias productoras de carbapenemasas, especialmente OXA-48.

� La detección de este tipo de microorganismos en el laboratorio es compleja

aunque ha de considerarse prioritaria.

� Los test fenotípicos puede proporcionar una aproximación para la detección de

carbapenemasas. Los métodos genotípicos son los que confirmarán

definitivamente estos determinantes de resistencia.

� Los sistemas comerciales de PCR a tiempo real o microarray ha permitido el

acceso a los sistemas genotípicos al laboratorio clínico, obteniéndose

resultados con gran rapidez y estableciéndose así medidas preventivas que

limiten la difusión de este tipo mecanismos de resistencia.

Bibliografía

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13

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