PRACTICA Nº 09

DETERMINACION DE AZUCARES REDCUTORES

OBJETIVO:

• Determinar el contenido de azucares reductores en productos

agroindustriales mediante el método de Lane Eynon.

FUNDAMENTO TEORICO:

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

Determinación de azúcares reductores. La práctica consistía

básicamente en realizar una serie de disoluciones con muestras

determinadas (glucosa, sacarosa, leche, fruta y miel) y comprobar si

reducían o no el reactivo de Fehling. En el caso de la glucosa, el

análisis dió positivo, dejando un precipitado rojo en el fondo del tubo

de ensayo. En cambio, en la sacarosa, el análisis dió negativo, debido

a que el enlace O-glucosídico que presenta es dicarbonílico y, por

tanto, no queda ningún carbonilo libre que reduzca el reactivo de

Fehling.

La reacción de Maillard (técnicamente: glucosilación no enzimática de

proteínas) se trata de un conjunto complejo de reacciones químicas

que se producen entre las proteínas y los azúcares reductores que se

dan al calentar (no es necesario que sea a temperaturas muy altas)

los alimentos o mezclas similares, como por ejemplo una pasta. Se

trata básicamente de una especie de caramelización de los alimentos,

es la misma reacción la que colorea de marrón la costra de la carne

mientras se cocina al horno. Los productos mayoritarios de estas

reacciones son moléculas cíclicas y policíclicas, que aportan sabor y

aroma a los alimentos, aunque también pueden ser cancerígenas.

Esta reacción la investigó en profundidad el químico Louis-Camille

Maillard en los comienzos del siglo **. En 1916 Maillard (1878-1936)

demostró que los pigmentos marrones y los polímeros que ocurren

durante la pirólisis (degradación química producida únicamente por

calor) se liberan después de la reacción previa de un grupo de

aminoácidos con un grupo carbonilo de azúcares. No fue sino hasta

1953 cuando se descubrió el mecanismo de las complejas

interacciones que se producen.La reacción de Maillard, también

conocida como 'Pardeamiento no enzimático', es la responsable de

muchos de los colores y sabores existentes en todos los alimentos:

• Galletas: el color tostado

del exterior de las

galletas genera un sabor

característico.

• El caramelo elaborado de

mezclas de leche y

azúcar, también llamado

toffee.

• Es el responsable del

color marrón en el pan al

ser tostado.

• El color de alimentos

tales como la cerveza, el

café, y el sirope de arce.

• Productos para las

cremas bronceadoras.

• El sabor de la carne

asada y de las cebollas

cocinadas en la sartén

cuando se empiezan a

oscurecer.

• El color del dulce de

leche, obtenido al

calentar la leche con el

azúcar.

Se ha descubierto que los productos finales avanzados (exceso de

cocción) de reacciones de Maillard están asociados con la patología

del mal de Alzheimer.[2] Punto algo dudoso ya que en los últimos 6

años los casos de alzheimer aunque hayan aumentado en número, se

han reducido en valor porcentual un 11.73% desde agosto del año

2002. (¿Y las referencias que acreditan lo escrito?).

Factores que influyen en la Reacción de Maillard 1- Tipo de hidrato de

carbono 2- Tipo de aminoácidos o proteína 3- Concentración de

sustratos 4- Tiempo y temperatura de cocción 5- pH 7- Presencia de

inhibidores 6- Actividad de agua Tipo de hidrato de carbono Los

hidratos de carbono se pueden clasificar según su estructura química

en Monosacáridos, Disacáridos, Polisacáridos.

Los monosacáridos dan una reacción más intensa que los

disacáridos.

• Dentro de los disacáridos, los azúcares reductores dan mayor

intensidad que los no reductores.

• Dentro de los monosacáridos, las pentosas dan reacción más

intensa que las hexosas Pentosas > Hexosas > Disacáridos reductores

> Disacáridos no reductores.

La intensidad de la reacción depende del tipo de hidrato de carbono

Tipo de proteínas y aminoácidos.

El aroma de los productos de reacción depende de los aminoácido

que componen las proteínas y de la temperatura de cocción.

La intensidad de color también depende del tipo de aminoácido. Los

básicos son los más reactivos.

Concentración de hidratos de carbono y proteínas.

Para que se lleve a cabo la reacción es necesario que estén presentes

los 2 sustratos: hidratos de carbono y proteínas.

Al aumentar la concentración de estos sustratos en el alimento,

mayor será la intensidad de la reacción.

Tiempo y temperatura de cocción

Si bien la reacción puede ocurrir a temperatura ambiente, se ve

favorecida a altas temperaturas.

Al aumentar el tiempo de cocción, aumenta la intensidad de la

reacción.

Los aromas generados también dependen de la temperatura y tiempo

de cocción.

pH La intensidad de la reacción aumenta a pH alcalinos (pH > 7) y

disminuye a pH ácidos (pH<7) Actividad de agua (aw) Los alimentos

de humedad intermedia, con valores de aw de 0.6 a 0.9, son los que

más favorecen esta reacción:

Un aw menor no permite la movilidad de los reactivos.

Un aw mayor ejerce una acción inhibidora ya que el agua diluye a los

reactivos.

Inhibidores

Los inhibidores mas comunes son los sulfitos, metabisulfitos, bisulfitos

y anhídrido sulfuroso.

Actúan en la etapa de inducción retardando la aparición de productos

coloreados, pero no evitan la perdida del valor biológico de los

aminoácidos.

Su uso esta limitado ya que produce efectos adversos a la salud

Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos poseen poder

reductor, que deben al grupo carbonilo que tienen en su molécula.

Este carácter reductor puede ponerse de manifiesto por medio de una

reacción redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de Cobre (II). Las

soluciones de esta sal tienen color azul. Tras la reacción con el glúcido

reductor se forma óxido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el

cambio de color indica que se ha producido la citada reacción y que,

por lo tanto, el glúcido presente es reductor.

Los azúcares o carbohidratos pueden ser monosacáridos, disacáridos,

trisacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

Los monosacáridos reaccionan de acuerdo a los grupos hidroxilo y

carbonilo que poseen.

Los disacáridos y los polisacáridos se pueden hidrolizar para producir

monosacáridos.

Los azúcares que dan resultados positivos con las soluciones de

Tollens, Benedict ó Fehling se conocen como azúcares reductores, y

todos los carbohidratos que contienen un grupo hemiacetal o

hemicetal dan pruebas positivas. Los carbohidratos que solo

contienen grupos acetal o cetal no dan pruebas positivas con estas

soluciones y se llaman azúcares no reductores.

Los azúcares reductores provocan la alteración de las proteínas

mediante la reacción de glucosilación no enzimática también

denominada reacción de Maillard o glicación. Esta reacción se

produce en varias etapas: las iniciales son reversibles y se completan

en tiempos relativamente cortos, mientras que las posteriores

transcurren más lentamente y son irreversibles. Se postula que tanto

las etapas iniciales como las finales de la glucosilación están

implicadas en los procesos de envejecimiento celular y en el

desarrollo de las complicaciones crónicas de la diabetes.

La glucosa es el azúcar reductor más abundante en el organismo. Su

concentración en la sangre está sometida a un cuidadoso mecanismo

de regulación en individuos sanos y, en personas que padecen

diabetes, aumenta sustancialmente. Esto lleva a que éste sea el

azúcar reductor generalmente considerado en las reacciones de

glucosilación no enzimática de interés biológico. Sin embargo,

cualquier azúcar que posea un grupo carbonilo libre puede reaccionar

con los grupos amino primarios de las proteínas para formar bases de

Schiff. La reactividad de los distintos azúcares está dada por la

disponibilidad de su grupo carbonilo. Se sabe que la forma abierta o

extendida de los azúcares no es muy estable, a tal punto que, por

ejemplo, en la glucosa representa sólo el 0,002 %. Las moléculas de

azúcar consiguen estabilizarse a través de un equilibrio entre dicha

forma abierta y por lo menos dos formas cerradas (anómeros cíclicos)

en las que el grupo carbonilo ha desaparecido. En 1953, el grupo de

Aaron Katchalsky, en el entonces recientemente creado Instituto

Weizmann de Israel, demostró que existe una correlación entre la

velocidad de la reacción de glicación y la proporción de la forma

abierta de cada azúcar [Katchalsky & Sharon, 1953]. De hecho, los

azúcares fosfato, que son azúcares reductores de gran importancia en

el interior celular, poseen mayor capacidad glucosilante que la

glucosa dada su mayor proporción de forma carbonílica (abierta).

La sacarosa es un disacárido que no posee carbonos anoméricos

libres por lo que carece de poder reductor y la reacción con el licor de

Fehling es negativa.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:

• Cocinilla eléctrica.

• Balanza analítica.

• Bureta graduada.

• Vasos de precipitación de

250 ml.

• Matraces de 250 ml.

• Matraz quitazato.

• Bomba de vacio.

• Pipetas de 10 ml.

• Papel filtro.

• Muestra mermelada.

REACTIVOS:

• Oxalato de sodio o potasio.

• Acetato de plomo.

• SOLUCION A: Se disuelve en 3,463 gr de CuSO4, 5H2O hasta

completar un volumen de 50 ml. De H2O destilada. Y se filtra.

• SOLUCION B: Se disuelve 17,3 gr de tartrato de potásico sódico

y 5 gr. De NaOH en 50 ml. De H2O destilada. Y se filtra.

• Solución de azul metileno al 0,2%.

PROCEDIMIENTO:

• Se peso 35 gr de muestra en un beacker de 150 ml con

aproximación de 0,1 mg.

• Se agrego 80 ml de agua destilada y agitar por rotación para

mezclar la muestra.

• Aforamos a 250 ml y se filtro la mezcla con papel filtro rápido

cuidadosamente con u embudo a una fiola de 100 ml.

• Aforar a 100 ml la muestra obtenida del filtrado(V1).

• Agregamos 1 ml de solución de acetato de plomo para

precipitar al 55 %.

• Valorar el azúcar reductor en el liquido filtrado utilizando el

método de fehling Causse - Bonnams.

• En un erlenmeyer de 250 ml de capacidad se coloca

exactamente 10 ml (5 de fehlig A, 5 ml fehling B) de reactivo

fehling, 30 ml de agua destilada y se calienta a ebullición, una

vez alcanzada esta; se comienza a agregar desde la bureta

graduada de 50 ml la solución patrón de azúcar de una

velocidad de goteo controlada de forma tal que evite

interrumpir la ebullición. Cuando la coloración azul reactivo

disminuya la intensidad o alcanze un tono celeste verdoso.

Sele agrego 3 gotas de la solución acuosa de azul de metileno

y se continua con el agregado de solución patrón ; gota a

gota, hasta decoloración.

• La primera gota que se tome a color rojo ladrillo parte de la

solución indica el punto final, (anotar el gasto de la solución

patrón) se debe realizar esta valoración por duplicado.

CALCULOS:

% DE AZUCARES REDUCTORES =

DONDE:

• V1 volumen total (100 ml).

• F Factor fehling (0,041).

• Wm peso de la muestra.

• G Gasto de la solución.

% DE AZUCARES REDUCTORES =

% DE AZUCARES REDUCTORES =

1,67 %

RESULTADO Y DISCUSIONES:

• Se obtuvo el porcentaje de azúcar redcutor en la mermelada

un 1,67 % realizando los cálculos correspondientes.

• La primera gota que se torno de rojo ladrillo inca el punto final

se hizo esta valoración por duplicado.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

• Se entiende por mermelada el producto preparado por cocción

de frutos

• enteros, troceados o tamizados y azúcar hasta conseguir un

producto semifluido o espeso.

• Se utilizo el método Fenling – Causse – Bonnans.

• En cuanto al contenido en azúcar de estos productos,

expresado en grados Brix. [ºBrix = (peso azúcar/peso

producto)x100; es decir, es la fracción de azúcar en el producto

referido al peso y expresado en tanto por ciento], las

legislaciones de los diversos países europeos son más o menos

coincidentes: Un mínimo de 45% (45 ºBrix) de azúcar en las

mermeladas.

• La practica de azucares reductores es laborioso y se necesita

realizarlo con mucho cuidado ya que si no obtendremos

resultados distintos a lo teórico.

BIBLIOGRAFIA:

• LEES, R. Análisis de los Alimentos. Métodos analíticos y de

control de calidad. Editorial Acribia, España, 1982. PEARSON, D.

Técnicas de laboratorio para el análisis de alimentos.

• Editorial Acribia, España, 1986.

www.sernac.cl/estudios/detalle.php?id=1246

www.varianinc.com/image/vimage/docs/products/consum/newsle

tter/shared/AR_164_PestiChemElut_SP.pdf

www.ars.usda.gov/is/espanol/pr/2007/070329.es.htm

ANEXO:

EQUIPOS: