TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Laboratorio de Biología Molecular PRÁCTICA No. 6 “TRANSFORMACIÓN DE E. coli CON DNA PLASMÍDICO” INTRODUCCIÓN La transformación genética es la transferencia de un fragmento de DNA de un genoma donador a través de la membrana celular de la célula receptora y la incorporación del fragmento en el genoma de esta célula. Generalmente se da cuando el DNA donador y la bacteria receptora son de la misma especie, pero no siempre ocurre así. La incorporación se lleva a cabo cuando parte del DNA de la célula receptora es reemplazado por el DNA donador a través de una recombinación. Este procedimiento fue descrito por Fred Grifth en 1920, quien trabajo con distintas cepas de Diplococcus pneumoniae. (Jenkins, 1982) La transformación ocurre de f orma natural en algunas especies de bacterias, aunque también se puede efectuar por medios artificiales. Para que ocurra la transformación, la bacteria debe estar en un estado de competencia, lo que puede ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a las condiciones ambientales, tales como la falta de nutrientes y una densidad celular elevada. (Jenkins, 1982). Un plásmido suele contener genes que proporcionan alguna característica beneficiosa a la bacteria portadora, para facilitar su supervivencia. En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse plásmidos de unas a otras, pudiendo así compartir esos genes beneficiosos. Este mecanismo les permite a las bacterias adaptarse a nuevos medios. Por ejemplo, el reciente fenómeno de la resistencia bacteriana a los antibióticos se debe a la transformación plasmídica. El plásmido pGLO presenta resistencia a la ampicilina y posee un gen para la síntesis de una proteína, que tiene la

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS Laboratorio de Biologa Molecular PRCTICA No. 6 TRANSFORMACIN DE E. coli CON DNA PLASMDICO

INTRODUCCIN La transformacin gentica es la transferencia de un fragmento de DNA de un genoma donador a travs de la membrana celular de la clula receptora y la incorporacin del fragmento en el genoma de esta clula. Generalmente se da cuando el DNA donador y la bacteria receptora son de la misma especie, pero no siempre ocurre as. La incorporacin se lleva a cabo cuando parte del DNA de la clula receptora es reemplazado por el DNA donador a travs de una recombinacin. Este procedimiento fue descrito por Fred Grifth en 1920, quien trabajo con distintas cepas de Diplococcus pneumoniae. (Jenkins, 1982) La transformacin ocurre de forma natural en algunas especies de bacterias, aunque tambin se puede efectuar por medios artificiales. Para que ocurra la transformacin, la bacteria debe estar en un estado de competencia, lo que puede ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a las condiciones ambientales, tales como la falta de nutrientes y una densidad celular elevada. (Jenkins, 1982). Un plsmido suele contener genes que proporcionan alguna caracterstica beneficiosa a la bacteria portadora, para facilitar su supervivencia. En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse plsmidos de unas a otras, pudiendo as compartir esos genes beneficiosos. Este mecanismo les permite a las bacterias adaptarse a nuevos medios. Por ejemplo, el reciente fenmeno de la resistencia bacteriana a los antibiticos se debe a la transformacin plasmdica. El plsmido pGLO presenta resistencia a la ampicilina y posee un gen para la sntesis de una protena, que tiene la capacidad de fluorescer en presencia de arabinosa. Este plsmido contiene un sistema especial de regulacin de genes que se puede usar para controlar la expresin de la protena fluorescente en las clulas transformadas. La seleccin de las clulas que se han transformado con el plsmido pGLO se realiza observando el crecimiento en placas con antibitico.

OBJETIVOS:

Realizar una transformacin gentica con Escherichia coli. Identificar la cepa transformada de acuerdo a sus caractersticas particulares, como la fluorescencia y la resistencia a la ampicilina.

DIAGRAMA

Cultivo celular.

Bao 42C: 90 segundos

Hielo: 2 minutos.

Centrifugar: 3000 rpm, 10 minutos.

Hielo: 20 minutos.

250 L de LB .

Resuspende r: 10 mL de regulador.

5 L plsmido SLO tubo +DNA.

37C : 20 minutos.

Hielo: 20 minutos.

Hielo

100 L a 4 cajas distintas.

Incubar 37C.

Centrifugar.

250 L: tubo +DNA y tubo DNA.

1. +DNA: LB/amp

4. -DNA: LB

Resuspender: 5mL de regulador.

Conservar a -70C.

2. +DNA: LB/amp/ar a

3. -DNA: LB/amp

RESULTADOS:

Fig. 1. Placas de +DNA en medio LB/ampicilina/arabinosa y LB/ampicilina. Se presenta crecimiento en ambas placas; del lado izquierdo se present crecimiento masivo y en la placa del lado derecho crecimiento aislado.

Fig. 2. Placas de DNA en medio LB/ampicilina y LB. No se observa crecimiento en la placa izquierda (medio LB/ampicilina), contrario a la placa de la derecha que solo tiene medio LB.

Fig.3. Placa de +DNA en medio LB/ampicilina/arabinosa. Primera placa (27/02/2013).

Fig.4. Placa de +DNA en medio LB/ampicilina/arabinosa (28/02/2013). En la placa izquierda no se observa el fenmeno de fluorescencia a diferencia de la placa del lado derecho.

DISCUSIN: La transformacin es el resultado de la introduccin de un DNA extrao al interior de otro organismo y esta nueva informacin gentica suele proporcionar al organismo una nueva caracterstica que puede ser identificada despus de la transformacin, siguiendo este principio se realizaron los experimentos para comprobarlo. Se tenan dos cultivos de clulas competentes a una de las cuales se le adicion el plsmido pGLO que tiene un gen que codifica la sntesis de una protena denominada GFP (Green Fluorescent Protein), tambin cuenta con un gen que le confiere resistencia al antibitico ampicilina. Para poner detectar las caractersticas del plsmido insertado se realiz la siembra en 3 medios de cultivo slido diferentes: 1) Medio LB, 2) Medio LB/ampicilina y 3) Medio LB/ampicilina/arabinosa. El DNA al cual se le adicion el plsmido pGLO fue denominado +DNA, se sembr en placas con medio LB/ampicilina y Medio LB/ampicilina/arabinosa, el resultado obtenido fue que en la placa con medio LB/ampicilina hubo crecimiento, dejando comprobado que el plsmido le confiri resistencia a ampicilina y por lo tanto pudo crecer en presencia de ste antibitico, la segunda placa (LB/ampicilina/arabinosa), permite que se ponga de manifiesto la expresin de la protena GFP ya que solo en presencia de arabinosa se puede expresar esta protena, confirindole a la bacteria la cualidad de fluorescer al exponerse a la luz UV, como resultado de los experimento realizados en el laboratorio, al exponer la placa en el transluminador no se observ la actividad fluorescente (Fig.3), sin embargo s se observ crecimiento de la bacteria en forma masiva, posteriormente se procedi a realizar nuevamente la siembra en un medio nuevo de LB/ampicilina/arabinosa, en esta ocasin se coloc como referencia una placa con el medio utilizado anteriormente, como resultado se observ el fenmeno de fluorescencia de las clulas (Fig.4) en todas las placas excepto en aquella que contena el medio utilizado anteriormente, por lo tanto se piensa que la razn por la cual en la primera placa no se present el fenmeno de fluorescencia, es que la arabinosa y/o el antibitico se encontraban degradados. Se tomaron como controles aquellas placas en las cuales se sembr la bacteria, a la cual no se le agrego el plsmido pGLO (-DNA), obteniendo como resultado la ausencia de crecimiento bacteriano en la placa con LB/ampicilina (Placa Izq. Fig. 2), esto se debe a que al no estar presente el plsmido, la bacteria no adquiri resistencia al antibitico y por lo tanto no era resistente ni capaz de crecer en este medio, a diferencia de la placa que contena solo medio LB, en la cual si creci la bacteria ya que no tena ningn impedimento para hacerlo, porque no se encontraba presente el antibitico (Placa Der. Fig.2). CONCLUSIONES:

El plsmido pGLO confiere resistencia a antibiticos y fluorescencia. La protena responsable de la fluorescencia (GFP) solo se expresa en presencia de arabinosa. Las cepas que no fueron transformadas por el plsmido pGLO no crecieron en medio con antibitico.

BIBLIOGRAFIA Y REFERENCIAS Jenkins B. J. 1982. Gentica. Editorial Revert. Barcelona, Espaa. Pp. 512 Biotechnology Explorer. Manual de Kit de transformacin bacteriana con pGLO. Espaa. Disponible en: http://www.biorad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/4006097ES.pdf . Consultado: 05/03/13.