PID 9049 Detección de Escherichia coli productor de … · Detección de Escherichia coli...

Universidad Nacional de Entre Ríos. ISSN 2250-4559. Eva Perón 24; 3260 FIB Concepción del Uruguay, Entre Ríos, Argentina. Tel: 54-03442-421558/421530, http://www.revistacdyt.uner.edu.ar/suplemento/

PID 9049 Detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga a partir de bovinos, agua ambiental y muestras clínicas (Gualeguaychú, Entre Ríos) Tanaro J.D.*; Leotta G.A.**; Lound L.H.*; Deza N.**; Ledri S.E.*; Carbonari C.**; Piaggio M.C.*; Rivas M..** Autores: * Facultad de Bromatología UNER (Gualeguaychú, Argentina); ** Servicio de Fisiopatogenia INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” (Buenos Aires, Argentina) Contacto: [email protected]

Resumen Desde setiembre/2005 hasta agosto/2006 se investigó Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC), en 288 muestras de hisopados rectales bovinos y 79 de cursos de agua de un establecimiento rural próximo al casco urbano de la ciudad de Gualeguaychú, y en heces diarreicas con evidencia de sangre de 30 niños que concurrieron en ese mismo período al hospital local. En 135 (46,9%) de las muestras animales, se detectaron los genes stx1 y/o stx2, en tanto que en 9 (3,1%) se detectó la presencia de los genes rfbO157, stx1 y/o stx2, y se aislaron 11 cepas que portaron los genes rfbO157, stx1 y/o stx2. En 26 (32,9%) de las muestras de agua, se detectaron los genes stx1 y/o stx2, y en 4 (5,1%), rfbO157/stx1 y/o stx2, y se aislaron 4 cepas STEC, dos portadoras del gen stx2, una de stx1/stx2 y una de stx2/rfbO157/eae/ehxA/fliCh7. No hubo aislamientos de STEC en muestras clínicas dentro del lapso en estudio. Se observó una marcada diferencia entre las cepas obtenidas del agua y de los bovinos en lo que respecta a la frecuencia del serotipo O157:H7, y a la portación de factores de virulencia. No se aislaron cepas en un tercio de las muestras acuáticas positivas al tamizaje por PCR. Se confirmó en bovinos criados a campo una importante prevalencia de STEC. En el presente muestreo no pudo verificarse ningún clúster de origen mixto (animal y ambiental) de E. coli O157, pero sí la presencia de dos cepas STEC no-O157 (O124:H19) con patrón XbaI-PFGE indistinguible aisladas a partir de hisopos rectales y el agua con un intervalo de 5 meses con genotipo stx1/stx2/saa/ehxA. Algunos patrones XbaI-PFGE identificados en el presente estudio fueron idénticos a los perfiles de cepas aisladas de humanos, alimentos y fuentes de origen animal incluidas en la Base de Datos de PulseNet Argentina. Palabras clave: Escherichia coli, toxina Shiga, agua, bovinos, SUH. I. Introducción

Escherichia coli es un comensal habitual del intestino de animales de sangre caliente. Pero también es el agente productor de infecciones urinarias más frecuentes, puede causar sepsis y meningitis neonatal y, como patógeno gastrointestinal, exhibe una diversidad de mecanismos patogénicos. Las cepas que provocan enfermedad diarreica se clasifican actualmente en seis diferentes categorías basadas en los factores de virulencia que portan, en los mecanismos de patogenicidad, los síndromes clínicos que generan, y los antígenos somáticos y flagelares. Para establecer algunas de ellas se apela a técnicas microbiológicas sofisticadas que exceden la capacidad de diagnóstico de los laboratorios microbiológicos de rutina.

E. coli enterohemorrágico (EHEC) es un subgrupo dentro de E. coli productor de toxina Shiga (STEC), que además de la capacidad de producir toxinas, poseen adhesinas para colonizar el intestino y otros factores de virulencia.

Para establecer las diferencias en la virulencia de las cepas STEC, Karmali et al. (2003) establecieron cinco seropatotipos basándose en la incidencia de los distintos serotipos en

+6enfermedad humana, y la relación de los diferentes serotipos con perfiles genéticos característicos. Los seropatotipos más virulentos están asociados a brotes epidémicos y a enfermedad humana severa, consistente en microangiopatías trombóticas. Estas son desórdenes oclusivos microvasculares que se caracterizan por la agregación sistémica o intrarrenal de plaquetas, con trombocitopenia y lisis de eritrocitos. En el síndrome urémico hemolítico (SUH), los trombos fibrino-plaquetarios se depositan predominantemente en la circulación renal (Elliott y Nichols, 2001).

TANARO, J.D. et al. Detección de Escherichia coli …

En la púrpura trombótica trombocitopénica (PTT), la agregación microvascular generalizada de las plaquetas produce isquemia en distintos órganos, con predominio del cerebro.

El fenómeno de emergencia de nuevos patógenos se relaciona con múltiples factores: cambios ambientales, tecnológicos, socioculturales y a la evolución misma de los microorganismos. La virulencia está asociada a la presencia de ciertos genes que pueden adquirirse por transferencia horizontal de elementos genéticos móviles (plásmidos, fagos lisogénicos, etc.) y por evolución de islas de patogenicidad cromosómicas, de modo que aparecen ventajas adaptativas.

Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) emergentes, en particular, están asociadas a múltiples cambios globales: crecimiento poblacional y pobreza, urbanización desordenada, incremento del comercio, nuevos productos alimenticios y tecnologías de procesamiento, el uso de sistemas de distribución rápida de alimentos, cambios de hábitos y tendencias de consumo, la existencia de poblaciones especialmente susceptibles.

Escherichia coli O157:H7 fue reconocido entre los agentes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) emergentes cuando se asoció este serotipo con dos brotes de colitis hemorrágica en 1982 (Centers for Disease Control, 1982). Luego se observó que compartiendo similar potencial patogénico existen más de 150 serotipos.

La aparición de este patógeno con particulares características, como una baja dosis infectiva y tolerancia a los ácidos, condujo a una revisión de los conceptos aceptados sobre tiempo/temperatura y acidez para preservar los alimentos de gérmenes nocivos y dio origen a una nueva legislación. En 1994, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) obligó a etiquetar los alimentos en relación al manejo sanitario de productos cárnicos y avícolas, y luego reglamentó el sistema de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP), requiriendo que muchas compañías incluyan EHEC al identificar los peligros en sus planes HACCP. La nueva legislación otorgó a USDA competencia para retirar productos del mercado y se realizaron grandes decomisos por detección de E. coli O157:H7.

En mayo de 2004 se incluyó en el Código Alimentario Argentino el artículo 156 tris y se modificaron los artículos 255 y 302, que contemplan la detección de E. coli O157:H7/NM en 5 muestras de 65 g cada una, en productos preparados a base de carne picada una vez cocidos, en carne picada fresca y chacinados frescos, recomendando utilizar la metodología validada por USDA/FSIS.

Escherichia coli O157:H7 tiene alto impacto en nuestro país. El SUH post-entérico es endémico en Argentina. La incidencia estimada oscila entre 9,2 y 13,9 casos por cada 100.000 niños menores de 5 años, con una mortalidad de 3,4% (2005), y más de 7.000 casos han sido registrados desde 1965. En fechas recientes se ha visto un aumento de casos en adultos y jóvenes.

Los costos económicos son muy altos, e incluyen tanto los de internación como la atención posterior de los pacientes con secuelas, la pérdida de días laborales de los adultos, etc. Un estudio realizado en el Hospital Nacional de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahan” (Caletti, María Gracia, Servicio de Nefrología, Hospital Garrahan, 2006) demostró el elevado costo para tratar 213 casos de SUH durante el año 2005. Por otro lado, existen consecuencias comerciales en la exportación de productos agropecuarios.

Las enfermedades causadas por STEC son zoonosis, más precisamente ántropo-zoonosis, enfermedad humana que puede transmitirse de animales a personas. La vía de infección es fecal-oral. La muy baja dosis infectiva -10 a 100 bacterias por gramo de alimento- permite la transmisión por contacto directo con animales y la interpersonal. A diferencia de Shigella (con la cual comparte poseer una muy baja dosis infectiva), los brotes ocurren sin extenderse al resto de la comunidad, y dentro de las Enfermedades Emergentes, se la considera de aquéllas que causan brotes autolimitados. La ecología de este patógeno no ha terminado de comprenderse en su totalidad aunque hay también muchos ítems aceptados sobre la vía de transmisión y el reservorio: - Los vehículos alimenticios son muy diversos (productos cárnicos insuficientemente cocidos,

vegetales crudos, jugos no pasteurizados, etc.). - Su baja dosis infectiva permite la infección por contacto de portadores, posiblemente la principal vía

que infecta a los lactantes. - Tiene una peculiar resistencia, que permite su supervivencia en alimentos ácidos (embutidos

fermentados, etc.) - El principal reservorio de la bacteria son los rumiantes (aunque hay portadores humanos y

animales). En distintos países, entre los que se incluye a la Argentina, se realizaron numerosos estudios

sobre la prevalencia de STEC que permitieron confirmar el rol del ganado vacuno como principal reservorio. La bacteria no es patógena para el ganado, con excepción de casos en neonatos bovinos. La colonización es de menos de 2 meses de duración y la portación fecal es más frecuente en el

Ciencia , Docencia y Tecnología Sup lemento | Año I I I | Nº 3 | 2013

ganado joven (2 a 24 meses) que en el ganado adulto. Las ovejas y las cabras también son reservorios de STEC, pero además se los ha encontrado en forma transitoria en multitud de animales silvestres y de corral, como cerdos, caballos, aves e inclusive mascotas habituales como perros y gatos.

El agua es uno de los vehículos de transmisión de STEC al ser humano, en forma directa o indirecta (Hrudey et al., 2003; Geldreich et al., 1992; Swerdlow et al., 1992). Puede sobrevivir en vegetales frescos contaminados por la fertilización de los cultivos con materia fecal animal utilizada como abono, o por agua de regadío contaminada. Pero también puede ser ingerida desde aguas recreacionales. En el 2003, ocurrió un brote en la ciudad de Paraná, Entre Ríos, donde cuatro niños que se bañaban en una pileta presentaron diarrea sanguinolenta (uno con SUH), pudiéndose aislar E. coli O157:H7.

¿Cuánta importancia tiene el agua en la permanencia del patógeno en el reservorio? Las aguas superficiales contaminadas con las heces del ganado son una vía de diseminación entre los animales. Tradicionalmente, la presencia de E. coli en agua se consideró como un indicador de contaminación fecal reciente (Standard methods for the examination of water and wastewater. 1998), suponiendo la difícil supervivencia en el ambiente extraintestinal. Sin embargo, hoy se sabe que esta bacteria puede permanecer en fase estacionaria durante largos periodos de tiempo en el medio ambiente, para lo cual estarían implicados genes como el rpoS, que codifica para el Factor σ (Sigma), que controla regulones específicos que se activan en determinadas condiciones de estrés (Paton et al., 1998a). Esto ha conducido a proponer al medio acuático como un potencial reservorio de E. coli (Lee Lang et al.,1994; Grant et al.,1996; Kurokawa et al.,1999). Debe, además, considerarse que los fagos libres en el medio acuático son un reservorio de los genes de virulencia.

Existe un consenso sobre la dificultad de lograr la erradicación completa de los animales portadores de STEC, entre otras causas debido a la naturaleza transitoria de la infección en un rodeo y a la dificultad en la detección en las heces animales con bajos números de STEC (Caprioli et al., 2005). Se han hecho diversas recomendaciones acerca de la sanitización de los abrevaderos como forma de prevenir el contagio. Esas estrategias válidas, donde los animales tienen restringido su movimiento, pueden ser muy poco efectivas en otros contextos de producción donde los animales se desplazan libremente. Por ejemplo, en el área donde se realizó este estudio, con charcos o lagunas accesibles a los animales. II. Objetivos -Aislar y caracterizar durante un año cepas STEC en bovinos de engorde en un establecimiento del Departamento Gualeguaychú, y en cursos de agua en la misma área de cría. -Aislar y caracterizar eventuales cepas de STEC de origen clínico en el Departamento citado. III. Materiales y métodos III.1. Área de estudio y período de muestreo

El campo en el cual se realizó el estudio tiene una superficie de 80 hectáreas. Ubicado entre la ciudad de Gualeguaychú, de la cual está separado por un parque y el río homónimo, y el municipio de Pueblo General Belgrano. En las proximidades se encuentra un centro turístico termal.

Hay dos pequeños cursos de agua, uno dentro del campo y otro por afuera, pero que por el declive del terreno recibe las escorrentías posteriores a las precipitaciones pluviales.

Los animales se crían con un sistema de pastoreo diurno en áreas de delimitadas por alambradas eléctricas y suplementos dietéticos (granos, fibras y núcleo proteínico) que se proporcionan en corrales de encierro nocturno. El número permanente de bovinos es de unos 150, los cuales se compran en forma aleatoria en subastas, según criterios de conveniencia comercial. En general se trata de animales en torno a los dos años de edad, que permanecen en el establecimiento hasta alcanzar un peso mínimo de unos cuatrocientos kilogramos, luego de lo cual son faenados en un frigorífico local.

El muestreo se realizó en el curso de un año, desde septiembre de 2005 hasta agosto de 2006. III.2. Procesamiento de las muestras

La búsqueda de E. coli O157:H7/NM se basó en lo que se considera la técnica Gold Standard, la separación inmunomagnética (IMS), y se usaron caldos de enriquecimiento adicionados de inhibidores de otros gérmenes asociados. Para el aislamiento de colonias presuntivas se utilizaron


dos medios sólidos, uno cromogénico, O157:H7 ID™ (bioMerieux, Marcy-l’Etoile, Francia), y agar MacConkey sorbitol (Biokar) adicionado de telurito de potasio y cefixima (TC-SMAC) (bioMerieux)..

La búsqueda de STEC, a partir de colonias presuntivas en placas de agar MacConkey, se basó en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) como medio de tamizaje y para establecer los diversos factores de virulencia.

Macrorrestricción y electroforesis de campo pulsado

Esta metodologia (Strockbine et al., 1989) permite observar el polimorfismo genético existente en una población bacteriana, a través de diferencias en los patrones de restricción del ADN genómico. Se basa en la utilización de enzimas de restricción de corte poco frecuente, que generan diez a veinte fragmentos grandes (de 40 a 500 kb), los cuales son luego separados por la aplicación de campos eléctricos alternados durante la electroforesis. En este trabajo se utilizó el protocolo estandarizado de la red PulseNet América Latina, que usa como marcador molecular Salmonella Braenderup H9812. El análisis de los patrones moleculares individuales se realizó con el programa informático BioNumerics versión 3.0 (Applied Maths BVBA, Kortrijk, Bélgica) y en la interpretación se siguieron los criterios de Tenover (número de bandas de diferencia para definir clonalidad) (Tenover et al., 1995). III.2.1. Muestras de ganado bovino

a. Tamaño y distribución de las muestras Para establecer el número de animales a estudiar se utilizó el programa Epi Info versión 6 (Dean et al., 1996). Para disponer de una muestra estadísticamente significativa se asumió una prevalencia de STEC O157 del 10% (Meichtri et al., 2004, Hancock et al., 1994, Keene et al., 2006), un nivel de confianza del 95%, y un error del 5%, sobre una población constante de 150 animales por estación. El tamaño de muestra calculado fue de 72 animales por estación. Las muestras fueron tomadas en el primer mes de cada estación. En el transcurso del año de estudio (septiembre/2005-agosto/2006) se analizaron un total de 288 muestras.

b. Obtención de las muestras Las muestras se obtuvieron mediante hisopados rectales (Rice et al., 2003).

c. Procesamiento Se estriaron por agotamiento placas de agar MacConkey, las cuales fueron incubadas a 37ºC durante 24 h. Luego los mismos hisopos fueron colocados en tubos con 15 ml de caldo EC modificado (Biokar) con novobiocina 20 mg/l (Sigma Chemical co. St. Louis, USA) (ECm+N) e incubados a 42ºC por 24 h. Posteriormente, se realizaron pools cada tres de los caldos enriquecidos, y se procesó 1 ml de éstos acorde con la metodología basada en la separación inmunomagnética (Wright et al.,1994). Para la detección de E. coli O157 se utilizaron perlas inmunomagnéticas (DYNABEADS® DYNAL, Compiàgne, Francia). Finalmente, se obtuvieron 100 µl del concentrado, los cuales fueron sembrados por agotamiento en placas de O157:H7 ID™ (bioMerieux, Marcy-l’Etoile, Francia), y agar MacConkey sorbitol (Biokar) adicionado de telurito de potasio y cefixima (TC-SMAC) (bioMerieux). Una vez obtenidos los aislamientos presuntivos, se realizaron las siguientes pruebas: agar hierro tres azúcares (T.S.I.) (Biokar), medio sulfuro-indol-movilidad (S.I.M.) (Laboratorio Britania, Buenos Aires, Argentina) y seroagrupamiento O157 presuntivo en portaobjetos utilizando antisuero específico provisto por el Servicio Sueros y Antígenos (INPB – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”). Paralelamente, se realizaron pools de diez colonias presuntivas de las placas de MAC en un tubo con tritón 1X, a la vez que se repicaron en una placa de agar MacConkey grillada. Cada pool y una ansada de la zona confluente de la primer estría fueron analizados por PCR múltiple para la detección de los genes stx1, stx2, y rfbO157 (Leotta et al.,2005). Se utilizaron los cebadores diseñados por Pollard et al. (Pollard et al.,1990), que amplifican un fragmento de 130 pb de la región del gen stx1, correspondiente a la subunidad B para Stx1, y un fragmento de 346 pb de la región del gen stx2, correspondiente a la subunidad A para Stx2, y los cebadores diseñados por Paton et al. (Paton et al., 1998b), que amplifican un fragmento de 259 pb del gen rfbO157 correspondiente a una proteína involucrada en la síntesis del LPS O157. En la Figura 1 se presentan las secuencias de cada uno de los cebadores utilizados. A partir de las placas grilladas, y por PCR múltiple, se identificaron las colonias portadoras del gen rfbO157 de cada uno de los pools positivos (Figura 1).


Tabla 1. Secuencia de cada uno de los cebadores utilizados

Figura 1. Procesamiento de las muestras colectadas de bovinos

________Hisopado rectal ________

↓ ↓

Placa de MAC a 37ºC 24 h 15 ml ECm+N a 42ºC 24 h

↓ ↓

PCR-múltiple IMS a 1 mlZona de confluencia + pooles ↓

hasta obtener cepas aisladas TC-SMAC + ID ó CHR

↓ Colonias presuntivas

↓

Caracterización fenotípica y genotípica ← PCR-múltiple


III.2.2. Muestras de agua ambiental a. Obtención de las muestras y procesamiento Entre septiembre de 2005 y agosto de 2006 se tomaron 79 muestras de agua. La frecuencia de muestreo fue semanal, eligiendo en los días lluviosos, dos o más puntos correspondientes a pequeños vertederos que drenan el agua que se acumula en el campo en estudio. Las muestras se tomaron con hisopos de Moore (OPS, 1997), los cuáles se colocaron en los cursos de agua, de a pares y durante 24 h. Los hisopos de cada punto de muestreo fueron paralelamente colocados in situ en frascos con 100 ml de caldo ECm+N (Biokar) y de caldo EC. Luego, fueron transportados hasta el laboratorio, donde se incubaron, respectivamente, a 42ºC y a 37ºC durante 24 h.

La búsqueda, el aislamiento y la caracterización de E. coli O157:H7/NM y de cepas STEC se realizó a partir del caldo enriquecido según la metodología descripta en el punto III.2.1.c. (Figura 2).

Figura 2. Procesamiento de las muestras de agua ambiental

________Hisopos de Moore_______

↓ ↓

100 ml EC a 37ºC 24 h 100 ml ECm 42ºC 24 h

↓ ↓

Placa de MAC a 37ºC 24 h IMS a 1 ml

Zona de confluencia + pooles ↓

hasta obtener cepas aisladas TC-SMAC + ID ó CHR

↓ colonias presuntivas

↓

Caracterización fenotípica y genotípica ← PCR-múltiple

III.2.3. Muestras clínicas

a. Obtención de las muestras y procesamiento Se estudiaron todas las muestras fecales pediátricas provenientes de niños con diarrea sanguinolenta que concurrieron al hospital Centenario de Gualeguaychú en el lapso mencionado de muestreo. El procesamiento se resume en la Figura 3.

Figura 3. Procesamiento de las muestras clínicas

Diarreas con sangre eventuales durante un año (+ AH ó T ó FR)

________________________(Transporte em Cary Blair)_______________

↓ ↓ ↓

Placa EMB 15 ml ECm+N a 42ºC 24 h Placa MAC

Inc. a 37ºC 24 h IMS a 1 ml Inc. a 37ºC 24 h

↓ ↓ ↓

Placa SMAC (grillada) Placa SMAC (por agotamiento) PCR múltiple

↓ ↓ de zona confluente

Confirmación bioquímica ← colonias presuntivas y pooles hasta obtener cepas aisladas

↓ ↓

Caracterización fenotípica y genotípica

AH: Anemia hemolítica

T: Trombocitopenia

FR: Fracaso renal

III.3. Caracterización de los aislamientos


III.3.1. Caracterización fenotípica Se realizó mediante: a) características tintoriales, morfológicas y bioquímicas (Edwards y Ewing, 1984); b) serotipificación de antígeno somático O157 y flagelar H7; c) citotoxicidad específica en células Vero, y d) sensibilidad a antibióticos. Se realizaron las siguientes determinaciones: catalasa, citocromo oxidasa (Mac Faddin, 1980), rojo de metilo (Becton Dickinson), Voges Proskauer (Becton Dickinson), agar triple azúcar hierro (Britania), β-D glucuronidasa (MUG) (Lab. Biokar), β-galactosidasa (Laboratorio Britania, Buenos Aires, Argentina), utilización de citrato (Britania) y de acetato (Britania), producción de pigmento (Britania), urea (Becton Dickinson), lisina decarboxilasa (agar lisina hierro, Britania), ornitina decarboxilasa (Britania), indol (agar sulfuro indol movilidad, Britania), movilidad (agar sulfuro indol movilidad, Britania), y producción de enterohemolisina mediante la prueba de hemólisis en agar sangre ovina suplementada con cloruro de calcio (Sigma) (Beutin et al.,1989). Cada aislamiento fue inoculado en caldo base rojo de fenol (Becton Dickinson) conteniendo 1% de los siguientes carbohidratos (ICN Biomedicals Inc, Costa Mesa, EE.UU.): glucosa, lactosa, sacarosa, rafinosa, ramnosa, sorbitol, dulcitol y celobiosa. A los aislamientos identificados como E. coli portadores del gen rfbO157 y seroagrupamiento O157 positivo, se les realizó la serotipificación confirmatoria utilizando antisueros somático (O157) y flagelar (H7), según la metodología propuesta por Ørskov y Ørskov (1984). Previo a la serotipificación flagelar, se realizó la estimulación de la movilidad en medio de Craigie (Manual de Procedimientos para la detección de Escherichia coli O157 y no-O157 en alimentos por separación inmunomagnética y PCR. Servicio Fisiopatogenia. Dpto. de Bacteriología. INEI – ANLIS. 2005). Los antisueros fueron provistos por el INPB – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. Para estimular la producción de las toxinas, en el ensayo de citotoxicidad con células Vero, se usó el sobrenadante y el extracto del periplasma celular (Karmali et al., 1985), utilizando anticuerpos monoclonales específicos para Stx1 y Stx2 (Mab 13C4 and BC5BB12, respectivamente), provistos por la Dra. N. A. Strockbine, del Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, EE.UU. (CDC). Se determinó la susceptibilidad de los aislamientos a diferentes antimicrobianos mediante la técnica de difusión en agar (según normas recomendadas por CLSI/NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards). Se utilizaron los siguientes antimicrobianos (Laboratorio Britania): ampicilina (AMP), ampicilina-sulbactama (AMS), piperacilina (PIP), piperacilina-tazobactama (P/T), cefalotina (CEF), cefoxitina (CXT), cefuroxima (CFU), cefotaxima (CTX) ó ceftriaxona (CRO), ceftacidima (CAZ), cefepime (CFP), imipenem (IMP) o meropenem (MER), ácido nalidíxico (NAL), norfloxacina (NOR) o ciprofloxacina (CIP), trimetoprima-sulfametoxazol (TMS), nitrofurantoína (NIT), gentamicina (GEN) o amicacina (AKN), cloranfenicol (CMP), fosfomicina (FOS), tetraciclina (TET). III.3.2. Caracterización genotípica Se realizó mediante PCR para la detección de los genes eae, ehxA, saa, fliCH7, y las variantes de Stx por PCR-RFLP. Se utilizaron los cebadores propuestos por Karch et al. (1993), que amplifican un fragmento de 864 pb de la región conservada del gen eae para EPEC y EHEC. Los cebadores propuestos por (Schmidt et al., 1995), que amplifican un fragmento de 1551 pb del gen ehxA que codifica para la enterohemolisina (EHEC-hly). Los cebadores propuestos por Paton et al. (2001), que amplifican un fragmento de 119 pb del gen saa. Los cebadores propuestos por Gannon et al.(1997), para amplificar un fragmento de 625 pb del gen fliCh7. En la Figura 1 se presentan las secuencias de cada uno de los cebadores utilizados. Se procedió de acuerdo a los protocolos puestos a punto en el Servicio Fisiopatogenia (Manual de Procedimientos “Detección de Escherichia coli O157 y no-O157 en alimentos por separación inmunomagnética y PCR”. 2005. Servicio Fisiopatogenia. Dpto. de Bacteriología. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires, Argentina). Para la caracterización genotípica de stx2 se utilizó la técnica de PCR-análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP) (16c), obtenidos por restricción enzimática con Haelll, Rsal y Ncil del amplicón correspondiente a una PCR que utiliza cebadores que amplifican un fragmento de 285 pb de la región del gen correspondiente a la subunidad B para stx2 y para las variantes stx2vh-a y stx2vh-b. Simultáneamente a la PCR mencionada, se realiza una segunda PCR. Ambas difieren en que la segunda amplifica a partir de los genes stx2vh-a y stx2vh-b, y la primera a partir de los genes stx2, stx2vh-a y stx2vh-b, de modo que nos permite discernir según obtengamos los dos amplicones (285 y 385 pb) o uno solo (285), si existen variantes o se trata de stx2, en cuyo caso no se procede al segundo paso consistente en la digestión enzimática. Para determinar stx1 y stx1c por PCR-RFLP, se utilizaron oligonucleótidos iniciadores que amplifican un fragmento de 282 pb de la región del gen correspondiente a la subunidad B para stx1 y stx1c. Luego


se determinó la variante de stx1 por análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción obtenidos con HhaI del producto de amplificación de 282 pb. IV. Resultados IV.1. Muestras de ganado bovino IV.1.1. STEC Sobre un total de 288 muestras de hisopados rectales de origen bovino, en 135 (46,9%) se detectó la presencia de los genes stx1 y/o stx2 por PCR. En la primera estación muestreada (primavera/2005) el tamizaje por PCR fue positivo en 17/65 (26,2%) muestras, y en las siguientes fue de 31/69 (44,9%), 36/73 (49,3%), y 51/81 (63,0%), respectivamente. En todas las muestras bovinas positivas al tamizaje por PCR se logró un buen porcentaje de recuperación de cepas, que fue para cada estación de 88,2% (15/17), 83,9% (26/31), 77,8% (28/36), y 88,2% (45/51) (Tabla 2 y Figura 4). Tabla 2. Muestras de origen bovino positivas y negativas al tamizaje por PCR para los genes stx1 y/o stx2 con o sin aislamientos. Primavera Verano Otoño Invierno Total

A 15 26 28 45 114 (39,6%) B 2 5 8 6 21 (7.3%) C 48 38 37 30 153 (53,1%)

Total 65 69 73 81 288 Ref.: A. Muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 con aislamiento de las cepas B. Muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 sin recuperación de las cepas C. Muestras donde no se detectaron los genes stx1 y/o stx2

Figura 4. Porcentaje de detección de los genes stx1 y stx2 y de recuperación de cepas STEC de las muestras bovinas En 114 muestras sobre las 135 positivas al tamizaje por PCR, se lograron aislar 121 cepas que portaron los genes stx1 y/o stx2, de las cuales 28 (23,1%) portaban stx1, 68 (56,2%) stx2. y 25 (20,7%) de stx1 y stx2 simultáneamente (Tabla 3). IV.1.2. STEC O157 Sobre un total de 288 muestras de hisopados rectales de origen bovino, en 9 (3,1%) se detectó la presencia de los genes rfbO157, stx1 y/o stx2 por PCR.


En ninguna muestra se detectó el gen rfbO157 en la primera estación muestreada (primavera/2005),. En las tres estaciones subsiguientes, las muestras con el gen rfbO157 acompañado de los genes stx1 y/o stx2 (STEC O157) en relación a las totales donde se detectó el gen rfbO157 (incluyendo las no toxigénicas) fue de 1/2, 4/4, y 9/11, respectivamente.

En total, se aislaron 11 cepas que portaron los genes rfbO157, stx1 y/o stx2; de las cuáles 5 (45,5%) portaban stx2 y 6 (54,5%) stx1 y stx2 simultáneamente (Tabla 3).

IV.1.3. Caracterización fenotípica de los aislamientos a. Características tintoriales, morfológicas y bioquímicas (Tabla 4) Todos las cepas de E. coli aisladas de muestras bovinas fueron morfológicamente cocobacilos o bacilos, gram negativo, crecieron en agar MacConkey redujeron el nitrato y dieron positivos la prueba del rojo de metilo. El 97% produjo indol, un 98% decarboxiló lisina y un 81% ornitina. La movilidad se observó en el 95% del total. Ninguno dio positivo a la prueba de citocromo oxidasa, fenilalaninadeaminasa, arginina dehidrolasa, ni produjo ácido sulfhídrico, acetoína, ni pigmento. Un 95% fermentó lactosa, un 75% rafinosa, un 84% sorbitol, 97,5% fue β-galactosidasa positivo, y un 79% β-glucuronidasa positivo. Un 56% fue hemolítico. La totalidad de los aislamientos de E. coli O157 fueron lactosa positiva en agar MacConkey, citocromo oxidasa negativa y β-galactosidasa positiva. En agar TSI, todas las cepas fueron fermentadoras y generadoras de gas, pero no productoras de ácido sulfhídrico. En el medio SIM, todas las cepas fueron indol positivo, ácido sulfhídrico negativo, y una cepa no exhibió movilidad a las 24 h. Ninguna cepa produjo pigmento, y todas fueron positivas a la reacción de acidez persistente con rojo de metilo, y decarboxilaron lisina y ornitina. Todas las cepas fueron negativas para las pruebas de: producción de acetoína (VP), fenilalanina deaminasa, arginina dehidrolasa, ureasa, utilización de citrato como única fuente de carbono, y fermentación de sorbitol. Diez cepas fueron β-D glucuronidasa negativas. Siete cepas (63,6%) fermentaron rafinosa, pero ninguna dulcitol y L-rhamnosa, por lo tanto pertenecieron al biotipo C. Diez cepas (90%) produjeron enterohemolisina.


b.Serotipificación

La serotipificación de las cepas STEC no-O157 no fue posible por requerir recursos económicos con los que no se contaba. Diez de las 11 cepas que fueron positivas para el antígeno somático O157 fueron positivas a la prueba de aglutinación para la detección del antígeno H7, previa estimulación de la movilidad. c. Citotoxicidad específica en células Vero En siete cepas portadoras de los genes stx1 y stx2 se confirmó la expresión de las toxinas Stx1 y Stx2 mediante la observación de citotoxicidad específica en células Vero. Tres cepas portadoras del gen stx2 no produjeron efecto citopático en dicha línea celular. Una de las cepas no pudo caracterizarse porque perdió viabilidad. d. Sensibilidad a antibióticos (Tabla 5). Todas las cepas identificadas como E. coli O157 fueron sensibles a: aminopenicilina sulbactama, El 5% fue resistente a ampicilina, 8% a piperacilina, 3% a cefalotina, 2% a ácido nalidíxico y a tetraciclina.

Todas las cepas fueron sensibles al resto de los antibióticos que probados.


IV.1.4 .Caracterización genotípica de los aislamientos En la Tabla 6 se presenta la frecuencia de genotipos detectados en las cepas STEC aisladas de muestras de origen bovino y ambiental. En las 121 cepas de origen bovino, la frecuencia de genotipos fue la siguiente: stx2 (36 cepas, 29,8%), stx2-saa-ehxA (24, 19,8%), stx1/2- saa-ehxA (17, 14,1%), stx1-eae-ehxA (16, 13,2%), stx1 (10, 8,3%), stx1/2- rfbO157- eae-ehxA-fliCh7 (6, 5%), stx2- rfbO157- eae-ehxA- fliCh7 (4, 3,3%), stx2-eae-ehxA (2, 1,7%), stx1-eae (1, 0,8%), stx1-ehxA (1, 0,8%), stx2- rfbO157- eae (1, 0,8%), stx2- ehxA (1, 0,8%), stx1/2 (1, 0,8%), y stx1/2-eae-ehxA (1, 0,8%). El gen stx2 presentó numerosas variantes y asociaciones las cuales fueron en orden de frecuencia: stx2 (33 cepas), stx2c (27 cepas), stx2d2 (15 cepas), stx2c + stx2d2 (6 cepas), 2+ stx2d2 (4 cepas), 2+ stx2c (2 cepas). Tres cepas resultaron no tipificables (NT). Las 52 cepas que portaban el gen stx1 tuvieron una única variante stx1. IV.2. Muestras obtenidas de agua ambiental IV.2.1. STEC Sobre un total de 79 muestras de origen acuático, en 26 (32,9%) se detectó la presencia de los genes stx1 y/o stx2 por PCR (Tabla 8). Entre septiembre/2005 y agosto/2006, el tamizaje por PCR del muestreo mensual fue positivo en: octubre/2005 66,7% (8/12), diciembre/2005 10% (1/10), enero/2006 50% (2/4), febrero/2006 28,6% (2/7), marzo/2006 80% (4/5), junio/2006 28,6% (2/7), julio/2006 28,6% (2/7), agosto/2006 35,7% (5/14). De las 26 muestras positivas al tamizaje, por PCR solamente en 4 (15,4%) se recuperaron los aislamientos, respectivamente (Tabla 8 y figura 6). De las 4 muestras positivas al tamizaje, por PCR se lograron aislar 4 cepas de las cuales tres portaban stx2, y una stx1 y stx2 simultáneamente (Tabla 6).

IV.2.2. STEC O157 Sobre un total de 79 muestras de agua, en 4 (5,1%) se detectó la presencia de los genes rfbO157, stx1 y/o stx2 por PCR (Tabla 9), una en diciembre/2005, dos en marzo/2006, y una en agosto/2006. De estas muestras positivas al tamizaje solo se logró un aislamiento de una cepa, portadora de los genes rfbO157 y stx2.


Tabla 8. Muestras de origen acuático positivas y negativas al tamizaje por PCR para los genes stx1 y/o stx2 con o sin aislamientos.

SEPT OCT NOV DIC ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO TOTAL

A 0 1 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 4 (5,1%) B 0 7 0 1 2 0 4 0 0 2 2 4 22 (27,8%) C 5 4 1 9 2 5 1 4 3 5 5 9 53 (67,1%)

Total 5 12 1 10 4 7 5 4 3 7 7 14 79 Ref.: A. Muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 con aislamiento de las cepas B. Muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 sin recuperación de las cepas C. Muestras donde no se detectaron los genes stx1 y/o stx2 Observaciones: El número de muestras tomadas mensualmente estuvo influido por limitaciones de índole meteorológico

Figura 6. Porcentaje de detección de los genes stx1 y stx2 y recuperación de cepas STEC de muestras de agua


IV.2.3. Caracterización fenotípica de los aislamientos a. Características tintoriales, morfológicas y bioquímicas (Tabla 3) Los 4 STEC aislados de muestras de agua fueron morfológicamente cocobacilos o bacilos, gram negativo, crecieron en agar MacConkey redujeron el nitrato y dieron positivos a la prueba del rojo de metilo, produjeron indol, decarboxilaron lisina y ornitina, y resultaron móviles. Fermentaron lactosa, rafinosa, y fueron β-galactosidasa positivo. Ninguno dio positivo la prueba de citocromo oxidasa, fenilalaninadeaminasa, arginina dehidrolasa, ni produjo ácido sulfhídrico, acetoína, ni pigmento. Las tres cepas STEC no-O157 fermentaron sorbitol, presentaron actividad β-glucuronidasa, y dos resultaron hemolíticas. La cepa STEC O157 no fermentó sorbitol, no tuvo actividad β-glucuronidasa, fue hemolítica, y se clasificó dentro del biotipo C (fermentó dulcitol y ramnosa). b. Serotipificación La serotipificación de los STEC no-O157 no fue posible por requerir recursos económicos con los que no se contaba. La cepa que fue positiva para el antígeno somático O157 también lo fue a la prueba de aglutinación para la detección del antígeno H7, previa estimulación de la movilidad. c. Citotoxicidad específica en células Vero. No se realizó d. Sensibilidad a antibióticos Todas las cepas fueron sensibles a los antibióticos que se probaron.

IV.2.4. Caracterización genotípica de los aislamientos De las 4 cepas STEC aisladas, dos portaron solo el gen stx2 (una la variante stx2c y la otra stx2), una los genes stx1, stx2, (variantes stx1 y stx2, respectivamente), saa, y ehxA y una los genes stx2, rfbO157, eae-ehxA, y fliCh7. Esta última cepa presentó las variantes stx2+ stx2c (Tabla 6). De las muestras de agua se aislaron E. coli O157 no toxigénicas; no así de las de los bovinos (Tabla 7). IV.3. Muestras clínicas No se realizaron aislamientos de STEC a partir de muestras clínicas en esta área geográfica, dentro del lapso en estudio. IV.4. Análisis de la diversidad genética y relación clonal Por PFGE, los 18 aislamientos pertenecientes al serotipo O157:H7 se diferenciaron en 8 patrones XbaI-PFGE conteniendo entre 16 y 21 bandas comprendidas en el rango de 36 – 582 kb. Todos tuvieron un porcentaje de similitud igual o mayor a 75%. Se detectaron aislamientos con patrones de restricción XbaI-PFGE idénticos*, los cuales fueron agrupados como grupo de aislamientos altamente relacionados genéticamente o “clusters”. Se observaron 4 clusters y 4 cepas con patrones XbaI-PFGE diferentes. Dos de éstas tenían un 85% de similitud con alguno de los clusters, respectivamente (Figura 7 y Tabla 9).


Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%]

PFGE-XbaI

100

9590858075

PFGE-XbaI

795/06

796/06

845/06

794/06

1030/06

980/06

612/06 8

841/06 1.2.3

841/06 16b

841/06 2

867/06 31

867/06 31b

867/06 36

489/06 16

867/06 1.2.3

867/06 26

867/06 2b

848/06

1030/06 12

Figura 7: Patrones obtenidos por XbaI-PFGE de 18 aislamientos pertenecientes al serotipo O157:H7

Tabla 9: Origen de las cepas E. coli O157 analizadas por PFGE

Referencias: A: cepas de origen acuático; B: cepas de origen bovino;

Fecha: Origen: Cepas Clusters

13/08/06 A: Canaleta de la bomba de agua 795/06

13/08/06 A: Arroyo externo 796/06 # I

04/07/06 A: Vertedero Izquierdo 845/06

08/11/06 A: Arroyo externo 1030/06 – ∆12 # II

05/10/06 A: Arroyo externo 980/06

02/05/06 B 612/06 (8)

10/07/06 B 841/06 (1-2-3)

10/07/06 B 841/06 (16)b (16,17,18)

10/07/06 B 841/06 (2) # III

17/07/06 B 867/06 (31)

17/07/06 B 867/06 (31)b

17/07/06 B 867/06 (36) (34-35-36)

17/07/06 B 867/06 (1-2-3)

17/07/06 B 867/06 (26) (25,26,27) # IV

17/07/06 B 867/06 (2)b

Cepas independientes

13/08/06 A: Vertedero derecho 794/06

18/04/06 A: 489/06 (16)*(13,14,15)

04/07/06 A: Canaleta de la bomba de agua 848/06

08/11/06 A: Arroyo externo 1030/06 - ∆11


V. Discusión

La prevalencia de STEC en bovinos productores de carne de unos dos años de edad hallada en este trabajo fue de 39,6%, en tanto que la prevalencia de STEC O157 en bovinos fue de 3,1%. La comparación de estos valores con los múltiples informes existentes en la bibliografía se dificulta por los distintos métodos de muestreo empleados y por la forma en que los autores expresan sus resultados, y por el tipo de metodología utilizada en el procesamiento de las muestras.

Se observó una marcada diferencia en el número de cepas recuperadas en las muestras de origen ambiental y animal, posterior a la detección por PCR múltiple (Tablas 1 y 8). Mientras que en los hisopados rectales bovinos, las muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 sin lograrse aislamientos fueron el 7,3%, en el agua ambiental fueron el 27,8%. Esta dificultad para recuperar cepasde muestras del medio acuático ambiental con tamizaje positivo podría atribuirse a que se encuentren en un estado estacionario y en bajo número.

Todas las cepas de origen acuático fueron sensibles a los antibióticos ensayados. Las de origen bovino fueron sensibles en general, exhibiendo cierta resistencia: a ampicilina (5%), a cefalotina (2,5%), a ácido nalidíxico, nitrofuranos, gentamicina y tetraciclina (2%), a trimetoprima-sulfametoxazol y piperacilina (1%). Dos cepas fueron resistentes simultáneamente a ampicilina más cefalotina, y a ampicilina más tetraciclina.

También se observó una marcada diferencia entre las cepas obtenidas del agua y de los bovinos en lo que respecta a la frecuencia del serotipo O157 y la asociación con el antígeno H7, y la portación de factores de virulencia.

La variante prevalente en las STEC O157 obtenidas en este estudio fue stx2c, presente en el 100% de las cepas. En cambio, en las STEC no-O157, la variante predominante fue stx2, seguida de stx2d2, y en último lugar stx2c.

Con excepción de una cepa bovina que solo tenía el gen eae, el resto de las cepas toxigénicas portaron simultáneamente los genes eae, ehxA y fliCh7, entrando en la definición de EHEC que hace la OMS (World Health Organization, 1997). El hecho de que la mayor proporción de las cepas portaran el gen que codifica Stx2, toxina 100 a mil veces más potente que Stx1 muestra el potencial riesgo sanitario, considerando que en Argentina el genotipo prevalente asociado a SUH es stx2+stx2c. Puede observarse, además, que más de la mitad de las cepas bovinas pueden incluirse dentro del seropatotipo A de Karmali et al. (2003), caracterizado por su alta incidencia en enfermedad severa humana y su frecuencia común en la ocurrencia de brotes.

En el presente muestreo no pudo verificarse ningún clúster de origen mixto (animal y ambiental) de E. coli O157, pero sí la presencia de dos cepas STEC no-O157 (O124: H19) con patrón XbaI-PFGE indistinguible (clon) aisladas a partir de hisopos rectales y el agua con un intervalo de 5 meses con genotipo stx1/stx2/saa/ehxA.

Algunos patrones XbaI-PFGE identificados en el presente estudio fueron idénticos a los perfiles de cepas aisladas de humanos, alimentos y fuentes de origen animal incluidas en la Base de Datos de PulseNet Argentina.

También, hemos podido constatar fuera del período en estudio (Tanaro et al., 2002), la presencia de cepas toxigénicas en los pequeños cursos de agua donde se realizó el muestreo y en aguas abiertas del Río Gualeguaychú frente al casco urbano en zonas recreativas. VI. Conclusiones • Se confirmó, en bovinos destinados al consumo interno criados a campo, una prevalencia de

STEC O157 más alta que la descripta en trabajos previos realizados en Argentina, y se corroboró una prevalencia de STEC semejante a la obtenida por otros autores.

• Los STEC fueron aislados de los bovinos en forma creciente durante el período muestreado y no siguieron el patrón habitual de mayor prevalencia en los meses cálidos.

• La presencia de E. coli O157:H7 en bovinos se verificó en forma intermitente, durante el período muestreado

• A diferencia de las muestras de origen animal, en las de origen acuático en un tercio de las mismas donde se detectó por PCR los genes de las toxinas, las cepas no pudieron ser recuperadas.

• Se aisló del medio acuático una sola cepa de E. coli O157:H7 productora de Stx2, que no estaba relacionada genéticamente con las cepas bovinas.

• Hubo un importante número de cepas de E. coli O157 no toxigénicas aisladas de agua ambiental, en contraste con las obtenidas de los animales, las cuales fueron todas STEC.


• Los resultados del presente estudio refuerzan la hipótesis de estiércol como una fuente de contaminación y la necesidad de establecer estrategias de control antes de la cosecha para reducir la transmisión de este grupo de agentes patógenos.

VII. Referencias bibliográficas

1 ARANA, I., POCINO, M., MUELA, A., FERNÁNDEZ-ASTORGA, A., BARCINA, I. Detection and enumeration of viable but non-culturable transconjugants of Escherichia coli during the survival of recipient cells in river water. J Appl Microbiol. 1997; 83: 340–6.

2 BEUTIN, L., MONTENEGRO, M.A., ØRSKOV, I., ØRSKOV, F., PRADA, J., ZIMMERMANN, S., STEPHAN, R. Close association of verotoxin (Shiga-like toxin) production with enterohemolysin production in strains of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 1989; 27: 2559-2564.

3 CAPRIOLI, A., MORABITO, S., BRUGÈRE, H. AND OSWALD, E. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Vet. Res. 2005; 36: 289-311.

4 CENTERS FOR DISEASE CONTROL. Isolation of E. coli O157:H7 from sporadic cases of hemorrhagic colitis-United States. Morbid. Mortal. Weekly Rep. 1982; 31:580-5.

5 DEAN, A.G., DEAN, J.A., COULOMBIER, D., BURTON AH, BRENDEL KA, SMITH DC, et al. Epi Info™, Version 6.04a, a word processing, database, and statistics program for public health on IBM-compatible microcomputers. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention, July 1996.

6 ELLIOTT, M.A., NICHOLS, W.L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and hemolytic uremic syndrome. Mayo Clin Proc, 2001; 76: 1154-62.

7 GANNON, V.P., D'SOUZA, S., GRAHAM, T., KING, R.K., RAHN, K., READ, S. Use of the flagellar H7 gene as a target in multiplex PCR assays and improved specificity in identification of enterohemorrhagic Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 656-62.

8 GELDREICH, E.E., FOX, K.R., GOODRICH, J.A., CHARK, R.M., SWERDLOW, D.L. Searching for a water supply connection in the Cabool, Missouri disease outbreak of Escherichia coli O157:H7. Water Res. 1992; 26:1127-37.

9 HANCOCK, D.D., BESSER T.E., KINSEL M.L., TARR P.I., RICE D.H., PAROS M.G. The prevalence of Escherichia coli O157:H7 in dairy and beef cattle in Washington State. Epidemiol. Infect. 1994; 113:199-207.

10 HRUDEY, S. E., P. PAYMENT, P. M. HUCK, R. W. GILLHAM, Y E. J. HRUDEY. A fatal waterborne disease epidemic in Walkerton, Ontario: comparison with other waterborne outbreaks in the developed world. Water Sci. Technol. 2003; 47:7-14.

11 KARCH, H., BOHM, H., SCHMIDT, H., GUNZER, F., ALEKSIC, S., HEESEMANN, J. Clonal structure and pathogenicity of Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H7. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 1200-05

12 KARMALI, M.A., MASCARENHAS, M., SHEN, S., ZIEBELL, K., JONSON, S., REID-SMITH, R., ISAAC-RENTON, J., CLARK, C., RAHN, K., KOPER, J.B. Association of genomic O island 122 of Escherichia coli EDL933 with verocytotoxin-producing Escherichia coli seropathotypes that are linked to epidemic and / or serious disease. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 4930-40.

13 KEEN, J.E., WITTUM, T.E., DUNN, J.R., BONO, J.L., DURSO, L.M. Shiga-toxigenic Escherichia coli O157 in agricultural fair livestock, United States. Emerging Infectious Diseases. 2006; 12(5):780-6.

14 KUROKAWA, K., TANI, K., OGAWA, M., NASU, M. Abundance and distribution of bacteria carrying sltII gene in natural river water. Lett. Appl. Microbiol. 1999; 28:405-10.

15 LEE LANG, A., TSAI, Y.L., MAYER, C.L., PATTON, K.C., PALMER, C.J. Multiplex PCR for detection of the heat labile toxin gene and Shiga like toxin I y II genes in Escherichia coli isolated from natural waters. App. Environ. Microbiol. 1994; 60:3145-49.

16 LEOTTA G.A., CHINEN I., EPSZTEYN S., MILIWEBSKY E., MELAMED I.C., MOTTER M., FERRER M., MAREY E., RIVAS M. Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga. Rev. Arg. Microbiol. 2005;37: 1-10.

17 Manual de Procedimientos para la detección de Escherichia coli O157 y no-O157 en alimentos por separación inmunomagnética y PCR. 2005. Servicio Fisiopatogenia. Dpto. de Bacteriología. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires.


18 MEICHTRI, L., MILIWEBSKY, E., GIOFFRÉ, A., CHINEN, I., BASCHKIER, A., CHILLEMI, G., GUTH, B.E.C., MASANA, M., CATALDI, A., RODRÍGUEZ, H.R., RIVAS M. Shiga toxin-producing Escherichia coli in healthy young beef steers from Argentina: prevalence and virulence properties. I. J. Food Microbiol. 2004; 96: 189-198

19 Na, S. H. , Miyanaga, K. , Unno, H. and Tanji, Y. The survival response of Escherichia coli K12 in a natural environment. Appl Microbiol Biotechnol. 2006; 72: 386-92.

20 OPS. Publicación Científica 564: Cólera. 16ª Ed. 1997. 21 PATON, A.W., SRIMANOTE, P., WOODROW, M.C., PATON, J.C. Characterization of Saa,

a novel autoagglutinating adhesin produced by locus of enterocyte effacement-negative Shiga-toxigenic Escherichia coli strains that are virulent for humans. Infect. Immun. 2001; 69: 6999-7009.

22 PATON, AW. PATON JC. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfbO157. J. Clin. Microbiol. 1998b; 36: 598-602.

23 PATON, J.C., PATON A.W. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. Clin. Microbiol. Rev. 1998a; 11:450-79.

24 POLLARD D.R., JOHNSON W.M., LIOR H., TYLER S.D., ROZEE K.R. Rapid and specific detection of verotoxin genes in Escherichia coli by the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1990; 28: 540-5.

25 POMMEPUY, M., BUTIN, M., DERRIEN, A., GOURMELON, R.R., CORMIER, M. Retention of enteropathogenicity by viable but nonculturable Escherichia coli exposed to seawater and sunlight. Applied and Environmental Microbiology. 1996; 62: 4621-26.

26 RICE, D.H., SHENG, H.Q., WYNIA, S., HOVDE C.J. Rectoanal mucosal swab culture is more sensitive than fecal culture and distinguishes Escherichia coli O157:H7-colonized cattle and those transiently shedding the same organism. J. Clin. Mic. 2003; 41: 4924-29.

27 SCHMIDT, H., BEUTIN, L., KARCH, H. Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain 933. Infect Immun. 1995; 63:1055-63.

28 STROCKBINE, N. A., WELLS, J. G., BOPP, C. A. & BARRETT, T. J.1998. En Escherichia coli O157:H7 and Other Shiga Toxin-Producing E. coli Strains, eds. Kaper, J. B. & O'Brien, A. D. (Am. Soc. Microbiol., Washington, DC), pp. 331-356.

29 SWERDLOW, D. L., WOODRUFF, B. A., BRADY, R. C., GRIFFIN, P. M., TIPPEN, S., DONNELL, K. D., GELDREICH, M., PAYNE, H. D. JR, MEYHER, E., WELLS, B. J., GREENE, A. JR., BRIGHT, J. G., BEAN, N. H. AND BLAKE. P. A. A waterborne outbreak in Missouri of Escherichia coli O157:H7 associated with bloody diarrhea and death. Ann. Intern. Med. 1992; 117:812-819.

30 TANARO JD, LOUND LH, LEDRI S, SCARPIN M, SCHIMPF MC, CASSE JS, LARRIVEY MA, RIVAS M. 2002. Desarrollo y aplicación de una metodología de aislamiento de Escherichia coli O157:H7 en el Municipio de Gualeguaychú. Rev. Arg. Microbiol. 34: 205-212. ISSN: 0325-7541

31 TENOVER FC, ARBEIT RD, GOERING RV, MICKELSEN PA, MURRAY BE, PERSING DH, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol. 1995;33:2233-2239

32 WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Prevention and control of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infections. Report of a WHO Consultation. Geneva: World Health Organization, 1997.

33 WRIGHT, D.J., CHAPMAN P.A., SIDDONS C.A. Immunomagnetic separation as a sensitive method for isolating Escherichia coli O157 from food samples. Epidemiol. Infect. 1994; 113:31-9.

PID 9049 Detección de Escherichia coli productor de … · Detección de Escherichia coli...

Documents

Transcript of PID 9049 Detección de Escherichia coli productor de … · Detección de Escherichia coli...