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1. INTRODUCCIÓN El tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), corresponde a una especie de ambiente tropical, por lo que es un cultivo sensible a temperaturas inferiores a los 10°C (MAROTO, 1994). Esto hace que se limite la época y las zonas geográfica de desarrollo de este cultivo al aire libre. Actualmente se ha logrado cultivar sólo en zonas con temperaturas cálidas y con ausencia de heladas. La tolerancia de los tomates a temperaturas menores a 10°C es de considerable importancia práctica. Los genotipos tolerantes a bajas temperaturas podrían mostrar un mejoramiento en la precocidad, adaptabilidad, uso de agua, y además producir frutos de mejor calidad, comparados con los genotipos susceptibles a estrés por frío. La necesidad de contar con nuevas variedades mejoradas de tomate resistentes a distintos tipos de estrés ha llevado al estudio de características genéticas presentes en especies silvestres de Lycopersicon. De ellas, L. hirsutum destaca por su capacidad para sobrevivir y desarrollarse en ambientes de bajas temperaturas letales para el tomate doméstico (NUEZ, 1995). Al igual que todos los miembros de la sub-familia Solenoideae, el tomate tiene una base de cromosomas X=12. La compatibilidad de cruzamiento entre Lycopersicon hirsutum y Lycopersicon esculentum ha permitido el desarrollo de líneas genéticas de tomate mediante procesos de retrocruza las cuales presentan la característica de tolerancia a bajas temperaturas, dada por la especie silvestre. Por otro lado, el desarrollo de líneas derivadas de un cruzamiento entre L. hirsutum y L. esculentum mediante una selección asistida con marcadores moleculares, proporciona una eficaz herramienta para el estudio de genes y su expresión fenotípica, incluyendo aquellos rasgos de potencial interés para el mejoramiento de las variedades cultivadas (MONFORTE y TANKSLEY, 2000).
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1. INTRODUCCIÓN
El tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), corresponde a una especie de ambiente
tropical, por lo que es un cultivo sensible a temperaturas inferiores a los 10°C
(MAROTO, 1994). Esto hace que se limite la época y las zonas geográfica de
desarrollo de este cultivo al aire libre.
Actualmente se ha logrado cultivar sólo en zonas con temperaturas cálidas y con
ausencia de heladas. La tolerancia de los tomates a temperaturas menores a 10°C
es de considerable importancia práctica. Los genotipos tolerantes a bajas
temperaturas podrían mostrar un mejoramiento en la precocidad, adaptabilidad, uso
de agua, y además producir frutos de mejor calidad, comparados con los genotipos
susceptibles a estrés por frío.
La necesidad de contar con nuevas variedades mejoradas de tomate resistentes a
distintos tipos de estrés ha llevado al estudio de características genéticas presentes
en especies silvestres de Lycopersicon. De ellas, L. hirsutum destaca por su
capacidad para sobrevivir y desarrollarse en ambientes de bajas temperaturas
letales para el tomate doméstico (NUEZ, 1995).
Al igual que todos los miembros de la sub-familia Solenoideae, el tomate tiene una
base de cromosomas X=12. La compatibilidad de cruzamiento entre Lycopersicon
hirsutum y Lycopersicon esculentum ha permitido el desarrollo de líneas genéticas
de tomate mediante procesos de retrocruza las cuales presentan la característica
de tolerancia a bajas temperaturas, dada por la especie silvestre. Por otro lado, el
desarrollo de líneas derivadas de un cruzamiento entre L. hirsutum y L. esculentum
mediante una selección asistida con marcadores moleculares, proporciona una
eficaz herramienta para el estudio de genes y su expresión fenotípica, incluyendo
aquellos rasgos de potencial interés para el mejoramiento de las variedades
cultivadas (MONFORTE y TANKSLEY, 2000).
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Temperaturas sub óptimas de crecimiento al igual a otros estreses
medioambietales dentro de los que se pueden nombrar temperaturas supra óptimas
de desarrollo o sequía, inducen a la planta a producir altos niveles de ácido
absísico, ABA. Este aumento endógeno de la hormona provoca que se expresen
genes que confieren a la planta diversos mecanismos de respuesta, pero también
existen señales de transducción independientes de ABA (SHINOZAKI y
YAMAGUCHI - SHINOOZAKI, 1996).
En las líneas de tomate que presentan la característica de resistencia a bajas
temperaturas esta condición respondería a altas concentraciones endógenas que
estas presenten, independiente de ser expuestas a estrés, o bien a un aumento en
el contenido endógeno de ABA frente a estrés por frío.
Por consiguiente, el presente estudio tiene como objetivo evaluar la evolución del
contenido endógeno de ABA en líneas genéticas de tomate que presentan
introgresiones provenientes de L. hirsutum, en un período de exposición a
temperaturas menores a 10 °C, así mismo evaluar el crecimiento vegetativo de las
líneas para establecer la posible correlación de parámetros vegetativos con la
evolución del contenido endógeno de ABA. Por otro lado, evaluar el desarrollo
vegetativo de las líneas genéticas que presenten diferencias respecto al contenido
endógeno de ABA durante un período de exposición constante a bajas
temperaturas, desde emergencia hasta la el momento de transplante.
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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Características de la especie:
El tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es miembro de la familia Solanaceae. El
centro de origen del tomate se ubica en las planicies costeras occidentales de
Sudamérica, extendiéndose desde el sur de Colombia hasta el norte de Chile
(KINET y PEET, 1997).
Los dos tipos principales de tomate cultivados en la actualidad son: (a)
determinados, los que poseen un período definido de floración (solo dos o tres
inflorescencias son producidas en el tallo principal), y otro periodo de desarrollo de
los frutos; y (b) indeterminados, los que son usados para consumo en fresco y para
producción bajo invernaderos (CHAMARRO,1995; y KINET y PEET, 1997).
2.1.1. Temperaturas requeridas por la especie
Respecto a las condiciones ambientales del cultivo, debido a que el tomate es un
cultivo típico de primavera - verano, de origen tropical, requiere tanto para su
desarrollo vegetativo como reproductivo, de temperaturas moderadas debiendo
existir una diferencia de varios grados entre el día y la noche, y un largo periodo
libre de heladas (CORFO Universidad Católica de Chile, 1986).
La temperatura mínima a la cual la planta puede sufrir daños de helada no es fácil
de precisar porque depende entre otros factores del estado de desarrollo de la
planta, de su potencial hídrico, del estado hídrico del suelo y de la atmósfera de
alrededor, pero a 1°C casi siempre se producen síntomas de helada en las hojas.
La mayoría de los genotipos de tomate sufren daño por frío cuando se exponen a
temperaturas cercanas a los 10°C o menores. Exposiciones prolongadas a
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temperaturas bajo los 10°C puede generar la muerte de la planta. Con exposiciones
menos extremas el crecimiento solo se retarda (STEVENS y RICK, 1986).
2.1.2. Efecto de frío en germinación - emergencia del tomate
Existen diversos factores que afectan el éxito de la germinación, dentro de los
cuales es posible señalar: factores genéticos, condiciones de cosecha y almacenaje
y factores abióticos presentes en el suelo como son la salinidad, pH, luz, contenido
hídrico, oxigenación y temperatura.
EL-SAYED y JOHN (1973) en un estudio de la heredabilidad de la emergencia del
tomate a diferentes temperaturas, concluyeron que el tiempo requerido para la
germinación y emergencia de las semillas de tomate esta influenciado por la
temperatura del suelo, y que el tiempo de germinación incrementa progresivamente
si la temperatura decrece de 15° a 10°C; bajo los 10°C la germinación es inhibida.
Sin embargo, existen diferencias entre genotipos de L. esculentum para rangos de
germinación a temperaturas mayores a 10°C, y el nivel de rapidez de germinación
es heredable.
2.1.3. Efecto de frío en desarrollo vegetativo
La temperatura es la variable de mayor incidencia en el crecimiento de las plantas,
en condiciones climáticas adversas, como presencia de frío aún sin llegar al punto
de congelamiento, se produce trastorno en la asimilación de nutrientes (GIACONI y
ESCAFF, 1993).
Otro efecto provocado por estrés por bajas temperaturas es que genera una
disminución de la capacidad fotosintética de las hojas maduras, lo que produce un
retraso en la formación de hojas nuevas hasta por una semana después de
ocurrido el estrés (BRUGGEMANN, 1992).
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Las temperaturas óptimas para el desarrollo del tomate son de 24-25°C/ 15-18°C
(día/noche). Bajo los 12°C se paraliza el desarrollo vegetativo y con temperaturas
inferiores a los 7°C se necesita una ayuda artificial de calefacción (RODRÍGUEZ,
TABARES y MEDINA, 1984).
Respecto a la temperatura diurna, se puede decir que esta afecta notoriamente la
velocidad de crecimiento provocando que se adelante la formación de hojas. Cabe
señalar que el aumento en 1°C de la temperatura media por 24 horas, aumenta la
velocidad de crecimiento en un 10% (BRUYNEL, 1993).
Respecto a la temperatura nocturna, FOLQUER (1979) señala que las plantas
jóvenes alcanzan su crecimiento máximo con temperaturas nocturnas de 26 a 30ºC,
pero al aumentar su edad, dicho punto óptimo desciende hasta 14 ó 17ºC. Según
WENT (1944) y WITTWER y AUNG (1969), citados por WOLF et al. (1986), breves
exposiciones a bajas temperaturas nocturnas (10° a 16°C) durante el estado
vegetativo de la planta de tomate, después de la total expansión de los cotiledones,
retrasan el crecimiento vegetativo y avanzan el crecimiento reproductivo por una
iniciación temprana de las inflorescencias.
Respecto a la temperatura del suelo, para RODRÍGUEZ, TABARES y MEDINA
(1984) la temperatura óptima para el crecimiento de la raíz del tomate oscila entre
20 y 30ºC. La temperatura del suelo incide directamente sobre el nivel nutricional,
por sus efectos en la tasa de producción de hormonas en las raíces y la distribución
de nutrientes dentro de la planta que de acuerdo a la fuerza de los distintos sinks
metabólicos (PAPADOPOULOS y TIESSEN, 1987). Además, la acción de
temperaturas relativamente bajas (10-13°C) a nivel radicular incrementa el número
de flores iniciadas en el primer racimo, mientras que la acción de estas mismas
temperaturas a nivel aéreo acorta el número de nudos sobre los que se desarrolla
el primer racimo floral (RAPPORT y SACHS, 1976, citados por MAROTO, 1994).
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2.1.4. Efecto de frío en floración
El tomate es una planta autónoma, es decir, no requiere condiciones ambientales
particulares para iniciar las estructuras reproductivas, como fotoperíodo o
vernalización. Sin embargo, esto no significa que la floración no sea afectada por el
ambiente (KINET y PEET, 1997). El número de días hasta la primera antesis es
determinado por el número de hojas que preceden a la primera inflorescencia, y el
grado de iniciación floral. Así, cuando el ritmo de producción de hojas es el mismo,
la floración y rendimiento más tempranos están asociados con un menor número de
hojas hasta la primera inflorescencia (DIELEMAN y HEUVELINK, 1992).
Cuando las plantas son sometidas a estrés por frío durante el desarrollo
reproductivo pueden manifestar un gran incremento en el número de órganos
florales, debido principalmente a la iniciación de un mayor número de primordios de
órganos en los meristemas florales (LOZANO et al., 1988).
2.2. Mecanismos de resistencia al frío:
Un estrés medioambiental raramente ocurre de forma individual; el estrés por frío
no es la excepción ya que factores como la duración del período de frío, la
intensidad de este, intensidad lumínica, aclimatación, estatus hídrico, ontogenia de
la planta y la sensibilidad inherente de ésta, interactúan y pueden incluso
acrecentar el efecto o mecanismo de acción frente a un daño por frío (KRATSCH Y
WISE, 2000).
El daño por frío ocurre en especies sensibles a la temperaturas que son muy bajas
para su normal crecimiento, pero no lo suficientemente bajas como para formar
hielo. KRATSCH Y WISE (2000), señalan en relación a los daños a nivel celular
que los cloroplastos son el primer y el mas dañado de todos los organelos,
seguidos por los tilacoides que pierden su forma y los gránulos de almidón
desaparecen, por otro lado, la desintegración de cloroplastos ocurre frente a
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períodos prolongados de frío, finalmente, las mitocondrias, núcleo y otros organelos
son menos susceptibles a daño por frío.
Todos estos daños a nivel celular en conjunto hacen que el crecimiento se retarde,
las hojas muestren inhibición de la fotosíntesis y traslocación de carbohidratos,
además ocurre un retardamiento de la respiración, inhibición de la síntesis proteica
y degradación de las proteínas existentes. Estas respuestas probablemente
dependen de un mecanismo primario común asociado a la pérdida de las
propiedades de la membrana durante la exposición al frío (TAIZ y ZEIGER, 1998).
En plantas sensibles al frío, los lípidos de la bicapa de la membrana celular poseen
un gran porcentaje de cadenas de ácidos grasos saturados, los cuales tienden a
solidificarse a temperaturas cercanas a los 0°C. Dichas membranas comienzan a
hacerse menos fluidas y sus componentes proteicos no pueden funcionar
normalmente, trayendo consigo la inhibición de la actividad de la H+ ATPasa y del
transporte de solutos entre y fuera de las células y por último inhibición del
metabolismo dependiente de enzimas. Un mecanismo fisilógico que presentan las
especies resistentes al frío consiste en la generación de ácidos grasos insaturados
en su membrana celular (TAIZ y ZEIGER, 1998).
Un mecanismo de resistencia al frío en Lycopersicon hirsutum, es la regulación de
la cadena de transporte de electrones a bajas temperaturas para prevenir la
producción incontrolada de radicales libres, los cuales dañan al fotosistema II
(WALKER y Mc KERSIE, 1991). Debido a que las temperaturas en el hábitat de
Lycopersicon hirsutum durante el día son siempre mayores que 10°C, pero caen
rápidamente bajo los 10°C en la noche, la capacidad de resistencia al frío puede
basarse en una alteración fotosintética muy lenta, y en una rápida recuperación de
la misma (PATTERSON, 1988).
Existe una relación entre el contenido endógeno de carbohidratos y la resistencia al
frío, ya que se ha demostrado que los contenidos endógenos de almidón y azúcar,
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disminuyen rápidamente en la planta durante un período de oscuridad, mientras
que durante un período de luz, por medio de una respuesta fotosintética, existe una
restauración de los niveles de carbohidratos en el tejido, por lo que el aumento de
la resistencia a las bajas temperaturas antes de los períodos de oscuridad estaría
asociada al contenido de carbohidratos de las plantas (KING et al, 1988).
2.3. Obtención de líneas con resistencia al frío:
La diversidad genética del tomate es reducida, y la característica de resistencia al
frío no ha sido encontrada en al germoplasma del tomate cultivado. Ello ha
motivado a los mejoradores a estudiar la posibilidad de introducir genes para la
resistencia de especies silvestres del género Lycopersicon que han evolucionado
en medios ambientes en los que la temperatura nocturna es menor a 10°C
(PATTERSON, 1988).
Como se señaló anteriormente, Lycopersicon hirsutum posee la capacidad de
resistencia a bajas temperaturas y ésta se manifiesta en diversas etapas de
desarrollo, incluyendo la germinación, emergencia y crecimiento vegetativo (WOLF
et al., 1986).
Algunos ecotipos de Lycopersicon hirsutum han sido colectados a diferentes
altitudes en Perú, desde cercanías al nivel del mar hasta los 3300 m. Las
variedades de tomates comerciales germinan muy lento bajo los 10°C, pero los
ecotipos Lycopersicon hirsutum de regiones cordilleranas germinan normalmente a
6°C - 7°C (PATTERSON, PAULL y SMILLIE, 1978).
Aunque algunas características del tomate están controladas por factores genéticos
individuales, como el hábito de crecimiento y la resistencia a varias enfermedades,
la mayoría están controlados por muchos genes diferentes, cada uno con un
pequeño efecto. La selección fenotípica para estos rasgos poligénicos es
generalmente lenta, debido a la segregación en numerosos loci y a los efectos
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medioambientales sobre el fenotipo, lo que implica una heredabilidad más bien baja
de estos rasgos (DE VERNA y PATTERSON, 1991).
Una técnica alternativa a las técnicas tradicionales para rescatar genes de plantas
silvestres, como los de Lycopersicon hirsutum, e incorporarlos a plantas cultivadas
es el método de la retrocruza. Ésta, consiste en el cruzamiento reiterado de la
progenie híbrida con uno de los parentales. El parental que aporta los genes que
controlan el carácter a mejorar es denominado donador o no recurrente. El parental
al cual se transfieren los genes es llamado recurrente, lo que indica que es usado
repetidamente en el proceso de retrocruza (FEHR,1991). Por otro lado, el uso de
marcadores moleculares para el mapeo de regiones cromosómicas que se
manifiestan de manera cuantitativa (QTL, quantitative trait loci), es útil para
determinar si los rasgos asociados son afectados por un mismo gen con efectos
pleitrópicos o por genes separados, pero ligados (LINDHOUT et al., 1994).
VALLEJOS y TANKSLEY (1983) en un trabajo en el que se utilizaron líneas
obtenidas a partir de la cruza entre Lycopersicon hirsutum y L. esculentum, se
analizaron once loci del genoma que confieren tolerancia al frío y que se distribuyen
en ocho de los doce cromosomas del género Lycopersicon. Del resultado del
estudio, se logró determinar un mínimo de tres loci responsables del crecimiento a
bajas temperaturas.
2.4. Reguladores del crecimiento en respuesta a estrés:
Una de la características de las fitohormonas es su interacción y la regulación de
procesos específicos en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Una hipótesis
general sobre el rol de las fitohormonas en la regulación de la respuesta de la
planta frente a un estrés sería la siguiente: las plantas responden a diferentes
estreses de una manera similar, y esta respuesta es el resultado de muchos
procesos coordinados en que todas las fitohormonas están envueltas (ITAI, 1999).
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2.5. Ácido abscísico:
El ABA (C15H20O4) es un sesquiterpeno apocarotenoide, que se sintetiza en los
cloroplastos y otros plastidios mediante escisión oxidativa de los epoxi-carotenoides
neoxantina y violaxantina. Su forma natural es (+)-(S)-ABA (ZACARÍAS y
LAFUENTE, 2000). El ácido abscísico (ABA) es un regulador esencial del
crecimiento de las plantas que se encuentran en pequeñas cantidades en todos los
tejidos vegetales en plantas superiores. También puede estar presente en algunos
musgos, algas verdes, cianobacterias y varios hongos fitopatógenos.
Al igual que otras hormonas, los procesos de biosíntesis, catabolismo y transporte
del ABA dependen de la concentración en el tejido y la sensibilidad del tejido a la
hormona (TAIZ y ZEIGUER, 1991).
El ABA presenta efectos fisiológicos que parecen estar implicados en respuesta al
estrés y en procesos del desarrollo (ZACARÍAS y LAFUENTE, 2000). De hecho,
esta hormona sobresale del resto de los otros reguladores del crecimiento en un
importante aspecto: la mayoría de los procesos fisiológicos son inhibidos por ABA,
mientras que muy pocos ejemplos de actividad estimulatoria por ABA son
conocidos (ITAI, 1999).
2.5.1. Funciones fisiológicas del ABA
El ABA juega un rol regulatorio en la iniciación y el mantenimiento de las semillas
en dormancia, además regula la respuesta de las plantas frente a algún estrés y
adicionalmente influencia muchos otros aspectos del desarrollo de la planta por
medio de la interacción con las auxinas, citoquininas y giberelinas.
En especies leñosas, la dormancia es una importante característica adaptativa en
climas fríos. Esta respuesta requiere un mecanismo sensorial que detecta los
cambios medioambientales y un sistema de control que traduce la señal y
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desencadena el proceso de desarrollo dejando las yemas dormantes. Existe una
interacción entre el ABA y otras hormonas como parte del proceso en el cual las
yemas dormantes y crecimiento son regulados. Este balance se realiza entre
inhibidores del crecimiento de las yemas, como el ABA, y sustancias inductivas del
crecimiento como citoquininas y giberelinas (TAIZ y ZEIGER, 1991).
El ABA parece actuar como hormona de inducción a dormancia. Inhibe la síntesis
de enzimas hidrolíticas esenciales para el desdoblamiento de reservas
almacenadas en la semilla. El crecimiento inducido por auxinas es inhibido por
ABA, por esta razón esta hormona es también llamada la hormona inhibitoria del
crecimiento (ZACARÍAS y LAFUENTE, 2000). En maíz (Zea mays), durante
limitación hídrica, ABA juega un rol en la inhibición de la división celular del
endosperma (OBER et al., 1991). Una de las funciones más importantes del ABA
en el desarrollo de las semillas es la de promover la síntesis de proteínas LEA, las
cuales están relacionadas con la tolerancia a la desecación (TAIZ y ZEIGER, 1991).
2.5.2. Funciones del ABA frente diferentes estreses
Desde un punto de vista biológico, podría considerarse una situación de estrés
como aquella que limita la producción de materia seca de toda o de cualquier parte
de la planta por debajo de su potencial genético. Desde un punto de vista agrícola,
el término de producción de materia seca esta relacionado con la producción o
cosecha (NUEZ, 1995).
Las condiciones de estrés inducen una modificación significativa en el balance
hormonal de la planta, aumentando el ABA en particular. RIKIN, BLUMENFELD Y
RICHMOND (1976), señalan que existe un mecanismo hormonal que involucra al
ABA, el cual regula la respuesta de las plantas a diversos estreses
medioambientales.
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El ABA es un ácido débil (pKa= 4.75). Las biomembranas son permeables a la
forma protonada, mientras que no lo son al anión disociado. La acumulación de
ABA se produce en los compartimentos celulares alcalinos. La distribución de ABA
depende de los valores relativos de pH de los compartimentos intra y extracelulares
que, a su vez, dependen de su capacidad de tamponar y transportar protones. En
respuesta al estrés, los niveles de ABA aumentan antes en el apoplasto que en
cualquier otro lugar de la hoja, ya que se reduce el gradiente de pH entre el
citoplasma y el apoplasto y, en consecuencia, se promueve el flujo de ABA desde la
célula (ZACARÍAS y LAFUENTE, 2000).
Esta redistribución del ABA jugaría un rol en la regulación de la apertura
estomática. La acumulación de ABA en hojas estresadas juega un rol muy
importante en la reducción de la pérdida de agua por transpiración bajo condiciones
de estrés hídrico. El cierre estomático puede también ser causado por ABA
producido en las raíces y exportado a los brotes (TAIZ y ZEIGER, 1991). El ABA
causa cierre estomático en muchas plantas con alrededor de -0,1 MPa de potencial
mátrico. El balance de ácido abscísico, auxinas y citoquininas puede ser
responsable de dar un control rápido en los movimientos estomáticos en respuesta
a cambios medioambientales (SEELEY, 1990).
La función del ABA protegiendo las plantas frente al estrés hídrico es doble; por una
parte reduce la transpiración en las hojas y por otra induce la síntesis de proteínas
que favorecen la resistencia a la desecación (ZACARÍAS y LAFUENTE, 2000). La
Yuca (Manihot esculenta) responde a la disminución de estatus hídrico con un
pronunciado cierre estomático y una disminución en el crecimiento del área foliar.
Esto puede deberse a la habilidad de la Yuca a rápidamente sintetizar y acumular
ABA en una fase temprana del episodio del déficit hídrico (ALVES y SETTER,
2000).
Se ha demostrado que la aplicación de ABA a hojas de distintas especies originan
el cierre de los estomas y que éstos permanecen cerrados, tanto en luz como en
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oscuridad, durante varios días. Sin embargo, el ABA no es único regulador
implicado en la respuesta al estrés hídrico, ya que muchos de los cambios
inducidos por la sequía no se inducen aplicando exógenamente ABA (ZACARÍAS y
LAFUENTE, 2000).
Otro efecto del ABA es el de incrementar la conductividad hidráulica y el flujo de
iones desde la raíz de la planta, por lo que este regulador de crecimiento no sólo
por disminución de la transpiración si no que también a través del incremento de la
conductividad hidráulica hacia las raíces, impide la pérdida de agua (TAIZ y
ZEIGER, 1991).
El ABA además se incrementa, en respuesta a otros estreses como las lesiones, el
estrés salino y el térmico (ZACARÍAS y LAFUENTE, 2000). TAIZ y ZEIGUER
(1991), RIKIN y RICHMOND (1976), citados por RIKIN, BLUMENFELD y
RICHMOND (1976) señalan que la aplicación de ABA a semillas de pepino de
ensalada, especie sensible al frío, reducen los daños por frío, tales como salida de
compuestos fuera de la célula, deshidratación de tejidos, aparición de necrosis, e
inhibición del crecimiento total. Los mutantes de Arabidopsis han puesto de
manifiesto que la deficiencia en ABA reduce la tolerancia a la congelación
(ZACARÍAS y LAFUENTE, 2000).
En la mayoría de estos ejemplos el factor de estrés real es una disminución en la
presión de turgor en el protoplasto. La deshidratación podría ser la señal común
que indujera la transcripción de los genes responsables de la síntesis de la
hormona (ZACARÍAS y LAFUENTE, 2000).
2.5.3. Cuantificación de ABA
Para cuantificar el ABA se han desarrollado los siguientes métodos analíticos:
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CG/EM (Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masa): Consiste en un método
físico muy específico y adecuado para análisis cuantitativos. Generalmente es
usado para la verificación del test de ELISA. En este método, los metil ésteres de
ABA son los compuestos analizados (WALKER-SIMMONS et al., 2000).
Inmunoensayo (test de ELISA): Este método consiste en el reconocimiento
específico de anticuerpos de ABA obtenidos de conejos y ratas inyectadas con este
regulador de crecimiento. El inmunoensayo puede detectar 10-13 g de ABA bruto o
de extracto parcialmente purificado. Este específico y altamente sensible ensayo
está disponible para ABA, auxinas, giberelinas y citoquininas (WEILER, 1984). El
desarrollo de anticuerpos monoclonales que específicamente reconocen la
hormona en plantas, (+)-(S)-Ácido Abscísico (ABA), ha facilitado el desarrollo de
inmunoensayos de ABA. Las mediciones con este inmunoensayo son eficientes,
sensibles y adaptadas a un gran número de muestras (WALKER-SIMMONS et al.,
2000).
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
Los ensayos que se describen a continuación se realizaron en el Laboratorio de
Fitogenética perteneciente a la Facultad de Agronomía, Pontificia Universidad
Católica de Valparaíso, Comuna de Quillota, Provincia de Quillota, V Región, Chile.
3.1. Material vegetal:
El material vegetal evaluado correspondió a líneas casi-isogenicas, NILs (Nearly
Isogenic-Lines), en las cuales L. hirsutum f. typicum ecotipo LA1777 actuó como
parental donador (ecotipo resistente al frío) y L. esculentum como parental
recurrente. Las NILs fueron seleccionadas por contener segmentos distintos de
DNA introgresado desde L. hirsutum en un trasfondo genético de L. esculentum Los
segmentos de DNA provenientes de L. hirsutum, corresponden a pequeñas
regiones bien definidas que contienen genes que afectan características
cuantitativas ó QTLs (quantitative trait loci) y que han sido ubicados en el mapa
genético del tomate gracias al uso de marcadores moleculares (MONFORTE y
TANKSLEY, 2000).
Las líneas utilizadas para los ensayos fueron: TA1111, TA1266, TA1544, TA1325 y
TA1297. Dichas líneas contienen QTLs únicos en sus cromosomas, que les
confieren resistencia a bajas temperaturas. La resistencia al frío en estas líneas fue
verificada por TAPIA (2002). Como control se utilizó el cv. E6023, padre recurrente
de las NILs.
3.2. Ensayo 1: Evolución del contenido endógeno de ABA y crecimiento vegetativo
en líneas genéticas resistentes al frío:
Este ensayo se realizó entre el 14 de junio y el 26 de agosto del 2002, y en él se
utilizaron las siguientes líneas genéticas: TA1111, TA1266, TA1297, TA1315,
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TA1544, TA1303 y el cv. E6203 como testigo. Las semillas de las líneas con
resistencia y el control fueron germinadas en bandejas almacigueras, en un
sustrato compuesto por turba y perlita. Las bandejas fueron mantenidas en una
cámara bioclimática a 25 °C en el día y 18°C en la noche, con una intensidad de luz
de 380 µmoles fotones m-2 . s-1, y 14 horas de iluminación. Luego de seis semanas,
cuando las plantas llegaron a formar entre tres a cuatro hojas verdaderas fueron
transferidas a macetas de 0.75 l con un sustrato previamente vaporizado de arena :
tierra de hoja (1:1). El tratamiento de frío se realizó dos semanas después de
transplante, transfiriendo la mitad de las plantas a otra cámara con igual condición
de luz, pero con temperaturas de 10°C día y 4°C en la noche por siete días.
3.2.1. Variables evaluadas
3.2.1.1 Concentración endógena de ABA
Esta variable se evaluó antes de iniciado el tratamiento de frío y luego de siete días
de recuperación a 25/18°C.
Extracción de ABA:
De cada planta se extrajo dos trozos de tejido de 1 cm2 correspondientes a hojas
maduras y totalmente expandidas, utilizando un sacabocado. Las muestras de
cuatro plantas fueron combinadas y se homogeneizaron en metanol al 99.8%
usando 10 ml por cada gramo de peso fresco, tal como lo indican DAIE Y
CAMPBELL (1981), (0.6 ml de metanol en 0.06 g de muestra). Esta
homogeneización se realizó en semi oscuridad con la ayuda de un mortero de
porcelana. Luego, se tomó una alícuota de 0.5 ml y se dispuso en tubos de
centrifugación de 1.5 ml, incubando por 1 h a 4°C, para posteriormente centrifugar
durante 7 min a 3000 g a 4°C (PEÑA-CORTÉS et al 1989).
Cuantificación de ABA:
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El sobrenadante resultante de la centrifugación se utilizó para la cuantificación de
ABA, la cual se realizó mediante el Test de ELISA (Enzyme - Linked
Immunosorbent Assay), basado en el principio de competencia por la unión con el
anticuerpo entre el ABA presente en la muestra y una cantidad de indicador
(fosfatasa alcalina) constante, el color amarillo resultante es inversamente
proporcional a la cantidad de hormona en la muestra. La cuantificación se realizó
de acuerdo a las instrucciones del fabricante del producto Phytodetek ABA (Agdia
Inc., Elkhart, EE.UU.).
Se procedió a efectuar la adhesión de 1 ml de agua destilada a cada contenedor de
indicador liofilizado, dejando que actuara por 5 minutos. Después de esto se le
agregó 4 ml de diluyente de indicador a cada contenedor y se mezcló.
Paralelamente se realizó la preparación de estándar de ABA. En primer lugar se
preparó una solución stock con una concentración de 1.0 µmol . ml-1, utilizando 1
mg de (+) - cis, trans - ácido abscísico (A - 4906, SIGMA Chemical C.O., St. Louis,
EE.UU.) disuelto en 3.78 ml de metanol absoluto. Esta solución se almacenó a 4°C
en oscuridad. Luego, tal como lo indica el Cuadro 1, se realizaron las disoluciones
de esta solución stock para preparar la curva estándar de ABA.
El llenado de las placas se realizó aplicando 100 µl de estándar o muestra a cada
test y en segundo lugar sobre los estándar o muestra se realizó la adhesión de 100
µl de indicador, diluido anteriormente a cada test con una pipeta multicanal. La
placa se selló y depositó en una caja húmeda, incubando por 3 h a 4°C.
Antes de finalizadas las 3 h, se procedió a preparar la solución del sustrato
disolviendo una tableta de sustrato en 5 ml de diluyente de sustrato. Pasado este
período de tiempo, se retiraron del refrigerador las placas para descartar su
contenido, efectuando un lavado con 200 µl de solución de lavado a cada test con
una pipeta multicanal, descartando nuevamente el contenido de las placas,
repitiendo esta operación dos veces. Posteriormente, se realizó la adhesión 200 µl
18
de solución de sustrato, luego se sellaron las placas y se depositaron nuevamente
en la caja húmeda, incubando por 1 h a 37°C.
Finalizado este período de tiempo se retiró del incubador y se le agregó una gota
del agente de detención de la reacción a cada test.
Finalmente se leyó la absorvancia a 405 nm para realizar el análisis de los datos en
base a la curva de calibrado (estándar de ABA).
CUADRO 1. Diluciones de Solución stock, absorvancias y porcentaje de unión.
N° test Solución de ABA
Buffer TBS
Picomoles ABA/ml
Abs % unión
Dilución
A1 = NSB 5 µl SS + 495 µl 1000 0.206 0 1:1000 B1 50 µl A1 + 450 µl 100 0.248 7.30 1:10 C1 50 µl B1 +200 µl 20 0.291 14.78 1:5 D1 50 µl C1 +200 µl 4 0.353 25.57 1:5 E1 50 µl D1 +200 µl 0.8 0.494 50.09 1:5 F1 50 µl E1 +200 µl 0.16 0.585 65.91 1:5 G1 50 µl F1 +200 µl 0.032 0.660 78.96 1:5 H1 50 µl G1 +200 µl 0.0064 0.702 86.26 1:5 A2 = Bo 100 µl TBS 0.781 100
Donde,
SS = 1.0 µmol de ABA/ml (solución stock) = 1000000 picomoles ABA/ml.
NSB = unión no específica, 0 % de unión.
Bo = 100 % de unión.
Se calculó el promedio de las absorvancias de los duplicados de las muestras o de
los estándares. Posteriormente, se calculó el porcentaje de unión de cada muestra
o estándar. Los resultados se muestran en el Cuadro 1 y se calcularon de la
siguiente forma:
% Unión = ( Abs estándar o muestra - Abs NSB) X 100 Abs Bo - Abs NSB
19
Donde,
Abs = Absorvancia.
NSB = 100 µl de A1 (1000 picomoles ABA/ml) + 100 µl de indicador
= 0% de unión.
Bo = 100 µl de A2 (indicador + Buffer TBS)
= 100% de unión.
La curva estandar (Figura 1), resultante entre el porcentaje de unión v/s
concentración de ABA (picomoles/ml), fue utilizada para realizar un análisis de
regresión para interpolar la concentración de ABA.
3.2.1.2. Crecimiento vegetativo
Antes y después de la exposición al frío se midió la altura de la planta, diámetro del
tallo, número de hojas mayores a 2 cm y área foliar. Esta última se estimó mediante
mediciones del ancho de las hojas y un factor indicado específico para estimar
dicha área en tomates (SWARTZ y KLARING, 2001). De tal forma, que el área foliar
será:
AF = 0.203* (AH)1.674
Donde,
AF = área foliar (cm2).
AH = ancho de la hoja (cm).
Al final del experimento se realizó una medición de materia seca, cortando las
planta desde la base y secando en un horno a 60°C hasta obtener peso constante.
Para todas las variables, exceptuando materia seca, la frecuencia de medición fue
de siete días. Para esto se debe considerar el día 0 como aquel día en que se
realizó la medición antes de la exposición de frío (T0), y el día 7 corresponde al
20
momento en que se realizó la medición en el período de recuperación, pasado el
período de estrés (T2).
3.2.2. Análisis estadístico
El presente ensayo se trabajó como un experimento factorial con un Diseño
completamente al azar, en donde el factor 1 corresponde a dos niveles de
temperatura (25/18ºC y 10/5ºC) y el factor 2 corresponde a seis niveles de líneas
genéticas (5 NILs y el cv. E6203). La unidad experimental correspondió a un grupo
de cuatro plantas, el número de repeticiones correspondió a tres.
El modelo matemático para un diseño factorial es el siguiente:
Yijk = µ + αi +βj+(αβ)ij+ εijk , donde:
Yijk : es el k-ésimo valor observado en cada unidad experimental.
µ : es el efecto de la media general sobre cada observación.
αi : es el efecto causado por el i-ésimo valor de temperatura.
βj : es el efecto causado por el j-ésimo nivel de cada línea genética.
(αβ)ij : es el efecto causado por la interacción causada por la i,j-ésima
combinación de los niveles de los factores
εijk : es el efecto del error experimental aleatorio sobre cada observación.
El efecto de los tratamientos se calculó a través de una tabla ANDEVA. En aquellos
casos en que el análisis de varianza indicó que al menos un tratamiento es distinto
de los otros (P≤0.05), se realizó una comparación de medias con el test de Tukey,
comparando cada tratamiento con el testigo, con un α= 0,05. Los análisis fueron
realizados con el sotware Minitab (Minitab Inc., Pennsylvania, EE. UU.).
21
FIGURA 1: Curva estándar de ABA elaborada a partir de las diluciones de la
solución stock.
Curva estándar de ABA y = 262,14e-0,1192x
R2 = 0,9636
0,001
0,01
0,1
1
10
100
1000
0 20 40 60 80 100
Unión (%)
conc
entr
ació
n de
AB
A(p
icom
oles
AB
A/m
L)
22
A todas las variables se le calculó la variación relativa de la respuesta, de la
siguiente forma:
Variación relativa = medición en T0 – medición en T2
Medición en T0
En donde, T0: primera fecha de medición
T2: segunda fecha de medición
3.2.3. Relaciones entre los parámetros estudiados
3.2.3.1. Correlación entre evolución del contenido de ABA y parámetros vegetativos
Esta herramienta se utilizó para establecer la relación entre las distintas variables
en estudio. Para esto, todos los datos fueron analizados (líneas y tiempo) y en
forma separada, el set de datos de frío. Se consideró como significativas aquellas
correlaciones con un valor – p ≤ 0.1.
3.2.3.2 Regresión lineal múltiple
Se utilizó un modelo de regresión lineal múltiple para predecir la acumulación de
materia seca. Para ello se utilizó como variables independientes los siguientes
parámetros de variación relativa: área foliar, diámetro del tallo principal, altura de la
planta, concentración endógena de ABA, número de hojas y peso fresco. Mediante
la metodología de los mejores subconjuntos se seleccionó un grupo de predictores
que permite obtener un r2 estabilizado.
3.3. Ensayo 2: Evaluación de crecimiento y desarrollo de las plantas de tomate expuestas a temperaturas sub-óptimas constantes:
El ensayo se realizó entre el 5 de diciembre del 2002 y el 6 de febrero del 2003.
Según los resultados del ensayo 1 se escogió aquellas líneas sometidas a estrés
que presentaron la mayor variación numérica positiva en la concentración
23
endógena de ABA durante la exposición al frío (línea TA1303) y aquella con menor
variación numérica en dicha concentración (línea TA 1266), además se utilizó como
control el cv. E6203. El protocolo de siembra se realizó igual al ensayo 1. Las
bandejas fueron puestas en dos cámaras bioclimáticas, la cámara 1 tuvo
temperaturas desde un comienzo del ensayo de 25°C en el día y 18°C en la noche
y la cámara 2 tuvo temperaturas desde un comienzo de 10°C en el día y 4°C en la
noche. Ambas cámaras fueron mantenidas con una intensidad de luz de 380
µmoles fotones m-2 . s-1 y 14 horas de iluminación.
3.3.1. Variables evaluadas
En este ensayo se evaluaron los días promedio de germinación (HARTMANN y
KESTER, 1988), los que fueron calculados de la siguiente forma:
Días promedio = N1*T1+N2*T2+..................NX*TX
Número total de semillas germinadas
Donde,
N: número de semillas que germinó dentro de intervalos consecutivos de tiempo.
T: tiempo trascurrido entre el inicio de la prueba y el final del intervalo específico de
medición.
Otro parámetro de germinación fue la de valor de germinación (HARTMANN y
KESTER, 1988). Este fue calculado de la siguiente forma:
Valor de germinación = PV * MDG
Donde,
PV: porcentaje de germinación en el punto en que la tasa de germinación comienza
a disminuir, dividido por el número de días necesarios en llegar a ese punto.
24
MDG: porcentaje de germinación final dividido por el número de días que las
semillas estuvieron a prueba.
Por otro lado, los otros parámetros vegetativos medidos fueron el número de hojas
mayores a 2 cm, diámetro de tallo y materia seca. La frecuencia de medición para
la para la germinación fue semanal y para las demás variables al mes de siembra y
al término del período de ensayo. La materia seca fue medida una vez terminado el
ensayo. La variación relativa de las variables se calculó igual que en el ensayo 1.
3.3.2. Análisis estadístico
En este ensayo se trabajó como un experimento factorial con un Diseño
completamente al azar, en donde el factor 1 corresponde a dos niveles de
temperatura (25/18ºC y 10/5ºC) y el factor 2 corresponde a tres niveles de líneas
genéticas (2 NILs y el cv. E6203). La unidad experimental correspondió a una
planta, el número de repeticiones para este caso fue de 10.
25
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Ensayo 1. Evolución del contenido endógeno de ABA y crecimiento vegetativo:
4.1.1. Concentración endógena de ABA
Frente a un estrés térmico, la planta produce altos niveles de ABA (SHINOZAKI y
YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 1996). Se esperaba que las líneas que presentan las
introgresiones provenientes de L. hirsutum lograran incrementar su contenido
endógeno de ABA frente al estrés, o bien que independiente de la temperatura las
líneas presentaran altas concentraciones de ABA.
Antes de la exposición a bajas temperaturas no hubo diferencias significativas en el
contenido de ABA. Los valores obtenidos se encontraron en el rango de 0.003 – 1.8
pmoles. ml-1. Los datos que se presentan en el Cuadro 2 indican los valores
obtenidos luego de medir el contenido de ABA por medio del test de ELISA
pasados siete días después de la exposición a bajas temperaturas. Como puede
observarse, existieron diferencias significativas entre la línea TA1303 sometida a
10/5ºC y la misma línea a 25/18ºC la que presentó un incremento de ABA en 12.7
veces. Un comportamiento similar se observó en la línea TA1315 sometida a
25/18ºC y la misma línea a 10/5ºC, con un incremento en su concentración
endógena de ABA en 6.4 veces. Lo anterior indicaría que la resistencia al frío de
estas líneas se debe a un incremento en sus concentraciones endógenas de ABA.
Además, la línea TA1303 fue la única mayor respecto del cv. E6203 a 10/5ºC con
un alza de ABA de un 66% respecto a la línea control.
El Cuadro 2 también presenta la variación relativa del contenido endógeno de ABA,
entre mediciones antes del período de frío y siete días después de la exposición.
Como es posible de apreciar, sólo la línea TA1303 respecto de la línea control
sometida a la misma temperatura de estrés fue 2.58 veces mayor. Por otro lado, las
26
líneas TA1303 y TA1315 a 25/18ºC respecto a las mismas líneas sometidas a bajas
temperaturas, presentaron un alza de 12.7 veces y 6.4 veces, respectivamente.
CUADRO 2. Concentración endógena de ABA en líneas de tomate casi isogénicas
(NILs) en estado vegetativo, siete días después de la exposición a 10/5ºC y variación relativa de la concentración endógena de ABA.
Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05).
El aumento de la concentración de ABA frente a estrés por bajas temperaturas ha
sido reportado previamente en tomate por DAIE y CAMBELL (1981), que
sometieron a plantas de tomate, Lycopersicon esculentum cv. Venus, de 5 meses
de edad a temperaturas de 10/5ºC, 15/10ºC, 25/15ºC, 35/25ºC y 45/35ºC en
intervalos de tiempo de 0, 12, 24, 48 y 72 h. Sus resultados arrojaron que los
mayores valores de ABA estuvieron asociados a temperatura de 10/5ºC, en casi
todos los tiempos de muestra, obteniéndose el máximo incremento a las 72 h bajo
la misma temperatura doblando el valor inicial. En el presente ensayo el aumento
de ABA fue mucho mayor a lo observado por estos autores, lo que señalaría
entonces en las líneas TA1303 y TA1315 una clara resistencia al frío, dada por el
aumento endógeno de ABA.
Temperatura Línea genética Concentración de ABA (pmoles.ml-1)
Variación relativa de Concentración de ABA
25/18ºC E6203 2.140 c -0.156 d TA1111 0.971 c 2.03 cd TA1266 2.818 c 0.56 cd TA1297 2.840 c 3.53 cd TA1303 2.514 c 2.24 cd TA1315 3.454 c 0.69 cd TA1544 0.590 c 5.53 cd 10/5ºC E6203 12.371 bc 11.97 bcd TA1111 11.817 bc 10.9 bc TA1266 3.287 c 2.3 cd TA1297 4.968 c 7.13 cd TA1303 31.880 a 35.85 a TA1315 22.055 ab 20.14 ab TA1544 7.809 c 11.75 cd
27
4.1.2. Crecimiento vegetativo
En forma simultánea a las mediciones de ABA, se evaluó el crecimiento vegetativo
en condiciones subóptimas de temperatura.
El crecimiento vegetativo representa la integración de factores tales como condición
fisiológica de la planta y su respuesta frente a las condiciones ambientales, en este
caso el estrés por bajas temperaturas. Un mejor desarrollo vegetativo supone la
posible inducción de genes involucrados en la resistencia al frío ubicados en
distintos cromosomas de las líneas genéticas en estudio en condiciones de estrés
por bajas temperaturas (VALLEJOS y TANKSLEY, 1983).
4.1.2.1. Diámetro del tallo principal
Al analizar los resultados de este parámetro no se detectó una interacción entre los
factores de temperatura y líneas genéticas, por lo que cada factor se estudió por
separado.
Del análisis del Cuadro 3, se desprende que antes de la exposición a bajas
temperaturas las líneas TA1315 y TA1544 presentaron un menor diámetro que
TA1303 en un 11.7% y 12.5%, respectivamente. Pasado el período de frío todas las
líneas se comportaron similares al cv. E6203 y en la variación relativa del diámetro
de tallo tampoco se observaron diferencias. Respecto al factor de la temperatura,
se observa que esta actuó en forma diferencial sobre la variable en estudio, ya que
a 25/18ºC en todas las mediciones se obtuvo un mayor valor, alcanzando un valor
de un 60% aproximadamente mayor sobre las plantas sometidas a estrés.
Por consiguiente, bajo las condiciones experimentadas en el presente ensayo las
líneas evaluadas no presentaron un mejor comportamiento que la línea control en
cuanto a crecimiento del diámetro del tallo bajo temperaturas subóptimas de
28
crecimiento, ya que la introgresión de genes con resistencia para esta variable no
tuvo respuesta significativa (P>0.05).
CUADRO 3. Diámetro del tallo principal y variación relativa de este (cm), en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) en estado vegetativo, antes (T0) y después (T2) de la exposición a 10/5ºC.
Factor Nivel Diámetro del
tallo T0 (cm) Diámetro del tallo T2 (cm)
Variación relativa del diámetro del tallo (cm)
Línea E6203 0.577 ab 0.630NS 0.092NS TA1111 0.565 ab 0.610 0.079 TA1266 0.588 ab 0.645 0.096 TA1297 0.563 ab 0.597 0.059 TA1303 0.623 a 0.682 0.093 TA1315 0.550 b 0.618 0.124 TA1544 0.545 b 0.600 0.101 Temperatura 25/18ºC 0.589 x 0.659 x 0.560 x 10/5ºC 0.557 y 0.593 y 0.228 y Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05). NS: No significativo (P>0.05)
4.1.2.2. Altura de la planta
Tal como lo indica el Cuadro 4, el comportamiento de las líneas genéticas en
estudio fue afectado en forma diferencial por la temperatura. Pasado el período de
bajas temperaturas ninguna de las líneas en estudio, sometidas a estrés, presentó
un mejor comportamiento que el control bajo la misma condición de temperatura.
Además, se puede observar que las líneas control bajo los dos regímenes térmicos
se comportaron de forma similar. Esto podría indicar que la línea E6203 presente
algún grado de resistencia al frío. Adicionalmente, la línea TA1266 no presentó
diferencias significativas entre bajas temperaturas de crecimiento y a temperatura
control, presentando la menor altura de todas las líneas en estudio. Sin embargo,
respecto a la variación relativa de la altura de las plantas se puede afirmar que el
factor de temperatura influyó significativamente en todas las líneas genéticas, ya
que comparando cada una de estas frente a ambos regímenes de temperatura,
29
ninguna se comportó de manera similar y, comparando las líneas en estudio
sometidas a estrés se observa que ninguna fue mejor que la línea control.
TAPIA (2002), en ensayos realizados en verificación de resistencia de las mismas
líneas genéticas encontró una mayor tasa de crecimiento en altura en las líneas
TA1111, TA1266 y TA1544 en relación al cv. E6203. Las otras líneas genéticas en
estudio presentaron menor crecimiento con temperaturas menores a los 12ºC.
Comparando sus resultados con el presente ensayo, no es posible encontrar
coincidencias; esto puede deberse a las distintas condiciones de ensayo en ambos
casos, ya que al aire libre existe una mayor cantidad de factores que se conjugan
en un resultado de un ensayo comparándolo con un ensayo realizado en cámara en
donde los factores que podrían incidir en alguna respuesta están controlados.
Por consiguiente, este parámetro no permite identificar claramente aquellas líneas
que presentan resistencia proveniente de L. hirsutum.
CUADRO 4. Altura de la planta y variación relativa de esta (cm) en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) en estado vegetativo, antes (T0) y después (T2) de la exposición a 10/5ºC.
Temperatura Línea
genética Altura de la
planta T0 (cm) Altura de la
planta T2(cm) Variación relativa
(cm) 25/18ºC E6203 14.083 cde 19.735 cde 0.403 bc TA1111 15.503 bcd 25.833 ab 0.666 a TA1266 12.503 e 17.960 efg 0.436 cd TA1297 14.083 cde 22.837 bcd 0.622 ab TA1303 18.920 a 27.583 a 0.458 ab TA1315 16.877 ab 23.837 abc 0.412 bc TA1544 16.333 bc 23.543 abc 0.441 abc 10/5ºC E6203 14.670 bcde 15.583 efg 0.085 e TA1111 14.880 bcd 17.337 efg 0.165 de TA1266 12.503 e 13.877 g 0.109 e TA1297 14.880 bcd 16.127 efg 0.084 e TA1303 16.210 bc 18.667 def 0.152 de TA1315 14.670 bcde 16.047 efg 0.093 e TA1544 13.503 de 14.503 fg 0.074 e
Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05).
30
4.1.2.3. Número de hojas
Al analizar los resultados de este parámetro no se detectó interacción entre los
factores de temperatura y líneas genéticas, por lo que cada factor se estudió por
separado.
Del análisis del Cuadro 5 es posible afirmar que antes de la exposición a
temperaturas de estrés sólo existieron diferencias significativas respecto del factor
de líneas genéticas. Es así como las líneas TA1315 y TA1266 produjeron el mayor
número de hojas respecto a las líneas TA1303, TA1297 y TA1111, las que
generaron entre un 5.18% a 17.4% menos. Pasado el período de frío, el factor de
temperatura nuevamente no influyó en el comportamiento de las líneas y la única
línea que tuvo diferencia significativa respecto al cv. E6203 fue la línea TA1297 que
generó un 17% menos hojas que la línea control. Por consiguiente, pasado un
período de exposición a bajas temperaturas, la formación de hojas no se ve
influenciada por este factor en las líneas en estudio.
CUADRO 5. Número de hojas para los distintos tratamientos en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) en estado vegetativo, antes (T0) y posterior (T2) de la exposición a 10/5ºC.
Factor Nivel Número hojas T0 Número hojas T2 Variedad E6203 10.083 abc 11.500 a TA1111 10.042 bc 10.833 ab TA1266 11.167 a 11.625 a TA1297 9.292 c 9.583 b TA1303 10.667 b 11.000 a TA1315 11.333 a 11.333 a TA1544 10.167 abc 10.917 ab Temperatura 25/18 °C 10.107 NS 10.917 NS
10/5 °C 10.679 11.024 Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05). NS: No significativo (P>0.05)
31
Finalmente, el Cuadro 6, en el que se observa la variación relativa del número de
hojas, es posible apreciar que a 10/5ºC el cv. E6203 presentó una mayor variación
relativa del número de hojas respecto a las líneas TA1266, TA1297, TA1315 y
TA1544, ya que estas líneas no generaron más hojas después del período de frío.
Esto podría indicar una alta influencia de la temperatura sobre la capacidad de
mantener una tasa de crecimiento del número de hojas. Por otro lado, se puede
apreciar que las líneas control se comportaron similar, independiente de la
temperatura, y comparando cada línea genética sometida a ambas temperaturas es
posible afirmar que solo la línea TA1544 sin frío tuvo diferencias significativas
respecto de la misma línea a 25/18ºC, ya que esta línea al enfrentarse a
temperaturas subóptimas de desarrollo mantuvo el número de hojas respecto a las
ya formadas antes de ser sometidas a estrés. Además, se observó que bajo
temperatura de estrés las líneas TA1111 y TA1303 se comportaron de manera
similar al cv. E6203.
CUADRO 6. Variación relativa en el número de hojas para los distintos tratamientos en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) en estado vegetativo.
Temperatura Línea genética Número de hojas
25/18 °C E6203 1.417 a TA1111 1.167 ab TA1266 0.917 ab TA1297 0.583 ab TA1303 0.083 b TA1315 0.000 b TA1544 1.500 a 10/5 °C E6203 1.417 a TA1111 0,417 ab TA1266 0.000 b TA1297 0.000 b TA1303 0.583 ab TA1315 0.00 b TA1544 0.00 b
Letras iguales indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05).
32
En estudios realizados por MILTAU, ZAMIR y RUDICH (1986), Las plantas de
tomate tolerantes a frío poseían un crecimiento mucho mayor que el del tomate
doméstico. Estos datos difieren de lo encontrado en el presente estudio, ya que las
líneas estudiadas por el autor corresponden a cruzas tempranas entre tomate
resistente y tomate doméstico.
Por consiguiente, los datos analizados sugieren que la introgresión de resistencia,
proveniente de L. hirsutum, no les confiere a las líneas TA1111 y TA1303 un
comportamiento que las haga tolerantes al frío en lo que respecta a la tasa de
crecimiento del número de hojas frente a una situación de estrés continuo por bajas
temperaturas, ya que su comportamiento fue igual al del cv. E6203 bajo estrés.
4.1.2.4. Área foliar
Tal como es posible apreciar en el Cuadro 7, pasado el período de exposición a
bajas temperaturas, se observa que respecto a las plantas que fueron sometidas a
25/18ºC se presentaron diferencias significativas sólo en las líneas TA1303 y
TA1544 respecto al cv. E6203, las cuales fueron un 19.3% y 21% menores. Esto
concuerda con lo descrito por HUSSEY (1965), que indica que el factor mas
importante en lo que respecta a crecimiento del área foliar es la luz, sin embargo,
existe un grado de interacción con la temperatura de exposición, ya que
exceptuando a baja intensidad luminosa, una temperatura mayor a las 25ºC
usualmente incrementa el nivel de expansión de hojas y también la superficie foliar.
En este caso casi todas las líneas a 25/18ºC concuerdan con lo afirmado por este
autor.
En relación a las plantas bajo 10/5ºC sólo la línea TA1266 alcanzó un área foliar
menor que el cv. E6203 en un 18.7%. Por otro lado, haciendo comparaciones entre
las líneas en estudio sometidas a ambas temperaturas, es posible destacar que tan
sólo la línea TA1315 presentó diferencias significativas a 25/18ºC y a 10/5ºC, ya
que a temperatura control generó un área 17.9% mayor. Esto significa que todas
33
las líneas, a excepción de TA1315, poseen la capacidad de generar un área foliar
normal frente a temperaturas de estrés.
CUADRO 7. Área foliar (1 hoja) y variación relativa para cada uno de los tratamientos (cm2), en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) en estado vegetativo, antes de la exposición a bajas temperaturas (T0) y posterior al período de frío (T2).
Temperatura Línea genética Área foliar
T0 (cm2) Área foliar T2 (cm2)
Variación relativa del Área foliar
(cm2) 25/18 °C E6203 12.127 a 12.740 a 0.051 ab TA1111 11.490 abc 11.540 abc 0.004 d TA1266 10.307 abcd 10.860 abcd 0.054 ab TA1297 11.407 abc 11.413 abc 0.0005 e TA1303 10.000 abcd 10.280 bcd 0.028 c TA1315 12.060 ab 12.060 ab 0 e TA1544 10.610 abcd 10.720 bcd 0.01 cd 10/5 °C E6203 11.003 abcd 11.547 abc 0.049 b TA1111 9.707 bcd 10.477 bcd 0.079 a TA1266 8.753 d 9.393 d 0.073 a TA1297 9.450 cd 9.933 cd 0.051 ab TA1303 10.733 abcd 11.287 abcd 0.052 ab TA1315 9.627 cd 9.900 cd 0.028 c TA1544 9.237 cd 9.777 cd 0.058 ab
Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05).
Respecto a la variación relativa del área foliar es posible observar en el Cuadro 7
que comparando todas las líneas respecto a las distintas temperaturas de
exposición la línea TA1266 y cv. E6203 se comportaron en forma similar a 25/18ºC
y 10/5ºC. Por otro lado, analizando las líneas sometidas a 10/5ºC el cv. E6203
presentó una menor variación relativa en área foliar que TA1111 y TA1266 en 1.61
y 1.49 veces respectivamente, y respecto a la línea TA1303 fue mayor en un
42.8%, lo que indicaría que destinarían gran parte de la energía generada en
aumentar el área fotosintética.
34
4.1.2.5. Materia seca
Para determinar el comportamiento de las líneas genéticas en estudio sometidas a
temperaturas subóptimas de crecimiento, se midió la materia seca de la planta, ya
que este parámetro constituye la variable más integral de la respuesta a la
exposición a bajas temperaturas.
En base a lo presentado en el Cuadro 8, se puede observar que frente a
temperaturas de estrés, ninguna de las líneas se comportó estadísticamente mejor
que el cv. E6203, solo se puede afirmar que la línea TA1315 a 25/10ºC posee un
peso seco equivalente al cv. E6203 a la misma temperatura. Es posible apreciar
que comparando las líneas respecto al factor temperatura, las líneas TA1266,
TA1297 y TA1303 no presentaron diferencias significativas comparando su
comportamiento a 25/18ºC y a 10/5ºC, esto indicaría que en estas líneas el factor
de temperatura no limita su comportamiento en lo que respecta a la capacidad de
generación de biomasa. Sin embargo, no se puede afirmar que se comportaron
mejor al cv. E6203, ya que generaron un grado similar de materia seca. El
comportamiento de estas tres líneas, TA1266, TA1297 y TA1303, concuerda con lo
estudiado por WOLFE (1991), ya que en estudios de efecto de frío en el
crecimiento vegetativo de diversas especies, encontró que la resistencia al frío ya
sea en tomate o en otra especie, se expresa en una mayor ganancia de materia
seca.
Del Cuadro 8 se puede observar también que las líneas TA1111 y TA1297, a
10/5ºC, presentaron un 22.5% y un 26.9% menos de acumulación de materia seca
respecto del cv. E6203, mientras que el resto de las líneas bajo la misma condición
de temperatura presentaron un comportamiento similar a la línea testigo. TAPIA
(2002) estudió el comportamiento vegetativo y reproductivo de líneas genéticas de
tomate con resistencia al frío y encontró que la línea TA1111 evidenció la influencia
de genes con resistencia que le confirieron tolerancia a temperaturas menores a
12ºC y en cuanto a la acumulación de materia seca, tiene 23% mas de acumulación
35
de biomasa que el cv. E6203. Cabe señalar que dadas las condiciones de su
ensayo, que correspondió a un cultivo al aire libre, no es posible hacer un paralelo
con en el presente estudio, el cual fue realizado en cámara con temperaturas
constantes de exposición.
CUADRO 8. Acumulación de materia seca (g) para los diferentes tratamientos, en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) en estado vegetativo.
Temperatura Línea genética Materia seca
(g) 25/18 °C E6203 2.110 ab TA1111 1.793 bcd TA1266 1.877 bcd TA1297 1.687 cde TA1303 1.767 bcd TA1315 2.360 a TA1544 1.950 bc 10/5 °C E6203 1.780 bcd TA1111 1.380 ef TA1266 1.550 def TA1297 1.300 e TA1303 1.950 bc TA1315 1.780 bcd TA1544 1.547 def
Letras iguales indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05).
4.1.3 Relaciones entre los diferentes parámetros medidos
4.1.3.1 Correlación entre evolución del contenido endógeno de ABA y parámetros vegetativos
En el Cuadro 9, es posible observar la correlación existente entre las distintas
variables medidas en este ensayo. Como es posible observar, existieron cuatro
correlaciones de tipo negativas, es decir, el aumento en una variable hace que el
valor de la otra decrezca.
El análisis de estas correlaciones indicaría que un aumento de la concentración
endógena de ABA implica un descenso en la tasa de crecimiento en altura de las
36
plantas. Esto podría explicarse ya que el ABA corresponde a un regulador de
crecimiento en el que la mayoría de los procesos fisiológicos son inhibidos (ITAI,
1999), dentro de los cuales se podría encontrar el de una disminución en el
crecimiento del tallo de las plantas destinando a proporcionar una tasa de
crecimiento del área foliar mayor (PICKEN, STEWART y KLAPWIJK, 1986). En
relación al área foliar, otra correlación encontrada fue en relación a la tasa de
crecimiento en altura, por lo que el aumento en la tasa de crecimiento del área foliar
implica una disminución en el crecimiento en altura de la planta posiblemente
debido a una priorización de repartición de asimilados a favor de generar una
mayor área fotosintética.
Por otro lado, se encontró que un aumento en la tasa de crecimiento en diámetro
disminuye la ganancia de peso seco. Esto podría deberse a que frente a estrés por
bajas temperaturas el crecimiento radial del diámetro se vea influenciado por una
mayor turgencia y no a una movilización de carbohidratos destinados a crecimiento
de estructuras, en este caso diámetro (CALVERT, 1964). Respecto al mismo
parámetro de peso seco, este se vería mermado frente a un aumento en la tasa de
crecimiento en área foliar, posiblemente debido a un gasto en carbohidratos debido
a la mayor tasa respiratoria potencialmente producida por una mayor superficie
foliar (PICKEN, STEWART y KLAPWIJK, 1986). La Figura 2 grafica la tendencia de
las cuatro correlaciones encontradas entre las variables.
Por otro lado, la correlación entre concentración de ABA y peso seco, en set de
datos de frío, arrojó un r2 de 0,768 y un p<0.1, lo que indicaría que frente a estrés
por frío la concentración de ABA está directamente relacionada con la ganancia de
peso seco.
37
CUADRO 9. Coeficientes de correlaciones entre los promedios de los parámetros medidos.
∆Concentración de ABA
∆ Diámetro
∆Altura ∆Número de hojas
∆Área foliar
Peso seco
∆Concentración de ABA
NS -0.55* NS NS NS
∆Diámetro NS NS NS -0.57*
∆Altura NS -0.72* NS
∆Número de hojas
NS NS
∆Área foliar -0.52*
Peso seco
*: valor - p < 0.1. NS: no significativo. ∆: variación relativa 4.1.3.2 Regresión lineal múltiple
Al combinar predictores para la acumulación de materia seca se observa que el
parámetro de variación relativa del área foliar, variación relativa del diámetro del
tallo y variación relativa de la altura de la planta explican el 33% de la variación en
la materia seca. La predicción debe incluir todos los parámetros evaluados pero no
supera el 41%.
38
FIGURA 2. Gráficos de las cuatro correlaciones existentes y sus respectivas líneas de tendencia.
Correlación entre peso fresco y tasa de crecimiento del área foliar
00,5
11,5
22,5
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1variación área foliar (cm2)
peso
fres
co (g
r)Correlación entre tasa de crecmiento en altura y tasa de cambio en
la concentración de ABA
-10
10
30
50
0 0,2 0,4 0,6 0,8variación en altura(cm)
conc
entr
acio
n de
A
BA
(pm
ol/m
L)
Correlación entre tasa de crecmiento en altura y tasa de cambio en la concentración de ABA
010203040
0 0,2 0,4 0,6 0,8variación en altura(cm)
conc
entr
acio
n de
A
BA
(pm
ol/m
L)
Correlación entre peso fresco y tasa de crecimiento del área foliar
00,5
11,5
22,5
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1variación área foliar (cm2)
peso
fres
co (g
r)
39
4.2. Ensayo 2: Evaluación de crecimiento y desarrollo de las plantas de tomate expuestas a temperaturas sub-óptimas constantes:
4.2.1. Evaluación de la germinación mediante el parámetro de Días Medios
Este parámetro se estudió para establecer los días promedio requeridos para la
emergencia de la radícula o de la plúmula.
Tal como se puede observar en el Cuadro 10, el comportamiento de las líneas
genéticas se vio afectado en forma diferencial por las temperaturas. Respecto de
las líneas sometidas a temperaturas constantes de 25/18ºC, se puede decir que
sólo la línea TA1266 presentó diferencias estadísticamente significativas respecto
del control siendo siete días más lenta en germinar. Comparando las líneas
sometidas a frío constante con las líneas sin frío sólo la línea TA1266 presentó un
comportamiento similar frente a las dos temperaturas, lo que indicaría la expresión
de resistencia de esta línea respecto a la capacidad de germinar cuando las
temperaturas son subóptimas de crecimiento.
CUADRO 10. Días medios de germinación para los distintos tratamientos.
Letras iguales indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05)
El tiempo requerido para la emergencia de la planta se ve afectado por diversos
factores, entre los que es posible mencionar germinación de la semilla y la calidad
del sustrato utilizado en la germinación. Es así, como condiciones ambientales tales
como temperatura es uno de los factores decisivos en el éxito de el proceso
germinativo y por consiguiente de emergencia (EL-SAYED y JOHN, 1973).
Temperatura Línea genética Días promedio (días) 25/18 °C E6203 7.0 a TA1266 14.1 bc TA1303 7.2 a 10/5 °C E6203 14.3 bc TA1266 13 b TA1303 17 c
40
Todo lo anterior, sugiere que la resistencia al frío presente en la línea TA1266, se
expresa durante la germinación manteniendo la emergencia de las plantas
sometidas a temperaturas de germinación y emergencia sub óptimas.
4.2.2 Valor de germinación
El Cuadro 11 refleja el valor de germinación que presentó cada línea a través del
tiempo. Es posible verificar que frente a 25/18ºC, la línea control se comportó de
mejor forma que las líneas TA1266 y TA1303, mientras que a temperaturas frías
constantes es posible verificar que la línea TA1303 fue un 54% mayor al cv. E6203,
por lo que este parámetro si refleja la expresión fenotípica de la resistencia en esta
línea.
CUADRO 11. Valor de germinación
Letras iguales indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05)
Para conocer la real influencia de la exposición a temperaturas sub óptimas
constantes, en la emergencia de las plántulas de tomate fue necesario cuantificar
esta variable, ya que incluye tanto la tasa como el porcentaje de germinación.
4.2.3. Diámetro del tallo principal
Los datos que contiene el Cuadro 12, reflejan que para este experimento no existió
interacción entre los factores de temperatura y variedades, por lo que cada factor
fue analizado por separado. Además, es posible afirmar que las líneas genéticas
presentan crecimientos equivalentes respecto al factor de línea genética en ambas
Temperatura Línea genética Valor de germinación 25/18 °C E6203 54.9 a TA1266 21.9 bc TA1303 39.6 b 10/5 °C E6203 6.16 d TA1266 0.18 e TA1303 13.5 c
41
fechas de medición. Por otro lado, el factor temperatura sí influyó en el crecimiento
en diámetro del tallo obteniéndose un mayor diámetro a 25/18°C en ambas fechas
de medición, con un 61% y 42% respecto a 10/5ºC.
CUADRO 12. Diámetro de tallo (cm) para los distintos tratamientos, en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) expuestas a temperaturas constantes.
Factor Nivel Diámetro de tallo
22/01/03 (cm)
Diámetro de tallo 29/01/03
(cm) Variedad E6203 0.210 NS 0.250 NS
TA1266 0.257 0.260 TA1303 0.222 0.245 Temperatura 25/18 °C 0.330 a 0.356 a 10/5 °C 0.127 b 0.206 b
Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05). NS: No significativo (P>0.05)
En este caso, no es posible establecer una relación directa entre la resistencia al
frío y el crecimiento del diámetro de tallo frente a temperaturas subóptimas
constantes.
4.2.4. Altura de la planta
El Cuadro 13 refleja la situación experimentada por las líneas genéticas en estudio
respecto a la altura de la planta. Al analizar los resultados de este parámetro no se
detectó una interacción entre los factores de temperatura y variedad. Además, es
posible observar que todas las líneas genéticas reaccionaron de manera similar en
ambas fechas de medición comparadas al cv. E6203. Acerca del factor de
temperatura, esta influyó aumentando el diámetro en un 83% y 58% respecto a
exposición a 10/5°C, en ambas fechas de medición. Por consiguiente, no es posible
establecer una relación directa entre la presencia de introgresiones provenientes de
L. hirsutum y un aumento en altura de las líneas genéticas en estudio bajo
condiciones de estrés constantes.
42
CUADRO 13. Valores de altura de planta (cm) para los diferentes tratamientos, en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) expuestas a temperaturas constantes.
Factor Nivel Altura de la planta
22/01/03 (cm)
Altura de la planta 29/01/03
(cm) Variedad E6203 6.575NS 6.590 NS
TA1266 4.375 4.200 TA1303 7.850 7.650 Temperatura 25/18 °C 10.717 a 12.50 a 10/5 °C 1.817 b 5.20 b
Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05). NS: No significativo (P>0.05)
4.2.5 Número de hojas
Tal como se puede observar en el Cuadro 14, nuevamente la interacción entre
factores de temperatura y líneas genéticas fue nula, por lo que cada factor se
estudió por separado. Sólo observando el factor genético se puede decir que
nuevamente en este caso las líneas en estudio no generaron un número de hojas
mayor al cv. E6203 en ambas fechas de medición. Respecto al factor temperatura,
a 25/18°C hubo una mayor generación de hojas, un 83.% y un 58.4%, respecto a
temperaturas de estrés en ambas fechas de medición.
CUADRO 14. Número de hojas para los distintos tratamientos, en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) expuestas a temperaturas constantes.
Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05). NS: No significativo (P>0.05)
Factor Nivel Número de hojas 22/01/03
Número de hojas 29/01/03
Variedad E6203 2.45 NS 2.50 NS
TA1266 1.65 1.70 TA1303 2.70 2.45 Temperatura 25/18 °C 3.267 a 4.25 a 10/5 °C 1.267 b 2.60 b
43
Por consiguiente, no es posible identificar alguna línea genética resistente al frío
que responda generando un mayor número de hojas ante temperaturas de
exposición subóptimas constantes.
4.2.6. Área foliar
El Cuadro 15 refleja la situación experimentada por las líneas genéticas en estudio
respecto al área foliar de la planta. Al analizar los resultados de este parámetro no
se detectó una interacción entre los factores de temperatura y línea genética , por lo
que cada factor fue estudiado separadamente. Además, las líneas genéticas
TA1266 y TA1303 reaccionaron de manera similar en ambas fechas de medición
comparadas al cv. E6203. Acerca del factor temperatura, esta influyó aumentando
el área foliar en un 68.6% y 46.1% respecto a exposición a 10/5°C en ambas fechas
de medición.
CUADRO 15. Área foliar (cm2) para cada uno de los tratamientos, en líneas de
tomate casi isogénicas (NILs) expuestas a temperaturas constantes.
Factor Nivel Área foliar 22/01/03
(cm2)
Área foliar 29/01/03
(cm2) Variedad E6203 2.735 NS 2.95 NS
TA1266 1.635 1.65 TA1303 2.288 2.35 Temperatura 25/18 °C 3.377 a 4.460 a 10/5 °C 1.062 b 2.403 b
Letras iguales en la columna indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05).
NS: No significativo (P>0.05)
Por consiguiente, no es posible establecer una relación directa entre la presencia
de introgresiones provenientes de L. hirsutum y un aumento del área foliar de las
líneas genéticas en estudio bajo condiciones de estrés constantes.
44
4.2.7. Materia seca.
Del análisis del Cuadro 16 se desprende que existieron diferencias significativas
entre los distintos tratamientos. La línea control presentó diferencias significativas
entre 25/18°C y 10/5°C, por lo que probablemente esta línea posee algún grado de
resistencia frente a temperaturas de exposición subóptimas constantes respecto a
este parámetro.
CUADRO 16 Materia seca (g) para los diferentes tratamientos, en líneas de tomate casi isogénicas (NILs) expuestas a temperaturas constantes.
Letras iguales indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test de Tukey (α=0.05).
Por otro lado, frente a frío constante el peso seco el cv. E6203 fue un 81.2% mayor
a la línea genética TA1266, y la línea TA1303 se comportó similar al cv. E6203.
Esto sugiere que la introgresión de genes provenientes de L. hirsutum le confieren
a la línea TA1303 un comportamiento que la hace ganar materia seca frente a una
situación de estrés continuo por bajas temperaturas.
4.3. Consideraciones finales:
Relacionando los experimentos del ensayo 1 se puede decir que a 25/18°C y luego
a 10/5°C, los datos obtenidos en las mediciones, en comparación a los datos del
ensayo 2 a temperatura constante de exposición, sólo existió coincidencias
respecto a la ganancia de peso seco, ya que la línea TA 1303 se comportó frente al
Temperatura Línea genética Peso fresco (g)
25/18 °C E6203 2.626 a TA1266 2.155 a TA1303 2.200 a 10/5 °C E6203 2.413 a TA1266 0.453 b TA1303 1.689 a
45
frío generando una cantidad de materia seca similar a la generada sin la exposición
a bajas temperaturas.
Por otro lado, se puede decir que el ensayo 1 simula una situación de crecimiento
en almácigo y transplante temprano en la primavera, mientras que el ensayo 2
simula una siembra directa temprana en primavera. En futuras investigaciones
sería interesante probar la línea TA1303 bajo los dos sistemas de cultivo
mencionados y así poder verificar fehacientemente la resistencia al frío.
46
5. CONCLUSIONES
En un período de exposición a temperaturas menores a 10°C, la evolución positiva
del contenido endógeno de ABA se evidenció en las líneas TA1303 y TA1315, por
lo que en este caso se evidenció la expresión fenotípica de los genes introgresados
a los cromosomas 7 y 8.
Respecto a los parámetros vegetativos estudiados en las mismas líneas evaluadas
respecto a la evolución de ABA, la expresión fenotípica de los genes introgresados
desde L. hirsutum se observó en los cromosomas 2, 3, 5 y 7 en las distintas
variables evaluadas. En el crecimiento del área foliar los cromosomas 3 y 2; y los
cromosomas 2, 5 y 7 en cuanto a la acumulación de materia seca.
En cuanto a la correlación existente entre los parámetros estudiados, todas estas
fueron de tipo negativa ya que el aumento de una implica la disminución de la otra,
esta se evidenció entre concentración endógena de ABA y tasa de crecimiento en
altura de la planta, tasa de crecimiento en altura de la planta tasa y tasa de
crecimiento en área foliar, tasa de crecimiento en diámetro de la planta y materia
seca, y por último tasa de crecimiento en área foliar y materia seca.
Al analizar el comportamiento de las líneas genéticas en frío constante en los
parámetros vegetativos estudiados es posible evidenciar la resistencia al frío
respecto a aspectos germinativos dados por los cromosomas 2 y 7. También se
verificó la resistencia reflejada en acumulación de materia seca evidenciada en el
cromosoma 7. Por lo tanto, el cromosoma 7 otorgaría expresión de resistencia a
temperaturas de exposición constantes de frío.
Finalmente para estas condiciones de ensayo, la introgresión proveniente de L.
hirsutum en el cromosoma 7 coincide con la expresión fenotípica de alza de ABA y
47
sucesivos progresos en el crecimiento vegetativo de las plantas, por lo que podría
ser usado para futuras hibridaciones.
48
5 RESUMEN Actualmente se han estudiado características genéticas presentes en especies silvestres de Lycopersicon, entre ellas Lycopersicon hirsutum que es capaz de crecer y desarrollarse en ambientes de temperaturas subóptimas de crecimiento. Mediante procesos de retrocruza y la utilización de marcadores moleculares a sido posible la obtención de líneas genéticas recombinantes entre L. hirsutum, que confiere genes de resistencia al frío, y L. esculentum. Las temperaturas subóptimas de crecimiento inducen a las plantas a producir respuestas moleculares, existiendo señales de transcripción de genes dependientes de Ácido Abscísico, ABA, o independientes de los contenidos de esta hormona. En las líneas de tomate que presentan la característica de resistencia al frío, podría o no responder aumentando las concentraciones de ABA. Por un lado la resistencia se vería reflejada en una alta concentración de la hormona independiente de la temperatura expuesta o bien, frente a un estrés por bajas temperaturas aumentar el contenido endógeno de ABA. En esta investigación se busca describir la evolución del contenido endógeno de ABA y evaluar el comportamiento vegetativo en una serie de líneas genéticas seleccionadas por manifestar resistencia al frío, bajo condiciones de cultivo al aire libre (TAPIA, 2002). En este trabajo se evaluaron las líneas NILs TA1111, TA1266, TA1297, TA1303, TA1315 y TA1544. Cada una con introgresión de la resistencia ubicados en distintos cromosomas. Como control se utilizó el cv. E6203, el cual presenta un crecimiento determinado igual que las líneas genéticas evaluadas. Se realizaron dos ensayos, el primero respecto de la evaluación del contenido endógeno de ABA en las líneas genéticas previamente descritas y el segundo acerca de la evaluación del comportamiento vegetativo de líneas con resistencia al frío bajo temperaturas de estrés constantes. En el primer ensayo se sometieron todas las líneas a estrés durante una semana y fue medido el contenido de ABA antes y después del periodo de bajas temperaturas. Así mismo los parámetros vegetativos como altura de la planta, diámetro de tallo principal, número de hojas, área foliar y materia seca fueron medidos en ambas ocasiones. Los resultados obtenidos fueron que las líneas TA1303 y TA1315 presentaron un alza considerable en el contenido endógeno de ABA después de ser sometidas a temperaturas de estrés. Por otro lado, se observó la expresión fenotípica de los genes introgresados desde L. hirsutum en los cromosomas 2, 3, 5 y 7 en las distintas variables evaluadas. En el crecimiento del área foliar los cromosomas 3 y 2; y los cromosomas 2, 5 y 7 en cuanto a la acumulación de materia seca. Respecto a este ensayo es también posible verificar
49
que existe correlación clara entre concentración endógena de ABA y tasa de crecimiento en altura de la planta, tasa de crecimiento en altura de la planta y tasa de crecimiento en área foliar, tasa de crecimiento en diámetro de la planta y materia seca, y por último tasa de crecimiento en área foliar y materia seca. Todas estas correlaciones de tipo negativa, es decir, el aumento de una variable disminuye la otra. Respecto al ensayo 2, se reflejó la resistencia respecto a parámetros de germinación dados por los cromosomas 2 y 7: además acerca de la materia seca, el cromosoma 7 refleja la expresión de la resistencia en este parámetro.
50
6 LITERATURA CITADA.
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