Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA FACULTAD DE MEDICINA MAESTRIA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en niños con un cuadro clínico diarreico y asintomático en Sinaloa: factores de virulencia y daño celular TESIS Que presenta Luis Monroy Higuera Para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Biomedicina Molecular Directores de tesis Dr. Vicente Adrián Canizalez Román Dr. Héctor Manuel Flores Villaseñor Culiacán. Sinaloa Febrero 2020
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Untitleden Sinaloa: factores de virulencia y daño celular
TESIS
Luis Monroy Higuera
Para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Biomedicina Molecular
Directores de tesis
Culiacán. Sinaloa Febrero 2020
ii
El presente trabajo se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Biología
Molecular de la Maestría en Ciencias en Biomedicina Molecular de la Facultad de
Medicina, perteneciente a la Universidad Autónoma de Sinaloa (UAS), bajo la
dirección del Dr. Vicente Adrián Canizalez Román (profesor e investigador, SNI-II
encargado del Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Medicina UAS)
y del Dr. Héctor Manuel Flores Villaseñor (profesor e investigador, SNI-I
encargado del Laboratorio de Biotecnología en Salud de la Facultad de Medicina
UAS).
v
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la institución Universidad Autónoma de Sinaloa y a la Facultad
de Medicina, al igual que a sus autoridades por haberme permitido cursar este
posgrado; a la coordinación de la Maestría en Ciencias en Biomedicina Molecular
que en dos años del programa tuve el apoyo para crecer de manera académica y
profesional. Por otro lado no me queda más que agradecer a mis tutores de tesis,
al Dr. Vicente Adrián Canizalez Román y al Dr. Héctor Manuel Flores Villaseñor
porque siempre conté con su apoyo incondicional, con sabios consejos, asesoría
profesional, académica, técnica y científica. También quiero dar las gracias a mis
asesores de tesis, al Dr. Velázquez, M.C Uriel y al Dr. Valdez por su ayuda en la
realización de este trabajo ya que aparte de contar con su asesoría científica conté
con su amistad a lo largo de mi travesía de esta maestría. A mis compañeros de la
maestría y amigos del laboratorio de investigación en especial a la Dra. Erika
Acosta y al Dr. Javier Gutiérrez que se suman a los agradecimientos, porque ellos
siempre estuvieron en las buenas y en las mejores, apoyándome con los retos que
se presentaron en esta etapa. A la Dra. Nidia León Sicairos por haberme
aconsejado desde el primer día que pise los laboratorios de investigación hace
algunos 11 años atrás en el año 2009; la guía de la Dra. Nidia también ha
contribuido al crecimiento de mi vida personal, académica y profesional. Por ultimo
agradecer a mi familia a mis padres Luis y Silvia Nereyda, a mis hermanos Toño y
Silvia, a mi sobrino Diego que ellos han sido mis compañeros de vida y el pilar
para seguir adelante.
3.2. Escherichia coli diarreogénica (DEC) y sus variedades .............................................. 9
3.2.1. Escherichia coli enteropatógena (EPEC) .................................................................. 9
3.2.2. Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) ........................................................... 13
3.2.3. Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) ............................................................... 16
3.2.4. Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC) .................................................................... 19
3.2.5. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)............................................................... 23
3.3. Factores de virulencia suplementarios en E. coli ....................................................... 30
3.3.1. Factores de virulencia suplementarios de E. coli relacionados con mecanismos de colonización .......................................................................................................................... 31
3.3.2. Factores de virulencia suplementarios de E. coli con actividad citotóxica ........... 33
3.3.3. Factores de virulencia suplementarios de E. coli con actividad proteolítica ......... 35
3.4. Epidemiología de DEC .................................................................................................. 38
3.5. Epidemiología de E. coli diarreogénica en pacientes asintomáticos ........................ 43
3.6. Grupos filogenéticos de E. coli ..................................................................................... 44
3.7. E. coli y su resistencia a antibióticos ........................................................................... 48
3.7.1. Mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos ................................... 52
IV. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.......................................................................... 57
8.2. Aislamiento e identificación de cepas de E. coli ......................................................... 61
vii
8.3. Cepas de referencia ...................................................................................................... 63
8.4. Extracción de ADN ........................................................................................................ 63
8.5. Detección de genes típicos y genes suplementarios de virulencia (GSV) en E. coli
por PCR. .................................................................................................................................... 64
8.7. Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos ........................................................ 72
8.8. Determinación de grupos filogenéticos en E. coli ....................................................... 74
8.9. Análisis estadístico ........................................................................................................ 74
9.1. Aislamiento de E. coli .................................................................................................... 76
9.2. La prevalencia de DEC fue de 18.6% en niños de Sinaloa, México, siendo los patotipos EAEC y EPEC los más frecuentes. ........................................................................ 76
9.3. De acuerdo a los GSV, las cepas de E. coli se agruparon en tres categorías, siendo las E. coli no-DEC con GSV las más frecuentes.................................................................... 78
9.4. El 44% de GSV se asociaron con las cepas DEC, principalmente los que codifican para factores de colonización y citotoxinas. ........................................................................... 82
9.5. Las cepas de E. coli aisladas de niños con diarrea (DEC y no-DEC) exhibieron un mayor puntaje de virulencia que las E. coli aisladas de niños asintomáticos (DEC y no- DEC). 86
9.6. Las cepas DEC aisladas de niños con o sin diarrea, exhibieron mayor citotoxicidad que las E. coli no-DEC .............................................................................................................. 88
9.7. Perfil de susceptibilidad a antimicrobianos ................................................................. 92
9.1. Filogenia de E. coli aisladas de niños de Sinaloa ....................................................... 96
X. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 100
XI. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 113
XII. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 115
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteropatógena y E. coli enterohemorrágica. ................................................................................................................... 11
Figura 2. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enterotoxigénica. ................................... 17
Figura 3. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteroinvasiva. ....................................... 20
Figura 4. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteroagregativa. ................................... 24
Figura 5. Mecanismo de patogenicidad en E. coli adherente difusa. ................................... 27
Figura 6. Las infecciones intestinales, segunda causa de morbilidad en niños de 5-14 años en Sinaloa, México. ......................................................................................................... 41
Figura 7. Dendograma de la filogenia de E. coli. ................................................................... 47
Figura 8. Comparación del puntajes de virulencia entre grupos de E. coli aisladas de niños con diarrea y asintomáticos. .................................................................................................... 87
Figura 9. Citotoxicidad de E. coli aisladas de niños con diarrea y asintomáticos de Sinaloa, México. ....................................................................................................................................... 89
Figura 10. Citotoxicidad de grupos de E. coli aisladas de niños con diarrea y asintomáticos en Sinaloa, México. ................................................................................................................... 90
Figura 11. Regresión lineal entre el puntaje de virulencia de cepas de E. coli aisladas de niños con/sin diarrea y el porcentaje de citotoxicidad. .......................................................... 91
Figura 12. Grupos filogenéticos representativos de E. coli aisladas en Sinaloa, México... 96
ix
Cuadro 1. Factores de virulencia de E. coli diarreogénica. ................................................... 29
Cuadro 2. Genes de virulencia suplementarios de E. coli investigados en este estudio. .. 37
Cuadro 3. Oligonucleótidos para amplificar el gen ARNr 16S en E. coli. ............................ 62
Cuadro 4. Oligonucleótidos para la detección de genes típicos de E. coli diarreogénicas. 65
Cuadro 5. Oligonucleótidos para la amplificación de GSV en E. coli. .................................. 67
Cuadro 6. Antibióticos usados y valores de corte. ................................................................. 73
Cuadro 7. Distribución de E. coli y sus patotipos de acuerdo a la condición clínica de niños de Sinaloa, México. ................................................................................................................... 77
Cuadro 8. GSV en E. coli aisladas de niños de Sinaloa, México. ........................................ 80
Cuadro 9. Distribución de GSV en E. coli aisladas de niños en Sinaloa, México. .............. 83
Cuadro 10. Distribución de GSV de acuerdo a la condición clínica de los niños de Sinaloa, México. ....................................................................................................................................... 84
Cuadro 11. Distribución de GSV en cepas DEC aisladas de niños en Sinaloa, México. ... 85
Cuadro 13. Resistencia a categorías de antimicrobianos de cepas DEC aisladas de niños con diarrea y asintomáticos en Sinaloa, México. ................................................................... 94
Cuadro 14. Distribución de los grupos filogenéticos de E. coli aisladas de niños de Sinaloa, México. ........................................................................................................................ 97
Cuadro 15. Grupos filogenéticos de acuerdo a los GSV de E. coli aisladas de niños en Sinaloa, México. ........................................................................................................................ 98
Cuadro 16. Grupos filogenéticos de E. coli aisladas de niños de Sinaloa, México, de acuerdo a la condición clínica. ................................................................................................. 99
1
I. RESUMEN
Durante el 2016, la diarrea de origen infeccioso se ubicó como la octava causa
de muerte en el mundo, siendo la población infantil menor de cinco años la más
afectada, entre quienes representó la quinta causa de muerte. E. coli
enterotoxigénica y E. coli enteropatógena se ubican dentro de los trece principales
agentes que provocan muerte por diarrea en el mundo en infantes menores de 5
años. En México, esta enfermedad es la segunda causa de morbilidad entre la
población; sin embargo, no hay estudios sobre las características de E. coli
diarreogénica en niños del noreste mexicano. El propósito del presente trabajo fue
determinar la prevalencia de esta bacteria aislada de niños con diarrea y
asintomáticos en Sinaloa, así como comparar su perfil de virulencia, el daño
celular, la resistencia a antimicrobianos y los filogrupos. En los resultados se
obtuvo que la prevalencia de DEC fue 18.6% y se asoció con la diarrea. Los
patotipos EPEC y EAEC fueron los más prevalentes (33% cada uno). Las cepas
DEC aisladas de diarrea exhibieron la mayor cantidad de genes suplementarios de
virulencia (GSV) entre 8 y 9 genes. Además los genes ehaA, ehaC, efa/lifA, nleB,
agg4A, espC, pet y pic se asociaron con las DEC, en tanto que los genes ehaA,
ehaB, kps, ag4A, eatA, espI, espP y pic se asociaron con la presencia de diarrea.
Las cepas DEC de niños con/sin diarrea exhibieron el mayor puntaje de virulencia
y causaron el mayor daño citotóxico sobre células HT-29. Las cepas DEC de niños
con diarrea fueron resistentes a tetraciclina y ampicilina (40.7 y 35.6%
respectivamente), en tanto que las DEC de niños asintomáticos fueron resistentes
2
al ácido nalidíxico y a cefotaxima (ambas con 32.2%). Por otra parte una gran
parte de las DEC fueron multi-farmaco resistentes (47.5%). Finalmente gran parte
de las cepas DEC se ubicaron en el filogrupo A (53.9%), seguido delos filogrupos
D y B1 (13.9% cada uno). El perfil biológico de las E. coli aisladas de niños con o
sin diarrea en el noreste mexicano, revela la alta presencia de GSV, además de la
elevada tasa de resistencia antimicrobiana en las cepas que colonizan a estos
huéspedes y que pueden fungir como reservorio para diseminar su potencial
patogénico.
3
ABSTRACT
During 2016, infectious diarrhea are the eighth leading cause of death in
the world, and the fifth leading cause of death among children under five years old.
Enterotoxigenic E. coli and enteropathogenic E. coli are the main etiologic agents
of diarrhea worldwide. In Mexico, diarrheal disease is the second cause of
morbidity among population. However, there are scarce studies about the
characteristics of diarrheagenic E. coli (DEC) in children in northwest of Mexico.
The aim of the present work was to determine the prevalence of DEC in children
with and without diarrhea in Sinaloa, as well as to compare their virulence profile,
cell damage, antimicrobial resistance and phylogroups. The prevalence of DEC
was 18.6% and was associated with the presence of diarrhea. EPEC and EAEC
were the most prevalent pathotypes (33% each). DEC strains isolated from
children with diarrhea exhibited more virulence supplementary genes (VSG
between 8 and 9 genes) than other E. coli. The ehaA, ehaC, efa/lifA, nleB, agg4A,
espC, pet and pic genes were associated with DEC strains, while ehaA, ehaB, kps,
agg4A, eatA, espI, espP and pic genes were associated with the presence of
diarrhea. DEC strains exhibited the highest virulence score and caused the
greatest cytotoxic damage on HT-29 cells. The majority of DEC strains from
diarrhea cases were resistant to tetracycline and ampicillin (40.7 and 35.6%,
respectively), while those isolated from asymptomatic children were resistant to
nalidixic acid and cefotaxime (both with 32.2%). A high proportion of DEC strains
were multi-drug resistant (47.5%), while more than a half belonged to the A
phylogroup (53.9%), followed by D and B1 phylogroups (13.9% each). The
biological profile of E. coli strains that colonize children with or without diarrhea in
4
northwest of Mexico is heterogeneous, with a high presence of VSG, in addition to
the high rate of resistance to the main antibiotics used in their control, and could
act as a reservoir for disseminate its pathogenic potential to commensal strains.
5
II. INTRODUCCIÓN
La humanidad ha estado en contacto y en convivencia con otros organismos
como animales, plantas y microorganismos (mo), entre estos las bacterias. La
simbiosis entre estos últimos y el hombre por lo general es benéfica, sin embargo,
algunos de estos microbios adquieren atributos adicionales que pueden causarle
daño mediante diversas enfermedades. Una de las bacterias ampliamente
estudiada en su relación con el hombre es Escherichia coli (E. coli), uno de los
miembros más frecuentes e importantes del genero Escherichia, que aunque es
parte de la microbiota del humano esta puede ser patógena asociándose con
diferentes enfermedades, que incluyen infecciones extraintestinales, como las
infecciones del tracto urinario, meningitis, sepsis y gastroenteritis; manifestándose
mediante diferentes tipos de diarrea (diarrea del viajero, diarrea hemorrágica, etc.),
pudiendo incluso causar insuficiencia renal y la muerte. Lo anterior se asocia a
que E. coli posee una amplia variedad de factores de virulencia especializados
que se pueden clasificar como adhesinas y exotoxinas (1). Durante el 2010 se
registraron más de 1,700 millones de episodios de diarrea en todo el mundo, de
los cuales 700,000 provocaron la muerte en niños menores de 5 años (2). Por otro
lado se tiene reportado que la diarrea es una infección causada por diferentes
patógenos y uno de los agentes etiológicos importantes (por su impacto en la
salud pública, principalmente en países en vías de desarrollo) es E. coli causante
de diarrea o DEC (por las siglas en inglés Diarrheagenic E. coli) (3).Durante 2016,
E. coli enterotoxigénica (ETEC) causó 51,186 muertes en la población general y
18, 669 muertes en niños menores de 5 años, detrás de este patotipo, E. coli
6
enteropatógena (EPEC) causó 12,337 muertes en la población general y 9,459
muertes en niños menores de 5 años (4). A pesar de que estas cepas no siempre
son patógenas pueden llegar a serlo, ya que existen DEC con factores de
virulencia típicos y/o suplementarios que se aíslan de personas asintomáticas y
pueden llegar a ser oportunistas. Las infecciones causadas por E. coli son
endémicas y están relacionadas con el nivel socio económico y las medidas de
higiene inadecuadas; aunado a ello, otro problema que ha surgido es la resistencia
de E. coli ante los antimicrobianos de primera elección. En Sinaloa, las infecciones
intestinales de origen bacteriano han ocupado el segundo lugar de morbilidad con
29,733 casos en el 2017; sin embargo hay escasos trabajos que documenten su
etiología, así como una caracterización biológica de dichos agentes infecciosos,
como E. coli. Por ello, el propósito de este trabajo fue determinar la prevalencia de
DEC en población infantil de Sinaloa, así como determinar las características de
las cepas de E. coli aisladas de niños con y sin diarrea, incluyendo la presencia de
genes típicos de virulencia, los genes accesorios (putativos) de virulencia, el grupo
filogenético, la citotoxicidad sobre células epiteliales y el perfil de susceptibilidad a
antimicrobianos de primera elección. Las hipótesis planteadas son: 1) existe una
mayor prevalencia de DEC, factores de virulencia típicos y accesorios en aislados
de pacientes con diarrea en comparación con los recuperados de niños
asintomáticos; 2) las cepas DEC pertenecen a los grupos filogenéticos B2 y D; 3)
las cepas DEC de pacientes diarreicos exhiben una mayor resistencia a los
antibióticos comparados con las recuperadas de sujetos asintomáticos. La
presente tesis aportará información actualizada sobre la prevalencia de E. coli
causante de diarrea entre población infantil de Sinaloa, sus características de
7
patogenicidad y el perfil de resistencia a los antimicrobianos de primera elección;
dichos datos aportarán conocimiento sobre las características de las cepas tipo
DEC en el noroeste de México.
8
III. REVISIÓN DE LA LITERATURA
3.1. Características de Escherichia coli
Escherichia coli fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore Von
Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium coli (5). Esta
bacteria coloniza el intestino del hombre pocas horas después del nacimiento y se
le considera un microorganismo de flora normal (6). El género Escherichia agrupa
bacterias Gram negativas, generalmente móviles, producen ácido y gas a partir de
azúcares y está constituido por cinco especies: Escherichia blattae, Escherichia
coli, Escherichia fergusonnii, Escherichia hermanii y Escherichia vulneris. De
éstas, únicamente E. coli tiene importancia clínica (6, 7).
E.coli es un bacilo aerobio facultativo que se mueve por acción de flagelos
perítricos, e s Gram negativo, oxidasa negativo, con un tamaño promedio de 1.1-
1.5 µm de ancho y 2.0-6.0 µm de largo (6). Esta bacteria habita en el intestino del
ser humano y de otros animales de sangre caliente. Aunque la mayoría de las
cepas son inofensivas, algunas pueden causar enfermedad de transmisión
alimentaria. De acuerdo con diversos trabajos reportados a nivel mundial las
infecciones causadas por E. coli se diseminan genéricamente por el consumo de
alimentos contaminados (8).
E. coli es una bacteria versátil debida a su gran plasticidad genética, la que
obedece a su habilidad para adquirir y transferir material genético (9). Aunque las
cepas comensales de E. coli raramente causan enfermedad (excepto en sujetos
9
inmunocomprometidos o cuando la barrera intestinal se ve alterada), algunas
clonas adquieren atributos específicos que les confieren la capacidad de causar
daño y por ende desencadenar la infección en el huésped (9). Dentro de la gama
de infecciones que esta bacteria causa se encuentran las infecciones
gastrointestinales, las del tracto urinario y las infecciones sistémicas
(sepsis/meningitis).
3.2. Escherichia coli diarreogénica (DEC) y sus variedades
Entre las cepas DEC se han descrito variedades patógenas o patotipos,
cada una con características únicas o compartidas en cuanto a sus factores de
virulencia y mecanismos de patogenicidad: E.coli enteropatógena (EPEC), E.coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E.coli enteroagregativa
(EAEC), E.coli adherente difusa (DAEC) y E. coli productora de toxina Shiga
(STEC); la variante E. coli enterohemorrágica (EHEC) es uno de los serotipos
más importantes del tipo STEC, por su importancia en la salud pública de
humanos y animales (9, 10). Recientemente se añadieron los patotipos E. coli
que desprende células (CDEC) y E. coli adherente-invasiva (AIEC) (9, 10).
3.2.1. Escherichia coli enteropatógena (EPEC)
EPEC es una causa importante de diarrea potencialmente mortal en bebés
de países en desarrollo (9). Este patovariante pertenece a una familia de
patógenos que forman lesiones de unión y borrado (por sus siglas en ingles A/E –
attaching/effacement-) en células epiteliales intestinales; otro miembro de esta
familia es EHEC. Las bacterias se adhieren íntimamente al enterocito y eliminan
10
los microvellosidades; la adherencia se ve favorecida por el reclutamiento de los
microfilamentos por debajo del sitio de unión, en una estructura llamada pedestal.
Este fenotipo en EPEC es mediado por genes localizados en el locus de borrado
de enterocitos (LEE), presentes en una isla de patogenicidad (PAI) de 35 kb (11).
LEE está altamente regulado y codifica un sistema de secreción tipo III (T3SS por
sus siglas en inglés) que transloca proteínas efectoras bacterianas al citoplasma
de la célula huésped. Siete de estas proteínas están codificadas en LEE, aunque
hay otras moléculas efectoras no codificadas por LEE (Nle) (12); el papel biológico
de muchos de estos efectores se encuentran en estudio.
Se cree que la unión inicial de EPEC a los enterocitos en el intestino
delgado involucra a los pili formadores de haces (Bfp – bundle forming pilus-),
codificados en el plásmido EAF (factor de adherencia de EPEC). Los Bfp son
fimbrias en forma de cuerda que interactúan con otras bacterias EPEC, para
formar microcolonias típicas de la adherencia localizada y cuyos receptores son
residuos de N-acetil-lactosamina presentes en la superficie de la célula huésped
(13). Recientemente se demostró que el pilus común de E. coli, presente en la
mayoría de los aislamientos de esta bacteria, actúa con el Bfp para estabilizar las
interacciones entre EPEC y las células huésped (14).
Para la unión íntima es necesaria la interacción entre la proteína intimina y
su receptor Tir (por sus siglas en inglés Translocated intimin receptor) (Figura 1).
EPEC utiliza el T3SS para internalizar Tir al citoplasma de las células huésped en
un proceso que posiblemente se inicie a través de la detección de Ca2+ (15).
Luego, Tir se expone en la superficie de la célula huésped (16) y actúa como un
11
receptor para la intimina. Las interacciones con esta proteína conducen a la
agrupación de Tir, que luego es fosforilada por varias tirosina quinasas huésped
(17, 18).
Figura 1. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteropatógena y E. coli enterohemorrágica. EPEC y EHEC comparten el mecanismo de anclado y efacelamiento de las microvellosidades del enterocito. Los efectores secretados por el T3SS pueden afectar el intercambio iónico (19).
EPEC posee un gran repertorio de efectores que son translocados a las
células huésped por T3SS y subvertir los procesos de la célula huésped; por
ejemplo, causan reordenamiento del citoesqueleto y modulación inmune, además
de contribuir a la diarrea. Muchos de estos efectores translocados tienen múltiples
funciones (19).
12
Uno de estos efectores relacionada con el patotipo EPEC es la proteína
asociada a la mitocondria (Map) pertenece a una familia de proteínas que
comparten el motivo WXXXE y se hipotetizó que mimetizaba la forma activa de la
proteína de control de la división celular 42 (CDC42), una proteína G pequeña. Sin
embargo, recientemente, se demostró que Map actuaba como un factor de
intercambio de guanina-nucleótido para CDC42, regulando la dinámica de la
actina para producir la formación de los filopodios que rodean las microcolonias
bacterianas (20, 21).
Map también está dirigido a las mitocondrias, donde interrumpe la función y
la estructura mitocondrial. Un segundo efector multifuncional, EspF, está dirigido a
las mitocondrias y desencadena la vía de la muerte mitocondrial. Además, EspF
está implicado en la inhibición de la fagocitosis (22) y la interrupción de las
uniones estrechas (23, 24), así como en la imitación de aspectos de la vía de
señalización de la célula huésped que participa en el tráfico de membranas (25).
EspB (también conocida como EaeB) tiene una función dual como proteína
de translocación T3SS y como efector que previene la fagocitosis (26). Las
proteínas Nle también participan en la virulencia de EPEC. Por ejemplo, NleA
(también conocida como EspI) reduce el tráfico de proteínas e interrumpe las
uniones estrechas, EspJ inhibe la opsonofagocitosis por los glóbulos rojos en tanto
que el factor inhibidor de ciclo (Cif) es una ciclomodulina que previene la
progresión del ciclo celular, con la concomitante apoptosis (27-30). Se han
identificado otras proteínas Nle, sin embargo, sus funciones aún permanecen sin
ser entendidas completamente (31).
3.2.2. Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC)
EHEC es un patógeno que causa la lesión A/E, altamente infeccioso y que
coloniza el íleon distal y el intestino grueso en los seres humanos y es a menudo
el agente causante de brotes de gastroenteritis severa en los países
desarrollados. La transmisión a los humanos usualmente ocurre a través de
alimentos y agua contaminados. La mayoría de los brotes en América del Norte,
Japón y algunos países de Europa, se deben al serotipo O157:H7. Los adultos y
los niños infectados con EHEC sufren de colitis hemorrágica (diarrea
sanguinolenta) y otras complicaciones pudiendo conducir al síndrome urémico
hemolítico potencialmente mortal (SUH) (9).
Casi todos los aislamientos de EHEC O157:H7 albergan un plásmido de
virulencia de 92 kb llamado pO157, con aproximadamente 100 nucleótidos del
marco de lectura abierto (por sus siglas en ingles Open Reading Frame ORF) y
codifica varios factores de virulencia. Sin embargo, el principal factor de virulencia
es la toxina Shiga (Stx) codificada por fagos (Stx; también conocida como
verocitotoxina), que es una característica definitoria del grupo de E. coli productor
de Stx (STEC) a la que pertenece EHEC O157:H7. Hay dos subgrupos de la
toxina Stx: Stx1 y Stx2, las que se pueden encontrar en aislamientos de EHEC,
siendo Stx2 más prevalente en la colitis hemorrágica y SUH que Stx1 (32). Stx es
una toxina tipo AB cuya subunidad B es un pentámero unido no covalentemente a
la subunidad A, parte de la toxina biológicamente activa.
EHEC carece de un mecanismo secretor para Stx, por lo que la liberación
de ésta se produce a través de la lisis mediada por fagos lambdoides en respuesta
14
al daño del ADN y la respuesta del sistema de reparación de emergencia (SOS)
(33). Por lo tanto, se debe desalentar la terapia con antibióticos, ya que la toxina
sería liberada. Otros serotipos también han estado involucrados en brotes de
gastroenteritis y enfermedad sistémica. Por ejemplo, durante 2011, el serotipo
STEC O104:H4 fue responsable de los brotes epidémicos en Alemania. Esta cepa,
resistente a múltiples fármacos, causó más de 3800 casos de diarrea sin SUH y
más de 830 casos con SUH, lo que ocasionó 54 muertes. Además, también se
aislaron cepas del serotipo O104:H4 en otros 12 países europeos, en América del
Norte y Canadá (34).
Los receptores para la toxina Stx son las globotriaosilceramidas (Gb3) que
se encuentran en las células de Paneth de la mucosa intestinal humana (Figura 1)
y en la superficie de las células epiteliales renales (32, 35). El ganado carece de
estos receptores en el tracto gastrointestinal, lo que puede explicar por qué la
colonización por EHEC en el ganado bovino es asintomático (36). La subunidad
Stx B interactúa con Gb3 e induce invaginaciones de la membrana para facilitar la
internalización de la toxina (37). Una vez internalizada, viaja a través de los
endosomas tempranos hacia el Golgi, donde la subunidad A (un N-glucosidasa
previniendo la síntesis de proteínas) se inactiva por un evento de escisión. La
unión inicial de EHEC a los colonocitos no está bien definida. Este patotipo posee
16 operones que codifican para fimbrias (38); sin embargo, estos no han sido
ampliamente estudiados. Trabajos recientes han identificado un pilus tipo IV,
llamado pili coli hemorrágico, involucrado en la adherencia y la formación de
biofilm. Los flagelos y el pilus común de E. coli también podrían estar involucrados
15
en la unión a las células huésped (39, 40). Como se ha documentado para EPEC,
la unión íntima de EHEC a las células hospedadoras se produce a través de las
interacciones entre intimina y Tir (Figura 1). La unión también se favorece
mediante la interacción de intimina con nucleolina, un receptor de intimina
localizado en la superficie, cuya expresión aumenta con Stx2 (41). A medida que
se libera Stx durante la lisis bacteriana, el aumento en la expresión de nucleolina
puede ser importante para la unión de la progenie EHEC.
El genoma de EHEC también contiene el operón LEE de EPEC, aunque
EHEC inyecta aproximadamente el doble de efectores en las células huésped que
EPEC, la mayoría de los cuales son redundantes (42). Esta redundancia puede
proporcionar a EHEC una ventaja evolutiva que le permita superar a otras
bacterias. El mecanismo de formación de pedestal por EHEC es ligeramente
diferente al de EPEC.
Tir no es tirosina fosforilada por la célula huésped y la formación del
pedestal es independiente de Nck, aunque los pedestales son muy similares (43).
La subversión del citoesqueleto de actina de la célula huésped está mediada por
un homólogo de EspF denominado proteína de acoplamiento del citoesqueleto Tir
o TccP (también conocida como EspFU), que está vinculada a Tir por una proteína
huésped, el receptor de insulina tirosina quinasa sustrato (IRTKS; también
conocido como BAIAP2L1), homólogo de la proteína del sustrato receptor de
insulina (IRSp53; también conocido como BAIAP2 de 53 kDa (44, 45).
16
TccP interactúa con N-WASP para activar el conjunto de actina mediada por
ARP2/3 (46, 47). Es importante tener en cuenta que los mecanismos descritos
anteriormente para la formación de pedestal en EPEC y EHEC son
representativos de las cepas prototipo; las cepas EPEC del linaje 2 y las cepas
EHEC no O157 utilizan una combinación de los mecanismos dependientes de Nck
e independientes de Nck (48).
De manera interesante, EHEC puede detectar las hormonas adrenalina y
noradrenalina de las células huésped, así como la molécula que detecta el quórum
autoinductor 3 de las células gastrointestinales, esto para regular la motilidad y la
expresión de T3SS. La detección de estas moléculas es necesaria para la
virulencia de EHEC en modelos animales y presenta una nueva interacción que
debe tenerse en cuenta al considerar las interacciones patógeno-huésped (19).
3.2.3. Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC)
La ETEC es la causa más común de diarrea del viajero y puede tener
consecuencias fatales para los niños menores de 5 años. La ETEC también es
importante en la industria agrícola, ya que los lechones post destete son altamente
susceptibles a la infección (3).
El mecanismo de patogenicidad de ETEC en células epiteliales del intestino
delgado (figura 2) está mediada por factores de colonización (por sus siglas en
inglés colonizations factors CFs), que pueden ser no fimbriales, fimbriales,
helicoidales o fibrilares. Se ha identificado un gran número de CFs, de las cuales
CFA/I, CFA/II y CFA/IV son los más comunes. Los receptores afines para CFs
17
están mal definidos, aunque trabajos recientes han encontrado interacciones entre
CFA/I y restos de carbohidratos de glicosfingolípidos y glicoproteínas no ácidos y
entre CFA/IV y el glicosfingolípido ácido sulfatida (49, 50).
Figura 2. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enterotoxigénica. La bacteria se ancla al enterocito mediante los CF´s y la adhesina EtpA localizada en la punta del flagelo. La adherencia más estrecha es mediada a través de Tia y TibA. Posteriormente se secretan las toxinas LT (termolábil) y ST (termoestable), las que causan diarrea a través de la activación mediada por AMP y GMP cíclicos del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) (19).
Un estudio reciente demostró que los flagelos que se unen transitoriamente
con la adhesina EtpA se pueden usar como factores de adherencia de las células
epiteliales (51). Tanto los CF´s como los flagelos anclan las células ETEC para la
unión inicial a las células huésped, pero la unión más externa puede ser facilitada
por las proteínas de la membrana externa Tia y TibA (Figura 2) (52).
18
La diarrea mediada por ETEC se ha atribuido a la secreción de la
enterotoxina ST, la enterotoxina LT o una combinación de éstas. Las ST son
pequeñas toxinas que pueden clasificarse adicionalmente como STa o STb en
función de su estructura y función sintetizándose como precursores de 72
aminoácidos que se procesan en formas activas de 18–19 y 48 aminoácidos (para
STa para STb, respectivamente) (9).
La STa, que está asociada con la enfermedad humana, se une a los
receptores de guanilil ciclasa presentes en el borde en cepillo del intestino y
estimula su actividad. Esto conduce a un aumento de los niveles intracelulares de
guanosín monofosfato cíclico, lo que resulta en una absorción deficiente de Na+ y
a la activación del regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis
quística (CFTR) (52). LT es similar a la toxina del cólera y también es una toxina
AB. Se secreta desde el polo de la célula bacteriana y se asocia con
lipopolisacáridos en la superficie, donde puede actuar como una adhesina,
facilitando la unión a las células huésped (53, 54).
La subunidad B de LT interactúa con el monosialogangliósido GM1 en las
células huésped; la toxina se internaliza en las balsas de lípidos, donde se
transporta al citosol a través del retículo endoplásmico. La subunidad “A”, ADP
ribosila la subunidad α de la proteína estimulante de la unión a nucleótido guanina
(Gsα) que activa la adenilil ciclasa y aumenta los niveles de Adenosín Monofosfato
Cíclico (AMPc) intracelular. Esto activa la proteína quinasa A (PKA) dependiente
de AMPc, que a su vez activa CFTR (32). Curiosamente, la activación de PKA y
19
otras vías de señalización de la célula huésped por LT inhibe la expresión de los
péptidos antimicrobianos (55).
Se ha demostrado que ETEC secreta otros factores de virulencia (42, 52).
Por ejemplo, EatA, que es un autotransportador tipo serín proteasa de
Enterobacteriaceae SPATE (por sus siglas en inglés Serine Protease
Autotransporters of Enterobacteriaceae) que escinde la catepsina G y puede
acelerar la acumulación de líquido. Otros factores de virulencia secretados
incluyen CylA, una citotoxina formadora de poros y la toxina EAST1, con funciones
similares a STa.
3.2.4. Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC)
En general se acepta que EIEC y Shigella deben formar una sola
patovariante, pues comparten los mismos mecanismos de patogenicidad. Sin
embargo, el nombre del género Shigella todavía se usa debido a su asociación
con la Shigelosis y se mantiene en esta sección.
EIEC es una bacteria muy virulenta que causa disentería bacilar y diarrea
con sangre. Esta patovariante difiere de los otros porque incluye bacterias
intracelulares obligadas que no tienen flagelos ni factores de adherencia. La
virulencia se debe en gran parte a un plásmido de 220 kb que codifica un T3SS en
el locus Mxi-Spa que se requiere para la invasión, la supervivencia celular y la
apoptosis de los macrófagos (56).
20
La infección comienza en el colon, donde las bacterias pasan a través de
las células M (células microfold) mediante transcitosis para llegar a la submucosa
subyacente (Figura 3). La interrupción de las uniones estrechas y el daño causado
por la inflamación también le dan a EIEC acceso a la submucosa. La absorción de
esta bacteria por macrófagos residentes, el escape del fagosoma, la activación del
inflamasoma dependiente de caspasa-1 y la liberación definitiva de macrófagos se
han revisado exhaustivamente (56).
Figura 3. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteroinvasiva. EIEC entra a la submucosa a través de las células M y tras replicarse en macrófagos, invade el lado basolateral; dichos procesos son mediados por efectores secretados en las células huésped por el sistema de secreción tipo III (19).
EIEC se libera de los macrófagos muertos a la submucosa, donde invaden
el lado basolateral de los colonocitos con la ayuda de efectores que son
secretados por el T3SS. Los efectores clave, como IpaC, activan las quinasas
21
SRC en el sitio del contacto bacteriano para finalmente reclutar el complejo
ARP2/3 y causar la polimerización de la actina y la formación de ondulaciones de
la membrana para la entrada bacteriana (57).
RAC1, que puede promover la formación de ondulaciones en la membrana
y puede activarse por el mimetismo del factor de intercambio guanina-nucleótido
(IpgB1) y RhoG en la vía ELMO–DOCK180 (engullimiento y motilidad celular-
dedicador de la proteína 1 de citocinesis) o directamente, por actividad deIpgB1
(20, 21, 58). Otros efectores, como IpgD, IpaA y VirA, están involucrados en la
desestabilización de la actina y los microtúbulos para promover la invasión a un
fagosoma, en tanto que el escape de los fagosomas depende de los efectores
IpaB, IpaC, IpaD y IpaH (56).
Una vez libre en el citoplasma de las células epiteliales, EIEC promueve su
supervivencia mediante el uso de efectores para subvertir los procesos de la
célula hospedadora (Figura 3). Para prevenir el recambio de células epiteliales
intestinales, IpaB media la detención del ciclo celular apuntando a MAD2L2, que
es un inhibidor de la anafase (59), y se ha demostrado que OspE interactúa con la
quinasa unida a la integrina (ILK) para prevenir el desprendimiento de células
epiteliales (60). También IpgD evita la apoptosis (61), que puede estimular la
fosfoinositida 3-quinasa y activar las proteínas Akt, que regulan la supervivencia
celular. Estos tres mecanismos previenen la muerte celular y el desprendimiento,
proporcionando un nicho replicativo para que EIEC mantenga una infección.
22
Para persistir dentro de los colonocitos, este patotipo debe evadir la
respuesta inmune innata, para lo que utiliza al menos cuatro efectores. Uno de
estos, OspG, se une a proteínas E2 ubiquitiladas, lo que evita la degradación del
inhibidor del factor nuclear-κB (NF-κB) subunidad-α (IκBα) y, por lo tanto, inhibe la
activación de NF-κB (62). Además, OspF se dirige al núcleo, donde desfosforila
irreversiblemente las proteínas quinasas activadas por mitógenos requeridos para
la transcripción de los genes regulados por NF-κB (63). IpaH también se dirige al
núcleo, donde interactúa con un factor de empalme involucrado en la expresión de
citoquinas inflamatorias (64-66).
El cuarto efector, OspB, actúa con OspF para reducir los niveles de
interleucina-8 (IL-8) mediante el reclutamiento de factores del huésped que
remodelan la cromatina (67). En conjunto, estos cuatro efectores están
involucrados en la atenuación de la respuesta inflamatoria y, por lo tanto, permiten
la persistencia bacteriana. Un mecanismo de defensa del huésped es la autofagia,
dirigida a las células presentes en el citosol, mediante el reconocimiento de VirG
de autofagia con proteína 5 (ATG5). Curiosamente, el efector secretado IcsB
puede unir a VirG y secuestrarlo, evitando así otro aspecto de la defensa del
huésped (68).
3.2.5. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)
Aunque se considera un patógeno emergente, EAEC es el agente etiológico
más frecuente de la diarrea del viajero (después de ETEC) tanto en los países
desarrollados como en los países en desarrollo. EAEC también se está
reconociendo comúnmente como una causa de diarrea endémica y epidémica en
todo el mundo. La diarrea causada por EAEC suele ser acuosa, pero puede ir
acompañada de moco o sangre. La colonización por EAEC puede ocurrir en la
mucosa de los intestinos en personas de todas las edades, lo que puede llevar a
una leve inflamación en el colon (3). La comprensión de la biología de EAEC y su
patogenia es limitada, en parte debida a la escasez de modelos animales
adecuados y la heterogeneidad de los factores de virulencia.
El fenotipo característico de EAEC es la adherencia agregativa, que implica
la disposición de las células en un patrón de ladrillos apilados sobre células HEp-2
y está mediado por genes localizados en el plásmido de virulencia pAA. Este
plásmido de 100 kb codifican los genes necesarios para las fimbrias de adherencia
agregativa (AAF), que están relacionadas con la familia de adhesinas Dr y median
la adherencia de la EAEC a la mucosa intestinal (Figura 4). La adherencia
mediada por AAF y flagelina induce una secreción de IL-8, que conduce a la
transmigración de los neutrófilos (69, 70).
24
Figura 4. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteroagregativa. Este patotipo se adhiere a los enterocitos tanto en el intestino delgado como en el grueso a través de fimbrias de adherencia agregada (AAF) que estimulan una fuerte respuesta de IL-8, permitiendo la formación de biopelículas en la superficie de las células. La toxina codificada por el plásmido (Pet) es una SPATE que se dirige a la α-fodrina (también conocida como SPTAN1), alterando el citoesqueleto de actina e induciendo la exfoliación (19).
Se han identificado cuatro variantes de AAF (AAF/I, AAF/II, AAF/III y Hda)
(71, 72). Los receptores para los AAF son desconocidos, pero los datos recientes
muestran que AAF/II puede unirse a la fibronectina (73). Se piensa que la
extensión de los AAF cargados positivamente (lejos del lipopolisacárido cargado
negativamente) ocurre a través de una proteína secretada llamada dispersina. La
dispersión se asocia con el lipopolisacárido a través de interacciones
electrostáticas y se especula para enmascarar la carga negativa del
lipopolisacárido, permitiendo así que el AAF se extienda lejos de la superficie
bacteriana en lugar de colapsar sobre ella. Esto promueve la dispersión de EAEC
a través de la mucosa intestinal, al contrarrestar la agregación excesiva mediada
por AAF entre otras células de EAEC (19).
25
Las biopelículas formadas por EAEC son distintas de las formadas por E.
coli no patógenas, ya que pueden formarse independientemente de factores
comunes como curli, flagelo y antígeno 43 (Ag43) (74). La biopelícula de EAEC en
la superficie de los enterocitos está encerrada en una capa de moco espeso. Se
cree que EAEC puede penetrar ésta a través de la actividad mucolítica de la
proteína autotransportadora Pic (75). Se han identificado algunos genes, tanto de
proteínas plasmáticas como cromosómicas, que codifican y participan en la
formación de biopelículas, incluidos los genes que codifican un sistema de
secreción de tipo VI (93).
EAEC causa daño a la mucosa al secretar citotoxinas, aunque no todas las
toxinas se encuentran en todos los aislados. La toxina codificada por el plásmido
(Pet) es una SPATE que se dirige a α-fodrina (también llamada SPANT1),
interrumpe el citoesqueleto de actina, e induce la exfoliación (9). La toxina se
internaliza por un mecanismo de endocitosis basado en clatrina y posteriormente
se transporta a través del retículo endoplásmico al citosol (76, 77). Otras toxinas
descritas son la enterotoxina 1 de Shigella (ShET1) y EAST1, cuya presencia
también varía entre los aislamientos EAEC, sin embargo, su papel en la
patogénesis no se conoce completamente.
26
3.2.6. Escherichia coli adherente difusa (DAEC)
DAEC es un grupo heterogéneo que genera un patrón de adherencia difuso
en las células HeLa y HEp-2. Este patrón está mediado por proteínas codificadas
por una familia de operones relacionados, que incluyen tanto adhesinas fimbriales
(por ejemplo, Dr y F1845) como afimbriales (Afa), denominadas colectivamente
adhesinas Afa-Dr (78). Los aislamientos de DAEC que expresan cualquiera de las
adhesinas Afa-Dr (que se denominan Afa-Dr DAEC) colonizan el intestino delgado
y están implicados en la diarrea en niños entre las edades de 18 meses y 5 años,
así como en casos de infecciones del tracto uterino en adultos (78).
Todas las adhesinas Afa-Dr interactúan con el factor de aceleración de la
descomposición del complemento (DAF) asociado al borde del cepillo, que se
encuentra en la superficie de las células epiteliales intestinales y urinarias (Figura
5). La unión a DAF da como resultado la agregación de moléculas de DAF debajo
de las bacterias adherentes. También desencadena una cascada de señalización
dependiente de Ca2+, que provoca el alargamiento y el daño de las
microvellosidades de borde en cepillo a través de la desorganización de
componentes clave del citoesqueleto (78).
27
Figura 5. Mecanismo de patogenicidad en E. coli adherente difusa.
DAEC forma un patrón de unión difuso en enterocitos del intestino delgado, mediado por las adhesinas Afa-Dr. La mayor parte de estos factores de colonización se unen para complementar el factor acelerador de la descomposición (DAF). La toxina autotransportada Sat se ha implicado en lesiones de uniones estrechas (TJ) en DAEC que expresan Afa-Dr, así como en una mayor permeabilidad (19).
Además, junto con flagelos, la interacción entre las adhesinas Afa-Dr y DAF
induce la secreción de IL-8 de los enterocitos, lo que promueve la transmigración
de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) a través de la capa epitelial de la mucosa.
Esto estimula la regulación positiva de DAF en la superficie apical de las células
epiteliales, proporcionando a DAEC más receptores para una adherencia más
íntima (79). La interacción de DAEC con PMN, mediada por Afa-Dr, conduce a una
tasa acelerada de apoptosis de PMN y una tasa disminuida de fagocitosis
mediada por PMN (80).
28
Una subclase de fimbrias Afa-Dr interactúa con miembros de la familia de
receptores de la molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno
carcinoembriónico (CEACAM) que se encuentran en las superficies de las
membranas, en particular en balsas lipídicas (78). Las interacciones con CEACAM
activan CDC42, lo que lleva a la agregación de CEACAM debajo de las bacterias
adherentes y al efacelamiento de las microvellosidades de borde en cepillo (81).
Estas lesiones alteran varias enzimas del borde en cepillo que participan en la
secreción y absorción intestinal, lo que puede contribuir a la diarrea (78).
Recientemente se demostró que las interacciones entre las adhesinas Dr y las
CEACAM provocan que los dímeros de CEACAM se disocien, de modo que Dr
pueda interactuar con la forma monomérica del receptor (82).
Esto puede servir para manipular las rutas de la célula huésped a través de
la respuesta mediada por la interrupción de los dímeros CEACAM. Las
interacciones de la adhesina Afa-Dr con CEACAM y con DAF pueden participar en
la captación de células DAEC dependiente de microtúbulos, tras lo cual las
bacterias pueden sobrevivir en vacuolas (83).
A diferencia de otros patotipos de E. coli, el mecanismo de daño de DAEC
parece estar mediada a través de las interacciones de la adhesina Afa-Dr con las
células huésped. La toxina autotransportadora secretada (Sat) se ha implicado en
lesiones de uniones estrechas que se encuentran con la infección por Afa-Dr
DAEC y en el aumento de la permeabilidad (84). No se han identificado sistemas
de secreción u otros factores de virulencia en los aislamientos típicos de Afa-Dr
DAEC.
29
De acuerdo con lo anterior, se sabe que existen genes que codifican para
diferentes factores de virulencia particulares para cada uno de los patotipos de
DEC y esta es la única manera de clarificarlos en cada una de las patovariantes
mencionadas anteriormente. Un resumen de estos factores de virulencia se
presenta en el cuadro 1.
Cuadro 1. Factores de virulencia de E. coli diarreogénica.
Gen Mecanismo de patogenicidad involucrado Patotipo de E. coli
relacionado
eae
bfp
enterocito EPEC
pcvd432
lt
hlyA
rfbEO157
fliCH7
Hemolisina
Flagelo
EHEC
30
Además de los reportes que existen de DEC y sus factores de virulencia
típicos (mínimo criterio para determinar E. coli causante de diarrea), también
existen otros factores que le otorgan a E. coli cierta virulencia (sus mecanismos de
patogenicidad aún no se han estudiado de manera precisa) codificados por sus
respectivos genes, estos son llamados Genes Suplementarios de Virulencia (GSV)
los cuales se describen brevemente en el siguiente apartado.
3.3. Factores de virulencia suplementarios en E. coli
Como se mencionó de manera general que existen otros factores en E. coli
cuyo papel en la virulencia no está directamente relacionada con la patogenicidad;
como lo menciona Vargas en el 2015 donde encontraron E. coli no DEC con la
presencia de GSV, probablemente debido a la capacidad de esta bacteria de
intercambiar material genético entre las cepas patógenas e inocuas como se ha
descrito en otros géneros bacterianos (85). Por otro lado estos GSV pueden
favorecer de manera secundaria el daño al huésped participando como factores de
virulencia putativos. Entre estos factores se han descrito adhesinas, proteínas con
diversas actividades biológicas como proteasas y toxinas.
También se pueden encontrar estos factores de virulencia entre proteínas
dela familia SPATE, ya que son una familia creciente de proteínas implicadas en la
virulencia secretadas por bacterias Gram negativas y que desempeñan una serie
de funciones en la patogénesis tales como adhesinas, toxinas, proteasas y
mediadores de la motilidad intracelular (86). La mayoría de estas proteínas
31
comprenden tres dominios funcionales básicos, una secuencia líder amino-
terminal, un dominio "pasajero" secretado y un núcleo carboxi-terminal.
Como ya se mencionó, algunos autotransportadores también tienen motivos
de serina proteasa dentro de sus dominios de pasajeros; esta es una
característica común de las moléculas de esta clase producidas miembros de la
familia Enterobacteriaceae y, por lo tanto, se denominan proteínas SPATE (87).
A continuación, se presenta una revisión de los factores de virulencia
suplementarios de E. coli abordados en este trabajo, categorizados con base en
su actividad biológica: factores de colonización (aida-1, cah, ehaA, ehaB, ehaC,
ehaD, sab, tibA, efa/lifA, kps, agg4A y nleB), citotoxinas (espC, pet y sat) y
proteínas que degradan sustratos (eatA, epeA, espI, espP y pic).
3.3.1. Factores de virulencia suplementarios de E. coli
relacionados con mecanismos de colonización
Los siguientes factores de virulencia se relacionan con mecanismos de
colonización de E. coli en la célula huésped: El gen aida-I codifica para una
proteína (adhesina) de DAEC que participa en el patrón de adherencia difusotípico
de esta variante patógena (88). Por otro lado el gen cah codifica para una proteína
(antígeno 43) de EHEC, la cual tiene la capacidad de unirse al antígeno de unión a
calcio homogéneo (89).
Los genes: ehaA, ehaB, ehaC, ehaD codifican para proteínas
autotransportadoras descritas en la cepa E. coli O157: H7 EDL933 (90). Los
32
genes, ehaA y ehaB codifican para las proteínas EhaA y EhaB que median la
autoagregación, la formación de biopelículas y la adhesión a las células epiteliales
(90). EhaA es una proteína del sistema de secreción tipo V y EhaB se adhiere a
proteínas como el colágeno y laminina de la célula huésped (91, 92).
Las proteínas EhaC (proteína autotransportadora C) y EhaD están
codificadas por los genes ehaC y ehaD que sintetizan adhesinas de EHEC,
implicadas en la adhesión y formación de biofilms (90, 93).
El gen sab (2496 pb) codifica para la proteína Sab de 1,431 aminoácidos,
perteneciente a la familia SPATE y que contribuye en la formación de biofilms en
la cepa STEC O113:H22 98NK2 (94).
El gen efa1 codifica la adhesina Efa1 (385 kDa) y se encuentra en una PAI
similar a la isla genómica O 122 (OI-122) de EHEC O157: H7 cepa EDL933 (95-
97). Este gen es el mismo que lifA, que codifica la linfostatina (LifA) en la cepa
EPEC E2348/69 (98, 99). LifA inhibe la proliferación de linfocitos de sangre
periférica y linfocitos gastrointestinales, así como la producción de linfocinas. El
gen fue designado efa1/lifA. Por otro lado el gen nleb codifica la proteína efectora
NleE, aunque no está presente en la PAI LEE.
Por otro lado, también se ha reportado que la isla de patogenicidad OI-122
contiene el gen virulencia efa1-lifA y nleB que parece estar implicado en la
colonización de la mucosa intestinal y en la inhibición de la respuesta inmune del
huésped (97, 99, 100).
33
Dentro de las estructuras implicadas en la colonización de EAEC, se ha
descrito la proteína codificada por el gen kps (cápsula). Este gen fue usado como
marcador genético para el escrutinio de cepas potencialmente virulentas de EAEC
en Río de Janeiro Brasil. El gen kps se encontró en 70.6% de cepas aisladas de
pacientes con diarrea y no se amplificó en las cepas recuperadas de los pacientes
controles (101).
Por otro lado, el gen tibA está relacionado con el patotipo ETEC. El gen tibA
codifica para la adhesina TibA, miembro de la familia SPATE. El gen tibA está
codificado en el cromosoma en el loci tib, y codifica una proteína
autotransportadora relacionada con la formación de biofilms, adherencia y
autoagregación en ETEC. Un estudio mostró que la cepa de E. coli HB101
transformada con tibA, se adhirió e invadió células HCT-8 (epitelio ileocecal
humano) (102).
El gen agg4A se describió en el patotipo EAEC y codifica para una fimbria
tipo IV que participa en la adhesión a células epiteliales (103).
3.3.2. Factores de virulencia suplementarios de E. coli con
actividad citotóxica
La proteína EspC (110 kDa) se describió en la cepa EPEC E2348/69 y está
codificada por el gen espC presente en una isla de patogenicidad en el
cromosoma bacteriano (104, 105). Esta proteína ejerce efectos enterotóxico y
citotóxico, así como degradar las proteínas fodrina, hemoglobina, pepsina, factor
de coagulación V y es parte de la familia SPATE (104, 106).
34
Sat es una proteína SPATE (142 kDa) descrita en la cepa UPEC CFT073 y
codificada por el gen sat (107). Otras bacterias en las que se ha descrito la
presencia de Sat han sido Shigella, EAEC, DAEC y E. coli que causa septicemia
neonatal. El gen está constituido por 3885 pb y se encuentra en una isla de
patogenicidad (106).
El gen sat se ha encontrado en cepas de E. coli daaC positivas, aisladas de
heces de niños con diarrea en Brasil y Francia (84, 88, 108). Por otro lado, se
afirma una correlación entre la presencia de DAEC y sat (84). Se ha hipotetizado
que las cepas DAEC pueden adquirir genes de virulencia presentes en UPEC, ya
que algunos factores de virulencia de DAEC como adhesinas y hemolisinas, se
encuentran en aislados de UPEC (89).
Las cepas UPEC que portan sat, provocan vacuolización y daño glomerular,
como se demostró en un modelo murino CBA (por sus siglas en ingles Cross of a
Bagg Albino)de ITU ascendente, lo que indica que Sat es una citotoxina
vacuolizante (107). Si Sat es un factor de virulencia que contienen algunas clonas
de DAEC, las lesiones observadas en el tracto urinario podrían ser similares en el
tejido intestinal, induciendo diarrea (108). En los aislados DAEC recuperados de
pacientes con diarrea y asintomáticos, el gen sat se ha encontrado de manera
equitativa en ambos grupos (109). Por otro lado, otro estudio ha reportado la
presencia del el gen sat en DAEC aislada de niños con diarrea (109).
35
actividad proteolítica
El gen eatA codifica para una proteína autotransportadora de la que se
tiene poco conocimiento sobre su mecanismo de virulencia, aunque se sabe que
es muy importante su participación como serina proteasa y tiene relación con
enfermedades intestinales severas contribuyendo a la virulencia de ETEC (110).
También se tienen reportes de que EatA es un péptido que actúa como sustrato
de la catepsina G, una serina proteasa producida por leucocitos
polimorfonucleares que modula o escinde una gran variedad de productos
extracelulares incluyendo a los proteoglicanos (111). Por otro lado, EpeA es una
proteína SPATE de alto peso molecular con actividad proteasa y mucinasa
identificada en el patotipo EHEC (112).
EspI (también conocida como NleA) es una proteína autotransportadora
descrita en EPEC y EHEC, codificada por el gen espI (fuera de LEE) (113). En
EPEC, EspI contribuye en la interrupción de las uniones estrechas (114) y se ha
identificado recientemente dentro de una isla de patogenicidad presente en cepas
STEC eae-negativas (115).
EspP (por sus siglas en inglés extracellular serine protease plasmid) está
codificada en el gen espP de E. coli O157:H7 cepa EDL933 y también es parte de
la familia SPATE con actividad proteolítica. Entre las moléculas diana sobre las
que ejerce su actividad biológica están la pepsina, el factor V, la apolipoproteína
así como las proteínas del complemento C3/C3b y C5 (106).
36
Otro de los factores accesorios de virulencia de EAEC es la proteína Pic
(codificada por el gen pic), serina proteasa (secretada también por Shigella
flexneri) involucrada en la colonización intestinal y crecimiento de EAEC en el
moco intestinal (116); también forma biofilms (asociada a la presencia de los
genes pic, sepA y agg4A), donde las proteínas que se expresan de estos genes
tiene actividad mucinolítica, hemaglutinación y resistencia sérica (117, 118). Un
estudio en el 2017, se identificó EAEC y los genes de virulencia con relación
diarrea persistente (≥14 días) en niños Daneses; la diarrea persistente se asoció
con cepas que carecen del gen pic (p = 0.002) y la combinación de los genes pic,
sat y ausencia del gen aggA (p = 0.05). También en este mismo estudio se reportó
que los genes pic, aggR, aap y aggA se asociaron con diarrea aguda (119). Un
estudio brasileño identificó la presencia de los genes pet y aafA en EAEC y se
relacionaron con el grupo de niños diarreicos y la presencia de los genes agg4A y
ORF61 con el grupo de niños sanos (120).
En el cuadro 2 se resumen los genes de los otros factores de virulencia de
E. coli con importancia en epidemiología y clínica como se describió
anteriormente.
37
Cuadro 2. Genes de virulencia suplementarios de E. coli investigados en este estudio.
Gen Mecanismo de patogenicidad involucrado
Patotipo de E. coli
DAEC (121)
EHEC (122)
ehaABCD Formación de biofilms (90) Sab Formación de biofilms (94) tibA Formación de biofilms
adherencia y autoagregación (102)
aEPEC (123)
EAEC (101)
agg4A Subunidad fimbrial AAF/IV EAEC (124) nleB La proteína NleE B aEPEC (123)
Citotoxicidad espC Actividad enterotóxica, escisión
de espectrina, pepsina y factor V
EPEC (104)
EAEC (87)
DAEC (108)
ETEC (110)
EHEC (112)
(115)
(125)
EAEC (126)
3.4. Epidemiología de DEC
La diarrea sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad a
nivel mundial, especialmente entre lactantes y niños pequeños. Durante 2010 se
registraron más de 1,700 millones de episodios de diarrea en todo el mundo, de
los cuales 700,000 provocaron la muerte en niños menores de 5 años (2, 127). En
2016, a nivel mundial la diarrea fue la 8va causa de muerte en población de todas
las edades y la quinta entre los menores de 5 años (4). Entre los agentes
etiológicos de diarrea, el rotavirus fue responsable de la mayor cantidad muertes
por diarrea (228,047), sin embargo, las bacterias son los agentes más frecuentes
de diarrea, siendo en ese mismo año las muertes causadas por Shigella las que
siguieron a rotavirus (212,438), V. cholerae, Salmonella no causante de tifoidea,
Campylobacter y los patotipos de E. coli, principalmente ETEC y EPEC; éstos
últimos causaron 51,186 y 12,337 (respectivamente) muertes en ese año (4). Con
estos datos, los diferentes patotipos de DEC constituyen una causa importante de
diarrea, particularmente en los países en desarrollo (2).
Aunque los patotipos DEC son agentes causales de diarrea, por tanto, son
de importancia para la salud pública, este tipo de bacterias no se buscan
rutinariamente como patógenos entéricos en los laboratorios clínicos, por lo que el
número de casos puede estar subestimado. Por lo tanto, la prevalencia de diarrea
causada por cepas de DEC generalmente se desconoce, particularmente en áreas
donde se cree que las cepas de DEC son endémicas (128).
La mayoría de los casos de diarrea reportados en México, Colombia y
Nicaragua están asociados con ETEC. Por otro lado, EAEC ha sido la patovariante
39
más prevalente en Brasil, Paraguay y Perú, en tanto que EPEC (aEPEC o tEPEC)
prevalece en Venezuela, Chile, Argentina y Uruguay. Para el caso de EHEC,
particularmente el serotipo O157:H7, ha tenido impacto regional en la parte sur del
continente y está representado por el predominio del serotipo O157:H7 (129).
En América del Sur, particularmente en Argentina, el patotipo EHEC O157:
H7 sigue siendo un importante patógeno transmitido al humano por los alimentos,
por lo que es el serotipo dominante en los casos de SUH. Se ha informado que la
incidencia de esta enfermedad en Argentina es de 12.2 casos por cada 100,000
niños menores de 5 años; Además, el SUH es la causa principal de insuficiencia
renal aguda en niños y es responsable del ∼20% de los trasplantes de riñón en
niños y adolescentes en aquel país (130).
Aunque se han identificado varios factores de riesgo para las infecciones
por EHEC en Argentina (ingerir carne de res poco cocida y el contacto con niños
<5 años de edad con diarrea) (130), la alta incidencia de infecciones por EHEC
O157 y los casos de SHU en este país se consideran un problema de salud
pública porque existe la posibilidad de que este patógeno pueda exportarse a
otros países. De hecho, en algunas zonas de Argentina, se ha informado de la
presencia casi exclusivamente de cepas de E. coli O157 pertenecientes al clado
hipervirulento 8, que muestran homogeneidad en los genotipos EHEC O157 que
se detectan en aislamientos humanos y bovinos, representando un factor de
riesgo para los humanos (131).
40
Debido al impacto de esta enfermedad humana en la salud pública de
Argentina, en el año 2000 el SUH se convirtió en una enfermedad notificable;
desde el 2013, se conmemora como día nacional al 19 de agosto celebrándose la
lucha contra el SUH aprobada como ley en ese país.
Con respecto a las cepas híbridas, los esfuerzos para identificar estos tipos
de aislamientos en América Latina se incrementaron después de la aparición de la
cepa EHEC / EAEC O104:H4 en un brote de Europa. Los estudios prospectivos
identificaron a un niño que ingresó a un hospital en Argentina y que padecía
diarrea aguda. A partir de las heces de este niño, se aisló E. coli y se caracterizó
en un laboratorio de referencia. Los resultados la identificaron como EAEC del
serotipo O104:H4; en tanto que se identificaron los factores de virulencia
relacionados con EAEC, pero negativo para los genes de la toxina Shiga (132). La
aparición de este serotipo ha reforzado la necesidad de implementar mejores
métodos de detección para todas las patovariantes de E. coli en América Latina
(133).
En México, durante casi dos décadas (1998-2018), las infecciones
intestinales bacterianas y virales han sido la segunda causa de morbilidad entre la
población mexicana (134). En el 2015, fue la segunda causa de morbilidad en
niños de 5 a 14 años y en el 2016 se reportó como la cuarta causa de mortalidad
entre los niños menores de cinco años (134, 135). Esta tendencia también se
observa en el noreste mexicano, dado que en Sinaloa, las infecciones intestinales
fueron la segunda causa de morbilidad entre niños de 5-14 años, solo por debajo
de las infecciones respiratorias agudas (Figura 6). Durante 2017 en este estado,
41
este tipo de infecciones se ubicó como la segunda causa de morbilidad, afectando
principalmente a personas de 25-44 años (17%), seguido de los niños de 1-4 años
(16.5%) (134).
Figura 6. Las infecciones intestinales, segunda causa de morbilidad en niños de 5- 14 años en Sinaloa, México. Las infecciones intestinales abarcan a las infecciones intestinales bacterianas (CIE A04), las infecciones intestinales debidas a virus, excepto rotavirus (CIE A08) y diarrea de presunto origen infeccioso (CIE A09) (136). CIE, código internacional de enfermedades.
Sin embargo, hay escasos estudios sobre la etiología de la diarrea
infecciosa, particularmente sobre la prevalencia de los patotipos DEC por grupos
de edad. Algunos estudios mostraron la presencia (28%) de cepas DEC en niños
menores de 2 años hospitalizados (127). Otro trabajo mostró la presencia de DEC
42
entre estudiantes estadounidenses que viajaron a México y se reportó que ETEC
fue la que se presentó en mayor proporción (36%) (137-139). Un estudio hecho en
Yucatán (2007 al 2011), reportó un 28% de E. coli diarreogénicas, las que se
asociaron con diarrea aguda en niños menores de 5 años que requirieron
hospitalización, los patotipos DAEC, EAEC y EPEC fueron los más frecuentes (35,
24 y 19%, respectivamente). De manera interesante, entre los niños afectados con
las variantes diarreogénicas de E. coli, 30% presentaron diarrea moderada, en
tanto que 14% tuvieron enfermedad diarreica severa. También encontraron que
los genes de virulencia suplementarios (aatA, astA, pet y cdt), los cuales fueron
más prevalentes en las cepas DEC que las E. coli no diarreogénicas(140).
Con el propósito de identificar a los agentes etiológicos, un estudio hecho
con 1037 pacientes que padecieron diarrea aguda en Sinaloa, reveló una
prevalencia de 23.3% de E. coli diarreogénica, siendo la variante EAEC la más
frecuente, seguida de EPEC y ETEC (12.2, 5.1 y 4.3%, respectivamente). El grupo
más afectado fue el de los niños menores a 2 años, de quienes se aisló
principalmente EPEC. Más del 90% de los aislados exhibieron resistencia a la
tetraciclina, ampicilina y trimetoprima-sulfametoxazol(141).
En Sinaloa también se han identificado cepas de E. coli en alimentos (7.9%),
siendo el 13.6% de éstas diarreogénicas. Los productos lácteos fueron los que
exhibieron mayor prevalencia de DEC (2.8%), siendo EPEC la más frecuente
(78.5%) (128).
3.5. Epidemiología de E. coli diarreogénica en pacientes asintomáticos
Se ha reportado el aislamiento de E. coli con factores de virulencia aunque
de pacientes asintomáticos, quienes no presentaron un cuadro clínico diarreico u
otro tipo de infección. En este sentido, existen diversos estudios donde han
aislado diferentes patotipos de E. coli diarreogénica de niños con diarrea y sin
diarrea (asintomáticos). Un trabajo realizado en Brasil en el 2007, reportó un
25.4% de prevalencia de DEC en el grupo de sujetos con diarrea, en tanto que
entre los asintomáticos, la prevalencia fue de 18.7%, sin embargo, dicha diferencia
no fue significativa (142). Por otro lado, se reportó en el año 2011, un trabajo
hecho en África, donde se encontró DEC en niños menores de 5 años con diarrea
(45%) y niños asintomáticos (29%) la cual hubo asociación significativa entre DEC
y diarrea (p<0.001) (143). La interpretación de la frecuencia de patógenos en
muestras de diarrea frente a las de control, es bastante compleja. La colonización
asintomática puede ser el resultado de varios factores (del patógeno, del huésped
o del ambiente) (127).
La presencia de un patógeno en heces en niños asintomáticos puede
explicarse considerando diversos factores del huésped como la edad, o los
derivados de la edad temprana como la lactancia, los anticuerpos
transplacentarios o factores protectores a mayor edad, como el desarrollo de
inmunidad adquirida en función de las infecciones previas (127).
44
3.6. Grupos filogenéticos de E. coli
El trabajo de Whittam y colegas (1983) reveló la existencia de una
subestructura genética en Escherichia coli y estudios posteriores han confirmado
la existencia de una extensa subestructura en la especie (144, 145). Esta
subestructura genética mostró que las cepas de diferentes filogrupos de E. coli no
se distribuían aleatoriamente con respecto a su fuente de aislamiento. Es decir, los
patotipos causantes de infección extraintestinal se agruparon entre los filogrupos
B2 o D que en A o B1 (146, 147). Este hecho posibilitó la idea de que este sería
un método simple para asignar aislamientos a un filogrupo de terminado. Esto
condujo al desarrollo y validación de un ensayo de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para detectar tres marcadores moleculares como los genes
chuA (gen que codifica una proteína de transporte hemorreguladora de hierro por
sus siglas en ingles E. coli haem-utilization), yjaA (su mecanismo es desconocido
pero se sabe que su secuencia génica se encuentra en el genoma completo de la
cepa E. coli K-12) y el fragmento de ADN TspE4.C2 (gen de la lipasa esterasa),
con el propósito de asignar cada cepa de E. coli a un grupo filogenético
determinado (148).
En base a la presencia o ausencia de estos tres fragmentos, una cepa de E.
coli podría asignarse a los filogrupos, A, B1, B2 o D (149). Este esquema se ha
utilizado ampliamente como un método simple y económico para determinar el
grupo filogenético de un aislado de E. coli; además, es una herramienta que ha
mostrado que las cepas de diversos filogrupos difieren en sus características
45
fenotípicas y genotípicas, las características de su nicho ecológico, rasgos de su
historia de vida así como la capacidad para causar enfermedades (150, 151).
Desde el año 2000 se han incrementado los datos sobre los tipos de
tipificación secuencia multilocus (por sus siglas en ingles Multi Locus Secuence
Typig –MLST-) para E. coli, esto a partir de diferentes huéspedes y hábitats. Estos
datos permitieron validar de manera más efectiva la utilidad del método de PCR
triple para la asignación de filogrupos (148). Este estudio demostró que el 80-85%
de las asignaciones de filogrupos son correctas. Sin embargo, también demostró
que una fracción significativa de cepas con genotipos particulares de PCR triple
(A0, D1, D2) se asignó incorrectamente.
Los extensos conjuntos de datos MLST disponibles, aunado al creciente
conocimiento de datos del genoma, han permitido una mejor comprensión sobre la
subestructura genética en E. coli. Por ejemplo, se estableció el filogrupo E, que de
acuerdo al esquema anterior estaba conformado por un conjunto de cepas de
filogrupo desconocido, de las cuales el patotipo O157: H7 es el miembro más
conocido (150).
Por otro lado, también se creó el filogrupo F que alberga cepas que
conforman un grupo hermano del filogrupo B2 (152, 153). Más recientemente, se
propuso el filogrupo C para aquellas cepas estrechamente relacionadas, pero
distintas del filogrupo B1 (153, 154). Walk y colegas (2009) notaron nuevos linajes
(nuevas especies) de Escherichia genéticamente distintos pero fenotípicamente
indistinguibles de E. coli (155). Al menos uno de estos linajes crípticos,
46
Escherichia clado I, también debe considerarse un filogrupo de E. coli en función
del grado de recombinación detectado entre cepas pertenecientes al clado I y E.
coli (156). Por tanto, en la actualidad el esquema se extendió a ocho filogrupos
reconocidos de E. coli, siete de los cuales pertenecen a E. coli en sentido estricto
(A, B1, B2, C, D, E, F) y uno corresponde a Escherichia clado I (Figura 7).
Dadas las limitaciones del método triple desarrollado por Clermont y
colegas en 2000, aunado a que el método no fue diseñado para detectar
filogrupos distintos de A, B1, B2 y D, estos investigadores consideraron apropiado
una modificación del método para superar estas limitaciones.
Al plantear modificaciones a este primer método de PCR triple, se
mantuvieron los marcadores chuA, yjaA y TspE4.C2.Los nuevos datos disponibles
del genoma se usaron para modificar las secuencias del cebador chuA, yjaA y
TspE4.C2 para evitar polimorfismos en la secuencia de nucleótidos utilizada para
la identificación del cebador y excluir la amplificación de TspE4.C2 y chuA en
cepas que pertenecen al clado críptico I y los clados III, IV y V respectivamente
(157). Además, se agregó el marcador genético arpA, por lo que el nuevo método
ahora es una PCR cuádruplex.
47
Figura 7. Dendograma de la filogenia de E. coli. Árbol de máxima verosimilitud que representa la estructura de los filogrupos de Escherichia coli. El árbol se construyó mediante el modelo general de evolución reversible (158).
La inclusión de arpa tuvo dos propósitos. Primero, actuar como control
interno de la calidad del ADN, ya que se espera que todas las cepas de E. coli y
clado I produzcan al menos un producto de PCR mediante el esquema de PCR
cuádruplex. En segundo lugar, la inclusión de este marcador permite que las
cepas pertenecientes al filogrupo F, anteriormente mal identificadas como cepas D
(chuA, yjaA -, TspE4.C2 -), se distingan porque arpA está presente en todas las E.
48
coli con la excepción de las pertenecientes a los filogrupos B2 y F (158). El
marcador arpA está ausente en los clados crípticos II, III, IV, V, así como en E.
albertii y E. fergusonii (158). Finalmente, para identificar las cepas que pertenecen
a los filogrupos C y E, se diseñaron dos pares adicionales de cebadores de PCR
específicos de alelo (159).
3.7. E. coli y su resistencia a antibióticos
La resistencia a los antimicrobianos (AMR) es la capacidad de un
microorganismo (como bacterias, virus y algunos parásitos) para evitar que un
antimicrobiano (como antibióticos, antivirales y antipalúdicos) actúen contra él;
como resultado, los tratamientos estándar se vuelven ineficaces, las infecciones
persisten y pueden extenderse a otros.
Están surgiendo y extendiéndose nuevos mecanismos de resistencia a nivel
mundial, amenazando nuestra capacidad para tratar las enfermedades infecciosas
comunes, lo que deriva en enfermedades prolongadas, discapacidad y muerte. Sin
antimicrobianos efectivos para la prevención y el tratamiento de infecciones, los
procedimientos médicos como el trasplante de órganos, la quimioterapia contra el
cáncer, el control de la diabetes y la cirugía mayor (por ejemplo, cesáreas o
reemplazos de cadera) se convierten en un riesgo muy alto.
La resistencia a los antimicrobianos aumenta el costo de la atención médica
con estadías más prolongadas en los hospitales y se requieren cuidados más
49
intensivos. Este fenómeno supone un riesgo para alcanzar los objetivos de
desarrollo sostenible (160).
La resistencia a los antimicrobianos ocurre naturalmente con el tiempo,
generalmente a través de cambios genéticos. Sin embargo, el mal uso y el uso
excesivo de antimicrobianos están acelerando este