TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Laboratorio de Biología Molecular PRÁCTICA No. 6 “TRANSFORMACIÓN DE E. coli CON DNA PLASMÍDICO” INTRODUCCIÓN La transformación genética es la transferencia de un fragmento de DNA de un genoma donador a través de la membrana celular de la célula receptora y la incorporación del fragmento en el genoma de esta célula. Generalmente se da cuando el DNA donador y la bacteria receptora son de la misma especie, pero no siempre ocurre así. La incorporación se lleva a cabo cuando parte del DNA de la célula receptora es reemplazado por el DNA donador a través de una recombinación. Este procedimiento fue descrito por Fred Grifth en 1920, quien trabajo con distintas cepas de Diplococcus pneumoniae. (Jenkins, 1982) La transformación ocurre de f orma natural en algunas especies de bacterias, aunque también se puede efectuar por medios artificiales. Para que ocurra la transformación, la bacteria debe estar en un estado de competencia, lo que puede ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a las condiciones ambientales, tales como la falta de nutrientes y una densidad celular elevada. (Jenkins, 1982). Un plásmido suele contener genes que proporcionan alguna característica beneficiosa a la bacteria portadora, para facilitar su supervivencia. En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse plásmidos de unas a otras, pudiendo así compartir esos genes beneficiosos. Este mecanismo les permite a las bacterias adaptarse a nuevos medios. Por ejemplo, el reciente fenómeno de la resistencia bacteriana a los antibióticos se debe a la transformación plasmídica. El plásmido pGLO presenta resistencia a la ampicilina y posee un gen para la síntesis de una proteína, que tiene la

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Laboratorio de Biología MolecularPRÁCTICA No. 6 “TRANSFORMACIÓN DE E. coli CON DNA PLASMÍDICO”

INTRODUCCIÓN

La transformación genética es la transferencia de un fragmento de DNA de un genoma donador a través de la membrana celular de la célula receptora y la incorporación del fragmento en el genoma de esta célula. Generalmente se da cuando el DNA donador y la bacteria receptora son de la misma especie, pero no siempre ocurre así. La incorporación se lleva a cabo cuando parte del DNA de la célula receptora es reemplazado por el DNA donador a través de una recombinación. Este procedimiento fue descrito por Fred Grifth en 1920, quien trabajo con distintas cepas de Diplococcus pneumoniae. (Jenkins, 1982)

La transformación ocurre de forma natural en algunas especies de bacterias, aunque también se puede efectuar por medios artificiales. Para que ocurra la transformación, la bacteria debe estar en un estado de competencia, lo que puede ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a las condiciones ambientales, tales como la falta de nutrientes y una densidad celular elevada. (Jenkins, 1982).

Un plásmido suele contener genes que proporcionan alguna característica beneficiosa a la bacteria portadora, para facilitar su supervivencia.En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse plásmidos de unas a otras, pudiendo así compartir esos genes beneficiosos. Este mecanismo les permite a las bacterias adaptarse a nuevos medios. Por ejemplo, el reciente fenómeno de la resistencia bacteriana a los antibióticos se debe a la transformación plasmídica.

El plásmido pGLO presenta resistencia a la ampicilina y posee un gen para la síntesis de una proteína, que tiene la capacidad de fluorescer en presencia de arabinosa. Este plásmido contiene un sistema especial de regulación de genes que se puede usar para controlar la expresión de la proteína fluorescente en las células transformadas. La selección de las células que se han transformado con el plásmido pGLO se realiza observando el crecimiento en placas con antibiótico.

OBJETIVOS:

Realizar una transformación genética con Escherichia coli. Identificar la cepa transformada de acuerdo a sus características

particulares, como la fluorescencia y la resistencia a la ampicilina.

DIAGRAMA

RESULTADOS:

Cultivo celular.

Centrifugar: 3000 rpm,

10 minutos.

Resuspender: 10 mL de regulador.

Hielo: 20 minutos.

Centri-fugar.

Resuspender: 5mL de

regulador.

Conservar a -70ºC.

250 μL: tubo

+DNA y tubo -DNA.

Hielo

5 μL plásmido

SÓLO tubo +DNA.

Hielo: 20 minutos.

Baño 42ºC: 90 segundos

Hielo: 2 minutos.

250 μL de LB .

37ºC : 20 minutos.

100 μL a 4 cajas

distintas.

1. +DNA: LB/amp

2. +DNA: LB/amp/ar

a

3. -DNA: LB/amp

4. -DNA: LB

Incubar 37ºC.

Fig. 1. Placas de +DNA en medio LB/ampicilina/arabinosa y LB/ampicilina. Se presenta crecimiento en ambas placas; del lado izquierdo se presentó crecimiento masivo y en la placa del lado derecho crecimiento aislado.

Fig. 2. Placas de –DNA en medio LB/ampicilina y LB. No se observa crecimiento en la placa izquierda (medio LB/ampicilina), contrario a la placa de la derecha que solo tiene medio LB.

Fig.3. Placa de +DNA en medio LB/ampicilina/arabinosa. Primera placa (27/02/2013).

Fig.4. Placa de +DNA en medio LB/ampicilina/arabinosa (28/02/2013). En la placa izquierda no se observa el fenómeno de fluorescencia a diferencia de la placa del lado derecho.

DISCUSIÓN:

La transformación es el resultado de la introducción de un DNA extraño al interior de otro organismo y esta nueva información genética suele proporcionar al organismo una nueva característica que puede ser identificada después de la transformación, siguiendo este principio se realizaron los experimentos para comprobarlo. Se tenían dos cultivos de células competentes a una de las cuales se le adicionó el plásmido pGLO que tiene un gen que codifica la síntesis de una proteína denominada GFP (Green Fluorescent Protein), también cuenta con un gen que le confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Para poner detectar las características del plásmido insertado se realizó la siembra en 3 medios de cultivo sólido diferentes: 1) Medio LB, 2) Medio LB/ampicilina y 3) Medio LB/ampicilina/arabinosa.

El DNA al cual se le adicionó el plásmido pGLO fue denominado +DNA, se sembró en placas con medio LB/ampicilina y Medio LB/ampicilina/arabinosa, el resultado obtenido fue que en la placa con medio LB/ampicilina hubo crecimiento, dejando comprobado que el plásmido le confirió resistencia a ampicilina y por lo tanto pudo crecer en presencia de éste antibiótico, la segunda placa (LB/ampicilina/arabinosa), permite que se ponga de manifiesto la expresión de la proteína GFP ya que solo en presencia de arabinosa se puede expresar esta proteína, confiriéndole a la bacteria la cualidad de fluorescer al exponerse a la luz UV, como resultado de los experimento realizados en el laboratorio, al exponer la placa en el transluminador no se observó la actividad fluorescente (Fig.3), sin embargo sí se observó crecimiento de la bacteria en forma masiva, posteriormente se procedió a realizar nuevamente la siembra en un medio nuevo de LB/ampicilina/arabinosa, en esta ocasión se colocó como referencia una placa con el medio utilizado anteriormente, como resultado se observó el fenómeno de fluorescencia de las células (Fig.4) en todas las placas excepto en aquella que contenía el medio utilizado anteriormente, por lo tanto se piensa que la razón por la cual en la primera placa no se presentó el fenómeno de fluorescencia, es que la arabinosa y/o el antibiótico se encontraban degradados.

Se tomaron como controles aquellas placas en las cuales se sembró la bacteria, a la cual no se le agrego el plásmido pGLO (-DNA), obteniendo como resultado la ausencia de crecimiento bacteriano en la placa con LB/ampicilina (Placa Izq. Fig. 2), esto se debe a que al no estar presente el plásmido, la bacteria no adquirió resistencia al antibiótico y por lo tanto no era resistente ni capaz de crecer en este medio, a diferencia de la placa que contenía solo medio LB, en la cual si creció la bacteria ya que no tenía ningún impedimento para hacerlo, porque no se encontraba presente el antibiótico (Placa Der. Fig.2).

CONCLUSIONES:

El plásmido pGLO confiere resistencia a antibióticos y fluorescencia. La proteína responsable de la fluorescencia (GFP) solo se expresa en

presencia de arabinosa. Las cepas que no fueron transformadas por el plásmido pGLO no

crecieron en medio con antibiótico.

BIBLIOGRAFIA Y REFERENCIAS

Jenkins B. J. 1982. Genética. Editorial Reverté. Barcelona, España. Pp. 512

Biotechnology Explorer™. Manual de Kit de transformación bacteriana con pGLO. España. Disponible en: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/4006097ES.pdf. Consultado: 05/03/13.