Extracción de ADN de tejidos animales y vegetales.

I. INTRODUCCIÓN

Todos los seres vivos están formados por células que son la mínima

organización supramolecular, que cumplen con todas las

características de los seres vivos. Estas están compuestas por: -una

membrana plasmática o celular, conocida como plasmalema,

compuesta por una doble capa de fosfolípidos en la que están

inmersas diferentes proteínas; -una matriz citoplasmática o

citoplasma que consiste en un gel casi liquido compuesto por agua, en

el que están inmersas moléculas y macromoléculas libres, como

glúcidos, lípidos, aminoácidos y proteínas; -material genético o

cromatina, que les permite autoduplicarse y transmitir a su

descendencia las características de la especie, y que está formado por

ácido desoxirribonucleico (ADN) asociado a proteínas (histonas),

situado en el núcleo de las células eucariotas; el núcleo esta formado

por un carioplasma (sustancia viscosa en estado de gel, con ácidos

nucleicos, aminoácidos, nucleótidos, proteínas, glucógeno, etc.) y

rodeado por una doble membrana: la carioteca o envoltura nuclear. 

El ADN constituye el material hereditario de un individuo. En él están

escritas las instrucciones que deben seguir las células para construir

un organismo y mantenerlo vivo. Todas las células que forman un

individuo contienen una copia idéntica del ADN. Cada una de ellas, sin

embargo, lee una parte de estas instrucciones y por eso hay células

con diferentes formas y funciones. Está formado por

Desoxirribonucleótidos (A, G, C, T), que a su vez están formados de

desoxirribosa y un ion fosfato. La proporción y la secuencia de las

bases nitrogenadas diferencian a los polinucleótidos. Estructuralmente

la molécula de ADN se presenta en forma de dos cadenas helicoidales

enrolladas alrededor de un mismo eje (imaginario); las cadenas están

unidas entre sí por las bases que la hacen en pares. Los

apareamientos son siempre adenina-timina y citosina-guanina. Desde

el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es

decir, un polinucleótido. Un polímero es un compuesto formado por

muchas unidades simples conectadas entre sí. En el ADN,

cada unidad es un nucleótido, y cada nucleótido, a su vez, está

formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que

puede ser adenina, timina, citosina o guanina) y un grupo fosfato que

actúa como enganche de cada unidad con la siguiente. Lo que

distingue a un nucleótido de otro es, entonces, la base nitrogenada, y

por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando sólo la

secuencia de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro

bases a lo largo de la cadena es la que codifica la información

genética. En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble

cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí

por unas conexiones denominadas puentes de hidrógeno.

II. OBJETIVOS

Extraer el ADN a partir de una muestra biológica.

Reconocer microscópicamente el ADN, haciendo uso de un colorante.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de

que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN,

permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza

por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su

contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el

ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de

restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en

menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se

habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por

acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa

mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza etanol.

El ácido desoxirribonucleico (DNA) es la molécula que contiene y

transmite la información genética de los organismos, excepto en algunos

tipos de virus. Está formado por dos cadenas complementarias de

nucleótidos que se enrollan entre sí formando una doble hélice que se

mantiene unida por enlaces de hidrógeno entre bases complementarias.

Los cuatro nucleótidos que forman el DNA contienen las bases adenina

(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). El modo en que funciona una

célula depende de su DNA, que actúa como un plano o como un

conjunto de instrucciones, y es el encargado de codificar todo lo que

nosotros somos, desde el color del pelo hasta las proteínas que tenemos

en nuestra sangre. El conjunto completo del DNA de un organismo se

conoce como su genoma. La extracción de DNA requiere una serie de

etapas básicas. En primer lugar, se tienen que romper tanto la pared

celular (en el caso de tratarse de células vegetales) como la membrana

plasmática, para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación,

debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el DNA.

Por último, hay que proteger el DNA de enzimas que puedan degradarlo

y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.

En esta práctica, simplemente utilizando detergente, papaína (del zumo

de piña), y etanol, el DNA puede obtenerse tanto de frutas como la fresa

u hortalizas como la cebolla.

IV. MATERIALES Y EQUIPOS

Proporcionado por el

laboratorio

Solución salina

fisiológica.

Solución de cloruro de

sodio 2M.

Colorante de Acridina o

Safranina.

Mortero.

Vasos de precipitación.

Plátano molido

(aprox. 10 gr)

60 ml de detergente líquido

Papel filtro

Alcohol etílico al 96%

Balanza Hígado molido

(aprox. 10gr)

Varillas de agitación.

Pipetas de 10ml.

Embudo de vidrio.

Laminas portaobjetos.

V. PROCEDIMIENTO

1. triturar 10 gr de hígado de pollo con 15 ml de SSF.

2. Filtrar la mezcla para eliminar restos de tejido.

3. Agregar una solución de NaCl 2 M en igual volumen que el filtrado.

4. Lugo añadir 1 ml de detergente y con una varilla agitar durante 10 minutos.

5. En un vaso de preciptado añadir la muestra y por la paredes agregar alcohol lentamente hasta que se formen dos capas, en la interfase está el ADN.

6. Con una varilla ir moviendo en el mismo sentido, hasta formarse una fibra blanquesina a simple vista (ADN).

7. Realizas un preparación en fresco sancando una fibra de ADN y depositándolo e una lámina portaobjetos y agregar el colorante.

8. Dejar actuar el colorante durante 2 minutos. Llevar al microscópio y obrvar su estructura fibrilar.

VI. RESULTADOS

A. Extracción del ADN del Hígado y plátano

a. Rompimiento de membranas y paredes celulares

b. Ruptura de núcleos

c. Separación de proteínas, carbohidratos y lípidos

Lo mismo se repite para el plátano

Plátano triturado Hígado triturado

Muestra del hígado y plátano ya agregado el detergente

Ruptura de la muestra del hígado y plátano

d. Precipitación del ADN

Muestra del plátano ya agregado alcohol. Y vista de la fibra de ADN.

Muestra del hígado ya agregado el alcohol. Y vista de la fibra de ADN.

e. Observación microscópica del ADN

VII. DISCUSIONES

El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN

puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN.

Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas

que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se

unan al ADN.

Las células vegetales son distinguibles de las células

animales por su pared celular rígida y orgánulos como el

cloroplasto. También contienen proteínas y enzimas que

juegan un papel en la fotosíntesis. Algunas células de las

plantas son poliploides, lo que significa que tienen más de

una copia de cada cromosoma por célula. Los procesos

celulares que ocurren en las plantas tales como la

Muestra del Hígado en el microscopio.

Muestra del plátano en el microscopio.

fotosíntesis producen una gama de metabolitos secundarios.

Las células animales no tienen una pared celular, pero

todavía necesitan ser tratadas con productos químicos como

el dodecilsulfato sódico (SDS) para romper la membrana

celular para liberar el ADN genómico.

El ADN genómico de las plantas es más difícil de extraer a

causa de la pared celular de la planta, que se elimina por

homogeneización o mediante la adición de celulasa para

degradar la celulosa que forma la pared celular. Además, los

metabolitos presentes en la célula vegetal pueden interferir

con la extracción de ADN genómico por la contaminación de

la muestra de ADN durante el proceso de precipitación.

Los leucocitos de sangre periféricos son una fuente principal

de ADN genómico en animales, pero la recogida de muestras

es difícil ya que la sangre debe ser retirada del animal. La

sangre contiene una serie de compuestos como proteínas,

lípidos, glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas y plasma,

que pueden contaminar la muestra de ADN. El contaminante

principal del ADN de animal extraído por muestras de sangre

es hemo, el componente no proteíco de la hemoglobina.

Las diferencias entre el ADN de las plantas y los animales se

encuentra en la secuencia de bases en la hélice. Los

compuestos que se encuentran en las células vegetales

están ausentes en las células animales y las secuencias de

bases de ADN reflejan esto, puesto que el ADN genómico de

la planta es a menudo mayor que el ADN de los animales.

Estas diferencias afectan los métodos de extracción, ya que

impacta en el rendimiento y la pureza del ADN.

La observación de ADN como filamentos blanquecinos no ha

sido posible debido al vencimiento de la proteasa peptina. La

función de la encima proteolítica es proteger al ADN de

enzimas que puedan degradarlo y elimina las proteínas que

puedan contaminar al ADN y aquellas que se encuentran en

el núcleo celular. A partir de esto el ADN no se pudo ver

porque quedó atrapado en el núcleo celular donde, al no

funcionar la peptina, no se pudieron degradar las

membranas proteicas que recubren al ADN, haciendo que no

se desenrolle y salga al exterior.

Si la peptina hubiese separado al ADN de las proteínas

hubiera sucedido la precipitación del mismo ante la

presencia del alcohol para luego extraerlo de la solución. De

esta manera habríamos obtenido como resultado final la

aparición de fibras blanquecinas de ADN.

VIII. CONCLUCIONES

1. En esta práctica se logró el objetivo principal y planteado que es la

extracción del ADN en este caso fue de tejido animal, todo esto

siguiendo una serie de pasos para poder lograrlo, así se pudo

separar de otros componentes como proteínas, lípidos,

carbohidratos y se pudo distinguir cual era cual y el resultado final

fue la extracción y separación del ADN.

2. Para la obtención del ADN en las de tejidos vegetales suele ser

más compleja que en la de tejidos animales debido a su pared

celular.

3. Existen otros colorantes aparte del colorante de safranina o

acridina como; El bromuro de etidio, SYBR Green y Poliacrilamida.

4. Se considera a la pectina proteolítica como el único factor que

llevó a la falla de la experimentación ya que los pasos del

procedimiento fueron llevados a cabo.

5. En otro caso para poder cuantificar la cantidad de ADN Primero

separando bien el ADN de la muestra y después usando la técnica

de PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

IX. CUESTIONARIO

1. ¿Qué muestras biológicas se puede utilizar para extraer ADN?

Para la obtención de ADN se puede utilizar cualquier muestra

biológica que cuente con enzimas ya que estas son las que

contienen el ADN.

2. ¿Cuál es el método estructural del ADN?

El ADN dentro del núcleo celular se encuentra enrollado y

comprimido, haciendo que su diámetro sea de 2nm. Pero es

posible verlo a simple vista luego de la experimentación ya que

el ADN al encontrarse fuera del núcleo, se desenrolla

aumentando su volumen al ocupar más espacio.

3. ¿Qué otros colorantes podrían ser utilizados para

visualizar ADN?

Entre otros tenemos al El bromuro de etidio, SYBR Green

Poliacrilamida, Agarosa y Almidón

4. ¿Cuál es la importancia de la práctica?

La importancia es que ya se conoce como encontrar el ADN y en que

partes específicas se puede encontrar, también para conocer cuáles

son los métodos más utilizados para el reconocimiento de este.

X. BIBLIOGRAFÍA

1. Mary K. Campbell,Shawn O. Farrell, Bioquímica. Editorial Cengage learning. 30/11/2006 - 844 páginas.

2. Helena Curtis, Sue James, Adriana Schnek. Biología, editorial médica panamericana, séptima edición.