TPN10 Azucares

Trabajo PracticoN°10

Hidratos de Carbono

Florencia Skoropad, Rocío Torres, Mónica Guberman y Nicolás González

Trabajo Practico N°10

Hidratos de Carbono

Objetivos:

Identificar monosacáridos y derivados a partir de cromatografía de partición sobre capa delgada de celulosa y cromatografía gas-líquido.

Reconocer los monosacáridos que componen un disacárido en este caso lactosa, realizando su hidrólisis acida

Introducción:

En la práctica se estudiaran los hidratos de carbono mediante tres distintos enfoques. Primeramente se identificarán diferentes azúcares por cromatografía en capa delgada de celulosa; luego se realizará la hidrólisis de lactosa siguiendo la reacción por CCD de celulosa con los patrones correspondientes y por último se identificará una mezcla de azúcares por CGL habiéndolos derivatizado adecuadamente con anterioridad.

Desarrollo Experimental:

1. Separación de hidratos de carbono por cromatografía en celulosa:

Los azúcares pueden identificarse por varios métodos; cuando se tratande azúcares relativamente sencillos puede realizarse un CCD de celulosa; si fuese más complicada serian necesario utilizar más métodos. En este caso, se estudiará como varían los Rg de los compuestos carbohidratados con solo la variación de un carbono quiral (como D-glc y D-gal) o también por grupos funcionales distintos (como D-Glc y D-Fructosa, o también un disacárido cualquiera). Las eluciones de cada uno ahora no solo dependerá de la polaridad de cada enlace y por lo tanto de la molécula en general, así como de su estructura; sino también de la posiciones de estos enlaces en el espacio por su quiralidad; es decir, en estas determinaciones se separan además diasteroisomeros.La celulosa es la fase estacionaria, que se encuentra adherida sobre un soporte para así lograr formar una película sobre la misma pudiéndose así adsorber selectivamente cada compuesto. Respecto del solvente de elución es una mezcla muy polar que maximiza la solubilidad de los azúcares (más que en agua), ya que es una mezcla de acetato de etilo, piridina y agua en relación 6:3:1. Las propiedades polares (por los oxígenos) y no polares (por la cadena etílica) del acetato de etilo, así como también para la piridina dada por el nitrógeno y el anillo hidrocarbonado, hacen solubles a una mezcla de azucares de estas características.

Reveladores:


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El problema principal para revelar placas de celulosa es evitar que esta misma reaccione, ya que a pesar de su estructura diferente, no deja de ser también un polímero de hidratos de carbono. Es por ello que deben evitarse reveladores destructivos como ácido sulfúrico que carbonizaría no solo los compuestos eluidos sino también la placa, y también la lámpara de UV-Vis (de 240nm en general) no resulta útil debido a que los compuestos no son insaturados y mucho menos conjugados. Los reveladores utilizados son los siguientes:

a) Para azúcares reductores:

Para todos aquellos azucares que posean un grupo ceto reactivo, será posible oxidarlos a acido con plata en solución; en este caso se requiere medio básico no amoniacal y se evitara la formación del óxido correspondiente con un agregado posterior de tiosulfato. Este último se compleja con la plata no reactiva (en general precipitara inicialmente como un sólido marrón del Ag2O) manteniéndola en solución en una especie incolora. Pudiéndose observar en las áreas donde la plata reacciona, la formación de plata sólida que se observaría como una mancha oscura. Con este revelador se identifican todas las azucares reductoras; ya sean aldosas como disacáridos reductores. Además, como el medio será básico se favorece la formación de enoles derivadas de la cetosa correspondiente que está en equilibrio a su vez con la forma aldólica y por ende reductora; pudiendo reaccionar así también las cetosas al irse desplazando el equilibrio ceto-enolico.

b) Para azúcares aldosas reductoras:Luego, pueden diferenciarse aldosas mediante el uso de ácido ftálico en anilina. La mezcla de reactivos se realizara in-situ y forman primeramente un compuesto coloreado (Rosa) que será éste quien reaccione sobre el carbono carbonílico de la aldosa. Dependiendo de si es una hexosa o una pentosa el color del producto variará; ya que el primero forma un compuesto amariilo-marron y el segundo será de color rosa. Nuevamente debido al equilibrio ceto-enolico existente para las cetosas, es posible que se revelen luego de un cierto tiempo, ya que como en este caso el medio no es básico, la concentración de especie aldoica es mucho menor y por ende menor será la velocidad de la reacción.

c) Para polialcoholesEl ultimo revelador es universal para azucares y polialcoholes no derivatizados. Este es un oxidante especifico de periodato que destruye enlaces de dioles vecinales (presentes en azucares y polialcoles) formando las cetonas correspondientes. A estos productos se los oxida nuevamente, con permanganato en medio carbonato (levemente básico, disminuye poder oxidante) produciéndose los ácidos correspondientes y la formación del óxido de manganeso (IV) de color marrón, que a estas concentraciones se observa amarillo. La aparición de este color- así como la desaparición del color púrpura propio del permanganato- indica el positivo a la presencia del compuesto.

Como cada revelador y compuesto difieren en velocidad de reacción y reactividad, será necesario que se siembren una cierta cantidad de gotas de cada patrón o muestra de forma de que se observe la reacción positiva o no en un tiempo mínimo, pero a la vez se deben minimizar la cantidad de las mismas para evitar difusión durante las eluciones y dificultar la identificación de las mismas; por lo que existe un compromiso entre estos dos aspectos en la cantidad de gotas


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utilizadas. Asimismo se alejan las siembras lo máximo posible también para contribuir a disminuir las difusiones que puedan ocurrir.

2. Hidrólisis de la lactosa e identificación de los productos de hidrólisis por cromatografía en capa delgada de celulosa:

La lactosa es un disacárido de la D-glucosa y la D-galactosa, como la unión es 1-4 y no involucra ambos carbonos anomericos, una de las terminales es reductora, pudiendo así observarse por CCD de celulosa su reacción con los reveladores anteriormente citados.En este caso, se producirá su hidrólisis en medio ácido y por digestión, de forma de romper la unión glicosidica formándose los hidratos de partida, en este caso serán D-glucosa y D-galactosa. Ambas también son identificables por CCD en celulosa por lo que se realizara el seguimiento de la reacción por cromatografía, sembrando la solución resultante a varios tempos de reacción en una misma placa. La condiciones de la siembra, elución y revelado son idénticas al ítem anterior. Se revelarán las placas con las primeras dos técnicas a) y b).

3. Preparación de los acetatos de alditoles:En la última parte del trabajo práctico se dispondrá de una muestra de azucares incógnita, dada por los docentes, de la cual se deber identificar su composición. Para el análisis de la mezcla se utilizara un método muy común debido a su selectividad, precisión y sensibilidad: el CGL. Pero es necesario que los compuestos carbohidratados sean derivatizados primeramente, ya que la enorme cantidad de hidroxilos que contienen nunca podrían eluirse de la fase estacionaria y podrían hasta permanecer en la misma como impurezas en posteriores análisis. Se realizarán entonces una reducción y una posterior acetilación; la reducción es necesaria porque de no realizarse, se observarían en el análisis de cada carbohidrato las distintas variedades de sus formas furanosas y piranosas (4 solamente por cada aldosa o hexosas, y otros más para disacáridos dependiendo del tipo de unión); la acetilación es necesaria para aumentar la volatilidad de los productos y su termoestabilidad.

4. Análisis por Cromatografía Gaseosa

La cromatografía gaseosa utilizada en este caso es gas-liquido. La resolución en CGL está dada tanto por la volatilidad de los productos como por la partición selectiva en la columna debida a las diferentes solubilidades. La volatilidad de los hidratos aumenta al derivatizarlos ya que los compuesto acetilados poseen un menor punto de ebullición al no existir ahora posibilidades de puente hidrogeno entre las moléculas que existían tanto en forma de hidratos y aun más en la forma del polialcohol. Luego también las solubilidades disminuyen considerablemente por lo que los tiempos de retención disminuyen proporcionalmente.

De esta manera, la muestra reducida y acetilada, habiéndose previamente eliminado los subproductos y residuos con lavados orgánicos, y obteniéndose la muestra derivatizada pura, se la inyectara en el CGL, que le realizar ´PREVIAMENTE un Split, de 1:100 tomando solamente 10μL de muestra. Los tIempos de retención variaran por tamaño de molécula y por la estructura de la misma, comparándose luego con patrones pertinentes.


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Procedimiento:

1. Separación de hidratos de carbono por cromatografía en celulosa:Los hidratos de carbono que se analizaran con esta técnica serán los siguientes:

Estas corresponden a tres aldosas (dos hexosas y una pentosa), una cetosa, un polialcohol, un disacarido y un glicosido. Se siembran en una cromatoplaca de 10x10cm de celulosa utilizado una mezcla de Acetato de etilo-Piridina-Agua 6:3:1 como solvente de desarrollo. Dejando un centimetro entre cada calle de la placa para evitar dispersion de las mismas, dificultando la identificacion de cada azucar luego de los revelados. Debido a que los compuestos son muy polares, es neceario que la placa sea eluida dos veces para lograr no solo el aumento general de cada mancha sino tambien, poder aumentar las diferentes eluciones de los diasteroisomeros que son minimas y que solo de esta forma pueden seraparse adeacuadamente.

Reveladores:

a) Para azúcares reductores:La placa recientemente corrida, se deja secar y se la sumerge en una mezcla acetona saturada en solución de nitrato de plata y posteriormente se le pulveriza una solución alcohólica básica de NaOH 5% en EtOH 5%. Posteriormente se eliminan los excesos de plata con un lavado en solución de tiosulfato 5% en agua.La reacción global que se lleva a cabo es:


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Se observa asi que la presencia de estos grupos, ceto y aldolico se identifican por la presencia de la mancha oscura de plata. En particular, las cetonas son reactivas (lentamente, pero lo hacen),por el quilibrio ceto-anolico que experimentan en medio basico; dada por la siguiente reaccion de equlibrio

La lentitud de la reaccion se debe a la minima proporcion de forma aldolica que hay presente respecto a la cetosa.

Ademas, la plata en medio basico precipita en forma de su oxido marron, muy insoluble; por lo que para diferenciar las manchas oscuras de plata del oxido se disuelve este ultimo por el lavado en solucion de tiosulfato, que forma el siguiente complejo incoloro que disuelve el precipitado debido a una constante de formacion mas favorable.

b) Para azúcares aldosas reductoras:

Mediante el uso de este revelador es posible diferenciar entre hexosas y pentosas. En el caso de aldopentosas se obtiene furfural y para las aldohexosas, el producto es hidroximetilfurfural. Luego, este compuesto carbonílico reacciona con la anilina a través de un ataque nucleofílico al carbono carbonílico. El producto que se forma es la correspondiente imina. Para que este último paso ocurra, el azúcar de partida debe ser reductor. Las primeras dan una mancha de color rosado mientras que las segundas presentan manchas de coloración parda. Las cetosas también pueden reaccionar pero lo hacen muy lentamente.

La reacción global es:


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El reactivo se prepara en el momento usando acido ortoftalico en butanol saturado con agua y anilina previamente destilada. Se pulveriza sobre la placa de celulosa recientemente eluida y secada y se seca en estufa por solo unos minutos. Evitando asi en este tiempo que la celulosa se descomponga.

c) Para polialcoholes

Para identificar todo tipo de compuestos con dioles vecinales, se usa una mezcla de periodato al 2% y permanganato al 1% en bicarbonato al 2%; al igual que las anteriores se prepara en el momento. La reacción es más lenta que las anteriores pero da buenos resultados. Primeramente el periodato oxida los enlaces de los dioles fragmentando la molécula en dos compuestos ceto-derivados. Luego, el permanganato oxida a acido cada uno de esto y por lo tanto este se reduce a dióxido de manganeso (IV) que es de color marrón, pero se observara como una coloración amarilla sobre los compuestos recientemente eluidos.

La reacción Global correspondiente es:


Se hidroliza lactosa en medio acido, obteniéndose D-glc y D-gal. Se hidratan 200 mg de lactosa en 1 ml de agua y se hidroliza adicionando 0,2ml de ácido clorhídrico 2M. Luego se calentara a baño maría por 30 minutos. El seguimiento de la reacción se realiza sembrando en cromatoplaca de celulosa de 10x10cm utilizando como testigos lactosa, d-glc y d-gal. Se tomaran muestras a los tiempos: 0, 5, 10, 20 y 30 min, sembrándolas adecuadamente en la placa, Nuevamente se utiliza como solvente de elución una mezcla de AcOEt-Py-H2O (6:3:1) y se revelaran con nitrato de plata y permanganato; por lo que se sembrara cada muestra y patrón en dos placas paralelamente.La reacción resulta:


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Es válido aclarar que ambos productos, por hallarse en solución, al cabo de un tiempo se encontrarán en equilibrio con sus otras formas (abiertas y cerradas, en α y en β).

3. Preparación de los acetatos de alditoles:

A la muestra incógnita de hidratos de carbono que se nos suministró por el grupo docente, se la disolvió en metanol y se agregó una punta de espátula de borohidruro de sodio. Se deja reaccionar y se procede a la eliminación con acético del borohidrato resultante por el docente a cargo. Se elimina por volatilidad el éster-borato resultante. Luego se procede a la acetilación adicionando a la solución anterior anhídrido acético en piridina y calentando por 30min a 80°C aproximadamente.

Luego se realizan extracciones a partir de la solución resultante en cloruro de metileno con agua, eliminando la posible existencia de borato aun persistente, luego con bicarbonato para eliminar el ácido acético en exceso y luego con agua para neutralizar y eliminar posibles sales resultantes. La fase orgánica se evaporara luego a sequedad y el residuo se disuelve en cloruro de metileno y se analiza por CGL.

Reacciones Involucradas:Reducción:

Acetilación:


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Mecanismo de la acetilacion (R en este caso es cada terminal alcohólica del alditol):


Se inyecta la mezcla anterior en el cromatografía, 1μL , y se corre la cromatografía a 230°C con flujo de 1ml por min. Se compara luego los picos obtenidos con los patrones correspondientes.

Resultados y Conclusiones:

1. Separación de hidratos de carbono por cromatografía en celulosa:


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La mancha correspondiente a la xilosa era de un color rosa intenso, la de la glucosa marrón, la de la galactosa era marrón amarillenta y la de la lactosa era muy tenue.Los compuestos revelados con biftalato fueron xilosa, galactosa, glucosa y lactosa, mientras que el glucitol, la fructosa y el metilglicósido no fueron revelados. Es decir, se consiguió revelar aldohexosas, aldopentosas y azúcares reductores, pero no cetosas, alditoles ni metilglicósidos. Como indica la reacción correspondiente (expuesta anteriormente) el biftalato de anilina reacciona con el carbono carbonílico del azúcar, por lo tanto se necesita que este esté libre para reaccionar, y no reacciona con alditoles ni con carbonilos involucrados en uniones glicosídicas (metilglicósidos o azúcares no reductores), tampoco con cetosas, porque al ser el medio de reacción ácido no puede establecerse el equilibrio ceto-enólico necesario para formar el aldehído.Además, tras colocar la placa en la estufa, se observo que la xilosa (pentosa) revelaba fucsia, mientras que los restantes compuestos revelaban marrón, en concordancia con las reacciones anteriormente planteadas.

No se obtuvieron placas de revelado con nitrato de plata o permanganato con resolución suficiente como para ser analizadas.


Se observa en ambos revelados, por contraste con patrones en la misma placa: a tiempo cero presencia de lactosa, y a medida que avanza el tiempo de reacción se nota un aumento en la concentración de los productos de hidrólisis, glucosa y galactosa (el aumento de concentración se ve en el hecho de que las manchas se hacen más intensas) y una disminución en la concentración del disacárido (identificado por manchas más tenues). Luego de veinte minutos de reacción, la hidrólisis es total y no se observa presencia del disacárido.



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Condiciones de corridaColumna SP 2330Longitud: 30mDiámetro interno: 0,25μmGrosor del film: 0,2μm

Programa:Temp. columna: 230°C isotérmicaTemp. Inyector y detector: 240°CFlujo: 1ml/minSplit: 1/100

Cromatograma de patrones Cromatograma de la muestra incógnita

De acuerdo a la comparación basada en los tiempos de retención del cromatograma obtenido para la muestra incógnita con el cromatograma de patrones, se identifica en la mezcla incógnita la presencia de los derivados acetilados de la d-glucosa y de la d-xilosa, en proporciones de 34% y 66% respectivamente, en base al área encerrada bajo cada una de los picos (las integraciones para los picos están indicadas en los cromatogramas adjuntos). Caben entonces dos posibilidades: los compuestos originales podrían ser D-glucosa y D-xilosa, o los alditoles glucitol y xilitol (puede ser que hubiese un alditol, ambos alditoles, o mezclas de las mencionadas hexosas con sus alditoles). Se descarta la posibilidad de que hubiese una fructosa presente, o alguna otra hexosa presente, porque entonces se deberían haber observado picos correspondientes a los derivados de dos azúcares que son epímeros en la posición en la que se encuentra el cabonilo de la cetosa: por ejemplo, de tener fructosa se debería haber observado en el CG la presencia de los derivados de la glucosa y de la manosa (epímeros en C2, que es donde la fructosa tiene el carbonilo) y de tener una cetopentosa además del derivado de la xilosa se debería haber observado la presencia del derivado de otra pentosa (epímero de la xilosa).


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Conclusiones

En este trabajo práctico se buscó, principalmente, analizar y reconocer hidratos de carbono según distintas técnicas; algunas de estas técnicas han perdido su plena vigencia en la actualidad- como los distintos reveladores sobre placas de celulosa-, y han sido desplazados por métodos más prácticos, cómodos y precisos, como la cromatografía gas-líquida.

No se pueden establecer conclusiones claras sobre la utilidad del revelado de placas de celulosa para identificar compuestos, ya que se obtuvieron resultados confusos y poco claros. El único revelador con el cual se obtuvieron placas con claridad suficiente para establecer un análisis fue el de biftalato/anilina, en el que se pudieron diferenciar claramente hexosas de pentosas. Sin embargo, este revelador no permite identificar compuestos tales como cetosas, alditoles o glucósidos, por lo que sería necesario emplear otra técnica para ellos. Sin embargo, fue posible controlar el progreso de una reacción de hidrólisis mediante placa de celulosa, tanto revelada con plata en medio básico como en la ya mencionada mezcla de biftalato/anilina, en la cual se observó claramente la progresiva disminución en la concentración del disacárido y su correspondiente aumento en la concentración de los monosacáridos obtenidos.

Por otro lado, el análisis de una muestra incógnita por cromatografía gas-líquida presentó resultados muy satisfactorias, ya que no solo se pudieron identificar las muestras incógnitas, si no incluso también la proporción en la que se encontraban. Pese a su precisión, esta técnica presenta algunas contras. En primer lugar, las muestras deben ser sometidas a un especial tratamiento antes de ser utilizadas en esta técnica, ya que no todos los compuestos son aptos para ser analizados por cgl. Las derivatizaciones necesarias para analizar la muestra por cgl pueden demorar el análisis horas o incluso días. Por otro lado, es necesario contar con patrones bien analizados, para poder contrastar con estos las muestras a identificar, aunque esta es una necesidad que presentan prácticamente todos los métodos de identificación. Por último, los tratamientos a los que es necesario someter a las muestras pueden llegar a generar resultados ambivalentes en las identidades de estas. Por ejemplo, si se hubiese obtenido una mezcla de manitol y sorbitol, esta mezcla podría haber provenido originalmente de una mezcla de glucosa y manosa, de fructosa, o de los alditoles directamente (por no mencionar todas las posibles combinaciones). Sin embargo, existen otros métodos que pueden ser utilizados a la hora de hacer un análisis más fino como, por ejemplo, realizar una derivatización con grupos nitrilo, etc.

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