Técnicas para medir Técnicas para medir Inmunidad CelularInmunidad Celular

Inmunología Aplicada Inmunología Aplicada 10651065Semestre 2005Semestre 2005--2 Grupo 032 Grupo 03

Carolina Hernández Martínez Carolina Hernández Martínez Subprograma 121 Subprograma 121

FormaciónFormación de de profesoresprofesoresRevisado por MD LastraRevisado por MD Lastra

HEMOGRAMAHEMOGRAMA

Número total de eritrocitos, plaquetas, Número total de eritrocitos, plaquetas, linfocitos, linfocitos, monocitosmonocitos y y granulocitosgranulocitos

Población Población linfocitarialinfocitaria::Linfocitos B: CD19, CD20Linfocitos B: CD19, CD20Linfocitos T: CD3, CD4, CD8Linfocitos T: CD3, CD4, CD8Células NK: CD56, CD16Células NK: CD56, CD16

Función de las células TFunción de las células T

Pruebas cutáneas de hipersensibilidad Pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardadaretardadaEstudios funcionales Estudios funcionales “in“in vitro”vitro”Respuesta Respuesta linfoproliferativalinfoproliferativaCultivo mixto de linfocitosCultivo mixto de linfocitosProduciónProdución de de mediadores:citocinasmediadores:citocinasCitotoxicidadCitotoxicidad T CD8+T CD8+CitotoxicidadCitotoxicidad NKNK

Test de hipersensibilidad retardada

Respuesta a diferentes Respuesta a diferentes antígenos.antígenos.

El método de la El método de la blastogénesisblastogénesis consiste en consiste en cultivar los linfocitos cultivar los linfocitos evaluando su evaluando su respuesta a respuesta a antígenos antígenos específicosespecíficos o con o con varios mitógenos que varios mitógenos que provocan mitosisprovocan mitosis(inmunoproliferación por estímulos(inmunoproliferación por estímulos no no específicos).específicos). La transformación La transformación blásticablásticaespecífica se mide por la capacidad que específica se mide por la capacidad que tiene el antígeno de inducir tiene el antígeno de inducir inmunoproliferacióninmunoproliferación..

Rosetas con los eritrocitos

Los linfocitos T presentan la característica de formar rosetas cuando se unen a los eritrocitos de carnero . Se pueden cuantificar los linfocitos T incubándolos con eritrocitos de carnero (reconocimiento de moléculas CD2+ y CD58+);posteriormente se observan al microscopio,cuantificando las rosetas (se considera normal entre 70 y 80% positivas).

LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS LINFOCITOS T (CD 8+)LINFOCITOS T (CD 8+)

La actividad citotóxica de los linfocitos La actividad citotóxica de los linfocitos T T CDCD 8+ frente a una célula 8+ frente a una célula blanco (diana)blanco (diana)se puede estudiar, midiendo la capacidad se puede estudiar, midiendo la capacidad citocida,citocida, que que loslos linfocitos T tienen para linfocitos T tienen para destruir un determinado número de destruir un determinado número de células diana, al estar ambas poblaciones células diana, al estar ambas poblaciones en contacto. Se puede medir mediante la en contacto. Se puede medir mediante la liberación de Crliberación de Cr5151 por las células blanco por las células blanco (diana) previamente marcadas.(diana) previamente marcadas.

Cr51

Cr51

CitotoxicidadCitotoxicidad NKNK

En esta prueba se mide la capacidad de En esta prueba se mide la capacidad de estas células para matar células blanco estas células para matar células blanco especiales (K562). La especiales (K562). La citotoxicidadcitotoxicidad suele suele determinarse mediante el uso de determinarse mediante el uso de CrCr51.51.

Por citometría de flujo se determina la Por citometría de flujo se determina la actividad de estas células utilizando los actividad de estas células utilizando los marcadores marcadores específicos.específicos.

SubpoblacionesSubpoblaciones de Tde T

Mediante anticuerpos Mediante anticuerpos monoclonales marcadosmonoclonales marcadoscon fluorocromos (fluoresceína, rodamina, etc) con fluorocromos (fluoresceína, rodamina, etc) sese pueden marcar las diferentes poblaciones pueden marcar las diferentes poblaciones linfocitarias y cuantificarlas usando un citometro linfocitarias y cuantificarlas usando un citometro de flujo:de flujo:LinfocitosLinfocitos ThTh: CD4+: CD4+LinfocitosLinfocitos TcTc: : CD8CD8++

Las mediciones obtenidas se indican en Las mediciones obtenidas se indican en porcentajes de cada población.porcentajes de cada población.

Evaluación de la Fagocitosis

Prueba del NBT

Es posible observar la Es posible observar la reducción del reducción del nitroazulnitroazul de de tetrazoliotetrazolio(NBT) debido a que (NBT) debido a que éste acepta un éste acepta un protón, cambiando su protón, cambiando su típica coloración típica coloración amarilla transparente amarilla transparente por un azul intenso, por un azul intenso,

TestTest de la reducción de de la reducción de dihidrorodaminadihidrorodamina (DHR).(DHR).

LosLos fagocitosfagocitos reducen reducen lala DHR a un DHR a un compuesto fluorescente en individuos compuesto fluorescente en individuos sanos. sanos. La ausencias de La ausencias de fluorescencia nos fluorescencia nos indicaría que puede tratarse deindicaría que puede tratarse deEnfermedad Granulomatosa CrónicaEnfermedad Granulomatosa Crónicaligada al ligada al X. X.

Índice Fagocítico.Índice Fagocítico. Determina la Determina la capacidad de fagocitar de los leucocitos, capacidad de fagocitar de los leucocitos, pero no el poder para digerir las partículas pero no el poder para digerir las partículas fagocitadas.fagocitadas.

Actividad bactericida.Actividad bactericida. Complementa la Complementa la prueba anterior y determina si las prueba anterior y determina si las bacterias fagocitadas son o no destruidas bacterias fagocitadas son o no destruidas por las por las enzimasenzimas de los de los fagosomasfagosomas de los de los leucocitos.leucocitos.

EritrosedimentaciónEritrosedimentación.. IndiceIndice inespecífico, inespecífico, un valor normal descarta una infección un valor normal descarta una infección bacterianabacteriana..

QuimiotaxiaQuimiotaxia.. Se basan en medir la Se basan en medir la locomoción direccional de los locomoción direccional de los neutrófilosneutrófiloshacia diversos estímulos hacia diversos estímulos quimiotácticosquimiotácticos: : por ejemplo la cpor ejemplo la cámaraámara de de ““BoydenBoyden”.”.

Ventana cutánea de Ventana cutánea de ““RebuckRebuck””Normalmente se presenta un Normalmente se presenta un acúmuloacúmulo de de PMN en las primeras 6 horas, después es PMN en las primeras 6 horas, después es sustituido por uno de linfocitos. sustituido por uno de linfocitos.

QuimioluminiscenciaQuimioluminiscenciaLos Los neutrófilosneutrófilos emiten pequeñas emiten pequeñas cantidades de radiación electromagnética cantidades de radiación electromagnética después de la ingestión de después de la ingestión de microorganismos. microorganismos. Durante la explosión Durante la explosión respiratoria se genera oxígeno molecular respiratoria se genera oxígeno molecular (inestable y muy reactivo) (inestable y muy reactivo) que seque se combina combina con bacterias u otros elementos con bacterias u otros elementos intralisosómicosintralisosómicos formando grupos formando grupos carboxilo de inestabilidad electrónica. carboxilo de inestabilidad electrónica. Cuando estos grupos regresan a su Cuando estos grupos regresan a su estado basal, emiten energía lumínicaestado basal, emiten energía lumínica

Pruebas para células BPruebas para células B• Proteínas (Electroforésis)• IgA, IgE• Isohematoaglutininas AB (IgM)• Anticuerpos Antitoxoide Tetánico (Función IgM)• Anticuerpos Antitoxoide Diftérico (Función IgG)• Anticuerpos Anti Candida • Anticuerpos Anti Neumococo *• Antígeno CD20 (Función de células B)• Subclases de IgG (IDR)*Si estos anticuerpos se administran pre y post vacunación pueden ser

evaluados como una prueba funcional

En la actualidad estas técnicas En la actualidad estas técnicas son de gran utilidad para conocer son de gran utilidad para conocer las poblaciones las poblaciones celulares celulares afectadasafectadas en diferentes en diferentes enfermedades enfermedades