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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS PROYECTO DE TITULACIÓN PREVIO, AL TÍTULO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO MODALIDAD: Semestral TÍTULO: Estudio farmacognóstico, fitoquímico, y microbiológico del Phlebodium pseudoaureum (calaguala). AUTORES: BURGOS MATUTE OSCAR ANDRES COELLO MUÑOZ MEIBY TANIA TUTOR: Mg MARÍA AUXILIADORA ALARCON PERASSO PERIODO ACADÉMICO: AÑO 2018-2019 GUAYAQUIL-ECUADOR
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
PROYECTO DE TITULACIÓN PREVIO, AL TÍTULO
DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO
MODALIDAD: Semestral
TÍTULO:
Estudio farmacognóstico, fitoquímico, y microbiológico del
Phlebodium pseudoaureum (calaguala).
AUTORES:
BURGOS MATUTE OSCAR ANDRES
COELLO MUÑOZ MEIBY TANIA
TUTOR: Mg MARÍA AUXILIADORA ALARCON PERASSO
PERIODO ACADÉMICO:
AÑO 2018-2019
GUAYAQUIL-ECUADOR
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FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO: ESTUDIO FITOQUÍMICO, FARMACOGNÓSTICO Y MICROBIOLÓGICO DEL PHLEBODIUM PSEUDOAUREUM (CALAGUALA)
AUTOR(ES) (apellidos/nombres):
BURGOS MATUTE OSCAR ANDRES COELLO MUÑOZ MEIBY TANIA
REVISOR(ES)/TUTOR(ES) (apellidos/nombres):
Q.F. MARÍA AUXILIADORA ALARCÓN PERASSO, Mg
INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
UNIDAD/FACULTAD: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:
GRADO OBTENIDO: TERCER NIVEL – QUÍMICO FARMACÉUTICO
FECHA DE PUBLICACIÓN: 10 DE SEPTIEMBRE DEL 2018 No. DE PÁGINAS: 90
ÁREAS TEMÁTICAS: FITOQUIMICA, FARMACOGNÓSIA Y MICROBIOLOGÍA
PALABRAS CLAVES/ KEYWORDS:
metabolitos secundarios, rizoma, Phelobodium pseudoaureum, Escherichia coli, perfil lipídico, índice de acidez, índice de yodo, índice de saponificación, determinación de metales.
RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras): El presente estudio se realizó para determinar los metabolitos secundarios presentes en el rizoma del Phlebodium pseudoaureum (conocida vulgarmente como calaguala) mediante un screening fotoquímico y al mismo tiempo analizar su efecto farmacognóstico. Se estudió la actividad antimicrobiana en concentraciones de 40% de un extracto metanólico del rizoma del Phelobodium pseudoaureum. Se utilizó una cepa de E. coli ATCCC 25922, se preparó la solución turbia en caldo cerebro-corazón con ayuda de los patrones de Mc Farland y que posteriormente se sembró en agar Muller Hinton mediante el método de difusión en agar. Los resultados obtenidos indican que a la concentración de 40% se aprecia un halo de inhibición frente a este metabolito. También se realizaron otros análisis, tales como HPLC con extracto hexánico obtenido por el método de Soxhlet, índices de acidez, índice de yodo e índice de saponificación, cuyos resultados sugieren la presencia de ácidos grasos de alto peso molecular. Se realizó la determinación de metales presentes en el rizoma de la calaguala obteniendo valores poco significativos de sodio, calcio, fósforo, magnesio y zinc. El presente trabajo tuvo como objetivo general obtener información fitoquímica, farmacognóstica y microbiológica del rizoma de la calaguala. La importancia de este proyecto radica en la necesidad de estudiar especies de plantas poco conocidas con el fin de ampliar los conocimientos existentes y brindarle bases científicas a la medicina tradicional u homeopática.
ADJUNTO PDF: X SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES:
Teléfono: 0967975514 0982443446
E-mail: [email protected] [email protected]
CONTACTO CON LA INSTITUCIÓN:
Nombre: SEDE CIENCIAS QUÍMICAS
Teléfono: 052970459
E-mail: www.fcq.ug.edu.ec
Agradecimiento
Agradezco a Jesús y Maria por tanto amor y por haber estado conmigo desde siempre. Por
haberme dado a la familia y amigos que tengo.
A mis padres, hermanos y tíos, por todo el esfuerzo y apoyo durante toda mi vida.
A mis amigos, por todo lo vivido en estos 5 años de carrera.
A Q.F. María Auxiliadora Alarcón y Q.F. Osvaldo Pesantes, por su ayuda y enseñanzas para
culminar éste proyecto
Dedicatoria
A Dios, por amarme desde y hasta la eternidad, porque gracias a Él he podido culminar una de
las metas que Él mismo puso en mi corazón.
A mi querida madre, la Virgen María, por ser la mejor maestra. “En el cielo quedaremos
gratamente sorprendidos al ver todo lo que María Auxiliadora ha hecho por nosotros” San Juan
Bosco.
A mi familia por siempre inspirarme deseos de superación. De manera especial agradezco a
mi mamá por todos los sacrificios que ha hecho por mí, por su apoyo incondicional y sobre
todo por su amor y por su compañía en mis días de estudio.
A mis amigos, por la amistad tan genuina que me brindaron desde el inicio de mis estudios
universitarios; a la mejor amiga que he podido tener en la vida, Katherine Lindao por siempre
alentarme en los momentos difíciles y estar siempre en los felices, a Jesús Matute y Miguel
Palma, por ser amigos incondicionales y excepcionales y sobre todo a mi amigo José Cantos,
por ser mi refugio, mi consejero y sin duda alguna, la mejor persona que pude haber conocido
en estos 5 años.
A mi gran amigo y compañero Oscar Burgos, por todo su apoyo y por haber dado todo de sí
mismo para este trabajo de titulación.
ÍNDICE GENERAL
Índice de tablas
Índice de cuadros
Índice de fotografías
Índice de anexos
Resumen .................................................................................................................. I
Abstract ................................................................................................................... II
Introducción ........................................................................................................... III
Capítulo I ................................................................................................................ 1
1.1. Planteamiento del problema ............................................................................ 1
1.2. Formulación del problema ...................................................................... 1
1.3. Objetivo general .................................................................................... 2
1.4. Objetivo especifico ........................................................................................... 2
1.5. Justificación ...................................................................................................... 3
1.6. Delimitación ......................................................................................... 4
1.7. Hipótesis .............................................................................................. 4
1.8. Operacionalización de variables ....................................................................... 5
Capítulo II .............................................................................................................. 6
2.1. Antecedentes de la investigación .................................................................... 6
2.2. Marco teórico ........................................................................................... 8
2.2.1. Phlebodium pseudoaureum ............................................................. 8
2.2.1.1. Historia ....................................................................... 8
2.2.1.2. Clasificacion taxonómica ............................................... 9
2.2.1.3. Descripción botánica .....................................................10
2.2.1.4. Distribución geográfica ..................................................10
2.2.1.5. Usos medicinales atribuidos ............................................ 11
2.2.1.6. Formas de uso ................................................................. 11
2.2.1.7. Composición química ...................................................... 12
2.2.1.8. Actividad biológica de los componentes ........................12
2.2.1.9. Actividad inmunológica .................................................. 14
2.2.1.10. Actividad dermatológica ............................................... 14
2.2.1.11. Actividad antivírica e inmuno supresora .......................... 14
2.2.1.12. Condiciones climáticas para la propagación ..................... 14
CAPÍTULO III ..................................................................................................... 16
3.1. Lugar de investigación.................................................................................16
3.2. Periodo de la investigación ................................................................. 16
3.3. Tipo de investigación .................................................................................17
3.4. Diseño de la investigación ..........................................................................17
3.5. Población y muestra ...................................................................................18
3.6. Metodologia ...............................................................................................18
3.6.1. Determinación de humedad ...................................................................... 19
3.6.2. Determinación de cenizas totales ........................................................... 19
3.6.3. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico .................. 20
3.6.4. Determinación de cenizas solubles en agua ........................................... 21
3.6.5. Preparación para la obtención del extracto fluido ..............................22
3.6.5.1. Método por extracto etéreo ....................................................... 22
3.6.5.2. Método por extracto acuoso ....................................................... 22
3.6.5.3. Método por extracto etanólico ................................................... 22
3.6.6. Descripción organoléptica ...............................................................22
3.6.7. Determinación del pH .....................................................................23
3.6.8. Determinación de la densidad relativa ........................................... 233
3.6.9. Determinación del índice de refracción ...........................................24
3.6.10. Determinación de sólidos totales ....................................................24
3.6.11. Pruebas fitoquimicas preliminares ..................................................25
3.6.11.1. Ensayo de Fehling. ................................................................ 25
3.6.11.2. Ensayo de espuma ............................................................... 255
3.6.11.3. Ensayo del cloruro férrico. ................................................... 25
3.6.11.4. Ensayo de cumarinas ............................................................ 26
3.6.11.5. Ensayo de Sudán III ............................................................. 26
3.6.11.6. Ensayo de Nihidrina ............................................................. 27
3.6.11.7. Ensayo de Bornträger ........................................................... 27
3.6.11.8. Ensayo de Baljet ..................................................................... 27
3.6.11.9. Ensayo de Liebermann – Burchard ..................................... 28
3.6.11.10. Ensayo de antocianidinas .................................................... 28
3.6.11.11. Ensayo de Shinoda. .............................................................. 28
3.6.11.12. Ensayo de resinas. .......................................................................... 29
3.6.12. Caracterización por reacciones de precipitación alcaloides ..............29
3.6.13. Actividad antimicrobiana .................................................................. 30
CAPÍTULO IV ..................................................................................................... 32
4.1. Resultados ....................................................................................................... 32
4.1.1. Determinación de humedad....................................................................... 32
4.1.2. Determinación de cenizas totales ........................................................... 33
4.1.3. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico .................. 34
4.1.4. Determinación de cenizas solubles en agua ........................................... 35
4.1.5. Descripción organoléptica ....................................................................... 36
4.1.6. Parámetros físicos .............................................................................37
4.1.7. Reacciones de caracterización, tamizaje fitoquímico. ........................... 38
4.1.8. Análisis microbiológico ............................................................................. 41
4.1.9. Análisis de metales .................................................................................... 43
4.1.10. Analisis de índice de acidez, saponificación, y de yodo .................44
4.1.11. . Analisis de las vitaminas liposolubles A Y D3 por HPLC ............. 45
CAPÍTULO V ...................................................................................................... 49
5.1. Discusión....................................................................................................49
5.2. Conclusiones ...............................................................................................50
Referencias Bibliográficas ..................................................................................51
Glosario ..............................................................................................................63
ÍNDICE DE FIGURAS
Figuras 1. Cromatograma del Estándar de vitamina A ……………………………… 45
Figuras 2. Cromatograma de la vitamina A, del extracto de hexano de calagua 45
Figuras 3. Resultado del Cromatograma de la Vitamina A ................................. 46
Figuras 4. Cromatograma del Estándar de vitamina D3 ………………………. 47
Figuras 5. . Cromatograma de la vitamina D3, del extracto de hexano de calagua 47
Figuras 6. Resultado del Cromatograma de la Vitamina D3 ............................... 48
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Operacionalización de variables …………………………………….…………5
Cuadro 2. Clasificacion taxonómica del Phlebodium pseudoaureum ……………………9
Cuadro 3. Resultados de la determinación de humedad en muestra pulveriada de calaguala
………………………………………………………………………………………………32
Cuadro 4. Resultados de la determinación de cenizas totales en muestra pulverizada de
calaguala…………………………………………………………………………………….33
Cuadro 5. Resultados de la determinación de determinación de cenizas insolubles en ácido
clorhídrico en muestra pulverizada de calaguala…………………………………….……..34
Cuadro 6. Resultados de la determinación de determinación de cenizas solubles en agua en
muestra pulverizada de calaguala……………………………………………………………35
Cuadro 7. Resultados de la descripción organoléptica en muestra pulverizada de
calaguala……………………………………………………………………………………..36
Cuadro 8. Resultados de los parámetros físicos en muestra pulverizada de calaguala……...37
Cuadro 9. Resultados del tamizaje fitoquímico en extracto acuoso de rizoma de
calaguala………………………...............................................................................................38
Cuadro 10. Resultados del tamizaje fitoquímico en extracto alcoholico de rizoma de
calaguala…………………………………………………………………………………..….39
Cuadro 11. Resultados del tamizaje fitoquímico en extracto etereo de rizoma de
calaguala………………………………………………………………………………….…..40
Cuadro 12. Resultados del análisis microbiológico del extracto metanólico de rizoma de
calaguala……………………………………………………………………………….……..41
Cuadro 13. Resultados de la determinación de metales en cenizas del rizoma de
calaguala………………………………………………………………………………….......43
Cuadro 14. Resultados de acidez, saponificación e indice de yodo del rizoma de
calaguala...................................................................................................................................44
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS
Fotografía 1. Rizoma del Phlebodium pseudoaureum………………………………… 8
Fotografía 2. Prueba de sensibilidad con extracto metanólico al 40% de calaguala….. 41
Fotografía 3. Prueba de sensibilidad con extracto metanólico al 80% de calaguala….. 42
Fotografía 4. Prueba de sensibilidad con extracto metanólico al 100% de calaguala… 42
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Clasificacion taxonómica del Phlebodium pseudoaureum .................. 53
Anexo 2. Certificado de Metales pesados en laboratorios UBA. ........................ 54
Anexo 3. Certificado del Perfil lípidico en laboratorios Cromanova. ................... 55
Anexo 4. Testimonios fotográficos ....................................................................... 56
I
I
Resumen
El presente estudio se realizó para determinar los metabolitos secundarios presentes en
el rizoma del Phlebodium pseudoaureum (conocida vulgarmente como calaguala) mediante un
screening fitoquimico y al mismo tiempo analizar su efecto farmacognóstico. Se estudió la
actividad antimicrobiana en concentraciones de 40% de un extracto metanólico del rizoma del
Phelobodium pseudoaureum. Se utilizó una cepa de E. coli ATCCC 25922, se preparó la
solución turbia en caldo cerebro-corazón con ayuda de los patrones de Mc Farland y que
posteriormente se sembró en agar Muller Hinton mediante el método de difusión en agar. Los
resultados obtenidos indican que a la concentración de 40% se aprecia un halo de inhibición
frente a este metabolito. También se realizaron otros análisis, tales como HPLC con extracto
hexànico obtenido por el método de Soxhlet, índices de acidez, índice de yodo e índice de
saponificación, cuyos resultados sugieren la presencia de ácidos grasos de alto peso molecular.
Se realizó la determinación de metales presentes en el rizoma de la calaguala obteniendo
valores poco significativos de sodio, calcio, fósforo, magnesio y zinc. El presente trabajo tuvo
como objetivo general obtener información fitoquímica, farmacognóstica y microbiológica del
rizoma de la calaguala. La importancia de este proyecto radica en la necesidad de estudiar
especies de plantas poco conocidas con el fin de ampliar los conocimientos existentes y
brindarle bases científicas a la medicina tradicional u homeopática.
Palabras clave: metabolitos secundarios, rizoma, Phelobodium pseudoaureum,
Escherichia coli, perfil lipídico, índice de acidez, índice de yodo, índice de saponificación,
determinación de metales.
II
II
Abstract
The present study was carried out to determine the secondary metabolites present in
rhizome of Phlebodium pseudoaureum (commonly known as calaguala) by means of a
phytochemical screening and at the same time to analyze its pharmacognostic effect. The
antimicrobial activity was studied in concentrations of 40% of a methanolic extract of the
rhizome of Phelobodium pseudoaureum. A strain of E. coli 25922 ATCC was used, the turbid
solution was prepared in brain-heart broth with the aid of the Mc Farland standards and
subsequently seeded on Muller Hinton agar by the agar diffusion method. The results obtained
indicate that at the 40% concentration a halo of growth inhibition of the microorganism is
observed. An HPLC analysis with hexane extract obtained by the Soxhlet method, acidity
index, iodine index and saponification index, whose results suggest the presence of high
molecular weight fatty acids were also carried out. The determination of metals present in the
rhizome of Calaguala was carried out, obtaining insignificant values of sodium, calcium,
phosphorus, magnesium and zinc. The general objective of this work was to obtain
phytochemical, pharmacognostic and microbiological information on the rhizome of the
calaguala. The importance of this project lies in the need to study lesser-known plant species
in order to expand existing knowledge and provide solid foundations for traditional empirical
medicine.
Key words: secondary metabolites, rhizome, Phelobodium pseudoaureum,
Escherichia coli, lipid profile, acid number, iodine value, saponification index, metal
determination.
III
III
Introducción
Según (Alonso, 1968), gran parte de las necesidades terapéuticas han sido cubiertas a
lo largo del tiempo gracias al uso de plantas medicinales. El uso de las mismas se conoce
ampliamente en varias culturas y se han trasferido de generación en generación. La
implementación de nuevas técnicas y el refinamiento de las existentes han permitido ampliar
los análisis obteniendo cada vez resultados más exactos y útiles en el desarrollo de la
terapéutica natural. Dado que la vegetación alcanza un promedio de medio millón de especies
y que esta cifra se encuentra en crecimiento, no solo en cantidad sino también en biodiversidad,
se crea la necesidad de aumentar el número de estudios.
La presente
investigación tiene como objetivo el estudio de la calaguala, específicamente del rizoma. Esta
planta crece en América Tropical y semitropical y es calificada como un hibrido producto del
cruzamiento de especies diploides (Gattuso, Gattuso, & Gattuso, Caracteres morfoanatómicos
de especies de Phlebodium, 2007).
El nombre Calaguala, significa adorno
juvenil, estos helechos son tradicionalmente cultivados en Honduras y Guatemala, donde se
cree que eran consumidos por jóvenes indígenas cuando efectuaban danzas ceremoniales
(Alonso, 1968).
1
Capítulo I
1.1. Planteamiento del problema
El estudio fitoquímico permite conocer los metabolitos presentes en las plantas, su
función, su contribución en los mecanismos de defensa del cuerpo humano, así como su
utilidad farmacológica, lo que ratifica sus usos tradicionales en la fitoterapia popular. Un
estudio fitoquímico permite comprobar en las especies vegetales la presencia o ausencia de
principios activos tales como alcaloides, terpenos, compuestos fenólicos (entre otros
cumarinas, flavonoides, quinonas, taninos), compuestos esteroidales, etc (Sampietro, Isla,
Quiroga, & Vattuone, 1997).
El conocimiento adquirido gracias a este estudio se integra con la descripción
de la especie vegetal, concretamente de aquellos elementos de la droga que tienen valor
diagnóstico (Farmacognosia). Considerando que constantemente es necesario realizar nuevos
estudios relacionados a la medicina tradicional o popular, es ineludible en mayor grado el
estudio de especies poco conocidas (Sampietro, Isla, Quiroga, & Vattuone, 1997).
1.2. Formulación del problema
¿Qué características farmacognósticas, fitoquímicas y microbiológicas tendrá el rizoma
de la especie de Phlebodium pseudoaureum (Calaguala)?
2
1.3. Objetivo general
Evaluar fitoquímica, farmacognóstica y microbiológicamente el rizoma de la calaguala.
1.4. Objetivo especifico
Cuantificar las vitaminas liposolubles A y D3 y las concentraciones de Calcio,
Fosforo, Zinc, Magnesio y Sodio del rizoma de la calaguala.
Determinar los valores de los índices de yodo, acidez y saponificación.
Identificar los fitoconstituyentes presentes en el rizoma de Phlebodium
pseudoaureum.
Determinar la acción antimicrobiana, mediante el análisis CMI (Concentración
Mínima Inhibitoria) del extracto de calaguala frente a Escherichia coli 25922 ATCC.
3
1.5. Justificación
Las plantas forman parte de un recurso incalculable en los países en desarrollo. La
organización Mundial de la Salud, calcula que más del 80% de los habitantes mundiales
prefieren la medicina tradicional para tratar sus afecciones, utilizando extractos o infusiones
para obtener los principios activos (Oliveira, Velasquez, & Bermudez, 2005).
Apoyándose en esta evidencia, la OMS promueve el estudio de plantas para obtener
nuevas fuentes de fármacos. Un hecho importante que promueve la investigación de nuevas
especies de plantas de las ya existentes, es que menos del 10% de plantas totales han sido
evaluadas para determinar su composición química y sus propiedades (Oliveira, Velasquez, &
Bermudez, 2005).
Según (Oliveria), el uso de las plantas no solo se limita a la medicina tradicional, si no
que la medicina moderna también se apoya en ella, tanto así que se considera el uso de plantas
como materia prima para la fabricación de medicamentos semisintéticos más complejos a partir
de estructura química que poseen sus principios activos y que posteriormente podrían ser
usados como nuevos principios activos.
La importancia de este
proyecto radica en la necesidad de estudiar especies de plantas poco conocidas con el fin de
ampliar los conocimientos existentes y brindarle bases sólidas a la medicina tradicional
empírica.
1.6. Delimitación
4
Delimitación del tema
Tema: “Estudio farmacognóstico, fitoquímico, y microbiológico del Phlebodium
Pseudoaureum (calaguala)”
Campo: Investigación
Área: Fitoquímica y Farmacognosia
Problema: Características farmacognósticas, fitoquímicas y microbiológicas presentes
en el rizoma de la especie de Phlebodium pseudoaureum.
Delimitación Temporal: Mayo – Agosto 2018
1.7. Hipótesis
La calaguala posee propiedades farmacognósticas y microbiológicas.
1.8. Operacionalización de variables
5
Cuadro 1. Operacionalización de variables
Fuente: (Autores, 2018)
Variable Conceptualización
Dependiente Calaguala
Independiente Propiedades farmacognósticas y microbiológicas
6
Capítulo II
2.1. Antecedentes de la investigación
Según Maria Carretero, la calaguala fue introducida por el farmacéutico y botánico de
nacionalidad española Hipólito Ruiz López en el siglo XVIII en el viejo continente. Los nativos
de Europa la usan para tratar inflamaciones y tumores y a partir de 1970 es usada en el
tratamiento contra la psoriasis y la dermatitis atópica.
La parte del helecho comúnmente utilizada es el rizoma aunque también se reporta el
uso de las hojas en infusiones. En su composición química, posee un 10% de triterpenos, en el
que destaca la calagualina; esteroides como la ecdisoma y la ecdiserona; ácidos grasos
poliinsaturados, flavonoides, ácidos fenólicos entre los que destacan el ácido p-cumárico,
ferúlico, cafeico, 4-OH-cinamoilquínico, clorogénico; taninos, resinas, mucilago y aceite
esencial.
La actividad biológica que ejerce se relaciona a la presencia de compuestos fenólicos
presentes en las partes aéreas. Estudios in vitro demuestran que extractos de calaguala pueden
ser eficaces reductores de daño producido por especies reactivas de oxígeno, de la inflamación
e irritación de la dermis.
Investigaciones realizadas
posteriormente demuestran su acción antitumoral in vitro frente a mutaciones producidas por
emisiones UVA, al proteger las células de los cambios producidos por dicha radiación. Se cree
que esta protección se debe a la capacidad de detener la formación de radicales libres y de esta
manera proteger a las células de una apoptosis por radiación.
7
En un ensayo clínico se pudo
demostrar el efecto quimiofotoprotector frente a la fototoxicidad por exposición a psoraleno-
UVA (usado en el tratamiento de la psoriasis) durante un año administrado por vía oral, cuya
muestra fueron 10 individuos saludables. También se pudo demostrar su efecto depresor del
SNC, al evidenciar el aumento del tiempo de sueño estimulado por barbitúricos, reduciendo la
temperatura corporal y la agilidad motora espontánea.
En 1983 se realizó un estudio clínico durante seis meses para demostrar su efectividad
en el tratamiento de la psoriasis a dosis comprendidas entre 80 y 720 mg/kg, considerando la
edad y el cuadro clínico. Los resultados favorables sobrepasaron el 60% y sin presentar efectos
adversos significativos.
Un
estudio clínico doble ciego buscaba demostrar la actividad antihistamínica en niños y
adolescentes de 2 a 17 años. La administración se realizó por vía oral a dosis de 240 mg/día
de extracto o placebo, al finalizar el tratamiento se pudo reducir la cantidad de antihistamínicos
en cuanto a duración.
A la especie de
Phlebodium se le confiere propiedades antioxidantes, fotoprotectoras e inmunomoduladoras,
según estudios recientes en el año 2014; esto conlleva que puede ser efectivo para tratamientos
de la piel, como los casos de vitíligo que causa la desaparición de la pigmentación de la piel,
psoriasis que manifiesta una acumulación de escamas y manchas secas provocando comezón,
dermatitis atópica uno de los casos mas comunes en la niñez y melasma.
2.2 Marco teórico
8
2.1. Phlebodium pseudoaureum
Fotografía 1. Rizoma del Phlebodium pseudoaureum. Fuente: (Autores, 2018).
2.2.1.1. Historia
En los países de Centroamérica como Honduras y Guatemala, el nombre calaguala
posee un significado en quechua, que se traduce como un adorno juvenil, esto se debe a
tradiciones por parte de los jóvenes indígenas que utilizaban a la calaguala como un objeto
ornamental al momento de realizar sus danzas ceremoniales. La calaguala desde tiempos
ancestrales se la consumía por medio de infusiones para tratar varios trastornos digestivos,
como purgante posee una excelente efectividad, también fue utilizado como laxante natural
para eliminar las ingesta de veneno; uno de los usos más relevantes, era en los casos de tumores
malignos ya que fue considerado uno de los mejores medicamentos en ese tiempo.
En
1810 la especie de calaguala Polypodium decumanum fue descrita por primera vez por el
botánico alemán Willd. Los cientificos Horvath, Alvarado y Cols, en el año de 1967
realizando estudios en la especie de Polypodium leucotomos, logran aislar un metabolito, se
trataba de un heterósido, lo denominaron calagualina. Efectuan estudios en ratones
inyectándoles por vía intraperitoneal concentraciones mínimas de calagualina junto con valina
9
marcada, como resultado se observó un incremento de la valina en las proteínas de diferentes
órganos.
Con el nombre de calaguala se designan varias especies de helechos de la familia
Polypodiaceae. Distribuidas en Mesoamérica, las más comúnmente utilizadas son Phlebodium
pseudoaureum y P. decumanun para el tratamiento de afecciones gastrointestinales,
respiratorias, cardíacas, renales, reumatismo, diabetes e hipertensión.
2.2.1.2. Clasificación taxonómica
Cuadro 2. Clasificación taxonómica del Phlebodium pseudoaureum
Clase Equisetopsida C. Agardh
Subfamilia Polypodiidae Cronquist, Takht. & W. Zimm.
Orden Polypodiales Link
Familia Polypodiaceae J.Presi & C. Presi
Género Phlebodium (R. Br) J. Sm.
Nombre científico Phlebodium pseudoaureum (Cav.) Lellinger
Nombre vernáculo Calaguala
Fuente: (Herbario GUAY, 2018).
2.2.1.3. Descripción botánica
10
Rizoma
Los rizomas son rastreros, cuyo espesor varia de uno a dos centímetros, externamente
están cubiertos por escamas, cuya forma linear- lancelada puede extenderse hasta los 1.5 cm
de largo. Sus bordes son ligeramente ciliados y presentas brotes que se encuentran a distancias
de entre 1.5 a 2 centímetros (Pensamiento, 2013).
Frondes
A lo largo del
rizoma se encuentran esparcidos frondes de dos tipos, fértiles (cuyo envés es soroso) y estériles
(que carecen de soros). Los frondes pueden llegar a medir hasta 120 centímetros de largo desde
la raíz hasta la lámina frondal, según las condiciones de desarrollo (Pensamiento, 2013).
El fronde se divide en un peciolo de
color café-rojizo cuyo diámetro y longitud es de 0.5 centímetros de diámetro y hasta 30
centímetros de longitud; y en la lámina frondal que posee alrededor de 29 pinas que miden 26
centímetros de longitud con una base de 45 centímetros. En su segmento más ancha el fronde
mide 42 centímetros (Pensamiento, 2013).
2.2.1.4. Distribución geográfica
A la calaguala se la puede encontrar creciendo rústicamente en troncos de palmas,
árboles de encino y roca caliza desintegrada, en zonas con gran porcentaje de humedad. Se
localizan desde México y Centro hasta Sur América en alturas de 1.200-2.200 m. En Guatemala
se ha descrito en Alta Verapaz, Baja Verapaz, Chimaltenango, Escuintla, Guatemala,
11
Huehuetenango, Jalapa, Quetzaltenango, Suchitepéquez y Zacapa (Pensamiento, 2013).
2.2.1.5.
Usos medicinales atribuidos
Por
lo general la calaguala se administra por vía oral, en forma de infusión, para tratar personas
con problemas gastrointestinales, cardiacos, respiratorios, hipertensión, diabetes, renales, a
nivel óseo y gota. También es posible usarla en forma de crema para aliviar el dolor causado
por contusiones, reumatismo, úlceras, quebraduras. Además su uso tópico se extiende al cáncer,
cierto tipo de tumores, psoriasis y eczema. La decocción de las hojas se usa para detener las
hemorragias. Se le atribuye propiedad analgésica, antihemorrágica, depurativa, diurética,
desinflamante, emenagoga, espasmolítico, expectorante, febrífuga, laxante, pectoral, purgante,
sudorífica y tranquilizante.
2.2.1.6. Formas de uso
Generalmente se usan
extractos obtenidos de la raíz con una dosificación de 1-4 ml. Para tratamiento de enfermedades
cutáneas como psoriasis, eczemas, dermatosis, vitíligo y para estados de deficiencia
inmunológica, se recomienda administrar tres veces al día en dosis de 1 capsula antes de las
comidas, 1-4 g/taza de decocción, 3-5 ml de tintura 1:10 en etanol 35% de la droga pura en
combinación con achiote, manzanilla y zarzaparrilla. Otra forma farmacéutica empleadas
tópicamente es la pomada. Por su actividad antiinflamatoria e inmunomoduladora puede
combinarse con achiote, apacin, manzanilla y zarzaparrilla.
2.2.1.7.
Composición química
12
A
pesar de los beneficios de la calaguala, aún no existen estudios suficientes de especies de
Phlebodium. Se conoce hasta ahora que el rizoma de Phlebodium contienen azúcar, aceite
esencial, mucílago, almidón, nitrato de potasio y colorante rojo: además contiene calagualina,
polipodina, aceites grasos y taninos, así como esteroides (ecdisterona y dos ecdisonas como la
polipodaureina) (Pensamiento, 2013).
2.2.1.8.
Actividad biológica de los componentes
A
pesar de que se han realizado análisis con la raíz de calaguala, estos estudios aún se encuentran
incompletos por lo que se sabe muy poco de esta planta en comparación a lo que es capaz de
ofrecer. Se ha demostrado resultados positivos en enfermedades de presión alta, renal, tópica e
inmunológica.
Se ha
demostrado resultados positivos en enfermedades de presión alta, renal, tópica e inmunológica.
En procesos cancerígenos, las células T modifican a las T helper, regulando procesos
inmunológicos asociados a inmunodeficiencias. Parte del rol que implican las células que
participan en el sistema inmunológico, ha podido ser dilucidado a lo largo del tiempo gracias s
las observaciones de las mismas en el desarrollo de enfermedades óseas y neuronales.
13
El conocimiento de los mecanismos de acción sobre el sistema inmunológico en
procesos degenerativos como artritis reumatóidea, esclerosis múltiple o esclerodermia o en
otros tales como vitíligo y psoriasis, ha puesto en la mira científica el rol que juegan en el curso
de los procesos mencionados los linfocitos, linfoquinas y demás participantes inmunológicos.
2.2.1.9. Actividad inmunológica
La estomatitis aftosa afecta directamente a los tejidos mucosos, en lo que corresponde
a La estomatitis aftosa afecta directamente a los tejidos mucosos, en lo que corresponde a la
fase pre ulcerosa se aprecia una cantidad acrecentada de Linfoncitos OKT-4 en proporción 2/1.
En el momento donde da principio la etapa ulcerativa, la correlación linfocitaria OKT-4/OKT-
8 se cambia a 1/10. Durante el proceso de resolución, la correspondencia se vuelve a modificar
transmutándose en 10/1. Un punto relevante en los ensyos in vitro demuestra que la
calagualina aumenta significativamente el número de linfocitos OKT-8, sin ningún efecto sobre
la producción de los linfocitos de tipo OKT-4 y OKT-3.
Enfermedades que
afectan a tejidos mucosos pueden alterar las respuestas inmunes, estos procesos se observan en
fases pre-ulcerosas cuando los niveles de linfocitos OKT4 superan a las OKT8. Cuando ocurre
la fase ulcerativa la relación OKT-4/OKT-8 se invierte varias veces en alternando proporciones
1/10. La calagualina ha demostrado durante ensayos su mental el número OKT-8 sin afectar a
al OKT-4 y OKT-3. En un ensayo clínico se demostró que la calagualina es capaz de inhibir el
proceso pre ulcerativo. En los ratones fue capaz de extender la vida de los injertos cutáneos en
ratones al retardar los cambios hidrológicos.
Hasta la década de los 60, pocos casos de recidivas de
leucemias linfáticas se habían reportado usando extractos de calaguala. El Instituto Americano
14
encargado de investigaciones relacionadas con cáncer, reportaron ensayos que emplearon
diferentes rizomas de calaguala, sin encontrar algún resultado favorable. Otros laboratorios de
investigación reportaron resultados similares. Sin embargo, el conocimiento adquirido a lo
largo de los años acerca del mecanismo, crea interés para futuras investigaciones.
2.2.1.10. Actividad dermatológica
Trabajos de investigación realizados extracto de calaguala, sugieren una dosis vía oral
de 80-720 mg/día para el tratamiento efectivo de la psoriasis. Otros trabajos realizados bajo las
mismas condiciones de administración, sugieren que a una dosis de cinco cápsulas de extracto
de calaguala es frecuente en el tratamiento un regulador de la CD4/CD8 y de las catequinas.
Por otro lado, la aplicación tópica, es para el vitíligo. Se ha atribuido a la calaguala la capacidad
de prevenir quemaduras agudas y fotoxicidad por psoraleno. Dicho efecto se incrementa
cuando entra en contacto con el PUVA (La Terapia Con Psoraleno Y Luz Ultravioleta).
2.2.1.11.
Acción antivírica e inmuno supresora
Investigaciones realizadas relacionan al grupo -EDIOL de la calaguala con la depresión
del sistema inmunológico y con una importante acción antiviral. El mecanismo está relacionado
con la inhibición de la agregación plaquetaria, modificando al factor activo -kB por NF que a
su vez es modificado por la calagualina.
La
conversión a NF, regula la expresión genética, afectando por lo tanto a procesos inflamatorio,
a la replicación, la formación de tumores, el crecimiento celular y la modificación de las
respuestas inmunes, razones por las cuales se emplea la calaguala en tratamientos para el
15
Cáncer. También es usada para disminuir la temperatura en procesos febriles, como estimulante
de la diaforesis y como expectorante. Cuando es administrada como tratamiento para la
psoriasis, es necesario realizar un ajuste de acuerdo a la edad.
2.2.1.12. Condiciones climáticas para la propagación
Luz: crecen apropiadamente en condiciones moderadas de luz, no resisten luz solar
directa por periodos prolongados y precisan de suficiente humedad ambiental para reproducirse
(Pensamiento, 2013).
Fotoperíodo: se
desarrollan velozmente durante todo el año (Pensamiento, 2013).
Temperatura: Las
temperaturas convenientes para su crecimiento son aproximadamente de 19 C a 24 C en
entornos uniformes. Son resistentes a temperaturas menores a 10 C, con la condición de que
se mantengan a valores de humedad inferiores a los requeridos. A medida que la temperatura
asciende hasta superar los 20 C, debe aumentar la humedad con la ayuda de riegos constantes
sobre el follaje (Pensamiento, 2013).
Riego: Necesitan de riego abundante a fin de que
se mantenga siempre húmedo el sustrato (Pensamiento, 2013).
pH: Se recomiendan los pH de 4.5-5 para helechos
(Pensamiento, 2013).
16
Capítulo III
3.1. Lugar de investigación
Laboratorio de Fitoquímica y Farmacognosia de la Facultad de Ciencias Químicas de
la Universidad de Guayaquil.
Laboratorio de Microbiología de Alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad de Guayaquil.
Laboratorios UBA de la ciudad de Guayaquil.
Laboratorios Cromanova de la ciudad de Milagro.
Herbario GUAY de la ciudad de Guayaquil.
3.2. Periodo de la investigación
Se inició en el mes de Mayo del 2018, las muestras se recolectaron en el mes de Junio
del 2018, en el parque Colón ubicado en la Avenida Vicente Rocafuerte y calle Sargento Morán
Buitrón y los análisis se realizaron entre los meses de Junio a Agosto del presente año.
17
3.3. Tipo de investigación
Para la aplicación del presente proyecto se utilizó un estudio de tipo experimental para
determinar la presencia de compuestos de interés fitoquímico y farmacognóstico de la
calaguala, así mismo su acción microbiológica sobre cepas de E.coli 25922 ATCC.
También fue de carácter descriptivo debido a que nos permite describir los resultados
obtenidos en la investigación durante el proceso de elaboración de los ensayos realizados.
3.4. Diseño de la investigación
La investigación se realizó durante el periodo establecido por la Universidad de
Guayaquil para el proceso de titulación. Se adquirió la muestra de calaguala en el parque Colón
ubicado en la Avenida Vicente Rocafuerte y calle Sargento Morán Buitrón y se envió a la
Facultad de Ciencias Naturales para la identificación taxonómica de la especie.
Se
procedió a la limpieza y desinfección de la muestra adquirida para la realización de pruebas
físicas (cenizas, humedad, índice de refracción y solubilidad) y para la obtención de extractos
alcohólico, etéreo y acuso necesarios para el tamizaje fitoquímico
Las cenizas
obtenidas a partir de la droga cruda, fueron enviadas a Laboratorios UBA para el análisis de
Calcio, Fosforo, Zinc, Magnesio y Sodio por los métodos recomendados por la AOAC
(Asociación de Químicos Analíticos Oficiales).
18
También se realizó la extracción por el método de Soxhlet, utilizando dos solventes; el
solvente Metanólico para la prueba de CMI y con solvente Hexánico para el análisis de HPLC.
3.5. Población y muestra
Las muestras fueron obtenidas en Plaza Colón ubicado en la Avenida Vicente
Rocafuerte y calle Sargento Morán Buitrón, en la ciudad de Guayaquil.
3.6. Metodología
La droga cruda (calaguala) fue previamente tratada, se procedió a cortar el rizoma en
partes pequeñas para facilitar su pulverización. La cantidad usada fue de 200 gramos de droga
cruda. Una vez la muestra pulverizada se realizó los extractos acuosos, alcohólicos y etéreos,
utilizando 8 gramos para cada extracto y 20 ml de cada solvente correspondiente.
Para los extractos de hexano y de metanol, se lo realizo por el método de Soxhlet. El extracto
de hexano se lo requirió para los análisis de cromatografía por HPLC, índices de yodo,
saponificación y acidez. El extracto de metanol para el análisis microbiológico. Lo que
corresponde a los análisis de determinación de metales, se procedió a realizar cenizas de nuestra
muestra, la cantidad de 100 gramos.
19
3.6.1. Determinación de humedad
Se pesan 2g de la muestra previamente pulverizada y se transfieren a una cápsula de
porcelana tarada y desecada a una temperatura de 105 ºC; consecutivamente se deseca a 105
ºC por un periodo de 3 horas. La cápsula se sitúa en el desecador en el que se deja enfriar a
temperatura ambiente, se pesa y se coloca reiteradamente en la estufa durante una hora,
pesándose nuevamente hasta alcanzar una masa constante. Los resultados se expresan de la
siguiente manera:
%𝐻 = 𝑀2 − 𝑀1
𝑀2 − 𝑀𝑋100
% H = Pérdida en peso por desecación (%).
M2 = Masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g.)
M1 = Masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g.)
M = Masa de la cápsula vacía.
100 = Factor matemático.
3.6.2. Determinación de cenizas totales
Se colocaron 2 gramos del ejemplar en un crisol de porcelana previamente tarado. Se
calento gradualmente la fracción de investigación hasta carbonizar y prontamente se incinera
en un horno mufla a temperaturas de 700 a 750 ºC por un periodo de 8 horas. Se enfría el crisol
en un desecador y se pesa hasta que tres pesadas sucesivas sean constantes, es decir, no difieran
en más de 0.5 mg. por g. (masa constante). Expresión de los resultados:
20
%𝐶𝑇 = 𝑀2 − 𝑀
𝑀2 − 𝑀𝑋100
%CT = porcentaje de cenizas totales en base hidratada.
M = masa del crisol vacío (g).
M1= masa del crisol con la porción de ensayo (g).
M2= masa del crisol con la ceniza (g).
100= factor matemático para los cálculos.
3.6.3. Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico
A las cenizas totales se le añadieron de 3 mL de ácido clorhídrico al 10%. El crisol se
tapó con un vidrio reloj y se llevó a baño de agua hirviente por 10 minutos. Se lavó el vidrio
reloj con 5 mL de agua caliente y se añadió al contenido del crisol. Se filtró la solución a través
de papel filtro; el residuo obtenido se lavó con agua caliente hasta que el filtrado no muestre
presencia de cloruros al acidularlo con nitrato de plata.
El
filtrado obtenido se desecó de 100 a 105 ºC., se transfirió al crisol inicial y se incineró en un
horno mufla a una temperatura de 700-750 ºC durante aproximadamente dos horas. A
continuación guardó el crisol en el desecador hasta que alcanzó temperatura ambiente, se pesó
y se repitió el procedimiento hasta obtener masa constante. Expresión de los resultados:
%𝐶𝑙 = 𝑀2 − 𝑀
𝑀2 − 𝑀𝑋100
21
%CI= porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada.
M = masa del crisol con la porción de ensayos (g.)
M2= masa del crisol con la ceniza (g.)
100= factor matemático. (25)
3.6.4. Determinación de cenizas solubles en agua
Se añadieron 20 mL. de agua a las cenizas totales. El crisol tapado se hirvió
apaciblemente a la flama del mechero durante 5 minutos. La solución obtenida se filtró a través
del papel de filtro limpio. El filtro con el residuo se transfirió al crisol inicial, se carbonizó en
un mechero y luego se incineró en un horno mufla de 700-750 ºC, durante 2 horas.
Posteriormente se colocó en un desecador y cuando alcanzó la temperatura ambiente, se pesó.
Se repitió el procedimiento hasta alcanzar peso constante. Expresión de los resultados.
%𝐶𝐴 = 𝑀2 − 𝑀a
𝑀2 − 𝑀𝑋100
%CA = Porcentaje de cenizas solubles en agua en base hidratada.
M2 = Masa del crisol con las cenizas totales (g).
Ma =Masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (g).
M1 = Masa del crisol con la muestra de ensayo (g).
M = Masa del crisol vacío.
100 = Factor matemático.
22
3.6.5. Preparación para la obtención del extracto fluido
3.6.5.1 Método por extracto etereo
Se pesaron 8 gramos de la muestra previamente pulverizada y se agregaron 20 ml de
éter. Se dejó reposar por 24 horas. Luego se procedió filtrar el extracto con la ayuda de papel
filtro.
3.6.5.2. Método por extracto acuoso
Se pesaron 8 gramos de muestra previamente pulverizada y se agregaron 20 ml de
agua. Se dejó reposar por 24 horas. Luego se procedió filtrar el extracto con la ayuda de
papel filtro.
3.6.5.3. Método por extracto etanólico
Se pesaron 8 gramos de muestra previamente pulverizada y se agregaron 20 ml de
etanol. Se dejó reposar por 24 horas. Luego se procedió filtrar el extracto con la ayuda de
papel filtro.
3.6.6. Descripción organoléptica
Se tomó una alícuota de 25 mL del extracto acuoso y se lo puso en un vaso de
precipitación de 50 mL. para determinar el análisis sensorial de color, olor, turbidez, aspecto.
23
3.6.7. Determinación del pH
La medición del pH se realizó con la ayuda de un potenciómetro. Se ajustó el equipo
con la solución reguladora de pH adecuada al rango en que se realizará la determinación.
Posteriormente se determinó el valor del pH de la muestra.
3.6.8. Determinación de la densidad relativa
Se pesó el picnómetro vacío y seco y se llenó solución de ensayo, conservándose a una
temperatura de 25 ºC (1ºC) durante 15 min. Se pesó cuidadosamente el picnómetro con la
solución de ensayo y se repitió la operación con agua destilada a 25 ºC, después de limpiar el
picnómetro. Expresión del resultado:
𝐷25 = 𝑀1 − 𝑀
𝑀2 − 𝑀
La densidad relativa a 25 º C se calcula por la siguiente fórmula:
Donde:
M1 = Peso del picnómetro con la muestra (g)
M2 = Peso del picnómetro con la muestra (g)
M = Peso el picnómetro vacío (g)
Los resultados se aproximan hasta la tercera cifra.
24
3.6.9. Determinación del índice de refracción
Se procedió a medir directamente la muestra en el refractómetro. Se colocaron 6 gotas
del extracto y se procedió a leer.
3.6.10. Determinación de sólidos totales
Se transfirió a una cápsula previamente tarada, 5 mL de muestra y se llevó a baño maría,
hasta completar la evaporación en estufa a 105°C. Por 3 horas, se pesaron las cápsulas, y se
repitió el procedimiento hasta peso constante con intervalos de 30 minutos. Los resultados se
expresaron en porcentaje de sólidos totales y se reportaron en cifras enteras, según fórmula:
𝑆𝑡 = 𝑃𝑅 − 𝑃
𝑉𝑋100
Donde:
Pr = Masa de la cápsula más el residuo (g).
P = Masa de la cápsula vacía (g).
V = Volumen de la porción de ensayo.
100 = Factor matemático para el cálculo.
25
3.6.11. Pruebas fotoquímicas preliminares (Ver Anexo #4)
3.6.11.1. Ensayo de Fehling
Permitió reconocer en el extracto la presencia de azúcares reductores. Para ello, se
realizó con extracto acuoso. Se adicionaron 2 mL del reactivo y se calentó en baño de agua 5-
10 minutos la mezcla. El ensayo se considera positivo si la solución se colorea de rojo o aparece
precipitado rojo.
3.6.11.2.
Ensayo de Espuma
Permite
reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica.
El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm
de altura y persistente por más de 2 minutos.
3.6.11.3. Ensayo del
Cloruro férrico
Nos permitió
reconocer la presencia de compuestos fenólicos y/o taninos en un extracto vegetal. A una
alícuota del extracto alcohólico se le adicionaron 3 gotas de una solución de tricloruro férrico
al 5 % en solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9 % en agua). Al extracto es acuoso,
el ensayo determinó fundamentalmente taninos. A una alícuota del extracto se añadió acetato
de sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución
salina fisiológica, un ensayo positivo puede dar la siguiente información general:
26
- Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general.
- Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.
- Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos.
3.6.11.4. Ensayo de Cumarinas
Para llevar a cabo su detección, se tuvo en cuenta el hecho de que son fluorescentes a
la luz ultravioleta y para aumentar la intensidad, se tratan previamente. Se introdujo una
pequeña cantidad de extracto acuoso en un tubo de ensayo, el cual se cubrió con un papel de
filtro previamente humedecido con Hidróxido de Sodio al 10%, se calentó el tubo al baño maría
hirviente durante varios minutos y se observó el papel de filtro a la luz ultravioleta, debiendo
aparecer fluorescencia amarillo-verdosa.
3.6.11.5. Ensayo de Sudán III
La técnica del Sudán III es un método utilizado generalmente para demostrar la
presencia de grasas mediante tinción de triglicéridos, aunque también tiñe otros lípidos. A un
tubo con 2 ml de la muestra se añadieron de 4-5 gotas de reactivo y se observó la tinción de
la muestra de rojo para un resultado positivo.
27
3.6.11.6. Ensayo de Nihidrina
La ninhidrina es específica para aminoácidos y proteínas, para diferenciar entre
carbohidratos y aminoácidos y proteínas. Reacciona con todos los α-aminoácidos contenidos
en la proteína dando lugar a la formación de un complejo color purpura.
3.6.11.7. Ensayo de Bornträger
Para la identificación de quinonas se emplea el ensayo de Borntrager. Se colocaó en un
tubo de ensayo una pequeña porción de droga antraquinónica 2 g (ruibarbo, sen, cáscara
sagrada). Se Añade 5 ml de benceno y se agitó, el benceno hasta que tomée un color amarillo.
Se trasvasa el benceno a otro tubo de ensayo y se añade unas gotas de hidróxido de potasio al
10%. Debe dar coloración roja.
3.6.11.8. Ensayo de Baljet
El ensayo de Baljet, permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos con
agrupamiento lactónico, en particular cumarinas, aunque otros compuestos láctonicos pueden
dar también positivo este ensayo. En estas condiciones se considera la presencia de esta familia
de compuestos por la aparición de una coloración y un precipitado.
28
3.6.11.9. Ensayo de Liebermann – Burchard
La presencia de triterpenos y/o esteroides, se puede realizar a través del ensayo de
Liebermann - Burchard, debido a que ambos tipos de productos poseen un núcleo de
androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6.
3.6.11.10. Ensayo de Antocianidinas
Permite reconocer la presencia de estructuras de secuencia C6-C3-C6 de grupo
flavonoides. En un tubo de ensayo se colocaron 2 ml del extracto alcohólico y se calentó. Se
adicionó 1 ml de ácido clorhídrico concentrado. Se dejó enfriar y se agregó 1 ml de agua
destilada, seguido de 2 ml de alcohol amílico. Se observó un precipitado color rojo, indica un
ensayo positivo indicando un resultado positivo.
3.6.11.11. Ensayo de Shinoda
Permite reconocer la presencia de flavonoides en un extracto de un vegetal. La alícuota
del extracto alcohólico se encuentra en alcohol, se diluyó con 1 mL de ácido clorhídrico
concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se esperó 5
minutos, se añadió1 mL. de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que
se separaron. Se procedió de igual forma con la alícuota del extracto acuso, a partir de la adición
del ácido clorhídrico concentrado. El ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amílico
se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intenso en todos los casos.
29
3.6.11.12. Ensayo de Resinas
Para detectar este tipo de compuesto, adicionaron a 2 ml de solución alcohólica, 10 ml
de agua destilada. La aparición de un precipitado, indica un ensayo positivo.
3.6.12. Caracterización por reacciones de precipitación alcaloides
Las soluciones acuosas ácidas de alcaloides dan con muchos reactivos yodados
precipitados coloreados característicos:
1. Con el reactivo de Bouchardat (solución de yodo yodurado).
2. Con el reactivo de Dragendorf (solución ácida de yodobismutato de potasio)
3. Con reactivo de Meyer (solución de yoduro de mercurio y potasio).
4. Mayer (mercuriyoduro potásico, precipitado blanco-amarillento)
Se repartió la solución en tres tubos de ensayo, se agregaron 0.5 ml de la solución
muestra, se añadieron en los tres primeros tubos 2 gotas de reactivo de Bouchardat; en la
segunda 2 gotas de reactivo de Dragendorf, en la tercera 2 gotas de reactivo de Meyer y en la
cuarto 2 gotas de reactivo de Mayer.
30
Con el reactivo de bouchardat genera precipitado café.
Con el reactivo de Dragendorf genera precipitados de color rojo anaranjado.
Con reactivo de Meyer genera precipitado blanco crema.
Mayer genera precipitado blanco-amarillento.
3.6.13. Actividad antimicrobiana
Previamente se obtuvo un extracto metanólico por el método de Soxhlet. El extracto
obtenido se concentró con ayuda de un rotoevaporador. La muestra en extracto hexánico se
colocó en un Matraz de fondo redondo La solución se coloca en un matraz de fondo redondo
sin llenarlo completamente. El matraz se acopló al rotoevaporador y se ajustó la velocidad de
rotación, la profundidad en la que el matraz con la muestra será introducida en el baño María
y la temperatura de calentamiento del agua a 70°C. Cuando se alcanzó la temperatura deseada,
empezó la destilación de los vapores y la condensación con ayuda un refrigerante. De esta
manera se recogió el solvente en un matraz colector de fondo redondo.
En el
día 1, se preparó una infusión de Cerebro-Corazón y el Agar de Muller-Hinton para el
antibiograma siguiendo las especificaciones del fabricante y ajustando al volumen que
esperábamos obtener.
31
En el día 2, se preparó la solución de Mc Farland 0.5 con 2ml de infusión Cerebro-
Corazón, sembrando y agitando hasta obtener la concentración indicada. Esta solución se
comparó con el Patrón de turbidez de Mc Farland 0,5 esta solución se usa como patrón de
turbidez para suspensiones de microorganismos en pruebas de sensibilidad antimicrobiana, en
este caso correspondió una suspensión homogénea de E.coli 25922 ATCC. Los reactivos se
mezclaron para formar una turbidez reproducible.
Una vez comparada la suspensión de E.coli 25922 ATCC, frente al nefelómetro de Mac
Farland, se sembró en el agar Muller-Hinton por el método de inundación, de manera que la
solución cubrió toda la superficie del Agar. Se realizó la dilución de extracto al 40%, se
embebió los discos de sensibilidad y se dejó secar y se colocaron en el agar Muller-Hinton. Se
incubó a 37°C por 24 horas.
Modo de preparación de la solución de Mac Farland: La turbidez se preparó
mezclando los siguientes reactivos, una fórmula aproximada para 100 mL. de 99.5 ml de
Ácido sulfúrico 0.18M y 0.5 mL cloruro de bario 0.048M .
32
Capítulo IV
4.1. Resultados y discusiones
4.1.1. Determinación del contenido de humedad
Cuadro 3. Resultados de la determinación de humedad en muestra pulverizada de calaguala
Muestra % Humedad Limite
1
4.5
< 6.5%
2
5.5
3
4.5
% Promedio
4.8
Fuente: (Autores, 2018).
El cuadro 3, refleja el porcentaje de humedad, en la muestra 1 se obtuvo un valor de
4.5, en la muestra 2 se obtuvo un valor de 5.5 y por último la muestra 3 con un valor de 4.5, el
promedio de la Humedad es 4.8, se encuentra dentro de los parámetros establecidos.
33
4.2. Determinación de cenizas totales
Cuadro 4. Resultados de la determinación de cenizas totales en muestra pulverizada de
calaguala
Muestra % Cenizas Totales Limite
1
5.68
Max 37.5 %
2
5.70
3
5.75
% Promedio
5.71
Fuente: (Autores, 2018).
En el cuadro 4, se puede apreciar el porcentaje de cenizas totales, la muestra 1 tiene un
valor de 5.68, la muestra 2 tiene un valor de 5.70 y la muestra 3 tiene un valor es de 5.75, dando
un promedio de 5.71 encontrándose dentro de los parámetros establecidos.
34
4.3. Determinación de determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico
Cuadro 5. Resultados de la determinación de determinación de cenizas insolubles en ácido
clorhídrico en muestra pulverizada de calaguala
Muestra
% Cenizas insolubles en ácido clorhídrico
Limite
1
7.521
Max 8 %
2
7.602
% Promedio
7.561
Fuente: (Autores, 2018).
El cuadro 5, muestra el porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico, la muestra
1 tiene un valor de 7.521 y la muestra 2 tiene un valor de 7.602, dando un promedio de 7.561,
encontrándose dentro de los parámetros establecidos.
35
4.4. Determinación de determinación de determinación de cenizas solubles en agua
Cuadro 6. Resultados de la determinación de determinación de cenizas solubles en agua en
muestra pulverizada de calaguala
Muestra
% Cenizas solubles en agua
Limite
1
6.204
Max 8 %
2
6.018
% Promedio
6.111
Fuente: (Autores, 2018).
El cuadro 6, muestra el porcentaje de cenizas solubles en agua, la muestra 1 tiene un
valor de 6.204 y la muestra 2 tiene un valor de 6.018, dando un promedio de 6.111,
encontrándose dentro de los parámetros establecidos.
36
4.5. Descripción organoléptica
Cuadro 7. Resultados de la descripción organoléptica en muestra pulverizada de calaguala
Parámetro Descripción organoléptica
COLOR CAFÉ-MARRÓN
OLOR
CARCTERÍSTICO
SABOR
AMARGO
TURBIDEZ
NO
ASPECTO
LIQUIDO
Fuente: (Autores, 2018).
Los extractos poseen valores únicos y característicos dependiendo de la planta, parte
de la planta y el tipo de extracción.
37
4.6. Parámetros Físicos
Cuadro 8. Resultados de los parámetros físicos en muestra pulverizada de calaguala
Determinacion
Resultado
pH 5.77
Densidad reltiva
0.996 g/ml
Indice refración 1.336
Solidos totales 6%
Fuente: (Autores, 2018).
En el cuadro 8, se observa los valores de los parámetros físicos, del extracto fluido de
Calaguala. Se obtuvieron los siguientes valores, pH un valor de 5.77, en densidad relativa un
valor de 0.996 g/ml, el índice refracción un valor de 1.336. Por último el valor de solidos totales
se encuentra dentro del rango mínimo establecido.
38
4.7. Reacciones de caracterización, tamizaje fitoquímico (ver anexo #4)
Cuadro 9. Resultados del tamizaje fitoquímico en extracto acuoso de rizoma de calaguala
Ensayo Metabolito Resultado
DRAGENDORFF ALCALOIDES POSITIVO (++)
BOUCHARDAT ALCALOIDES NEGATIVO
MAYER ALCALOIDES POSITIVO (+)
WAGNER ALCALOIDES NEGATIVO
SHINODA FLAVONOIDES POSITIVO
FEHLING ALDEHÍDO Y GRUPOS
REDUCTORES POSITIVO (++++)
CUMARINA CUMARINAS POSITIVO (+)
ESPUMA SAPONINAS NEGATIVO
CLORURO FÉRRICO FENOLES, TANINOS POSITIVO
Fuente: (Autores, 2018).
El cuadro 9, logra demostrar la presencia de ciertos metabolitos secundarios en el
extracto de acuoso de la calaguala; como alcaloides donde en la prueba de Bouchardat y
Wagner dieron negativo; flavonoides, aldehído y grupos reductores, cumarinas, fenoles y
taninos. Se estima que esta especie de calaguala no tiene presencia de saponinas.
39
Cuadro 10. Resultados del tamizaje fitoquímico en extracto alcoholico de rizoma de calaguala
Ensayo Metabolito Resultado
SUDÁN III COMPUESTOS GRASOS POSITIVO
SHINODA FLAVONOIDES POSITIVO
CLORURO FÉRRICO TANINOS POSITIVO
NINHIDRINA AMINAS EN GENERAL POSITIVO
BORNTRAGER QUINONAS POSITIVO (+++)
RESINAS RESINAS NEGATIVO
BALJET GRUPOS LACTÁNICOS POSITIVO (++)
LIEBERMANN-BURCHARD TRITERPENOS Y/O
ESTEROIDES POSITIVO
ANTOCIANIDINA ESTRUCTURAS C6C3C6 POSITIVO
Fuente: (Autores, 2018).
El cuadro 10, logra demostrar la presencia de ciertos metabolitos secundarios en el
extracto de alcohólico de la calaguala; como compuestos grasos, flavonoides, taninos, aminas
en general, quinonas, grupos lactánicos, triterpenos y/o esteroides y estructuras C6C3C6 de
grupos flavonoides. Para resinas resulto negativo.
Cuadro 11. Resultados del tamizaje fitoquímico en extracto etereo de rizoma de calaguala
40
Ensayo Metabolito Resultado
DRAGENDORFF ALCALOIDES POSITIVO (+++)
MAYER ALCALOIDES POSITIVO (+)
BALJET GRUPOS LACTÁNICOS POSITIVO (+++)
SUDAN III COMPUESTOS GRASOS POSITIVO
Fuente: (Autores, 2018).
El cuadro 11, logra demostrar la presencia de ciertos metabolitos secundarios en el
extracto de etéreo de la calaguala; como alcaloides, grupos lactánicos y compuestos grasos.
41
4.8. Análisis microbiológico.
Cuadro 12. Resultados del análisis microbiológico del extracto metanólico de rizoma de
calaguala
Extracto Concentración Halo Observaciones
Metanólico 40 % 6 mm Medianamente sensible
Metanólico 80 % 0 mm No presento sensibilidad
Metanólico 100 % 0 mm No presento sensibilidad
Fuente: (Autores, 2018).
Se logró observar que el extracto metanólico al 40% es medianamente sensible (Ver
fotografía 2), con un halo de 6 mm, resultando medianamente sensible; los extractos metanólico
al 80% y 100% (Ver fotografía 3 y 4) no presentan un halo de Inhibición frente a E.coli ATCC
25922.
Fotografía 2. Prueba de sensibilidad con extracto metanólico al 40% de calaguala.
Fuente: (Autores, 2018).
42
Fotografía 3. Prueba de sensibilidad con extracto metanólico al 80% de calaguala.
Fuente: (Autores, 2018).
Fotografía 4. Prueba de sensibilidad con extracto metanólico al 100% de calaguala.
Fuente: (Autores, 2018).
43
4.9. Análisis de metales (Ver anexo 2).
Cuadro 13. Resultados de la determinación de metales en cenizas del rizoma de calaguala
Fuente: (Autores, 2018).
El cuadro 12, logra demostrar que para la presencia y cantidad en cenizas, del metal
Calcio es de 5.74 g/100g, del metal zinc es de 0.02 g/100g, del metal fósforo es de 0.22 g/100g,
del metal sodio es de 0.31 g/100g y del metal magnesio es de 3.44 g/100g.
Parámetros Resultados Unidad
Calcio 5.74 g/100g
Zinc 0.02 g/100g
Fosforo 0.22 g/100g
Sodio 0.31 g/100g
Magnesio 3.44 g/100g
44
4.10. Analisis de índice de acidez, saponificación y de yodo (Ver Anexo 3)
Cuadro 14. Resultados de acidez, saponificación e indice de yodo del rizoma de calaguala
Fuente: (Autores, 2018).
En el cuadro 13, se logra se observar los valores de los parámetros de acidez con un
valor de 1.23%, saponificación un valor de 0.01% y el índice de yodo un valor de 0.05%.
Parámetros Resultados Unidad
Acidez 1.23 %
Saponificación 0.01 %
Índice de yodo 0.05 %
45
4.11. Analisis de las Vitaminas Liposolubles A Y D3 por HPLC
Figura 1. Cromatograma del Estándar de Vitamina A, Fuente: (Autores, 2018).
Figura 2. Cromatograma de la Vitamina A, del extracto de hexano de calagua. Fuente:
(Autores, 2018).
46
Figura 3. Resultado del Cromatograma de la Vitamina A. Fuente: (Autores, 2018).
Se puede apreciar en el cromatograma de la vitamina A, del extracto de hexano de
calaguala (Ver figura 2), un pico con tiempo de retención de 8.47 minutos, una concentración
de 0.037 mg/ml y un área de 10502. Mientras en el cromatograma del Estándar de vitamina A
(Ver figura 1), un pico con tiempo de retención de 8.02 minutos, una concentración de 0.32
mg/ml y con un área de 74728. El porcentaje de total de vitamina A en el rizoma de calaguala
se lo determina de la siguiente manera:
0.037∗ 5
1 = 0.185 mg /ml
0.185 x 100
1000= 0.0185 % Vitamina A
47
Figura 4. Cromatograma del Estándar de vitamina D3, Fuente: (Autores, 2018).
Figura 5. Cromatograma de la vitamina D3, del extracto de hexano de calagua, Fuente:
(Autores, 2018).
48
Figura 6. . Resultado del Cromatograma de la Vitamina D3, Fuente: (Autores, 2018).
Se puede apreciar en el cromatograma de la vitamina D3, del extracto de hexano de
calaguala (Ver figura 5), un pico con tiempo de retención de 10.04 minutos, una concentración
de 0.063 g/ml y con un área de 27388. Mientras en el cromatograma del Estándar de vitamina
D3 (Ver figura 4), un pico con tiempo de retención de 9.76 minutos, una concentración de
0.320 g/ml y con un área de 137129. El porcentaje de total de vitamina D3 en el rizoma de
calaguala se lo determina de la siguiente manera:
0.063 ∗ 5
1 = 0.315 mg /ml
0.315 x 100
1000= 0.0315 % Vitamina D3
49
50
Capítulo V
5.1. Discusión
Referente al análisis por HPLC se logra comprobar que la calaguala posee vitaminas
liposolubles, concretamente las vitaminas A y D3. En cantidades de 0.0185 % para vitamina A
y 0.0315 % para vitamina D3. No se logra comparar con otras especies de calaguala, las
cantidades que estas poseen, por motivo que no han realizado estos análisis.
El índice de yodo hace referencia al número de saturaciones presentes en la molécula, al tener
este un valor bajo podemos decir que posee pocas insaturaciones; el índice de acidez muestra
la calidad de la grasa, estableciendo la relación de que mientras más bajo sea este índice, la
calidad de la grasa es mejor; por último el índice de saponificación bajo nos indica la presencia
de ácidos grasos de alto peso molecular.
Se
obtuvieron resultados positivos para una gran diversidad de metabolitos secundarios, lo que
justificaría la utilidad que investigaciones anteriores le han atribuido al Phlebodium
pseudoaureum en el tratamiento de diferentes afecciones. Estos resultados son semejantes a los
obtenidos por Gudiel, 2019 en una especie diferente de calaguala.
En relación con las
cenizas totales al parecer, no están constituidas mayoritariamente por metales como sodio,
magnesio, zinc, calcio y fósforo, aspecto que se justifica con el valor obtenido en la
determinación de metales pesados y cenizas insolubles en ácido. Los resultados de los análisis
demuestran que el Phlebodium pseudoaureum no muestra sensibilidad frente a E.coli 25922
51
ATCC en concentraciones de 40%, 80% y 100% del extracto.
5.2. Conclusiones
Se pudo realizar la identificación y determinación de las vitaminas liposolubles A y D3
en la calaguala mediante HPLC, también esto se complementó con los resultados de índice de
yodo, acidez y saponificación. Se recomienda la realización de nuevas investigaciones que
puedan caracterizar cuantitativamente los ácidos grasos presentes en la calaguala.
En las
cenizas de la calaguala no se encontró valores significativos de los metales analizados, sin
embargo, esto no descarta la posibilidad de encontrar valores altos de otros metales. Se
recomienda el análisis de metales adicionales para recomendar nuevos usos nutritivos de la
calaguala.
El extracto
metanólico de Phlebodium pseudoaureum no mostró efecto antibacteriano in vitro en cepas de
Escherichia coli 25922 ATCC, en concentraciones del extracto metanólico al 40%, 80% y
100%. Es de mencionar que esta especie de Calaguala, registra muy poca información sobre
estudios de sus características fitoquímicas, farmacognósticas y microbiológicas, por lo que su
estudio debe continuar y el análisis microbiológico hacerlo frente a otros microorganismos.
52
Referencias Bibliográficas
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54
ANEXO 1. Certificado Phlebodium pseudoaureum.
55
ANEXO 2. Certificado de Metales pesados en laboratorios UBA.
56
ANEXO 3. Certificado del Perfil lípidico en laboratorios Cromanova.
57
ANEXO 4. Testimonios fotográficos
Preparación de la droga cruda
Droga cruda (Calaguala) Droga cruda (Calaguala)
Corte del rizoma en partes pequeñas Corte del rizoma en partes pequeñas
Muestra Calaguala Pulverizada Muestra Calaguala Pulverizada
58
Determinación de humedad por
método de estufa seca
Extractos acuoso, etanólico y etéreo Extracto acuoso
Extracto alcohólico Extracto etéreo
Determinación de humedad por
método de estufa seca
59
Polvo de Calaguala en crisol
Prueba de alcaloides
Obtención de cenizas de Calaguala
Pesado de polvo de Calaguala
Polvo de Calaguala en la mufla Cenizas de Calaguala
Prueba de Mayer en extracto acuoso Prueba de Mayer en extracto etéreo
60
Screening fitoquimico en extracto acuoso
Prueba de Dragendorff en extracto acuoso Prueba de Dragendorff en extracto etéreo
Prueba de Wagner en extracto acuoso Prueba de Bouchardat en extracto acuoso
Prueba de Cloruro férrico en extracto
acuoso
Prueba de Shinoda en extracto acuoso
61
Prueba de Fehling en extracto acuoso Prueba de Cumarinas en extracto acuoso
Screening fitoquimico en extracto alcohólico
62
Prueba de Antocianidina en extracto alcohólico Prueba de Baljet en extracto alcohólico
Prueba de Liebermann-Burchard en extracto
alcohólico
Prueba de Borntrager en extracto alcohólico
63
Análisis Microbiológico
Prueba de Ninhidrina en extracto alcohólico Prueba de Sudán III en extracto alcohólico
Prueba de Shinoda en extracto alcohólico
Screening fitoquimico en extracto etéreo
Prueba de Sudán III en extracto etéreo Prueba de Baljet en extracto etéreo
64
Glosario
Farmacología: Ciencia que estudia la composición, las propiedades y la acción
terapéutica de los medicamentos.
Cepa de E. coli 25922 ATCC Solución turbia de Infusión Cerebro-Corazón
Agar Muller Hinton
Infusión Cerebro-Corazón
Prueba de CMI por método de difusión en disco
65
Farmacognosia: La farmacognosia es la ciencia que se ocupa del estudio de las drogas
y los principios activos de origen natural: vegetal, microbiano y animal.
Fotoquímica: Parte
de la bioquímica que se ocupa de los procesos químicos de las plantas.
Fitoterapia: uso de productos de
origen vegetal para la prevención, la curación o el alivio de una amplia variedad de síntomas y
enfermedades. Forma parte de las llamadas terapias naturales.
Placebo: es una sustancia farmacológicamente inerte que se utiliza como control en un
ensayo clínico.
Rizoma: tallo subterráneo con varias yemas que crecen de forma horizontal emitiendo
raíces y brotes herbáceos de sus nudos. Los rizomas crecen indefinidamente.
Taxonomía: Ciencia que trata de los principios, métodos y fines de la clasificación,
generalmente científica; se aplica, en especial, dentro de la biología para la ordenación
jerarquizada y sistemática de los grupos de animales y de vegetales.
66
