Práctica N_ 1. Aislamiento y Caracterización Del ADN. (1)

8/21/2019 Prctica N_ 1. Aislamiento y Caracterizacin Del ADN. (1)

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INSTITUTO POLITCNICO N CION L

E

scuelaN

acional deC

iencias Biolgicas

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE ADN

Gonzlez Judd Pablo Miguel

Hernndez Acatitla Edwin Arturo

Grupo: 5QV1 Seccin:1

Equipo:5

Introduccin:

El desarrollo de la gentica como ciencia ha dado paso a otras ramas del conocimientoque buscan aplicar las bases tericas dilucidadas por la gentica en cuestiones prcticas,

as a menos de 60 aos de propuesta la estructura fsica del ADN la biotecnologa y labiologa molecular son realidades cercanas a nuestra vida cotidiana pues juegan cada vezpapeles ms grandes en temas centrales de la vida como la salud y la alimentacin, sinembargo muchas de estas aplicaciones tecnolgicas requieren partir de ADN puro paraelaborar secuencias, para identificar y en su caso modificar genes entre muchas otrasaplicaciones, lo cual plantea una dificultad inicial en cualquier trabajo porque en la clulael ADN no se encuentra libre, sino asociado a protenas y a ARN.

As y de manera paralela al desarrollo de estas aplicaciones tecnolgicas han aparecidouna gran cantidad de tcnicas para el aislamiento del ADN y no solo esto, sino que se hanido adaptando las ya existentes para extraer ADN de distintas fuentes y con los mejores

resultados posibles, en general el aislamiento del ADN de las clulas y de otroscomponentes celulares se puede dividir en cuatro etapas:

1) Interrupcin de las funciones celulares2) Lisis celular3) Desproteinizacin y remocin de otros componentes celulares4) Recuperacin del ADN

Las cuales se logran con distintos tratamientos, entre los que conviene mencionar elamplio uso que tienen las enzimas hoy da, para realizar varias de estas funciones, puesto

que tienen la ventaja de ser especficas, para la molcula, o tipo de molculas que sedesean retirar del medio de reaccin. Adicionalmente el hecho de que el ADN sea unamolcula muy tolerante a los cambios de pH permite usar procesos fisicoqumicos ms omenos agresivos, como la desnaturalizacin de protenas para completar la eliminacin dealgunos componentes celulares.


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Sin embargo, para obtener ADN de calidad que no se haya degradado durante el procesoy que est libre de protenas es importante considerar ciertas precauciones generales,adicionales a las buenas prcticas de laboratorio, tal y como son:

1. Usar en todo momento guantes, puesto que las nucleasas presentes en la piel y

otras impurezas podran degradar la muestra. Sin embargo, no es necesariotrabajar en condiciones de esterilidad puesto que a lo largo de la tcnica se usanreactivos que destruirn a cualquier clula contaminante extrayendo tambin suADN, el cual en comparacin al extrado del cultivo origina, representar una nfimaproporcin.

2. Evitar contaminar o alterar los reactivos, lo cual se logra con un uso adecuado delas micropipetas, con la preparacin y conservacin adecuada del material (ej.mantener las enzimas usadas a temperaturas bajas).

3. Evitar movimientos bruscos o agitacin intensa, al igual que pipetear conmicropipeta soluciones donde se sepa o suponga hay ADN libre, puesto que las

fuerzas de friccin lo alteran rompindolo.

En el cuadro n 1, se resumen las principales operaciones desarrolladas durante laprctica para el aislamiento de ADN, junto con un esbozo de su fundamento terico,aunque recalcamos que la tcnica de aislamiento elegida depender de la fuente del ADNy del propsito que se vaya a dar a este.

Cuadro. 1: Pasos de la tcnica de extraccin de ADN cromosmico, para un microorganismo Gramnegativo. Fundamentos tericos.

Reactivo uoperacin Componente conel que interacta Fundamento terico Resultado

Centrifugacin delcultivo

Clulas bacterianas

Permite separar por medio de lafuerza centrfuga a las clulas delmedio de cultivo para concentrarlasen un volumen menor y permitir elposterior lavado

Paquete celucompactado

Lavado con TE(50mM/20mM)

Clulas bacterianas

Eliminar el medio de cultivo (1aadicin de TE), lavando a las clulas,para despus (2a adicin de TE yresuspensin) proporcionar un mediotamponado (pH constante) que

permita la accin de las enzimas autilizar.

Adicionalmente el EDTA secuentraiones divalentes, que son requeridospor muchas enzimas y en especialpor las nucleasas como cofactores, loque impide su accin sobre lamuestra.

Suspensin celuen medio tampona


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RNAsa/IncubacinClulasbacterianas/RNAsa

Las enzimas solo son funcionales enun intervalo de temperatura, por loque la enzima, la cual se mantienerefrigerada, se deja incubar, parapermitir que se active y realiceposteriormente su accin degradativa

sobre el RNA

Suspensin celular

RNAsa activa

Lisozima

SDS

Pared celular

Membrana celular

La lisozima interacta con la paredcelular hidrolizando el enlace B 1,4entre los residuos de N-acetilmurmico y N-acetil-D-glucosamida,lo que expone a la membrana, la cualluego es degradada por el SDS quepor su naturaleza anfipticadesestabiliza a los fosfolpidos de lamisma.

Simultneamente al liberarse el

contenido celular la RNAsa degrada elRNA de la suspensin, dejando comocido nucleico solo al ADN.

Suspensin componentescelulares libres y RNA

TE

NaCl 5 M

Suspensin decomponentes

celulares

La accin de la RNAasa y de los otrosreactivos utilizados puede o noejercer un efecto importante sobre elpH del medio, por lo que se agregarun exceso de regulador (a menorconcentracin, puesto que ya sehaba adicionado), para garantizar laestabilidad del pH. Lo mismo ocurrecon el EDTA del regulador quesecuestrar a los iones divalentes de

la solucin, impidiendo la accin delas nucleasas liberadas con la lisiscelular.

El cloruro de sodio por otra partegarantiza la solubilidad del ADN, parapoderlo separar al realizarextracciones con fenol.

Suspensin componentescelulares libr

tamponada y Asolubilizado

Fenol saturado/extraccin Protenas

Como cido orgnico fuerte y comomolcula polar muy estable, el fenolinteracta con las protenasdesnaturalizndolas.

De forma adicional en la faseorgnica de la mezcla se desplazantodos los componentes lipdicos de lamisma que son solo solubles encompuestos orgnicos.

Solucin de A

libre de protenasrestos celulares

Cloroformo-alcohol isoamlico

ProtenasEste paso completa la remocin deprotenas, por la accindesnaturalizante del cloroformo

Solucin libre protenas


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(compuesto orgnico polar) y lava elfenol utilizado en las extracciones,

Isopropanol ADN

Por su polaridad remueve lasazcares que pudieran quedar ensolucin y al modificar la constantedielctrica de la solucin permite la

separacin del ADN, el cual alcentrifugarse se separa del seno dela solucin.

ADN precipitado lib

Etanol 70% ADN

Resuspende al ADN y permite supufiricacin al evaporarse si se utilizaen solucin, modifica la constantedielctrica de la misma y permiteigualmente separar al ADN ya librede otros componentes.

ADN

Objetivos:

Aislar ADN cromosmico de peso molecular alto, a partir de un cultivo bacteriano. Establecer el espectro de absorcin del ADN aislado. Determinar la concentracin y grado de pureza del ADN obtenido.

Adicionalmente mediante el uso del programa DNAMAN se busc:

Construir diferentes secuencias de ADN. Determinar para cada una de ellas, la temperatura media de desnaturalizacin. Determinar para cada una de ellas la influencia de las caractersticas de la

secuencia en la desnaturalizacin del ADN.

Materiales y mtodos:

Confrntese el manual de laboratorio EXPERIMENTOS EN GENTICA MICROBIANA, paravislumbrar el protocolo utilizado para la realizacin de la prctica el cual se sigui como secita, salvo, la acotacin puntualizada abajo.

Para la extraccin de ADN se sigui el apartado A, punto b. Cromosmico de unmicroorganismos Gram negativo (ejemplo Escherichia coli) la nica modificacin aintroducida en el trabaja, se hizo en este apartado en el punto n 8, donde seadicionaron, en lugar de proteinasa K, 50 L de lisozima.

Resultados:

Habiendo trabajado con la cepa W3350 de Escherichia coli, se aisl el ADN, segn elprotocolo indicado, el ADN seco fue re suspendido en 200L de agua estril, para medir


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sus absorbancias por espectrofotometra de radiacin ultravioleta y con esos datoscalcular la pureza y al concentracin final de ADN, datos que se resumen en el cuadro 2.

Cuadro. 2: Absorbancia a distintas longitudes de onda, concentraciones y pureza del ADN obtenidoa partir de E. coli(Seccin 1, Gpo. 5QV1).

Concentracin de DNA g

Equipo A260 nm A280 nm Pureza Formula Relacin1 0.1496 0.0848 1.76 6.64 7.482 0.095 0.028 3.39 4.22 4.753 0.1345 0.0843 1.59 5.97 6.724 0.822 0.384 1.94 36.5 41.15 0.1375 0.0753 1.82 6.11 6.87

Se denotan los resultados del equipo 5, donde se obtuvo una pureza de 1.82, la cual es apropiada paratrabajar, ntese adicionalmente la variacin que existe entre la concentracin de ADN calculada segn la

frmula y segn la relacin, que vara en un 10% aproximadamente.

Igualmente por espectrofotometra de radiacin ultravioleta se construy el espectro deabsorcin del ADN obtenido, haciendo un barrido de longitudes de onda desde los 220hasta los 280 nm, en intervalos de 10 en 10 nm. Los resultados de este espectro deabsorcin se muestran en el cuadro 3 y en el grfico 1. Este espectro fue construido solopor los equipos de trabajo 2 y 4, por lo que se muestran los resultados del equipo 4.

Cuadro. 3: Espectro de absorcin del ADN obtenido a partir de E. coli (Seccin 1, Gpo. 5QV1).

Longitud de onda Absorbancia

220 0.716230 0.403240 0.505250 0.761260 0.822270 0.636280 0.384


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Grfico. 1: Espectro de absorcin del ADN obtenido a partir de E. coli (Seccin 1, Gpo. 5QV1).

Los resultados obtenidos haciendo uso del programa informtico DNAMAN se anexan tal ycomo fueron arrojados por el mismo, al final de la prctica como anexo 1.

Discusin de resultados:

El trabajo realizo, puede evaluarse con respecto a dos parmetros, la pureza y laconcentracin del ADN en general, puede decirse que la tcnica siempre que seacomprendida y por lo tanto aplicada al pie de la letra no presenta gran dificultad operativapor lo que los errores que pudieras presentarse difcilmente pudieran achacarse aloperario, a menos claro que este no se hubiera familiarizado de antemano con la tcnica,no la comprendiera o fuese en extremo descuidado.

Otros factores de variacin que pudieran introducirse en al tcnica sera la preparacin yel manejo de los reactivos, como es el caso de las enzimas y su ya citada (cfr.introduccin) termolabilidad, otro ejemplo notable de variaciones en este sentido, pudieraintroducirlo el SDS que no debe de almacenarse a bajas temperaturas por que en talescondiciones precipita.

Los errores introducidos en las determinaciones por los instrumentos y equipos sera muydifciles de detectar dado que las magnitudes de medida utilizadas escapan a lapercepcin humana, sin embargo, estos errores pudieras evitarse dado al equipo su

mantenimiento preventivo y cuidando al mximo las condiciones de trabajo, para usarlode la mejor manera.

Salvo las variaciones ya comentadas, en general el espectro obtenido, permite observarque el ADN aislado tiene un alto grado de pureza, puesto que presenta un solo mximo deabsorbancia a 260nm, tal y como lo refiere la bibliografa, cuestin que adems secomplementa con el clculo terico de la pureza que al dar un valor de 1.82 indica que el% de protenas existentes es muy bajo y permitira trabajar con la muestra como si fuera

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

220 230 240 250 260 270 280

Absorb

ancia

Longitud de onda nm


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ADN puro, puesto que este clculo no hace sino relacionar la cantidad de protenas con lade ADN.

La cantidad de ADN aislada variar segn el clculo que se utilice para determinar dichovalor, pues este se mide indirectamente por la absorbancia de la muestra a 260 nm, sin

embargo esta variacin no excede el 10% por lo que se puede decir que se aislaron entre6.11 y 6.87 g de ADN.

Para la construccin de espectro se tom la muestra de mayor pureza, puesto que en allase esperaban menos interferencias, pero las conclusiones arrojadas por este espectro bienson vlidas para nuestro equipo puesto que la pureza es similar. An as cabe hacersemencin de que para la construccin del espectro se tom la pureza ms alta, pero alhacerse una segunda lectura con el mismo instrumento aparicin un segundo dato conuna pureza mayo cuestin que puede deberse al manejo del aparato que mostraba elgrfico de manera directa sin tomar individualmente las lecturas, an cuando con cada

cambio de longitud de onda debiera ajustarse la lectura a 0 con el blanco.Finalmente y con respecto al uso del programa DNAMAN se encontr, tal y como lopredice la bibliografa que a mayor % de G-C la Tm aumenta significativamente, cuestincierta, an para cambios en apariencia pequeos del % de G-C, toda variacin encontradaaqu corresponder a la secuencia misma, obedeciendo en primer lugar al % de G-C ydespus a la longitud de la cadena, pues an para cadenas con secuencias diferentes peromisma longitud y mismo % de G-C la Tm, permaneca en intervalos muy estrechos.

Como perspectivas de este trabajo sera interesante analizar computacionalmentecadenas ms largas y experimentalmente probar distintas tcnicas de extraccin

comparndolas entre s a la hora de calcular rendimientos y pureza, para as proponer unatcnica mejorada, para el trabajo rutinario en el laboratorio de gentica microbiana.

Conclusiones:

Se logr aislar ADN cromosmico de Escherichia coli, en cultivo. Se logr construir el espectro de absorcin del ADN aislado encontrndose que

presenta un mximo de absorcin a 260 nm. Se determin que se aislaron en total 6.11-6.87 g de ADN con una pureza de

1.82. Mediante el uso del programa DNAMAN se construyeron 9 diferentes secuencias de

ADN a las cuales se les determin computacionalmente la temperatura media dedesnaturalizacin, encontrndose que esa aumenta conforme en la secuenciaaumenta la proporcin de G-C.

Referencias bibliogrficas:


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