UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

PROYECTO DE TITULACIÓN PREVIO, AL TÍTULO DE QUÍMICO Y

FARMACÉUTICO

MODALIDAD: INVESTIGACIÓN

TITULO:

“ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO DE LAS SEMILLAS DE LOS

FRUTOS DULCES Y AMARGOS DE Nephelium lappaceum L.”

AUTORAS:

GÉNESIS YELITZA FARÍAS DELGADO

YULIANA LILIBETH OLAYA LARROSA

TUTORA: Q. F LAURA VALDEZ LÓPEZ, M.Sc.

CONSULTORA EXTERNA: DRA. MIGDALIA MIRANDA

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN: CIENCIAS BÁSICAS, BIOCONOCIMIENTO Y

DESARROLLO INDUSTRIAL

SUBLÍNEA DE INVESTIGACIÓN: CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA

GUAYAQUIL-ECUADOR

2018

FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA

UNIDAD DE TITULACIÓN

II

FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN

TÍTULO Y SUBTÍTULO:

ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO DE LAS

SEMILLAS DE LOS FRUTOS DULCES Y AMARGOS DE Nephelium

lappaceum L.

AUTOR(ES)

(apellidos/nombres):

FARÍAS DELGADO GÉNESIS YELITZA

OLAYA LARROSA YULIANA LILIBETH

REVISOR(ES)/TUTOR(ES)

(apellidos/nombres):

Blgo. GUSTAVO ESCOBAR VALDIVIESO, M.Sc. , REVISOR

Q.F LAURA LEONOR VALDEZ LÓPEZ, M.Sc., TUTOR(A)

MIGDALIA MIRANDA MARTÍNEZ, PhD., CONSULTORA EXTERNA

INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

UNIDAD/FACULTAD: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:

GRADO OBTENIDO: TERCER NIVEL – QUÍMICO FARMACÉUTICO

FECHA DE PUBLICACIÓN: 2018 No. DE PÁGINAS: 85

ÁREAS TEMÁTICAS: INVESTIGACIÓN FARMACOGNÓSTICA Y FITOQUÍMICA

PALABRAS CLAVES/

KEYWORDS:

Nephelium lappaceum L., semillas, ácidos grasos, estudio farmacognóstico,

fitoesteroles.

RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras):

Nephelium lappaceum es un fruto nativo de Malasia e Indonesia introducida al Ecuador con propósitos

alimenticios. El estudio tuvo como finalidad identificar los metabolitos bioactivos presente en las semillas dulces

y amargas del rambután, a través de un análisis farmacognóstico en base a la evaluación de parámetros físico-

químicos, screening fitoquímico por extracción sucesiva con solventes de polaridad creciente y cuantificación e

identificación de ácidos grasos por cromatografía de gases acoplado a espectrofotometría de masas. Los resultados

obtenidos demostraron que las semillas difieren de manera significativa en el contenido de fitoconstituyentes

grasos (ácidos grasos) debido a que la variedad dulce presenta 57.35% en comparación con la variedad amarga con

un 68.88%. En conclusión las semillas amargas contienen un mayor porcentaje de rendimiento pudiendo

corroborarse en el perfil cromatográfico la identificación de compuestos grasos en fracción saponificable e

insaponificable en comparación a las semillas dulces.

ADJUNTO PDF: SI NO

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AUTOR/ES:

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Nombre: SEDE CIENCIAS QUÍMICAS

Teléfono: 04-229-3680

E-mail: [email protected]

X

XII

ÍNDICE

RESUMEN .................................................................................................................... XXIII

ABSTRACT .................................................................................................................. XXIV

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1

CAPÍTULO I ......................................................................................................................... 3

1.1 Planteamiento del problema .................................................................................... 3

1.2 Formulación del problema ....................................................................................... 3

1.3 Justificación ............................................................................................................. 3

1.4 Delimitaciones ......................................................................................................... 4

1.5 Hipótesis .................................................................................................................. 4

1.6 Objetivos .................................................................................................................. 4

1.6.1 Objetivo general ................................................................................................... 4

1.6.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 5

1.7 Variables .................................................................................................................. 5

1.8 Conceptualización e indicadores ............................................................................. 6

CAPÍTULO II ....................................................................................................................... 7

MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 7

XIII

2.1 Antecedentes ............................................................................................................ 7

2.2 Nephelium lappaceum ............................................................................................. 9

2.2.1 Generalidades ....................................................................................................... 9

2.2.2 Taxonomía y características morfología del fruto ............................................... 9

2.2.3 Composición de la semilla ................................................................................. 11

2.2.4 Aplicación de las semillas a nivel técnico-industrial ......................................... 11

2.3 Compuestos grasos en plantas ............................................................................... 12

2.3.1 Lípidos ............................................................................................................... 12

2.3.1.1 Clasificación ............................................................................................. 13

2.3.1.1.1 Lípidos saponificables o complejos ................................................... 13

2.3.1.1.2 Lípidos no saponificables o simples .................................................. 16

2.3.2 Métodos de extracción de productos naturales .................................................. 18

2.3.2.1 Extracción mecánica ................................................................................. 18

2.3.2.2 Extracción con fluidos supercríticos ........................................................ 18

2.3.2.3 Extracción con disolventes ....................................................................... 19

3.3.2.3.1 Extracción discontinua ...................................................................... 19

3.3.2.3.2 Semicontinuos ................................................................................... 21

XIV

2.3.2.4 Método adicional de extracción ................................................................ 22

2.3.2.5 Método de identificación y cuantificación de ácidos grasos .................... 22

2.3.2.5.1 Cromatografía de Gases acoplado a espectrofotometría de masas

(CG/EM) .................................................................................................................. 22

CAPÍTULO III .................................................................................................................... 23

MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 23

3.1. Método de investigación ........................................................................................ 23

3.2. Población y muestra............................................................................................... 23

3.3. Criterio de inclusión .............................................................................................. 23

3.4. Criterio de exclusión .............................................................................................. 23

3.5. Materiales .............................................................................................................. 24

3.5.1 Materia prima ..................................................................................................... 24

3.5.2 Materiales de laboratorio ................................................................................... 24

3.5.3 Equipos .............................................................................................................. 24

3.5.4 Reactivos ............................................................................................................ 25

3.6. Metodología ........................................................................................................... 25

3.6.1 Estudio farmacognóstico .................................................................................... 25

XV

3.6.1.1 Operaciones preliminares del material vegetal ......................................... 25

3.6.1.2 Parámetros físico-químicos aplicados a las semillas ................................ 26

3.6.1.2.1 Ensayo de humedad residual ............................................................. 26

3.6.1.2.2 Ensayo de cenizas totales .................................................................. 27

3.6.1.2.3 Ensayo de cenizas insolubles en ácido .............................................. 27

3.6.1.2.4 Ensayo de sustancias solubles ........................................................... 27

3.6.2 Estudio químico cualitativo ............................................................................... 28

3.6.2.1 Screening fitoquímico .............................................................................. 28

3.6.2.1.1 Método de extracción de grasas ........................................................ 31

3.6.2.2 Análisis de ácidos grasos por cromatografía de gases acoplado a

espectrometría de Masas (CG/EM) .............................................................................. 33

CAPÍTULO IV .................................................................................................................... 35

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 35

4.1 Estudio farmacognóstico ....................................................................................... 35

4.2 Estudio químico cualitativo ................................................................................... 37

4.3 Extracción y análisis de compuestos grasos .......................................................... 38

DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 45

XVI

CAPÍTULO V ..................................................................................................................... 49

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................. 49

5.1 Conclusiones .............................................................................................................. 49

5.2 Recomendaciones ...................................................................................................... 50

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 51

ANEXOS ............................................................................................................................. 61

XVII

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I Descripción taxonómica del rambután ........................................................................ 10

Tabla II Condiciones cromatográficas ..................................................................................... 33

Tabla III Características macromorfológicas de las dos variedades de semillas del fruto

Nephelium lappaceum. ............................................................................................................. 35

Tabla IV Parámetros físico-químicos de las semillas del fruto Nephelium lappaceum .......... 36

Tabla V Resultados obtenidos del screening fitoquímico realizado a los extractos de las

semillas dulce del fruto Nephelium lappaceum ....................................................................... 37

Tabla VI Parámetros fisicoquímicos del extracto graso de las dos variedades del fruto

Nephelium lappaceum .............................................................................................................. 38

Tabla VII Compuestos identificados en la fracción insaponificable de las semillas de los frutos

amargos y dulces de Nephelium lappaceum. ........................................................................... 40

Tabla VIII Compuestos identificados en la fracción saponificable de las semillas de los frutos

dulces y amargos de N. lappaceum .......................................................................................... 43

XVIII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Características morfológicas del rambután .............................................................. 10

Figura 2. Estructura de ácido graso.......................................................................................... 13

Figura 3. Estructuras de los Acilgliceroles .............................................................................. 14

Figura 4.Estructura general de los fosfolípidos ....................................................................... 15

Figura 5. Formación estructural de las ceras ........................................................................... 15

Figura 6. Estructura del isopreno ............................................................................................. 16

Figura 7. Estructura general de los fitoesteroles ...................................................................... 17

Figura 8. Cromatogramas gaseosos analíticos de las fracciones de compuestos

insaponificables de los frutos de Nephelium lappaceum variedades amargas y dulces. ......... 39

Figura 9. Cromatogramas gaseosos analíticos de las fracciones de compuestos saponificables

de los frutos de N. lappaceum variedades amargas y dulces. .................................................. 42

XIX

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Lavado de frutos amargos y dulces del achotillo ..................................................... 61

Anexo 2. Separación de la cascara de las dos variedades del achotillo ................................... 61

Anexo 3. Despulpamiento del fruto amargo y dulce del achotillo. ......................................... 61

Anexo 4. Secado de las semillas amargas y dulces del achotillo............................................. 62

Anexo 5. Percepción de las semillas amargas y dulces del achotillo. ..................................... 62

Anexo 6. Pesado de las semillas de amargas y dulces del achotillo ........................................ 62

Anexo 7. Proceso de molienda de la semilla amarga del achotillo .......................................... 63

Anexo 8. Proceso de molienda de semillas dulces del achotillo. ............................................. 63

Anexo 9. Semillas molidas y etiquetadas para almacenamiento ............................................. 63

Anexo 10. Peso de las muestras para determinación de humedad ........................................... 64

Anexo 11. Muestras de semillas amargas y dulces en la estufa............................................... 64

Anexo 12. Muestras pesadas para cenizas totales. ................................................................... 64

Anexo 13. Muestras de semillas en la mufla. .......................................................................... 65

Anexo 14. Cenizas de las muestras en desecador. ................................................................... 65

Anexo 15. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico .................................... 65

Anexo 16. Pesado de muestras con disolventes para sustancias insolubles ............................ 65

XX

Anexo 17. Reflujo de la muestra/Residuo de sustancias solubles ........................................... 66

Anexo 18. Screening del extracto etéreo de las semillas amargas achotillo ............................ 66

Anexo 19. Screening del extracto de éter etílico de las semillas dulce de achotillo................ 66

Anexo 20. Prueba de Baljet del extracto etéreo semillas dulces y amargas. ........................... 66

Anexo 21. Prueba de Dragendorff del extracto etéreo de semillas dulces y amargas. ............ 66

Anexo 22. Prueba de Wagner de extracto etéreo de semillas dulces y amargas ..................... 66

Anexo 23. .Prueba de Sudan del extracto etéreo de semillas dulces y amargas. ..................... 67

Anexo 24. Prueba de Lieberman del extracto etéreo de semillas dulces y amargas. ............... 67

Anexo 25. Prueba de Resinas del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ............. 67

Anexo 26. Prueba de Cl3Fe del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ................ 67

Anexo 27. Prueba de Fehling del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ............. 67

Anexo 28. Prueba de Baljet del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas................. 67

Anexo 29. Prueba de Borntrager del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas ......... 67

Anexo 30. Prueba de Buchard del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ............ 67

Anexo 31. Prueba de Dragendorff del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas ...... 68

Anexo 32. Prueba de Wagner del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas ............. 68

Anexo 33. Prueba de saponinas del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ......... 68

XXI

Anexo 34. Prueba de Shinoda del extracto alcohólico de semillas dulces y amargas. ............ 68

Anexo 35. Screening del extracto de acuoso, de las semillas amargas del achotillo

(Nephelium lappaceum L) ........................................................................................................ 68

Anexo 36. Screening del extracto de acuoso de las semillas dulces del achotillo (Nephelium

lappaceum L). .......................................................................................................................... 69

Anexo 37. Prueba de Dragendorff del extracto acuoso de semillas dulces y amargas ........... 69

Anexo 38. Prueba de Fehling del extracto acuoso de semillas dulces y amargas. .................. 69

Anexo 39. Prueba de Espuma del extracto acuoso de semillas dulces y amargas. .................. 69

Anexo 40. Prueba de Shinoda del extracto acuoso de semillas dulces y amargas. .................. 69

Anexo 41. Prueba de Cl3Fe del extracto acuoso de semillas dulces y amargas ...................... 69

Anexo 42. Prueba de Wagner del extracto acuoso de semillas dulces y amargas. .................. 69

Anexo 43. Evaporación del solvente de extracción por medio de rota evaporador. ................ 69

Anexo 44. Extracción de ácidos grasos con hexano por el método de soxhlet. ...................... 69

Anexo 45. Determinación de índice de densidad relativa de los acido grasos de las semillas

dulce y amarga. ........................................................................................................................ 69

Anexo 46. Determinación de índice de saponificación de los acido grasos de las semillas

dulce y amarga. ........................................................................................................................ 69

Anexo 47. Determinación de índice de saponificación de los acido grasos de las semillas

dulce y amarga. ........................................................................................................................ 69

XXII

Anexo 48. Determinación de índice de esterificación de los acido grasos de las semillas dulce

y amarga. .................................................................................................................................. 69

Anexo 49. Saponificación de ácidos grasos de las semillas dulce y amarga ........................... 69

XXIII

RESUMEN

Nephelium lappaceum es un fruto nativo de Malasia e Indonesia introducida al Ecuador con

propósitos alimenticios. El estudio tuvo como finalidad identificar los metabolitos bioactivos

presente en las semillas dulces y amargas del rambután, a través de un análisis farmacognóstico

en base a la evaluación de parámetros físico-químicos, screening fitoquímico por extracción

sucesiva con solventes de polaridad creciente y cuantificación e identificación de ácidos grasos

por cromatografía de gases acoplado a espectrofotometría de masas. Los resultados obtenidos

demostraron que las semillas difieren de manera significativa en el contenido de

fitoconstituyentes grasos (ácidos grasos) debido a que la variedad dulce presenta 57.35% en

comparación con la variedad amarga con un 68.88%. En conclusión las semillas amargas

contienen un mayor porcentaje de rendimiento pudiendo corroborarse en el perfil

cromatográfico la identificación de compuestos grasos en fracción saponificable e

insaponificable en comparación a las semillas dulces.

Palabras claves: Nephelium lappaceum L., semillas, ácidos grasos, estudio farmacognóstico,

fitoesteroles.

XXIV

ABSTRACT

Nephelium lappaceum is a fruit native to Malaysia and Indonesia introduced in Ecuador with

purposes foodstuffs. The study aimed to identify the metabolites bioactive present in seed sweet

and bitter of rambutan, through an analysis farmacognóstico based on the evaluation of

physical and chemical parameters, Screening phytochemical by removing successively with

increasing polarity solvents, quantification, and identification of fatty acids by gas

chromatography coupled to mass spectrometry. The results obtained showed that the seeds

differ significantly in the content of fatty phytoconstituents (fatty acids) because the sweet

variety presents 57.35% compared to the bitter variety with 68.88%. In conclusion the bitter

seeds contain a higher percentage of performance can be corroborated in the chromatographic

profile the identification of fatty compounds in fraction saponifiable matter and unsaponifiables

in comparison to seed sweets.

Key words: Nephelium lappaceum L., seeds, fatty acids, pharmacognostic study, phytosterols.

1

INTRODUCCIÓN

En Ecuador existe una gran variedad de especies vegetales que tienen importancia en la

sociedad debido a sus propiedades farmacológicas y nutricionales, sin embargo, la mayoría no

cuenta con estudios científicos con respecto a su composición química, por consiguiente incita

a investigadores a emplear la farmacognosia y fitoquímica para dilucidar de manera objetiva

los metabolitos bioactivos propios de cada planta de estudio para luego establecer mediante

técnicas experimentales más avanzadas la posible cuantificación y beneficio terapéutico (Van

Baren, 2015).

Dentro de esta biodiversidad se destaca al rambután un fruto autóctono de la región tórrida de

Malasia. En el año de 1960 el rambután se incorporó al sector agrícola ecuatoriano con la

cualidad de arbusto ornamental, no obstante, en las últimas décadas acrecentó la explotación

nacional por el sabor peculiar de su pulpa; a su vez una cantidad inmensurable de residuos de la

corteza y semillas (Arias y Calvo, 2014).

Tradicionalmente lo definen con el término de “medicina tropical” al considerarlo un alimento

saludable capaz de proporcionar un alto contenido de vitaminas, proteínas, carbohidratos y

minerales, sin embargo, el 60 % de metabolitos con propiedades terapéuticas se encuentran en

las semillas por poseer cantidades altas de ácidos grasos, entre los de mayor relevancia el ácido

oleico y araquidónico alcanzando hasta un 53.76 % en su composición (García, et al.,2016). Por

ende, las convierte en la principal fuente energética para la mayoría de las células del organismo

y promueve el uso para la obtención de sustancias bioactivas que favorezcan el bienestar del

ser humano (Hernandez, Morales, Valenzuela, Morales, y Valenzuela, 2016).

Debido al desarrollo comercial del rambután en el país, las leyes medioambientales

paulatinamente buscan estrategias de eviten la extinción de la especie por la explotación

2

desmesurada por parte del mercado industrial, el cual fomenta un manejo sistémico de los

residuos y los convierte en un recurso sostenible. A su vez, ha permitido que el campo técnico

internacional se involucre en áreas investigativas relacionadas con los metabolitos activos

inmersos en los distintos órganos que conforman el fruto (Rodrigues, De oliviera, y Sousa, 2018).

Cabe destacar que en la literatura científica existen pocos tipos de monografía

farmacognóstica y química sobre las simientes del rambután, en este contexto el propósito de la

presente investigación es realizar un estudio comparativo de los compuestos químicos entre dos

variedades de semillas de la misma especie con la finalidad de aportar bases científicas que

puedan sostener posteriores estudios.

3

CAPÍTULO I

1.1 Planteamiento del problema

El rambután es un fruto con demanda comercial en las últimas décadas en el mercado

nacional e internacional, ancestralmente ha demostrado un amplio espectro de actividad

biológica, convirtiéndose en una herramienta óptima para la obtención de principios activos de

origen natural. A pesar del progreso indudable de estudios sobre la especie, hasta el momento

no muestra evidencia en la literatura científica acerca de los componentes fitoquímicos y ácidos

grasos presente en sus semillas (Rodrigues, et al., 2018).

De manera que el presente estudio procura realizar de forma detallada el análisis

farmacognóstico y químico de las semillas de las dos variedades del fruto Nephelium

lappaceum L.

1.2 Formulación del problema

¿Presentaran los ácidos grasos obtenidos de las semillas de los frutos dulces y amargos de

Nephelium lappaceum L. diferente composición química?

1.3 Justificación

En la naturaleza se encuentra una amplia gama de especies vegetales que destacan por sus

usos tradicionales, debido a la presencia de metabolitos secundarios que se producen dentro de

las mismas. En la actualidad, se ha demostrado que principalmente la mayoría de estas

sustancias portan un mecanismo de defensa para las plantas, estos componentes también

permiten ser utilizados en la agricultura, medicina, industrias farmacéuticas, industria

alimenticia y cosméticas, entre otras.

4

En Ecuador existen poco estudios bibliográficos y/o experimentales que permiten la

caracterización de los compuestos químicos de las semilla del Nephelium lappaceum L., por

tal motivo el presente proyecto de titulación tiene como finalidad realizar un estudio

farmacognóstico y químico de las dos variedades de semillas del rambután con el propósito de

aislar, identificar y cuantificar los ácidos grasos y otro componentes con actividad terapéutico

presentes en las mismas para así conceder la caracterización detallada de las semillas del

fruto y contribuir a futuras investigaciones a nivel farmacológico.

1.4 Delimitaciones

A pesar de que sería de gran interés evaluar de manera detallada las propiedades

farmacológicas de las moléculas bioactivas del fruto Nephelium lappaceum por circunstancias

económicas y de tiempo, el presente estudio se basa únicamente en el análisis farmacognóstico

y químico las dos variedades de semillas del fruto con la finalidad de dar a conocer los

metabolitos secundarios presentes en las simiente, para destacar las posibles diferencias de una

respecto a la otra, enfocándonos principalmente en la identificación y cuantificación de ácidos

grasos presentes en las mismas mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de

masas y así establecer cual posee un mayor grado de calidad.

1.5 Hipótesis

Los ácidos grasos obtenidos de la semilla de los frutos dulces y amargos del Nephelium

lappaceum L. poseen una diferencia significativa de compuestos químicos.

1.6 Objetivos

1.6.1 Objetivo general

Evaluar las características farmacognósticas y químicas de las semillas de los frutos dulces

5

y amargos de Nephelium lappaceum L.

1.6.2 Objetivos específicos

1. Analizar los parámetros físico-químicos de las semillas de los frutos dulces y

amargos de Nephelium lappaceum L.

2. Determinar a partir de las semillas de los frutos dulces y amargos de Nephelium

lappaceum L. ácidos grasos mediante la técnica Soxhlet.

3. Cuantificar los componentes químicos presentes en los extractos de ácidos grasos de

las dos variedades de semillas de la especie Nephelium lappaceum L. por cromatografía de Gases

acoplada a espectrometría de masas (CG-EM).

1.7 Variables

Variables

Independiente Parámetros físicos -químicos, caracterización de compuestos.

Dependiente

Composición química de las variedades (dulce, amarga) de semillas

Nephelium lappaceum L.

6

1.8 Conceptualización e indicadores

Variables Conceptualización Dimensión Indicador

1. Estudio físico-

químico de las

semillas rambután.

2. Extracción de

los ácidos grasos

de la semilla

Nephelium

lappaceum L.

3. Cuantificación

de los

componentes

químicos de la

semilla Nephelium

lappaceum L.

1. Se realiza

mediante varias

técnicas para poder

identificar los

diferentes compuestos

presentes.

2. Determinación

del contenido graso en

las semillas mediante la

separación de la

muestra sólida y un

disolvente.

3. Se realiza la

cuantificación por

medio de una

cromatografía de Gases

acoplada a

espectrometría de

masas.

1. Color, forma,

dimensiones,

Húmeda residual,

cenizas totales,

tamizaje de la

semilla.

2. Realización de

la técnica Soxhlet.

3. Aplicación de

la técnica

Cromatografía de

gases

1. Análisis macro

morfológico, físico-

químico de las

semillas mediante

una muestra.

2. Cantidad

obtenida de ácidos

grasos.

3. Tabla estadística

de los químicos que

componen la semilla

Rambután.

7

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1 Antecedentes

El seudónimo rambután procede del vocablo malayo rambut que significa “pelo” en referencia

a los tricomas que rodean la corteza del fruto (Sukasih y Setyadjit, 2015; Arías, Velásquez,

Mateus, Chaparro, y Orduz, 2016), en la década de los 60´s el cultivo de esta especie se extendió

a zonas templadas de Colombia, Costa Rica y Ecuador por la capacidad de adaptación a

diversos suelos (Small, 2012).

Dentro de las propiedades medicinales del fruto en el año 2013 se realizó un estudio en

ratones diabéticos inducidos con alloxan en donde se demostró que la infusión de semillas

maduras de Nephelium lappaceum a concentraciones de 3,12 g/kg durante un periodo de 16

días posee actividad reconstructiva de las células beta-pancreáticas por el alto contenido de

carbohidratos, grasas, proteínas y polifenoles; concluyendo así que la administración oral del

extracto disminuye de manera considerable los niveles hiperglucémicos en sangre (Rahayu,

Zakir, y Andriani, 2013).

Investigadores relacionados con la industria de alimentos a inicios del 2014 optaron por

evaluar la eficacia antioxidante de los extractos de los residuos del rambután (cascara y semilla)

al complementarlo a extractos de aceite de girasol para retardar la rancidez del mismo bajo

condiciones aceleradas, al compararlos con antioxidantes sintéticos (Tocoferol y

Butilhidroxianisol) observaron que no hay diferencias significativas, por tal motivo puede ser

una alternativa de origen natural segura que contribuya a prolongar la calidad, estabilidad y

vida útil de diversos aceites comerciales (Winne, et al., 2014).

8

En el mismo año debido al incremento de la comercialización del fruto se realizó un estudio

in vivo en ratas y conejos sobre la posible toxicidad de los aceites extraídos de las semillas a

partir de ensayos agudos orales, dérmicos e irritantes permitiendo obtener resultados que

sugieren que estos no poseen efectos tóxicos significativos y estableciendo así que son seguros

para su utilización en aplicaciones industriales tanto de alimentos y cosméticos (Eiamwat, et

al., 2014).

El Departamento de alimentos del Thailand Institute of Scientific and Technological

Research en el año 2016 evaluó las propiedades físico-químicas de la harina de la semilla del

rambután desgrasado con la finalidad de manifestar que el tratamiento alcalino con hidróxido

de sodio es un método de gran utilidad para alterar de manera favorable las características

propias de la materia prima, al momento de la extracción de almidón de la misma en conjunto

con el desgrasamiento con dióxido de carbono supercrítico (CO2- SC) para poder mantener la

constitución nutricional y sensorial del producto convirtiéndose así en una alternativa confiable

para el aprovechamiento de residuos del fruto (Wanlapa, Eiamwat, y Kampruengdet, 2016).

Por otro lado, Mahisanunt, Na Jom, y Matsukawa (2017) realizaron estudios comparativos

entre la fracción de grasa sólida y la fracción hidrogenada comercial de las semillas del

rambután mediante técnicas de fraccionamiento isotérmico con disolventes de referencia

(acetona y etanol) e indicaron que ambas poseen un uso viable para productos alimenticios por

la capacidad antioxidante y de preservación sobre las propiedades organolépticas de diversos

productos comestibles motivo que sugiere el desarrollo de estudios con respecto al fruto.

9

2.2 Nephelium lappaceum

2.2.1 Generalidades

La manipulación del rambután para su comercialización se realiza de manera delicada por

experimentar una rápida perdida de humedad y por ser susceptible a la oxidación de los

compuestos antioxidantes principalmente en su cascara lo que lleva a la pérdida de su fruta,

por ello, la industria alimentaria para prolongar su vida útil y disponibilidad del fruto durante

el año se basa en una serie de tratamientos térmicos con la finalidad de inactivar enzimas,

destruir microorganismos y mejorar el color y sabor, no obstante, en ocasiones puede reducir

las cualidades nutritivas del mismo (Nurhuda, et al., 2013; Faizah, et al., 2015).

Las actividades comerciales en el mercado nacional e internacional en la actualidad se han

incrementado debido a la aceptación de esta especie por parte de la población al ser altamente

demandante por su distintiva calidad sensorial y nutricional en relación a otros frutos, dichas

cualidades se las consigue al seguir a cabalidad los parámetros establecidos en la Norma del

Codex para el Rambután 246-2005 para su expendio, entre ellas cabe destacar: Variedad

comercial específica, grados Brix mayor de 18, aspecto apetecible y peso no inferior a 30 g

(Hernández, et al., 2011).

2.2.2 Taxonomía y características morfología del fruto

La taxonómica se describe en la tabla I; lo destacable de la morfología del rambután (figura

1) es que produce bayas de forma ovoide y oblongas, con un pericarpio de color rojo o amarillo

con un espesor entre 0.2-0.4 mm recubierto en su totalidad por espinas blandas que varían en

tonalidad (verde, amarillo y rojo). Consta de un arilo comestible translúcido, dulce y jugoso, la

semilla se caracteriza por su coloración marrón brillante, algo amarga y narcótica, con un alto

10

contenido en grasas, generalmente poseen una longitud de 2.0-3.5 cm y 1.2-2.2 cm de ancho

(Hernández, et al., 2011; Do Sacramento y Aparecida, 2014).

Tabla I Descripción taxonómica del rambután

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Sapindales

Familia Sapindaceae

Género Nephelium

Especie lappaceum

(Vargas, 2003)

Figura 1. Características morfológicas del rambután

(Rodrígues, et al., 2018)

11

2.2.3 Composición de la semilla

Uno de los elementos de mayor relevancia en el rambután es su semilla, por considerarse el

órgano del fruto para su reproducción. El porcentaje proximal de compuestos básicos que se

encuentra en la semilla son: Fibra (2.8 %-11.6 %), carbohidratos (28.7 %-48.1 %), proteína

(7.8 %-14.1 %) y grasa (37.1 % y 38.9 %) (Mahisanunt, et al., 2017; Mariod, Abdalbasit, y

Hussein, 2017).

2.2.4 Aplicación de las semillas a nivel técnico-industrial

En Ecuador se conoce que el rambután es una fruta de sabor agradable y de gran aporte

nutricional para la salud, sin embargo, no es motivo suficiente para una explotación comercial

significativa, cabe destacar que para el mercado industrial de nivel internacional se ha

convertido en una fuente económica sostenible para las diferentes áreas que lo conforman, por

tal motivo industrias farmacéuticas aprovechan la actividad farmacológica demostrada de los

extractos tanto etanólicos como metanólicos de las cascaras y semillas para emplearlo como

precursor en la elaboración de nuevos medicamentos para patologías como hipertensión,

diabetes y cáncer (Rodrigues, et al., 2018).

A su vez se utiliza los desechos del achotillo para la síntesis de nanocristales de óxido de

níquel y óxido de zinc para luego probarlos en bacterias Escherichia coli y Staphylococcus

aureus con la finalidad probar su actividad antibacteriana (Kuma y Rajeshkumar, 2018).

La industria cosmética procura innovar constantemente en el desarrollo de nuevas

formulaciones para reemplazar materias primas sintéticas, de esta manera apertura a una

posible utilización de grasas provenientes de las semillas del achotillo con la finalidad de

transformarlas en material ecológico sostenible, en particular, para productos de higiene

personal como son jabones, shampoo, cremas, entre otros (Lim, 2013; Lourith, et al.2016).

12

Por otro lado la industria alimentaria fue pionera en explotar el fruto por las cualidades de

los componentes empleándolos así como colorante y/o saborizante al ser más seguros que los

sintéticos, por tal motivo se concentran en los avances tecnológicos con la finalidad de potenciar

su recolección y estudios para la caracterización físico-químicas del fruto hacia la cosecha

considerando como criterios primordiales (estado físico, lipofilicidad, estabilidad química y

permeabilidad celular) para garantizar parámetros de seguridad y calidad comercial siendo el

punto partida para el auge en su exportación (Caballero, et al.,2011; Witayaudom y

Klinkesorn, 2017).

2.3 Compuestos grasos en plantas

La vegetación es una parte invaluable y útil del ecosistema, empíricamente en la antigüedad

las culturas chinas, egipcias, romanas y griegas descubrieron las cualidades terapéuticas de un

gran número de plantas por su capacidad de condicionar un estado de salud favorable en los

individuos que lo consumían, principalmente de aquellas ricas en compuestos grasos dando

apertura así a la aromaterapia (Azuola y Vargas, 2007).

Actualmente debido a los avances tecnológicos y científicos se ha podido demostrar que las

plantas posee un conjunto complejo de rutas metabólicas para la síntesis de una amplia variedad

de metabolitos primarios y secundarios responsable de su acción farmacológica, dichos

compuestos son indispensable para la sobrevivencia y de igual manera cotizadas como un

recurso natural propicio para la elaboración de productos rentables en la industria farmacéutica,

alimentaria y cosmética (Muñoz, 2002; Ortuño, Díaz, y Del Río, 2015).

2.3.1 Lípidos

Es un conjunto heterogéneo de moléculas hidrófobas de baja masa molecular que se originan

a partir de condensaciones de tioésteres o unidades de isopreno, cuya característica en común

13

es ser solubles en disolventes orgánicos. No obstante, la propiedad de agruparse e interaccionar

con otras moléculas como las lipoproteinas o glucolípidos generan biomoléculas anfipáticas,

que le permite en medio acuoso unirse al agua por su parte polar, dando lugar a diferentes

formas de agregación en forma de una bicapa lipídica (Cornago, 2013; Hoyos y Rosales, 2014;

Li, et al., 2018).

2.3.1.1 Clasificación

Los lípidos se catalogan de acuerdo con sus propiedades físico-químicas y/o por su

estructura molecular, en:

2.3.1.1.1 Lípidos saponificables o complejos

Ácidos grasos

Los ácidos grasos se definen de manera química como cadenas hidrocarbonadas de longitud

variable, con un grupo carboxilo en su extremo, pueden ser ácidos grasos saturados debido a

que poseen un mayor número de átomos de hidrogeno en la cadena de carbono, presente

generalmente en animales, tienden a solidificarse a temperatura ambiente considerándose así

como grasas. Mientras aquellos que han perdido algunos átomos de hidrogeno son conocidos

como ácidos grasos insaturados, fácilmente de encontrar en especies vegetales en estado

líquido y por lo tanto se denominan aceites (Morcillo, Cortés, y García, 2013).

Figura 2. Estructura de ácido graso (Liu, Ezernieks, Rochfort, & Simone , 2018)

14

Acilgliceroles

Se definen también como acilglicéridos, por tratarse de ácidos grasos unidos a una molécula

de glicerol, tienen la capacidad de esterificar uno, dos o tres grupos hidroxilos (OH) del glicerol

dando lugar a los mono, di y triacilglicéridos (Figura 2A, 2B, 2C), en donde los primeros

poseen una cierta polaridad al encontrarse OH libres sin esterificar, mientras que los últimos

son compuestos no polares, que constituyen una fuente importante de energía (Hoyos y

Rosales, 2014; López, 2017).

Figura 3. Estructuras de los Acilgliceroles (Liu, et al., 2018).

El punto de fusión de este tipo de compuestos se da en función de la cantidad de ácidos

grasos que los componen, es decir, que cuanto mayor sea la longitud de la cadena más elevado

es su punto de fusión (Hou, Lin, Dulay, y Ray, 2017). Generalmente pasan por procesos de

saponificación para la obtención de jabones al hidrolizarse en medio alcalino para separarlos

en glicerol y sales de ácidos grasos. Cuando están puros son incoloros, inodoros e insípidos, en

cambio si presentan coloración se debe a la presencia de otras sustancias orgánicas (Damaceno,

Jesus, y Ceriani, 2018).

Fosfolípidos

Formados por ácidos grasos un alcohol y ácido fosfórico (H3PO4) (Figura 3). Dentro de

este grupo están los glicerofosfolípidos que llevan como alcohol al glicerogol y los

15

esfingofosfolípidos en los que el grupo alcohol es la esfingosina que es un aminoalcohol

(Cornago, 2013).

Figura 4.Estructura general de los fosfolípidos (Lin, et al., 2015).

Ceras

Este tipo de compuesto grasos se puede obtener de fuente vegetal y animal; se forman entre

la unión de ácidos grasos con alcoholes monohidroxilados de alto peso molecular, cuando en

su cadena se ha provocado una hidrogenación que dan como resultado la presencia de ceras

sólido, mientras que cuando hay una insaturación en las cadenas dan origen a los conocidos

aceites o ceras liquidas (Zeisler-Diehl, Müller, y Schreiber, 2018).

Figura 5. Formación estructural de las ceras (Blake y Marangoni, 2015).

En general constituyen un 20 a 60 % en las cutículas de las plantas, además se han

encontrado dentro de su composición una gran cantidad de compuestos fenólicos,

16

triterpenoides, polipéptidos y polisacáridos, lo que ha provocado su explotación en el área

industrial y en la actualidad su explotación comercial se logra mediante la extracción con agua

caliente, hexano o por expoliación de las partes aéreas de las plantas (Marcano y Hasegawa,

2002; Tafolla, Gonzáles, Tiznado, Zacarías, y Báez, 2013).

2.3.1.1.2 Lípidos no saponificables o simples

Isoprenoides

Fitoquímicamente son definidos como alcanos naturales o terpenoides, por presentar una

doble unión entre carbonos, para su síntesis en las plantas derivan del isopentenil pirofosfato o

isómero dimetilalil pirofosfato pudiendo seguir dos tipos de ruta distintas, la primera es la ruta

del ácido mevalónico que se realiza en el citoplasma dando origen a una parte de la clasificación

de los isoprenoides como son los sesquiterpenos, triterpenos y politerpenos; por otro lado los

monoterpenos, diterpenos, tetraterpenos y algunas quinonas preniladas siguen la ruta del 5-

fosfono-1-Desoxi-D-xilulosa (DXP) que se lleva a cabo en los plástidos. La importancia de las

propiedades biológicas de este tipo se compuesto está ligada a la complejidad de sus moléculas,

la cual les confiere una extensa aplicabilidad en innumerables actividades industriales ya sea

como fijador de perfumes, disolvente o materia prima para la producción de grasas, ceras y

tintas e inclusive en ocasiones como fármacos para la elaboración de nuevos productos

terapéuticos (Sepúlveda, Porta, y Rocha, 2003; Felipe y Bicas, 2017).

Figura 6. Estructura del isopreno (Mu, et al., 2018).

17

Fitoesteroles

Se considera como fitoesteroles a los componentes sintetizados en la estructura interna de

la membrana celular de los vegetales denominadas como esteroles; generalmente se encuentran

como compuestos conjugados en donde el grupo 3b-OH del esterol se esterifica principalmente

a ácidos grasos libres y/o ácidos fenólicos aunque en ocasiones puede ocurrir una reacción de

glicosilación (Muñoz, Alvarado, y Encina, 2011).

La biosíntesis ocurre exclusivamente en el citoplasma, a partir de moléculas de acetil-CoA

y por la actividad enzimática de la enzima acetil- CoAcarboxilasa, convirtiendo la Acetil-CoA

en 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA, para reducirse a melovato que mediante procesos sucesivos

de fosforilaciones y descarboxilación es transformado en isoprenoide, el que finalmente da

origen a los esteroles que de acuerdo a su doble enlace en la posición 5 se los considera como

fitoesteroles (sitosterol, campesterol, estigmasterol) y si no posee el doble enlace serán

fitoestanoles (sitostanol, campestanol y estigmastanol); Estos compuestos mayoritariamente

insaturados son esterificados mediante la adición de ácidos grasos para su saturación lo cual

mejora su biodisponibilidad. Particularmente se encuentra en legumbres, cereales, semillas

oleaginosas y aceites vegetales, por ende, a nivel industrial son empleados para enriquecer

ciertos alimentos que por su naturaleza poseen una mínima cantidad de estos componentes

(Rodríguez, et al. 2014; Silva, et al., 2016; Meco, Pascual, y Solá, 2016; Urquiaga, et al, 2017).

Figura 7. Estructura general de los fitoesteroles (Meco, Pascual, y Solá, 2016).

18

2.3.2 Métodos de extracción de productos naturales

La extracción es una operación que permite la separación de compuestos inmersos en el

material vegetal por medio de la utilización de un disolvente puro o en mezclas definidas y de

un proceso de extracción adecuado, donde siempre se obtienen por lo menos dos componentes

que puede ser la solución extraída en su disolvente (extracto) y el residuo o refinado (Van

Baren, 2015).

2.3.2.1 Extracción mecánica

Generalmente para casi todos los aceites fijos se sigue el método conocido como expresión,

que se realiza en equipos que en su interior contiene prensas o tornillos cuya función principal

es ejercer una presión mecánica sobre el material vegetal fresco para extracción de compuestos,

para aquellas sustancias que son excretadas a través de los poros de la especie vegetal se puede

hacer uso del método de exudación que consiste en realizar una incisión en la planta viva o

bien introduciendo un capilar en la corteza para la obtención de los componentes de interés,

por ello, ambos son recomendables para mantener el estado original de los compuestos grasos

y sus constituyentes (Van Baren, 2015).

2.3.2.2 Extracción con fluidos supercríticos

Para llevar a cabo este método se emplean disolventes selectivos denominados como fluidos

supercríticos por su capacidad de extraer ciertos compuestos químicos en matrices porosas bajo

la combinación de temperatura y presión por encima de su punto crítico, este método es

trascendental principalmente para los residuos sólidos de vegetales para la obtención de

sustancias con propiedades antioxidantes, en este tipo de ensayo el fluido más aplicado es el

anhídrido carbónico por ser un gas inocuo lo que contribuye a la obtención de un extracto final

19

limpio y con características especiales en relación a sus componentes de interés (Van Baren,

2015; Villada, et al., 2017).

2.3.2.3 Extracción con disolventes

3.3.2.3.1 Extracción discontinua

Maceración

El vegetal seco y molido o fresco troceado se pone en contacto con un solvente selectivo en

un recipiente de cierre perfecto a temperatura ambiente y con agitaciones frecuentes a lo largo

de tres días. Este tipo de método es útil cuando los principios activos son fácilmente solubles

en frío o cuando la acción de la temperatura los altera, es más recomendable iniciar la

extracción con hexano o con éter de petróleo para separar lípidos para finalmente realizar la

extracción con etanol o metanol al 95 % (Ocaña, 2015).

Digestión

Es una forma de maceración con ligero calentamiento entre 35º a 40º C, por ello, la

temperatura debe ser controlada con rigidez con la finalidad de que no alterar los componentes

volátiles del material vegetal durante el proceso de extracción, se realiza durante un periodo

que puede oscilar entre media hora y veinticuatro horas, es de gran utilidad para aquellas partes

vegetales más duras o que contienen sustancias poco solubles (Cortéz, 2016).

Infusión y/o decocción

El disolvente se hierve y posteriormente se introduce la droga a extraer, dejándose enfriar

el conjunto hasta temperatura ambiente. El extracto recibe el nombre de infusión (Molina,

2012).

20

Microondas

Es un método alterno para la extracción de metabolitos secundarios de plantas,

principalmente compuestos grasos, en donde el material vegetal es expuesto a irradiación de

microondas para generar en el interior de sus tejidos el movimiento de sus moléculas mediante

la migración de iones y rotación de dipolos lo cual contribuye a una mejor extracción de los

compuestos inmersos en el mismo; cabe recalcar que cuando la muestra es fresca no se necesita

adicionar ningún tipo de solvente, mientras que si se trata de una muestra seca deberá ser

rehidratada con una cantidad considerable de agua y drenar el exceso antes de realizar el

proceso por lo cual se considera como un método independiente, sin embargo, puede acoplarse

al sistema tradicional de hidro-destilación (Azuola y Vargas, 2007; Peredo, Palou, y López,

2009).

Ultrasonido

El ultrasonido se lo define como una onda sonora con frecuencias que van desde 20 hasta

100 MHz, no obstante, también se lo considera como un método extractivo que se basa en la

ruptura de la pared celular del material vegetal que contiene los metabolitos de interés mediante

la rehidratación de sus tejidos con un disolvente específico y la cavitación ultrasónica, lo que

favorece la transferencia del soluto a través de difusión y procesos osmóticos, provocando que

pase de la fase sólida al disolvente en un período reducido (Rodríguez, Robaina, Jáuregui,

Blanco, & Rodríguez, 2014). Actualmente, el área industrial recurre a este tipo de método para

la obtención de compuestos bioactivos de calidad a partir de fuentes vegetales, debido a que en

términos de productividad posee una alta reproducibilidad y facilidad de manejo, a su vez que

emplea menos tiempo, dinero y sobre todo reduce los riesgos para el medio ambiental (Pérez,

Hernández, y Barragan, 2017; Valadez, López, García, y Ruíz, 2017).

21

3.3.2.3.2 Semicontinuos

Extracción por aparato Soxhlet

Es el proceso de evaporar una sustancia, condensar los vapores y cogerlos al estado líquido,

el Soxhlet es el proceso más empleado de extracción continua pues tiene la ventaja de requerir

una cantidad pequeña del solvente. El material vegetal se coloca dentro de un dedal de papel

filtro grueso, que se carga en la cámara principal del extractor Soxhlet donde se hace pasar el

solvente que puede ser hexano, metanol o acetona, este ciclo puede repetirse muchas veces,

durante horas o días a una temperatura de 20º- 30º C, al término de éste periodo, observar si

hay un precipitado, en caso de tenerlo, filtrar inmediatamente, evaporar el filtrado y con el

mismo solvente recuperado seguir lavando el precipitado, evaporando nuevamente los filtrados

para recuperar y guardar el solvente mediante un rotaevaporador (Rivas, Oranday, y Verde,

2016).

Percolación

Es un procedimiento que se realiza a temperatura ambiente, la droga es colocada en una

columna y está en contacto permanente con el disolvente que gotea por la parte superior de la

de la misma, atraviesa toda la zona donde se encuentra la droga con los metabolitos de interés,

los va extrayendo y por la parte inferior, se recogen los líquidos extractivos que contienen los

principios activos. La percolación puede llegar a conseguir extracciones prácticamente

completas de las especies vegetales pero con un elevado consumo de disolvente (Molina,

2012).

22

2.3.2.4 Método adicional de extracción

Enfleurage o enflorado

El proceso emplea una mezcla de grasa en frio altamente purificada formada por una parte

de sebo, dos partes de manteca y 0,6 % de benzoína como conservador para ponerla en contacto

por tres a cinco días con flores delicadas en la cual sus aceites esenciales no pueden ser

extraídos por el método de destilación. A continuación el material vegetal es removido y

reemplazado por material fresco de manera continua hasta llegar a la saturación de la grasa y

una vez impregnado del principio activo en la grasa (le pomade), se lava dos veces con alcohol

libre de congéneres, se filtra y se destila a vacío hasta recuperar como mínimo un 80 % del

volumen de alcohol utilizado (Betto, et al.,2016).

2.3.2.5 Método de identificación y cuantificación de ácidos grasos

2.3.2.5.1 Cromatografía de Gases acoplado a espectrofotometría de masas (CG/EM)

La cromatografía es una técnica de separación con gran capacidad para la identificación y

cuantificación de analitos específicos en una matriz compleja, por ende, la GC/EM permite la

separación de compuestos volátiles dependiendo de sus puntos de ebullición, al llegar al

detector las moléculas del analito son bombardeadas por electrones, rompiendo enlaces y

formando fragmentos estables. En la actualidad, al ofrecer una alta sensibilidad de análisis ha

provocado que se considere como el método más idóneo para la identificación y cuantificación

de ácidos grasos una vez convertidos en ésteres metílicos y separarlos por columnas capilares

(López, Arrubla, y Guerrero, 2009).

23

CAPÍTULO III

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Método de investigación

El presente trabajo de titulación se realizó de acuerdo con los objetivos propuestos, mediante

la aplicación de una metodología exploratoria-experimental; efectuado en los diferentes

laboratorios de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil, a través de

la extrapolación de datos.

3.2. Población y muestra

La población estuvo comprendida por 2000 frutos entre la variedad dulce y amarga de

Nephelium lappaceum L. los mismos que fueron identificados y recolectados, en el mes de

febrero 2018, en la hacienda del Sr. Steven Roca en la Cuidad de Quevedo – Los Ríos –

Ecuador (latitud 0O16´O 7.2´´S y longitud 79 O11´41.4´´E) de los cuales a 278 se seleccionaron

para la obtención del material vegetal objeto de estudio (semillas) a las que posteriormente se

evaluaron las características farmacognósticas y químicas más relevantes.

3.3. Criterio de inclusión

Las muestras de semillas de Nephelium lappaceum L. clasificadas de acuerdo con su

respectiva variedad.

3.4. Criterio de exclusión

Las Muestras de semillas de Nephelium lappaceum L que no presentaron los parámetros de

maduración óptimas.

24

3.5. Materiales

3.5.1 Materia prima

• Semillas amargas del fruto Nephelium lappaceum

• Semillas dulces del fruto Nephelium lappaceum

3.5.2 Materiales de laboratorio

• Balanza gramera

• Balón de destilación de 1000 mL

• Bureta de 50 mL

• Cápsulas de porcelana

• Condensador de reflujo en espiral

• Crisol de porcelana

• Desecador

• Embudo Buchner

• Embudos de 60 mm

• Frascos de vidrio ámbar 1000 cc

• Frascos de vidrio ámbar 500 cc

• Espátula

• Fundas ziploc pequeñas

• Gradilla

• Kitasato de 1000 mL

• Matraz erlenmeyer

• Mortero

• Papel absorbente

• Papel aluminio

• Papel filtro libre de cenizas

• Picnómetro

• Pinza para mufla

• Pipetas de 1 mL

• Pipetas de 5 mL

• Probeta de 100 mL

• Tamiz n° 10

• Tubos de ensayo

• Vaso de precipitación (400 mL)

• Vaso de precipitación (50 mL)

• Vernier

• Vidrio reloj

3.5.3 Equipos

• Balanza analítica • Bomba al vacío

25

• Estufa • Hornilla

3.5.4 Reactivos

• Acetato de etilo

• Ácido Clorhídrico

• Ácido sulfúrico

• Agua destilada

• Alcohol neutralizado 0,5 N

• Baljet

• Borntrager

• Cloroformo

• Cloruro de sodio

• Cloruro férrico

• Dragendorff

• Etanol

• Éter di etílico

• Fehling

• fenolftaleína

• Hexano

• Hidroxamato férrico

• Hidróxido de potasio

• Hidróxido de sodio

• Liebermann-Burchard

• Mayer

• Shinoda

• Sudan III o IV

• Sulfato de sodio anhidro

• Wagner

3.6. Metodología

3.6.1 Estudio farmacognóstico

3.6.1.1 Operaciones preliminares del material vegetal

Recepción y limpieza.- Los sacos que contienen los frutos fueron colocados en un lugar

fresco, se separan los racimos de los frutos y a continuación se lavaron con agua purificada

para eliminar suciedad y otros residuos.

Clasificación y despulpamiento.- Seleccionar los frutos que se encuentran en buen estado y

eliminar aquellos que presentan signos de pudrición u hongos, se considera oportuno retirar la

26

cáscara cuidadosamente y de ahí se procede a la remoción de la pulpa de su semilla de manera

manual.

Secado.- Colocar las semillas en una plancha de papel aluminio a estufa con temperatura de

60°C por un periodo de 12 horas por 3 días. Transcurrido el tiempo necesario de secado se deja

enfriar y se transfiere la materia prima en fundas ziploc.

Percepción de la materia prima.- Se refiere a la evaluación de las características más

relevante de las semillas como son: Características físicas (forma, dimensión, dureza, peso),

color, olor y peculiaridades.

Molienda.- Triturar las semillas en mortero hasta llegar a polvo fino, pasarlo por un tamiz

de n° 10. Transferir el polvo en fundas ziploc.

Pesado.- Con la ayuda de una balanza gramera pesar las fundas ziploc que contienen el

polvo y anotar los valores.

Almacenamiento.- En lugar fresco y seco.

Todos los procedimientos referidos a continuación están basados en el Manual de prácticas

de laboratorio farmacognosia y productos naturales descrito por Miranda y Cuellar (2000)

3.6.1.2 Parámetros físico-químicos aplicados a las semillas

3.6.1.2.1 Ensayo de humedad residual

Pesar 2 g de muestra de semillas, previamente pulverizada en cápsula de porcelana

previamente tarada, trasladar a la estufa y desecar 105 °C por 3 horas hasta masa constante,

dejar enfriar a temperatura ambiente y pesar. Realizar el ensayo por triplicado y calcular la

humedad residual con la expresión:

27

Hr (%)= M1 (masa de muestra desecada)

M(masa de muestra ensayo)×100 (factor matemático)

3.6.1.2.2 Ensayo de cenizas totales

Pesar 2 g de muestra desecada, transferirla a un crisol previamente tarado e incinerar en una

mufla con temperatura ente 700-750 °C durante 2 horas. Una vez transcurrido el tiempo enfriar

el crisol en un desecador y pesar, repetir el proceso por triplicado hasta masa constante en

intervalos de 30 minutos. Calcular las cenizas totales con la siguiente fórmula:

Ct (%)=M2 (g de cenizas)

M1(g de muestra de ensayo)×100 (factor)

3.6.1.2.3 Ensayo de cenizas insolubles en ácido

A las cenizas obtenidas se le adiciona 20 gotas de HCl al 10 %, se tapa el crisol con vidrio

reloj y se calienta a baño María durante 10 minutos, transcurrido el tiempo lavar el vidrio reloj

con 5 mL de agua destilada caliente, filtrar a través de un papel filtro libre de cenizas. El filtrado

con el residuo se deseca a 105 °C, se transfiere al crisol inicial para incineración en la mufla a

750 °C por 3 horas, dejar enfriar en desecador al menos 20 minutos y pesar; para calcular el

porcentaje de cenizas insolubles en ácido se utiliza la siguiente expresión:

CIA=C1 (Cenizas insolubles en HCl)

M(Masa de la muestra de ensayo)×100 (factor)

3.6.1.2.4 Ensayo de sustancias solubles

Método de extracción en caliente con etanol, hexano y acetato de etilo.-

• Pesar en un matraz erlenmeyer aproximadamente 4 g de muestra. Agregar 100 mL del

disolvente especificado en el procedimiento, pesar, agitar y dejar reposar por 1 hora.

28

• Acople un condensador de reflujo al matraz y hervir suavemente por 1 hora. Enfriar y

pesar, a continuación ajustar al peso inicial con el disolvente; agitar y filtrar por succión a

través de un filtro seco.

• Transferir 25 mL de filtrado a una cápsula de porcelana, evaporar hasta sequedad en un

baño María. Secar en estufa a 105 °C durante 2 horas, enfriar en un desecador durante 30

minutos, luego pesar sin demora. El contenido de materia extraíble se calcula mediante la

expresión:

Ss=R (Residuo de la muestra)

M( masas de muestra ensayada)×100 (factor matemático)

3.6.2 Estudio químico cualitativo

3.6.2.1 Screening fitoquímico

Someter la muestra vegetal a un sistema de maceración sucesiva con éter etílico, etanol y

agua, respectivamente; para conseguir que cada metabolito sea extraído de manera apropiada

según la selectividad por el solvente, medir el volumen obtenido y calcular su concentración.

En cada caso para realizar los ensayos se procede de la siguiente manera:

Ensayo de Sudan.- En un tubo de ensayo colocar una alícuota del extracto del material

vegetal, agregar 1 mL de la solución de Sudán IV y llevar a baño de agua hirviendo hasta

evaporación del solvente, la presencia de una película o gotas de color rojo en la superficie del

tubo es indicativo de un ensayo positivo para compuestos grasos.

Ensayos de Dragendorff, Mayer, Wagner.- Son pruebas cualitativas que permiten identificar

la presencia de alcaloides, para ello, si el extracto es acuoso se deberá agregar para cada ensayo

una alícuota del extracto previamente acidificada con 1 a 2 gotas de HCl concentrado y llevar

29

a calentar, mientras, que si el extracto se realizó con solventes orgánicos se procederá a

evaporar y el residuo redisolverse con 1 mL de HCl al 1 % en agua, por último añadir 3 gotas

del reactivo específico; la presencia de opalescencia se considera (+), turbidez definida (++),

precipitado (+++).

Ensayo de Baljet.- Es ideal para la identificación de coumarinas. Cuando el extracto no es

alcohólico, debe evaporarse el solvente en baño María y redisolverse con 1 mL alcohol; y al

final se agrega 20 gotas del reactivo Baljet, la aparición de coloración o precipitado rojo se

considera positiva.

Ensayo de Borntrager.- Tomar una alícuota del extracto redisuelta en cloroformo adicionar

1 mL de solución de hidróxido de sodio al 5 %, agitar mezclando las fases y reposar. Si la fase

acuosa alcalina se torna rosada o roja el ensayo se considera positivo para quinonas.

Ensayo de Liebermann- Burchard.- Permite reconocer en un extracto la presencia de

triterpenos y/o esteroides por ambos tipos de productos poseer un núcleo del androstano,

generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. A una alícuota del extracto redisuelta

en cloroformo adicionar 1 mL de reactivo, y a continuación observar el cambio rápido de

coloración: Rosado azul (muy rápido); Verde intenso (visible aunque rápido); Verde oscuro

(final de la reacción).

Ensayo de resinas.- En un tubo de ensayo transferir 2 mL de la solución alcohólica y 10 mL

de agua destilada, la aparición de un precipitado sugiere la presencia de resinas.

Ensayo de fehling.- Confirma la presencia de azucares reductores con la aparición de un

precipitado rojo, por ello, al residuo de una alícuota del extracto alcohólico previamente

disuelto con 2 mL de agua destilada, adicionar 2 mL del reactivo de fehling y calentar en baño

30

de agua caliente aproximadamente por 10 minutos, sin embargo, si es un extracto acuoso

agregar directamente el reactivo.

Ensayo de espuma.- En un tubo de ensayo transferir 2 mL de extracto y diluir con 5 veces

su volumen en agua, mezclar fuertemente durante 10 minutos. Al presentar espuma en la

superficie del líquido de más de 2mm de altura y persistencia por más de 2 minutos

inmediatamente el ensayo se considera positivo para saponinas.

Ensayo de cloruro férrico.-Permite reconocer la presencia de compuestos fenólicos y/ o

taninos en un extracto vegetal, por ello, si el extracto es alcohólico a una alícuota de este se le

adicionan 3 gotas de cloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica. Si el extracto es

acuoso a una alícuota del extracto se añade acetato de sodio para neutralizar y 3 gotas de una

tricloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica, un ensayo positivo puede sugerir la

presencia de: Compuestos fenólicos (Rojo-vino); taninos de tipo pirocatecólicos (verde

intenso), taninos del tipo piro pirogalotánicos (azul).

Ensayo Shinoda.- Exclusivo para la identificación de flavonoides en un extracto de un

vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra el alcohol, se diluye con 1 mL de ácido

clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción

se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las bases y se deja reposar

hasta que se separen.

Si la alícuota del extracto se encuentra en agua se procede de igual forma, a partir de la

adición del ácido clorhídrico concentrado. El ensayo se considera positivo, con el alcohol

amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos todos los casos.

Ensayo de mucílagos.- Permite identificar estructuras de tipo polisacárido, mediante la

formación de coloide hidrófilo al enfriar entre 0-5 °C una alícuota del extracto acuoso

31

Ensayo de principios amargos y astringentes.- Saborear 1 gota del extracto acuoso y

diferenciar el sabor de cada uno de estos principios al paladar.

3.6.2.1.1 Método de extracción de grasas

Método de extracción por soxhlet.- Pesar 20 g de muestra en un dedal y encima una torunda

de algodón, llevar al extractor soxhlet y extraer con hexano a 69 °C, realizar la extracción en

forma continua unas 15 veces. Separar del soluto de interés del solvente en el rotaevaporador

a temperatura de 70 °C, por diferencia de peso calcular el rendimiento.

En independencia del rendimiento de la grasa que se obtenga realizar los siguientes ensayos

de caracterización:

Densidad relativa.- Primeramente pésese el picnómetro vacío, luego llénese con la porción

de ensayo, manténgalo a la temperatura de 25 °C durante 15 minutos y ajústese el líquido al

nivel empleado. Expresión de los resultados:

D25=P1-P

P2-P

Donde

• P1= Peso del picnómetro con la muestra (g)

• P2= Peso del picnómetro con el agua (g)

• P= Peso del picnómetro vacío (g)

Índice de refracción.- Ajustar el refractómetro empleando agua destilada, posteriormente,

colocar una gota de la muestra de ensayo sobre el prisma de medición, cerrar el termoprisma y

enfocar la luz por el medio del espejo, de modo tal que la misma incida sobre la apertura de

entrada del prisma de medición. Realizar tres lecturas que no difieran en más de 0.002 y

32

calcular el promedio de estas, si las determinaciones no se efectúan a la temperatura de

referencia se emplea la formula siguiente:

Nd25= Nd

t+0.00044 (t-25)

Donde:

Nd25= Índice de refracción a 25 °C

Ndt= Valor leído en la escala del aparato a la temperatura.

t= Valor de temperatura a que se realiza la medición (°C)

0.00044 = Factor de corrección por grado celcios

Índice de saponificación.- Transferir 1,5 g de muestra a un erlenmeyer de 250 mL

previamente tarado, agregar 25 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N y tapar con papel

aluminio; calentar en un baño de vapor durante 30 minutos, agitando frecuentemente, agregar

10 gotas de fenolftaleína y titular el hidróxido de potasio en exceso con ácido clorhídrico 0.5

N. Realizar una determinación con un blanco.

𝐼𝑠 =(V[mL de HCL consumidos del blanco] − V´[mL de HCL consumidos de la muestra]) ∗ 28,05[factor]

g[Peso de la muestra]

Índice de esterificación.- Pesar 1,5 g de muestra en un erlenmeyer de 250 mL previamente

tarado, añadir 20 mL de alcohol neutralizado y 10 gotas de fenolftaleína, a continuación titular

con hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N hasta neutralizar totalmente los ácidos grasos, libres.

Agregar 25 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N y proceder a calentar en un baño

María por 15 minutos, agitando por rotación frecuentemente, titular el hidróxido de potasio en

exceso con ácido clorhídrico 0.5 N. Realizar una determinación con un blanco

𝐼𝐸 =(V[mL de HCL consumidos del blanco] − V´[mL de HCL consumidos de la muestra]) ∗ 28,05[factor]

g[Peso de la muestra]

33

Saponificación.-Al residuo sólido (grasa) añadirle 3 veces el peso del volumen de hidróxido

de sodio alcohólico 1 N, se refluja durante 2 horas. Enfriar, agregar igual volumen de agua

destilada y extraer tres veces con 15 mL de éter di etílico. Las fracciones etéreas reunidas se

lavan con agua destilada hasta pH 7. El extracto etéreo se seca con sulfato de sodio anhidro y

se rótula como fracción insaponificable.

El extracto acuoso se ajusta hasta pH 3 con HCl concentrado y se extrae 3 veces con 15 mL

de éter di etílico. Las fracciones etéreas reunidas se lavan con agua destilada hasta pH 7, se

seca con sulfato de sodio anhidro y se rótula como fracción de compuestos saponificable.

3.6.2.2 Análisis de ácidos grasos por cromatografía de gases acoplado a espectrometría

de Masas (CG/EM)

Una vez liberado los ácidos grasos mediante el procedimiento de saponificación, se procede

a la formación de esteres metílicos añadiendo a la muestra una solución de hidróxido de potasio

en metanol al 10 %, el cual se deja en contacto con la grasa disuelta en hexano durante 1 hora

y posteriormente se toma una alícuota de extracto de hexano para su análisis. Una vez realizado

el tratamiento a la muestra se realiza la identificación y cuantificación por triplicado de la

fracción saponificable e insaponificable de ácidos grasos en el cromatógrafo de gases acoplado

al espectrofotómetro de masas Shidmasu (López, Arrubla, & Guerrero, 2009). Las condiciones

del análisis cromatográficas son:

Tabla II Condiciones cromatográficas

Equipo:

Cromatógrafo de gases Agilent Technologies

acoplado a un espectrómetro de masas (sistema

7890A GC y 5975C inerte XL MSD con detector

de triple eje).

Columna: Columna capilar HP-5, 5 % Phenyl Methyl Siloxan

325° C: 30 m x 320 µm x 0.25 µm.

Espectrómetro de masas Operado a 70eV en modo full scan desde 40-1000 μ

ma.

Temperatura del inyector 280° C

34

Temperatura de horno

Temperatura inicial del horno 70° C durante 2,0

minutos, aumentando a 300° C a 5° C/min, por 6

minutos.

Volumen de inyección 2 uL

Flujo en la columna 1 mL/min

Velocidad lineal del gas 37,2 cm/s

Gas portador Helio a 1 mL/min.

Temperatura de fuente de iones 230 °C

Temperatura del cuadropolo 150 °C

Tiempo de corrida 52 min.

Los compuestos se identificaron mediante la comparación de sus espectros de masas con

los de la biblioteca del equipo Wiley 9th con NIST 2011 MS Library.

(Farías y Olaya, 2018)

35

CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este capítulo se expondrán mediante tablas, los resultados de los diferentes análisis

experimentales que se realizaron a las semillas de las dos variedades del fruto Nephelium

lappaceum.

4.1 Estudio farmacognóstico

Las dos variedades del fruto fueron recolectadas de forma manual y posteriormente se

realizó la limpieza, clasificación y despulpamiento a la materia prima. Una vez obtenida la

muestra del material vegetal objeto de estudio se procedió a realizar el ensayo de percepción y

a su vez el secado y almacenamiento.

El análisis macromorfológico de las semillas de los frutos de las dos variedades evidenció

que ambas no poseen diferencias significativas con lo que respecta a su morfología, sin

embargo, cabe recalcar que las semillas de la variedad dulce son más ancha y menos largas que

la variedad amarga (Tabla III).

Tabla III Características macromorfológicas de las dos variedades de semillas del fruto

Nephelium lappaceum.

Características

Semillas

Dulce Amarga

Olor Sui generis Sui generis

Color Marrón claro Marrón claro

Forma Ovaladas Ovaladas

36

Dimensiones

Valor promedio

Largo (cm) S

22.496 3.165 22.678 6.294

Valor promedio

ancho (cm) S

12.884 1.157 12.290 5.750

Peculiaridades Aceitosa al tacto Aceitosa al tacto


El análisis de los parámetros físico-químicos (Tabla IV) manifestó que los valores

obtenidos a partir de los ensayos de humedad residual, cenizas totales y cenizas insolubles en

HCl, en ambas semillas se encuentran dentro de los rangos permitidos para la droga vegetal,

mientras que, el ensayo de sustancias solubles demostró una diferencia marcada en el

porcentaje extracción con hexano encontrándose 14.680 % en semillas dulces y 3.960 % en las

semillas amargas.

Tabla IV Parámetros físico-químicos de las semillas del fruto Nephelium lappaceum

Parámetros Porcentaje (%) S

Semillas dulces Semillas Amargas

Humedad residual 3.997 0.005 2.640 0.01

Cenizas totales 1.469 0,002 1.498 0.001

Cenizas insolubles en ácido

clorhídrico 1.240 0.001 1.34 0.001

Sustancias

solubles en:

Hexano 14.680 0.001 3.960 0.001

Etanol 3.414 0.001 3.528 0.001

Acetato de

etilo 8.660 0.001 7.513 0.001


37

4.2 Estudio químico cualitativo

El screening fitoquímico que se realizó en tres tipos de extractos diferentes permitió

corroborar la existencia de diferentes metabolitos con actividad terapéutica inmersos en las

semillas, la similitud entre ellas es notoria, sin embargo, se evidenció una diferencia marcada

en el ensayo de Cl3FE y Fehling en los extractos alcohólicos y acuosos de ambas semillas con

respecto a las reacciones cromáticas (Tabla V).

Tabla V Resultados obtenidos del screening fitoquímico realizado a los extractos de las

semillas dulce del fruto Nephelium lappaceum

EXTRACTO ETÉREO

Tipo de ensayo Metabolito ensayado Semillas dulces Semillas Amargas

Sudan Compuestos grasos Positivo Positivo

Dragendorff Alcaloides +++ +++

Wagner Alcaloides +++ +++

Baljet Lactonas y coumarinas Positivo (++) ++

Liebermann-

Burchard Triterpenos y/o esteroides

Rosado -muy

rápido Rosado -muy rápido

EXTRACTO ALCOHÓLICO



Baljet Lactonas y coumarinas NA NA

Liebermann-

Burchard Triterpenos y/o esteroides

Rosado -muy

rápido Rosado -muy rápido

Resinas Resinas Positivo Positivo

Fehling Azúcares reductores +++ ++

Espuma Saponinas +++ +++

Cl3Fe Fenoles y taninos Verde intenso Verde intenso

Borntrager Quinonas Negativo Negativo

Shinoda Flavonoides Positivo Positivo

EXTRACTO ACUOSO



Fehling Azúcares reductores +++ ++

Espuma Saponinas +++ +++

Cl3Fe Fenoles y taninos Rojo-vino Rojo-vino

Shinoda Flavonoides Positivo Positivo

Mucilagos Estructuras polisacáridos Positivo Positivo

38

Principios

amargos Compuestos astringentes ++ +++


4.3 Extracción y análisis de compuestos grasos

La extracción de compuestos grasos se realizó por el método Soxhlet considerando la

recuperación de hexano (Tabla VI), el proceso permitió confirmar un alto rendimiento de grasa

presentes en las semillas de los frutos del Nephelium lappaceum, de este ensayo se puede decir

que las semillas amargas poseen un mayor porcentaje de compuestos grasos que las semillas

dulces, y que todos los parámetros evaluados como densidad, índice de refracción, índice de

saponificación e índice de esterificación presentan valores más elevado para estas semillas.

Tabla VI Parámetros fisicoquímicos del extracto graso de las dos variedades del fruto

Nephelium lappaceum

Parámetros Porcentaje (%) S

Semillas dulces Semillas Amargas

Rendimiento 57.350 0.080 68.888 0.030

Densidad 0.746 0.001 0.815 0.001

Índice de refracción 1.436 0.001 1.459 0.001

Índice de Saponificación 191.28 0.040 215.05 0.010

Índice de esterificación 146.39 0.050 185.37 0.020


Como se observa existen diferencias en los perfiles cromatográficos de las fracciones de

compuestos insaponificables de las semillas de las variedades amargas y dulces (Figura 8). El

equipo registró un total de 156 picos cromatográficos para el extracto de las semillas amargas

y 185 para el de las semillas dulces. En la (Tabla VII) se describen los compuestos

identificados para estas fracciones.

39


insaponificables de los frutos de Nephelium lappaceum variedades amargas y dulces.


40

Tabla VII Compuestos identificados en la fracción insaponificable de las semillas de los

frutos amargos y dulces de Nephelium lappaceum.

Semillas frutos amargos Semillas frutos dulces

Tr min Compuesto %

abund

Tr

min Compuesto

%

abund

24.83 Octadecano 0.21

25.50 Nonadecano 0.21

27.36 Caprilato de metilo 0.63

28.19 Trans 11-hexadecenoato

de etilo 5.94

28.32

9-hexadecenoato de etilo

(Ácido vaccénico etil

éster)

8.70

28,60 Palmitato de metilo 46.78

30.53

9,12 etadecadienoato de

metilo. (linoleato de

metilo)

0.84

30.67 Estearato de metilo 0.63

31,53 Ácido -9- octadecenoico

(Ácido vaccénico) 6.62

32.84 Ácido Cis-13-

octadecenoico 12.31

34,19 Tricosano 2.76

34.22 Nonadecano 2.76

34.33 Docosano 2.97

34.60 14-β-pregnano 2.33

34.86 Z-12-pentacoseno 3.60

34.96 n-tricosano 2.97

36.88 Pentadecano 6.58

37,42 Pentacosano 31.66

39,26 14-β-pregnano 6.70 37.08 14-β-pregnano isómero 9.34

37.49 Heptadecano 13.37

37.79 3-pentacoseno 6.15

38.19 n-pentacosano 11.46

38.65 n-hexacosano 8.91

44,12 Eicosano 5.53


De los 156 picos registrados en el cromatograma de los frutos amargos, sólo pudieron ser

identificados 6 y de los 185 registrados en los frutos dulces se pudieron identificar 19. Sólo se

encontró una coincidencia entre los compuestos insaponificables identificados en las semillas

41

de ambos frutos, el 14-β-pregnano, que presentó una abundancia de 6.7 % en las semillas

amargas y un 9.34 % en las dulces.

Las fracciones estuvieron fundamentalmente constituidas por ésteres de ácidos grasos e

hidrocarburos. Los componentes mayoritarios de las semillas de los frutos amargos fueron el

palmitato de metilo (46.78 %) y el pentacosano (31.66 %), el resto de los componentes no

alcanzaron abundancias superiores al 10%. Para las semillas de los frutos dulces los

componentes mayoritarios fueron el heptadecano (13.37 %), el ácido Cis-13-octadecenoico

(12.31 %) y el n-pentacosano (11.46 %); este último aunque se encontró en los frutos verdes,

se registró con tiempo de retención diferente.

Para la fracción de compuestos insaponificables de los frutos, no se registra ninguna

información en la bibliografía consultada, por lo que los resultados se informan por primera

vez.

Para la fracción de compuestos saponificables los cromatogramas gaseosos analíticos se

presentan en la Figura 9. Para estos compuestos se observa una mayor coincidencia, en los

cromatogramas, con diferencias en las intensidades de los picos cromatográficos. Para la

fracción de compuestos saponificables de las semillas de los frutos amargos, el equipo registró

un total de 11 picos cromatográficos, mientras que para la de los dulces registró 9. En la Tabla

VIII se relacionan los compuestos identificados para las fracciones de ambas semillas.

42


saponificables de los frutos de N. lappaceum variedades amargas y dulces.


43

Tabla VIII Compuestos identificados en la fracción saponificable de las semillas de los

frutos dulces y amargos de N. lappaceum

Semillas frutos amargos Semillas frutos dulces

Tr

min Compuesto

%

abund Tr min Compuesto

%

abund

18,97 Ácido hexadecanoico

(Palmítico) 4.47 18.97

Ácido hexadecanoico

(Palmítico) 4.27

25,78

Ácido 9,12

octadienoico

(Linoleico)

1.56 25.78

Ácido 9,12

octadienoico

(Linoleico)

1.47

26,15

Ácido 9-

octadecenoico

(Oleico)

38.4 25.90 Ácido 9-

octadecenoico (Oleico 42.25

26.34 Ácido 10

octadecenoico 2.51

27,33

Ácido

octadecanoico

(Esteárico)

5.89 27.33

Ácido

octadecanoico

(Esteárico)

6.38

34,40 Ácido cis -11-

eicosenoico 4.93 34.41

Ácido cis -11-

eicosenoico 4.80

34,67 Ácido -9-

eicosenoico 0.64

34.68 Ácido cis -13-

eicosenoico 0.91

35,62 Ácido eicosanoico

(Araquídico) 31.96 35.95

Ácido eicosanoico

(Araquídico) 35.85

40,95 Ácido docosanoico

(Behénico) 12.15 43.79

Ácido docosanoico

(Behénico) 1.57


En la fracción saponificable de los frutos amargos se pudieron identificar 8 ácidos grasos de

los cuales uno de ellos no se pudo identificar en los frutos maduros. En éstos últimos se

identificaron 9 compuestos, pero dos de ellos no se identificaron en la fracción de las semillas

de los frutos amargos.

El componente mayoritario en ambos frutos fue el ácido oleico (ácido-9-octadecenoico),

con una abundancia de 38.4 % para las semillas de los frutos amargos y un 42.25 % para los

dulces, le continuó en abundancia para ambos frutos el Ácido eicosanoico (Araquídico), con

44

un 31.96 % para los frutos amargos y 35.85 % para los dulces. En el caso particular de la

fracción saponificable de las semillas de los frutos amargos se encontró que el ácido

docosanoico (Behénico) presentaba un 12.15 % de abundancia, mientras que en los dulces sólo

alcanzó un 1.57 %.

45

DISCUSIÓN

Do Sacramento y Aparecida (2014) informaron que las semillas de Nephelium lappaceum

se destaca por poseer forma ovalada, una coloración marron clara, con una longitud entre 20-

23 cm y un ancho de 10 a 12 cm, dichas caracteristicas no difieren en relación a los resultados

obtenidos en el análisis macromorfológicas efectuados a las muestra de nuestro estudio.

Se considera que la humedad residual garantiza la conservación adecuada de las semillas,

cabe destacar que las semillas dulces poseen mayor porcentaje de humedad debido,

presumiblemente, a la mayor cantidad de azucares presente en ellas en comparación con las

semillas amargas.

Las cenizas totales reflejan la presencia de minerales presentes en la planta, los cuales son

absorbidos de los suelos; diversas Farmacopeas señalan porcentajes de cenizas hasta un 5 %

(WHO, 2011), en dependencia del órgano vegetal estudiado. Los valores de cenizas totales

están dentro de los rangos permitidos para droga vegetal y en ambos tipos de semillas no

difieren significativamente por lo que pueden ser consideradas prácticamente iguales. Para las

cenizas insolubles, que fundamentalmente reflejan la presencia de metales pesados, las

Farmacopeas plantean valores no mayores de un 2 %, para la especie estudiada resulta de gran

relevancia el porcentaje de cenizas insoluble en ácido clorhídrico debido que a pesar de estar

dentro de los valores permisibles, son muy próximas a los valores obtenidos para las cenizas

totales. Sin embargo, es importante destacar los resultados obtenidos por Wall (2006) quien

señala que los frutos de la especie son ricos en sales minerales y reportan la presencia de

macroelementos como fósforo, potasio, calcio, magnesio y sodio y dentro de los

microelementos señala la presencia de hierro, manganeso, zinc y cobre; lógicamente la

concentración y presencia en de éstos está en función del tipo de suelo donde crece la especie.

46

La determinación de las sustancias solubles es uno de los parámetros de mayor interés al

momento de seleccionar adecuadamente disolventes en el proceso de extracción. Estas fueron

evaluadas en tres tipos de solventes (hexano, etanol y acetato de etilo), de acuerdo con el

método en caliente recomendado por la WHO (2011), lo cual demostró que el hexano es el

solvente más adecuado para la extracción de sustancias solubles en semillas dulces, por otra

parte el acetato de etilo y el etanol puede emplearse para las dos variedades de semillas

considerando que el segundo presenta un menor rendimiento de extracción de este tipo de

sustancias. Cabe destacar las diferencias encontradas en el porcentaje de sustancias solubles en

hexano entre las semillas dulces y amargas, pueden ser indicativo de una diferencia marcada

en la concentración de sustancias de baja polaridad.

Es considerado de interés el estudio de una droga, conocer de forma preliminar su

composición química cualitativa, la cual se logra mediante métodos de tamizaje fitoquímico.

Cualitativamente los metabolitos que se identificaron de acuerdo a los ensayos realizados

demostraron que ambas variedades de semillas son ricas en metabolitos secundarios que poseen

actividad farmacológica y que las similitudes entre ellas son elevadas, sin embargo, el tamizaje

fitoquímico evidenció una diferencia marcada en cuanto a los ensayos de Cl3Fe y Fehling en

los extractos alcohólico y acuoso de los dos tipos de semillas debido que en los extractos

alcohólicos es de fácil identificación los taninos de tipo pirocatecólicos debido a su coloración

verde intensa en comparación con los extractos acuosos que desarrollaron una coloración rojo-

vino indicativo de compuestos fenólicos en general y a su vez que las semillas amargas poseen

menor cantidad de azúcares reductores frente a las semillas dulces.

La presencia de ácidos grasos es común para las semillas de las especies y su composición

ha sido informada. Rohman (2017) informo primera vez la presencia de diferentes compuestos

fenólicos tales como: geraniina, corilagina y ácido elágico; la presencia de estos y otros

47

compuestos fenólicos, fue ratificada por Perera, et al. (2012), mientras que Maran, et al. (2017)

llegaron a separar antocianidinas, flavonoides y compuestos fenólicos a partir por técnicas de

ultrasonido. Los triterpenoides por lo general, forman parte de la fracción insaponificable de

las grasas, aunque no se han encontrado reportes de su presencia.

Solís et al. (2010) informaron para las semillas de rambután (especie no especificada),

valores de índice de refracción de 1,468 ± 0,001 similar al obtenido para las semillas amargas;

el índice de saponificación informado fue de 1,86, en este caso similar al de las semillas dulces.

Estos autores también obtuvieron valores tales como índice de yodo (47.0); ácidos grasos libres

(1.99) e índice de acidez de 3.95, estos valores no fueron determinados en el presente trabajo.

Debido a la complejidad estructural que posee los ácidos grasos, además, de la dificultad

para la identificación y cuantificación de estos compuestos a partir de métodos tradicionales se

hizo indispensable recurrir a la técnica de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de

masas (GC/EM) para establecer el perfil lipídico de los extractos de las semillas dulces y

amargas de manera más simple y precisa; por ello, a la porción grasa obtenida por método

soxhlet se le realizo un tratamiento previo de saponificación para obtener extractos

concentrados (fracción saponificable e insaponificable) con los analitos de interés.

Una vez obtenidas las dos fracciones se prosiguió a realizar su respectivo análisis en el

cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas.

Solís et al. (2010), señalaron que en el aceite de las semillas de rambután los principales

ácidos grasos eran 40.3% de ácido oleico, 34.5 % de ácido araquídico, 6.1 % de ácido

palmítico; 7.1% de ácido esteárico y 2.9% de ácido behénico.

Según Mariod (2017) el aceite estaba constituido principalmente por palmítico (7.39 –

10.33 %), esteárico (12.21 % -16.58 %), araquídico (12.34 % -16.22 %) y behénico (6.53 % -

48

8.91 %) como ácidos grasos saturados, oleico (50.17 % -52.18 %) como ácido graso mono

insaturado y linolénico (2.02 % -3.04 %) como ácido graso poliinsaturado. Por su parte

Mahisanunt et al. (2017), señalaron que el mayor ácido graso de la fracción era el ácido

araquírico con más de un 90 %.

A pesar de que existen diferentes variedades de rambután, en ninguno de los trabajos

científicos consultados se especifica la variedad que ha sido objeto de estudio. No obstante, es

importante señalar que los ácidos grasos mencionados en la literatura se encuentran presentes

y sus variaciones cuantitativas pueden deberse a las condiciones ecológicas-geográficas donde

se desarrolla la especie.

49

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1 Conclusiones

De acuerdo con los resultados obtenidos se puede concluir que:

• El análisis macromorfológico evidenció que ambas semillas no poseían diferencias

significativas con lo que respecta a su morfología, en los parámetros físico-químicos

sólo se encontraron diferencias en la humedad residual que fue superior para las

semillas de los frutos dulces y las sustancias solubles en hexano que fueron también

significativamente superiores para las semillas de los frutos dulces.

• En el screening fitoquímico permitió demostrar a través de reacciones cromáticas la

existencia del mismo tipo de metabolitos para ambas variedades, no obstante, se pudo

visualizar una discreta diferencia al observar un mayor precipitado en la muestra de

semillas dulce respecto a la muestra de semillas amargas durante el ensayo de Fehling.

• Las semillas de la variedad amarga rindieron un 68.88 % de grasas, mientras que la

variedad dulce alcanzó un 57.35 %. Se observaron también diferencias en las

propiedades fisicoquímicas de las grasas.

• En el análisis por el sistema acoplado cromatografía gaseosa-espectrometría de masas,

se observaron diferencias marcadas entre las fracciones de compuestos

insaponificables, para las cuales no existe información en la literatura.

• Para la fracción de ácidos grasos se encontró mayor similitud cualitativa, estando las

diferencias centradas en lo cuantitativo. Los ácidos grasos identificados coinciden con

lo informado en la literatura.

50

5.2 Recomendaciones

Se recomienda:

• Profundizar en el estudio de las cenizas para establecer la composición en metales de

las variedades estudiadas.

• Evaluar la actividad terapéutica que posee las semillas del rambután a partir de estudios

de fraccionamiento de los constituyentes fitoquímicos de mayor relevancia y así

contribuir con el posible desarrollo de nuevos medicamentos de alta efectividad y

seguridad.

• Profundizar en el análisis de azúcares reductores principalmente en la variedad dulce

del fruto.

• Realizar la validación de un diseño experimental y estadístico enfocado en la

estandarización de los parámetros de calidad de los ácidos grasos para establecer de esa

forma los límites particulares en la especie.

51

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Arias, M., & Calvo, I. (2014). El cultivo del Ramnután o mamon chino. Ministerio de

agricultura y ganadería, 10(1), 13-14.

Arías, M., Velásquez, H., Mateus, D., Chaparro, H., & Orduz, J. (Julio-Diciembre de 2016). El

rambután (Nephelium lappaceum), frutal asiático con potencial para Colombia: avances

de la investigación en el piedemonte del Meta. Revista colombiana de ciencas

hortícolas, 10(2), 11.

Azuola, R., & Vargas, P. (2007). Extracción de sustancia asistida por ultrasonido (EUA).

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61

ANEXOS

Limpieza, clasificación y despulpamiento de los frutos del achotillo (Nephelium

lappaceum L.) en el Laboratorio de Tecnología Farmacéutica

Anexo 1. Lavado de frutos amargos y dulces del achotillo

Anexo 2. Separación de la cascara de las dos variedades del achotillo

Anexo 3. Despulpamiento del fruto amargo y dulce del achotillo.

62

Secado, percepción, molienda y pesado de las semillas del achotillo (Nephelium lappaceum

L.) en el Laboratorio de Tecnología Farmacéutica

Anexo 4. Secado de las semillas amargas y dulces del achotillo

Anexo 5. Percepción de las semillas amargas y dulces del achotillo.

Anexo 6. Pesado de las semillas de amargas y dulces del achotillo

63

Anexo 7. Proceso de molienda de la semilla amarga del achotillo

Anexo 8. Proceso de molienda de semillas dulces del achotillo.

Anexo 9. Semillas molidas y etiquetadas para almacenamiento

64

Métodos físico-químicos de las semillas del achotillo (Nephelium lappaceum L.) en el

Laboratorio de Alimentos

Ensayo de humedad residual

Anexo 10. Peso de las muestras para determinación de humedad

Anexo 11. Muestras de semillas amargas y dulces en la estufa.

Anexo 12. Muestras pesadas para cenizas totales.

65

Ensayo de cenizas insolubles

Anexo 15. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico

Anexo 16. Pesado de muestras con disolventes para sustancias insolubles

Anexo 13. Muestras de semillas en

la mufla.

Anexo 14. Cenizas de las

muestras en desecador.

66

Anexo 17. Reflujo de la muestra/Residuo de sustancias solubles

Screening de las dos variedades de semillas del achotillo (Nephelium lappaceum L.) en el

Laboratorio De investigación de Productos Naturales

Extracto de éter etílico semillas del achotillo

Anexo 18. Screening del extracto

etéreo de las semillas amargas achotillo

Anexo 19. Screening del extracto de

éter etílico de las semillas dulce de

achotillo

Anexo 20. Prueba de

Baljet del extracto

etéreo semillas dulces y

amargas.

Anexo 21. Prueba de

Dragendorff del extracto

etéreo de semillas dulces

y amargas.

Anexo 22. Prueba de

Wagner de extracto

etéreo de semillas dulces

y amargas

67

Extracto alcohólico de las semillas del achotillo

Anexo 23. .Prueba de Sudan

del extracto etéreo de semillas

dulces y amargas.

Anexo 24. Prueba de

Lieberman del extracto etéreo

de semillas dulces y amargas.

Anexo 25. Prueba de

Resinas del extracto

alcohólico de semillas

dulces y amargas.

Anexo 26. Prueba de

Cl3Fe del extracto


dulces y amargas.

Anexo 27. Prueba de

Fehling del extracto


dulces y amargas.

Anexo 28. Prueba de

Baljet del extracto


dulces y amargas

Anexo 29. Prueba de

Borntrager del extracto


dulces y amargas

Anexo 30. Prueba de

Buchard del extracto


dulces y amargas.

68

Extracto acuoso de las semillas del achotillo

Anexo 35. Screening del extracto de acuoso, de las semillas amargas del achotillo

(Nephelium lappaceum L)

Anexo 31. Prueba de

Dragendorff del extracto


dulces y amargas

Anexo 32. Prueba de

Wagner del extracto


dulces y amargas

Anexo 33. Prueba de

saponinas del extracto


dulces y amargas.

Anexo 34. Prueba de

Shinoda del extracto alcohólico

de semillas dulces y amargas.

69

Anexo 36. Screening del extracto de acuoso de las semillas dulces del achotillo

(Nephelium lappaceum L).

Anexo 37. Prueba de

Dragendorff del

extracto acuoso de

semillas dulces y

amargas

Anexo 38. Prueba de

Fehling del extracto

acuoso de semillas

dulces y amargas.

Anexo 39. Prueba de

Espuma del extracto

acuoso de semillas

dulces y amargas.

Anexo 40. Prueba de

Shinoda del extracto

acuoso de semillas

dulces y amargas.

Anexo 41. Prueba de

Cl3Fe del extracto

acuoso de semillas

dulces y amargas

Anexo 42. Prueba de

Wagner del extracto

acuoso de semillas

dulces y amargas.

70

Extracción y análisis de grasas de las semillas del achotillo (Nephelium lappaceum l.)

Anexo 43. Evaporación del solvente

de extracción por medio de rota

evaporador.

Anexo 44. Extracción de ácidos

grasos con hexano por el método de

soxhlet.

Anexo 45. Determinación de índice

de densidad relativa de los acido grasos

de las semillas dulce y amarga.


de saponificación de los acido grasos de

las semillas dulce y amarga.

Anexo 47. Determinación de índice de

saponificación de los acido grasos de las

semillas dulce y amarga.


de esterificación de los acido grasos de

las semillas dulce y amarga.

71

Análisis cromatográfico de ácidos grasos presentes en las semillas del achotillo

(Nephelium lappaceum l.)

Anexo 49. Saponificación de

ácidos grasos de las semillas dulce

y amarga

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