Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA FACULTAD DE MEDICINA MAESTRIA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en niños con un cuadro clínico diarreico y asintomático en Sinaloa: factores de virulencia y daño celular TESIS Que presenta Luis Monroy Higuera Para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Biomedicina Molecular Directores de tesis Dr. Vicente Adrián Canizalez Román Dr. Héctor Manuel Flores Villaseñor Culiacán. Sinaloa Febrero 2020

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA

FACULTAD DE MEDICINA

MAESTRIA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en niños con un cuadro clínico diarreico y asintomático

en Sinaloa: factores de virulencia y daño celular

TESIS

Que presenta

Luis Monroy Higuera

Para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Biomedicina Molecular

Directores de tesis

Dr. Vicente Adrián Canizalez Román

Dr. Héctor Manuel Flores Villaseñor

Culiacán. Sinaloa Febrero 2020

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El presente trabajo se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Biología

Molecular de la Maestría en Ciencias en Biomedicina Molecular de la Facultad de

Medicina, perteneciente a la Universidad Autónoma de Sinaloa (UAS), bajo la

dirección del Dr. Vicente Adrián Canizalez Román (profesor e investigador, SNI-II

encargado del Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Medicina UAS)

y del Dr. Héctor Manuel Flores Villaseñor (profesor e investigador, SNI-I

encargado del Laboratorio de Biotecnología en Salud de la Facultad de Medicina

UAS).

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AGRADECIMIENTOS

Agradezco a la institución Universidad Autónoma de Sinaloa y a la Facultad

de Medicina, al igual que a sus autoridades por haberme permitido cursar este

posgrado; a la coordinación de la Maestría en Ciencias en Biomedicina Molecular

que en dos años del programa tuve el apoyo para crecer de manera académica y

profesional. Por otro lado no me queda más que agradecer a mis tutores de tesis,

al Dr. Vicente Adrián Canizalez Román y al Dr. Héctor Manuel Flores Villaseñor

porque siempre conté con su apoyo incondicional, con sabios consejos, asesoría

profesional, académica, técnica y científica. También quiero dar las gracias a mis

asesores de tesis, al Dr. Velázquez, M.C Uriel y al Dr. Valdez por su ayuda en la

realización de este trabajo ya que aparte de contar con su asesoría científica conté

con su amistad a lo largo de mi travesía de esta maestría. A mis compañeros de la

maestría y amigos del laboratorio de investigación en especial a la Dra. Erika

Acosta y al Dr. Javier Gutiérrez que se suman a los agradecimientos, porque ellos

siempre estuvieron en las buenas y en las mejores, apoyándome con los retos que

se presentaron en esta etapa. A la Dra. Nidia León Sicairos por haberme

aconsejado desde el primer día que pise los laboratorios de investigación hace

algunos 11 años atrás en el año 2009; la guía de la Dra. Nidia también ha

contribuido al crecimiento de mi vida personal, académica y profesional. Por ultimo

agradecer a mi familia a mis padres Luis y Silvia Nereyda, a mis hermanos Toño y

Silvia, a mi sobrino Diego que ellos han sido mis compañeros de vida y el pilar

para seguir adelante.

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INDICE GENERAL

I. RESUMEN ........................................................................................................................... 1

ABSTRACT .................................................................................................................................. 3

II. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 5

III. REVISIÓN DE LA LITERATURA ................................................................................... 8

3.1. Características de Escherichia coli ................................................................................ 8

3.2. Escherichia coli diarreogénica (DEC) y sus variedades .............................................. 9

3.2.1. Escherichia coli enteropatógena (EPEC) .................................................................. 9

3.2.2. Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) ........................................................... 13

3.2.3. Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) ............................................................... 16

3.2.4. Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC) .................................................................... 19

3.2.5. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)............................................................... 23

3.2.6. Escherichia coli adherente difusa (DAEC)............................................................... 26

3.3. Factores de virulencia suplementarios en E. coli ....................................................... 30

3.3.1. Factores de virulencia suplementarios de E. coli relacionados con mecanismos de colonización .......................................................................................................................... 31

3.3.2. Factores de virulencia suplementarios de E. coli con actividad citotóxica ........... 33

3.3.3. Factores de virulencia suplementarios de E. coli con actividad proteolítica ......... 35

3.4. Epidemiología de DEC .................................................................................................. 38

3.5. Epidemiología de E. coli diarreogénica en pacientes asintomáticos ........................ 43

3.6. Grupos filogenéticos de E. coli ..................................................................................... 44

3.7. E. coli y su resistencia a antibióticos ........................................................................... 48

3.7.1. Mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos ................................... 52

IV. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.......................................................................... 57

V. JUSTIFICACIÓN................................................................................................................ 58

VI. HIPÓTESIS .................................................................................................................... 59

VII. OBJETIVOS ................................................................................................................... 60

VIII. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 61

8.1. Población de estudio ..................................................................................................... 61

8.2. Aislamiento e identificación de cepas de E. coli ......................................................... 61

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vii

8.3. Cepas de referencia ...................................................................................................... 63

8.4. Extracción de ADN ........................................................................................................ 63

8.5. Detección de genes típicos y genes suplementarios de virulencia (GSV) en E. coli

por PCR. .................................................................................................................................... 64

8.6. Ensayo de citotoxicidad ................................................................................................ 69

8.7. Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos ........................................................ 72

8.8. Determinación de grupos filogenéticos en E. coli ....................................................... 74

8.9. Análisis estadístico ........................................................................................................ 74

IX. RESULTADOS ............................................................................................................... 76

9.1. Aislamiento de E. coli .................................................................................................... 76

9.2. La prevalencia de DEC fue de 18.6% en niños de Sinaloa, México, siendo los patotipos EAEC y EPEC los más frecuentes. ........................................................................ 76

9.3. De acuerdo a los GSV, las cepas de E. coli se agruparon en tres categorías, siendo las E. coli no-DEC con GSV las más frecuentes.................................................................... 78

9.4. El 44% de GSV se asociaron con las cepas DEC, principalmente los que codifican para factores de colonización y citotoxinas. ........................................................................... 82

9.5. Las cepas de E. coli aisladas de niños con diarrea (DEC y no-DEC) exhibieron un mayor puntaje de virulencia que las E. coli aisladas de niños asintomáticos (DEC y no-DEC). 86

9.6. Las cepas DEC aisladas de niños con o sin diarrea, exhibieron mayor citotoxicidad que las E. coli no-DEC .............................................................................................................. 88

9.7. Perfil de susceptibilidad a antimicrobianos ................................................................. 92

9.1. Filogenia de E. coli aisladas de niños de Sinaloa ....................................................... 96

X. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 100

XI. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 113

XII. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 115

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viii

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteropatógena y E. coli enterohemorrágica. ................................................................................................................... 11

Figura 2. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enterotoxigénica. ................................... 17

Figura 3. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteroinvasiva. ....................................... 20

Figura 4. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteroagregativa. ................................... 24

Figura 5. Mecanismo de patogenicidad en E. coli adherente difusa. ................................... 27

Figura 6. Las infecciones intestinales, segunda causa de morbilidad en niños de 5-14 años en Sinaloa, México. ......................................................................................................... 41

Figura 7. Dendograma de la filogenia de E. coli. ................................................................... 47

Figura 8. Comparación del puntajes de virulencia entre grupos de E. coli aisladas de niños con diarrea y asintomáticos. .................................................................................................... 87

Figura 9. Citotoxicidad de E. coli aisladas de niños con diarrea y asintomáticos de Sinaloa, México. ....................................................................................................................................... 89

Figura 10. Citotoxicidad de grupos de E. coli aisladas de niños con diarrea y asintomáticos en Sinaloa, México. ................................................................................................................... 90

Figura 11. Regresión lineal entre el puntaje de virulencia de cepas de E. coli aisladas de niños con/sin diarrea y el porcentaje de citotoxicidad. .......................................................... 91

Figura 12. Grupos filogenéticos representativos de E. coli aisladas en Sinaloa, México... 96

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INDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Factores de virulencia de E. coli diarreogénica. ................................................... 29

Cuadro 2. Genes de virulencia suplementarios de E. coli investigados en este estudio. .. 37

Cuadro 3. Oligonucleótidos para amplificar el gen ARNr 16S en E. coli. ............................ 62

Cuadro 4. Oligonucleótidos para la detección de genes típicos de E. coli diarreogénicas. 65

Cuadro 5. Oligonucleótidos para la amplificación de GSV en E. coli. .................................. 67

Cuadro 6. Antibióticos usados y valores de corte. ................................................................. 73

Cuadro 7. Distribución de E. coli y sus patotipos de acuerdo a la condición clínica de niños de Sinaloa, México. ................................................................................................................... 77

Cuadro 8. GSV en E. coli aisladas de niños de Sinaloa, México. ........................................ 80

Cuadro 9. Distribución de GSV en E. coli aisladas de niños en Sinaloa, México. .............. 83

Cuadro 10. Distribución de GSV de acuerdo a la condición clínica de los niños de Sinaloa, México. ....................................................................................................................................... 84

Cuadro 11. Distribución de GSV en cepas DEC aisladas de niños en Sinaloa, México. ... 85

Cuadro 13. Resistencia a categorías de antimicrobianos de cepas DEC aisladas de niños con diarrea y asintomáticos en Sinaloa, México. ................................................................... 94

Cuadro 14. Distribución de los grupos filogenéticos de E. coli aisladas de niños de Sinaloa, México. ........................................................................................................................ 97

Cuadro 15. Grupos filogenéticos de acuerdo a los GSV de E. coli aisladas de niños en Sinaloa, México. ........................................................................................................................ 98

Cuadro 16. Grupos filogenéticos de E. coli aisladas de niños de Sinaloa, México, de acuerdo a la condición clínica. ................................................................................................. 99

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I. RESUMEN

Durante el 2016, la diarrea de origen infeccioso se ubicó como la octava causa

de muerte en el mundo, siendo la población infantil menor de cinco años la más

afectada, entre quienes representó la quinta causa de muerte. E. coli

enterotoxigénica y E. coli enteropatógena se ubican dentro de los trece principales

agentes que provocan muerte por diarrea en el mundo en infantes menores de 5

años. En México, esta enfermedad es la segunda causa de morbilidad entre la

población; sin embargo, no hay estudios sobre las características de E. coli

diarreogénica en niños del noreste mexicano. El propósito del presente trabajo fue

determinar la prevalencia de esta bacteria aislada de niños con diarrea y

asintomáticos en Sinaloa, así como comparar su perfil de virulencia, el daño

celular, la resistencia a antimicrobianos y los filogrupos. En los resultados se

obtuvo que la prevalencia de DEC fue 18.6% y se asoció con la diarrea. Los

patotipos EPEC y EAEC fueron los más prevalentes (33% cada uno). Las cepas

DEC aisladas de diarrea exhibieron la mayor cantidad de genes suplementarios de

virulencia (GSV) entre 8 y 9 genes. Además los genes ehaA, ehaC, efa/lifA, nleB,

agg4A, espC, pet y pic se asociaron con las DEC, en tanto que los genes ehaA,

ehaB, kps, ag4A, eatA, espI, espP y pic se asociaron con la presencia de diarrea.

Las cepas DEC de niños con/sin diarrea exhibieron el mayor puntaje de virulencia

y causaron el mayor daño citotóxico sobre células HT-29. Las cepas DEC de niños

con diarrea fueron resistentes a tetraciclina y ampicilina (40.7 y 35.6%

respectivamente), en tanto que las DEC de niños asintomáticos fueron resistentes

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al ácido nalidíxico y a cefotaxima (ambas con 32.2%). Por otra parte una gran

parte de las DEC fueron multi-farmaco resistentes (47.5%). Finalmente gran parte

de las cepas DEC se ubicaron en el filogrupo A (53.9%), seguido delos filogrupos

D y B1 (13.9% cada uno). El perfil biológico de las E. coli aisladas de niños con o

sin diarrea en el noreste mexicano, revela la alta presencia de GSV, además de la

elevada tasa de resistencia antimicrobiana en las cepas que colonizan a estos

huéspedes y que pueden fungir como reservorio para diseminar su potencial

patogénico.

.

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3

ABSTRACT

During 2016, infectious diarrhea are the eighth leading cause of death in

the world, and the fifth leading cause of death among children under five years old.

Enterotoxigenic E. coli and enteropathogenic E. coli are the main etiologic agents

of diarrhea worldwide. In Mexico, diarrheal disease is the second cause of

morbidity among population. However, there are scarce studies about the

characteristics of diarrheagenic E. coli (DEC) in children in northwest of Mexico.

The aim of the present work was to determine the prevalence of DEC in children

with and without diarrhea in Sinaloa, as well as to compare their virulence profile,

cell damage, antimicrobial resistance and phylogroups. The prevalence of DEC

was 18.6% and was associated with the presence of diarrhea. EPEC and EAEC

were the most prevalent pathotypes (33% each). DEC strains isolated from

children with diarrhea exhibited more virulence supplementary genes (VSG

between 8 and 9 genes) than other E. coli. The ehaA, ehaC, efa/lifA, nleB, agg4A,

espC, pet and pic genes were associated with DEC strains, while ehaA, ehaB, kps,

agg4A, eatA, espI, espP and pic genes were associated with the presence of

diarrhea. DEC strains exhibited the highest virulence score and caused the

greatest cytotoxic damage on HT-29 cells. The majority of DEC strains from

diarrhea cases were resistant to tetracycline and ampicillin (40.7 and 35.6%,

respectively), while those isolated from asymptomatic children were resistant to

nalidixic acid and cefotaxime (both with 32.2%). A high proportion of DEC strains

were multi-drug resistant (47.5%), while more than a half belonged to the A

phylogroup (53.9%), followed by D and B1 phylogroups (13.9% each). The

biological profile of E. coli strains that colonize children with or without diarrhea in

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4

northwest of Mexico is heterogeneous, with a high presence of VSG, in addition to

the high rate of resistance to the main antibiotics used in their control, and could

act as a reservoir for disseminate its pathogenic potential to commensal strains.

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II. INTRODUCCIÓN

La humanidad ha estado en contacto y en convivencia con otros organismos

como animales, plantas y microorganismos (mo), entre estos las bacterias. La

simbiosis entre estos últimos y el hombre por lo general es benéfica, sin embargo,

algunos de estos microbios adquieren atributos adicionales que pueden causarle

daño mediante diversas enfermedades. Una de las bacterias ampliamente

estudiada en su relación con el hombre es Escherichia coli (E. coli), uno de los

miembros más frecuentes e importantes del genero Escherichia, que aunque es

parte de la microbiota del humano esta puede ser patógena asociándose con

diferentes enfermedades, que incluyen infecciones extraintestinales, como las

infecciones del tracto urinario, meningitis, sepsis y gastroenteritis; manifestándose

mediante diferentes tipos de diarrea (diarrea del viajero, diarrea hemorrágica, etc.),

pudiendo incluso causar insuficiencia renal y la muerte. Lo anterior se asocia a

que E. coli posee una amplia variedad de factores de virulencia especializados

que se pueden clasificar como adhesinas y exotoxinas (1). Durante el 2010 se

registraron más de 1,700 millones de episodios de diarrea en todo el mundo, de

los cuales 700,000 provocaron la muerte en niños menores de 5 años (2). Por otro

lado se tiene reportado que la diarrea es una infección causada por diferentes

patógenos y uno de los agentes etiológicos importantes (por su impacto en la

salud pública, principalmente en países en vías de desarrollo) es E. coli causante

de diarrea o DEC (por las siglas en inglés Diarrheagenic E. coli) (3).Durante 2016,

E. coli enterotoxigénica (ETEC) causó 51,186 muertes en la población general y

18, 669 muertes en niños menores de 5 años, detrás de este patotipo, E. coli

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enteropatógena (EPEC) causó 12,337 muertes en la población general y 9,459

muertes en niños menores de 5 años (4). A pesar de que estas cepas no siempre

son patógenas pueden llegar a serlo, ya que existen DEC con factores de

virulencia típicos y/o suplementarios que se aíslan de personas asintomáticas y

pueden llegar a ser oportunistas. Las infecciones causadas por E. coli son

endémicas y están relacionadas con el nivel socio económico y las medidas de

higiene inadecuadas; aunado a ello, otro problema que ha surgido es la resistencia

de E. coli ante los antimicrobianos de primera elección. En Sinaloa, las infecciones

intestinales de origen bacteriano han ocupado el segundo lugar de morbilidad con

29,733 casos en el 2017; sin embargo hay escasos trabajos que documenten su

etiología, así como una caracterización biológica de dichos agentes infecciosos,

como E. coli. Por ello, el propósito de este trabajo fue determinar la prevalencia de

DEC en población infantil de Sinaloa, así como determinar las características de

las cepas de E. coli aisladas de niños con y sin diarrea, incluyendo la presencia de

genes típicos de virulencia, los genes accesorios (putativos) de virulencia, el grupo

filogenético, la citotoxicidad sobre células epiteliales y el perfil de susceptibilidad a

antimicrobianos de primera elección. Las hipótesis planteadas son: 1) existe una

mayor prevalencia de DEC, factores de virulencia típicos y accesorios en aislados

de pacientes con diarrea en comparación con los recuperados de niños

asintomáticos; 2) las cepas DEC pertenecen a los grupos filogenéticos B2 y D; 3)

las cepas DEC de pacientes diarreicos exhiben una mayor resistencia a los

antibióticos comparados con las recuperadas de sujetos asintomáticos. La

presente tesis aportará información actualizada sobre la prevalencia de E. coli

causante de diarrea entre población infantil de Sinaloa, sus características de

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7

patogenicidad y el perfil de resistencia a los antimicrobianos de primera elección;

dichos datos aportarán conocimiento sobre las características de las cepas tipo

DEC en el noroeste de México.

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III. REVISIÓN DE LA LITERATURA

3.1. Características de Escherichia coli

Escherichia coli fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore Von

Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium coli (5). Esta

bacteria coloniza el intestino del hombre pocas horas después del nacimiento y se

le considera un microorganismo de flora normal (6). El género Escherichia agrupa

bacterias Gram negativas, generalmente móviles, producen ácido y gas a partir de

azúcares y está constituido por cinco especies: Escherichia blattae, Escherichia

coli, Escherichia fergusonnii, Escherichia hermanii y Escherichia vulneris. De

éstas, únicamente E. coli tiene importancia clínica (6, 7).

E.coli es un bacilo aerobio facultativo que se mueve por acción de flagelos

perítricos, e s Gram negativo, oxidasa negativo, con un tamaño promedio de 1.1-

1.5 µm de ancho y 2.0-6.0 µm de largo (6). Esta bacteria habita en el intestino del

ser humano y de otros animales de sangre caliente. Aunque la mayoría de las

cepas son inofensivas, algunas pueden causar enfermedad de transmisión

alimentaria. De acuerdo con diversos trabajos reportados a nivel mundial las

infecciones causadas por E. coli se diseminan genéricamente por el consumo de

alimentos contaminados (8).

E. coli es una bacteria versátil debida a su gran plasticidad genética, la que

obedece a su habilidad para adquirir y transferir material genético (9). Aunque las

cepas comensales de E. coli raramente causan enfermedad (excepto en sujetos

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9

inmunocomprometidos o cuando la barrera intestinal se ve alterada), algunas

clonas adquieren atributos específicos que les confieren la capacidad de causar

daño y por ende desencadenar la infección en el huésped (9). Dentro de la gama

de infecciones que esta bacteria causa se encuentran las infecciones

gastrointestinales, las del tracto urinario y las infecciones sistémicas

(sepsis/meningitis).

3.2. Escherichia coli diarreogénica (DEC) y sus variedades

Entre las cepas DEC se han descrito variedades patógenas o patotipos,

cada una con características únicas o compartidas en cuanto a sus factores de

virulencia y mecanismos de patogenicidad: E.coli enteropatógena (EPEC), E.coli

enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E.coli enteroagregativa

(EAEC), E.coli adherente difusa (DAEC) y E. coli productora de toxina Shiga

(STEC); la variante E. coli enterohemorrágica (EHEC) es uno de los serotipos

más importantes del tipo STEC, por su importancia en la salud pública de

humanos y animales (9, 10). Recientemente se añadieron los patotipos E. coli

que desprende células (CDEC) y E. coli adherente-invasiva (AIEC) (9, 10).

3.2.1. Escherichia coli enteropatógena (EPEC)

EPEC es una causa importante de diarrea potencialmente mortal en bebés

de países en desarrollo (9). Este patovariante pertenece a una familia de

patógenos que forman lesiones de unión y borrado (por sus siglas en ingles A/E –

attaching/effacement-) en células epiteliales intestinales; otro miembro de esta

familia es EHEC. Las bacterias se adhieren íntimamente al enterocito y eliminan

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10

los microvellosidades; la adherencia se ve favorecida por el reclutamiento de los

microfilamentos por debajo del sitio de unión, en una estructura llamada pedestal.

Este fenotipo en EPEC es mediado por genes localizados en el locus de borrado

de enterocitos (LEE), presentes en una isla de patogenicidad (PAI) de 35 kb (11).

LEE está altamente regulado y codifica un sistema de secreción tipo III (T3SS por

sus siglas en inglés) que transloca proteínas efectoras bacterianas al citoplasma

de la célula huésped. Siete de estas proteínas están codificadas en LEE, aunque

hay otras moléculas efectoras no codificadas por LEE (Nle) (12); el papel biológico

de muchos de estos efectores se encuentran en estudio.

Se cree que la unión inicial de EPEC a los enterocitos en el intestino

delgado involucra a los pili formadores de haces (Bfp – bundle forming pilus-),

codificados en el plásmido EAF (factor de adherencia de EPEC). Los Bfp son

fimbrias en forma de cuerda que interactúan con otras bacterias EPEC, para

formar microcolonias típicas de la adherencia localizada y cuyos receptores son

residuos de N-acetil-lactosamina presentes en la superficie de la célula huésped

(13). Recientemente se demostró que el pilus común de E. coli, presente en la

mayoría de los aislamientos de esta bacteria, actúa con el Bfp para estabilizar las

interacciones entre EPEC y las células huésped (14).

Para la unión íntima es necesaria la interacción entre la proteína intimina y

su receptor Tir (por sus siglas en inglés Translocated intimin receptor) (Figura 1).

EPEC utiliza el T3SS para internalizar Tir al citoplasma de las células huésped en

un proceso que posiblemente se inicie a través de la detección de Ca2+ (15).

Luego, Tir se expone en la superficie de la célula huésped (16) y actúa como un

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11

receptor para la intimina. Las interacciones con esta proteína conducen a la

agrupación de Tir, que luego es fosforilada por varias tirosina quinasas huésped

(17, 18).

Figura 1. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteropatógena y E. coli enterohemorrágica. EPEC y EHEC comparten el mecanismo de anclado y efacelamiento de las microvellosidades del enterocito. Los efectores secretados por el T3SS pueden afectar el intercambio iónico (19).

EPEC posee un gran repertorio de efectores que son translocados a las

células huésped por T3SS y subvertir los procesos de la célula huésped; por

ejemplo, causan reordenamiento del citoesqueleto y modulación inmune, además

de contribuir a la diarrea. Muchos de estos efectores translocados tienen múltiples

funciones (19).

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12

Uno de estos efectores relacionada con el patotipo EPEC es la proteína

asociada a la mitocondria (Map) pertenece a una familia de proteínas que

comparten el motivo WXXXE y se hipotetizó que mimetizaba la forma activa de la

proteína de control de la división celular 42 (CDC42), una proteína G pequeña. Sin

embargo, recientemente, se demostró que Map actuaba como un factor de

intercambio de guanina-nucleótido para CDC42, regulando la dinámica de la

actina para producir la formación de los filopodios que rodean las microcolonias

bacterianas (20, 21).

Map también está dirigido a las mitocondrias, donde interrumpe la función y

la estructura mitocondrial. Un segundo efector multifuncional, EspF, está dirigido a

las mitocondrias y desencadena la vía de la muerte mitocondrial. Además, EspF

está implicado en la inhibición de la fagocitosis (22) y la interrupción de las

uniones estrechas (23, 24), así como en la imitación de aspectos de la vía de

señalización de la célula huésped que participa en el tráfico de membranas (25).

EspB (también conocida como EaeB) tiene una función dual como proteína

de translocación T3SS y como efector que previene la fagocitosis (26). Las

proteínas Nle también participan en la virulencia de EPEC. Por ejemplo, NleA

(también conocida como EspI) reduce el tráfico de proteínas e interrumpe las

uniones estrechas, EspJ inhibe la opsonofagocitosis por los glóbulos rojos en tanto

que el factor inhibidor de ciclo (Cif) es una ciclomodulina que previene la

progresión del ciclo celular, con la concomitante apoptosis (27-30). Se han

identificado otras proteínas Nle, sin embargo, sus funciones aún permanecen sin

ser entendidas completamente (31).

Page 22: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

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3.2.2. Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC)

EHEC es un patógeno que causa la lesión A/E, altamente infeccioso y que

coloniza el íleon distal y el intestino grueso en los seres humanos y es a menudo

el agente causante de brotes de gastroenteritis severa en los países

desarrollados. La transmisión a los humanos usualmente ocurre a través de

alimentos y agua contaminados. La mayoría de los brotes en América del Norte,

Japón y algunos países de Europa, se deben al serotipo O157:H7. Los adultos y

los niños infectados con EHEC sufren de colitis hemorrágica (diarrea

sanguinolenta) y otras complicaciones pudiendo conducir al síndrome urémico

hemolítico potencialmente mortal (SUH) (9).

Casi todos los aislamientos de EHEC O157:H7 albergan un plásmido de

virulencia de 92 kb llamado pO157, con aproximadamente 100 nucleótidos del

marco de lectura abierto (por sus siglas en ingles Open Reading Frame ORF) y

codifica varios factores de virulencia. Sin embargo, el principal factor de virulencia

es la toxina Shiga (Stx) codificada por fagos (Stx; también conocida como

verocitotoxina), que es una característica definitoria del grupo de E. coli productor

de Stx (STEC) a la que pertenece EHEC O157:H7. Hay dos subgrupos de la

toxina Stx: Stx1 y Stx2, las que se pueden encontrar en aislamientos de EHEC,

siendo Stx2 más prevalente en la colitis hemorrágica y SUH que Stx1 (32). Stx es

una toxina tipo AB cuya subunidad B es un pentámero unido no covalentemente a

la subunidad A, parte de la toxina biológicamente activa.

EHEC carece de un mecanismo secretor para Stx, por lo que la liberación

de ésta se produce a través de la lisis mediada por fagos lambdoides en respuesta

Page 23: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

14

al daño del ADN y la respuesta del sistema de reparación de emergencia (SOS)

(33). Por lo tanto, se debe desalentar la terapia con antibióticos, ya que la toxina

sería liberada. Otros serotipos también han estado involucrados en brotes de

gastroenteritis y enfermedad sistémica. Por ejemplo, durante 2011, el serotipo

STEC O104:H4 fue responsable de los brotes epidémicos en Alemania. Esta cepa,

resistente a múltiples fármacos, causó más de 3800 casos de diarrea sin SUH y

más de 830 casos con SUH, lo que ocasionó 54 muertes. Además, también se

aislaron cepas del serotipo O104:H4 en otros 12 países europeos, en América del

Norte y Canadá (34).

Los receptores para la toxina Stx son las globotriaosilceramidas (Gb3) que

se encuentran en las células de Paneth de la mucosa intestinal humana (Figura 1)

y en la superficie de las células epiteliales renales (32, 35). El ganado carece de

estos receptores en el tracto gastrointestinal, lo que puede explicar por qué la

colonización por EHEC en el ganado bovino es asintomático (36). La subunidad

Stx B interactúa con Gb3 e induce invaginaciones de la membrana para facilitar la

internalización de la toxina (37). Una vez internalizada, viaja a través de los

endosomas tempranos hacia el Golgi, donde la subunidad A (un N-glucosidasa

previniendo la síntesis de proteínas) se inactiva por un evento de escisión. La

unión inicial de EHEC a los colonocitos no está bien definida. Este patotipo posee

16 operones que codifican para fimbrias (38); sin embargo, estos no han sido

ampliamente estudiados. Trabajos recientes han identificado un pilus tipo IV,

llamado pili coli hemorrágico, involucrado en la adherencia y la formación de

biofilm. Los flagelos y el pilus común de E. coli también podrían estar involucrados

Page 24: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

15

en la unión a las células huésped (39, 40). Como se ha documentado para EPEC,

la unión íntima de EHEC a las células hospedadoras se produce a través de las

interacciones entre intimina y Tir (Figura 1). La unión también se favorece

mediante la interacción de intimina con nucleolina, un receptor de intimina

localizado en la superficie, cuya expresión aumenta con Stx2 (41). A medida que

se libera Stx durante la lisis bacteriana, el aumento en la expresión de nucleolina

puede ser importante para la unión de la progenie EHEC.

El genoma de EHEC también contiene el operón LEE de EPEC, aunque

EHEC inyecta aproximadamente el doble de efectores en las células huésped que

EPEC, la mayoría de los cuales son redundantes (42). Esta redundancia puede

proporcionar a EHEC una ventaja evolutiva que le permita superar a otras

bacterias. El mecanismo de formación de pedestal por EHEC es ligeramente

diferente al de EPEC.

Tir no es tirosina fosforilada por la célula huésped y la formación del

pedestal es independiente de Nck, aunque los pedestales son muy similares (43).

La subversión del citoesqueleto de actina de la célula huésped está mediada por

un homólogo de EspF denominado proteína de acoplamiento del citoesqueleto Tir

o TccP (también conocida como EspFU), que está vinculada a Tir por una proteína

huésped, el receptor de insulina tirosina quinasa sustrato (IRTKS; también

conocido como BAIAP2L1), homólogo de la proteína del sustrato receptor de

insulina (IRSp53; también conocido como BAIAP2 de 53 kDa (44, 45).

Page 25: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

16

TccP interactúa con N-WASP para activar el conjunto de actina mediada por

ARP2/3 (46, 47). Es importante tener en cuenta que los mecanismos descritos

anteriormente para la formación de pedestal en EPEC y EHEC son

representativos de las cepas prototipo; las cepas EPEC del linaje 2 y las cepas

EHEC no O157 utilizan una combinación de los mecanismos dependientes de Nck

e independientes de Nck (48).

De manera interesante, EHEC puede detectar las hormonas adrenalina y

noradrenalina de las células huésped, así como la molécula que detecta el quórum

autoinductor 3 de las células gastrointestinales, esto para regular la motilidad y la

expresión de T3SS. La detección de estas moléculas es necesaria para la

virulencia de EHEC en modelos animales y presenta una nueva interacción que

debe tenerse en cuenta al considerar las interacciones patógeno-huésped (19).

3.2.3. Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC)

La ETEC es la causa más común de diarrea del viajero y puede tener

consecuencias fatales para los niños menores de 5 años. La ETEC también es

importante en la industria agrícola, ya que los lechones post destete son altamente

susceptibles a la infección (3).

El mecanismo de patogenicidad de ETEC en células epiteliales del intestino

delgado (figura 2) está mediada por factores de colonización (por sus siglas en

inglés colonizations factors CFs), que pueden ser no fimbriales, fimbriales,

helicoidales o fibrilares. Se ha identificado un gran número de CFs, de las cuales

CFA/I, CFA/II y CFA/IV son los más comunes. Los receptores afines para CFs

Page 26: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

17

están mal definidos, aunque trabajos recientes han encontrado interacciones entre

CFA/I y restos de carbohidratos de glicosfingolípidos y glicoproteínas no ácidos y

entre CFA/IV y el glicosfingolípido ácido sulfatida (49, 50).

Figura 2. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enterotoxigénica. La bacteria se ancla al enterocito mediante los CF´s y la adhesina EtpA localizada en la punta del flagelo. La adherencia más estrecha es mediada a través de Tia y TibA. Posteriormente se secretan las toxinas LT (termolábil) y ST (termoestable), las que causan diarrea a través de la activación mediada por AMP y GMP cíclicos del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) (19).

Un estudio reciente demostró que los flagelos que se unen transitoriamente

con la adhesina EtpA se pueden usar como factores de adherencia de las células

epiteliales (51). Tanto los CF´s como los flagelos anclan las células ETEC para la

unión inicial a las células huésped, pero la unión más externa puede ser facilitada

por las proteínas de la membrana externa Tia y TibA (Figura 2) (52).

Page 27: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

18

La diarrea mediada por ETEC se ha atribuido a la secreción de la

enterotoxina ST, la enterotoxina LT o una combinación de éstas. Las ST son

pequeñas toxinas que pueden clasificarse adicionalmente como STa o STb en

función de su estructura y función sintetizándose como precursores de 72

aminoácidos que se procesan en formas activas de 18–19 y 48 aminoácidos (para

STa para STb, respectivamente) (9).

La STa, que está asociada con la enfermedad humana, se une a los

receptores de guanilil ciclasa presentes en el borde en cepillo del intestino y

estimula su actividad. Esto conduce a un aumento de los niveles intracelulares de

guanosín monofosfato cíclico, lo que resulta en una absorción deficiente de Na+ y

a la activación del regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis

quística (CFTR) (52). LT es similar a la toxina del cólera y también es una toxina

AB. Se secreta desde el polo de la célula bacteriana y se asocia con

lipopolisacáridos en la superficie, donde puede actuar como una adhesina,

facilitando la unión a las células huésped (53, 54).

La subunidad B de LT interactúa con el monosialogangliósido GM1 en las

células huésped; la toxina se internaliza en las balsas de lípidos, donde se

transporta al citosol a través del retículo endoplásmico. La subunidad “A”, ADP

ribosila la subunidad α de la proteína estimulante de la unión a nucleótido guanina

(Gsα) que activa la adenilil ciclasa y aumenta los niveles de Adenosín Monofosfato

Cíclico (AMPc) intracelular. Esto activa la proteína quinasa A (PKA) dependiente

de AMPc, que a su vez activa CFTR (32). Curiosamente, la activación de PKA y

Page 28: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

19

otras vías de señalización de la célula huésped por LT inhibe la expresión de los

péptidos antimicrobianos (55).

Se ha demostrado que ETEC secreta otros factores de virulencia (42, 52).

Por ejemplo, EatA, que es un autotransportador tipo serín proteasa de

Enterobacteriaceae SPATE (por sus siglas en inglés Serine Protease

Autotransporters of Enterobacteriaceae) que escinde la catepsina G y puede

acelerar la acumulación de líquido. Otros factores de virulencia secretados

incluyen CylA, una citotoxina formadora de poros y la toxina EAST1, con funciones

similares a STa.

3.2.4. Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC)

En general se acepta que EIEC y Shigella deben formar una sola

patovariante, pues comparten los mismos mecanismos de patogenicidad. Sin

embargo, el nombre del género Shigella todavía se usa debido a su asociación

con la Shigelosis y se mantiene en esta sección.

EIEC es una bacteria muy virulenta que causa disentería bacilar y diarrea

con sangre. Esta patovariante difiere de los otros porque incluye bacterias

intracelulares obligadas que no tienen flagelos ni factores de adherencia. La

virulencia se debe en gran parte a un plásmido de 220 kb que codifica un T3SS en

el locus Mxi-Spa que se requiere para la invasión, la supervivencia celular y la

apoptosis de los macrófagos (56).

Page 29: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

20

La infección comienza en el colon, donde las bacterias pasan a través de

las células M (células microfold) mediante transcitosis para llegar a la submucosa

subyacente (Figura 3). La interrupción de las uniones estrechas y el daño causado

por la inflamación también le dan a EIEC acceso a la submucosa. La absorción de

esta bacteria por macrófagos residentes, el escape del fagosoma, la activación del

inflamasoma dependiente de caspasa-1 y la liberación definitiva de macrófagos se

han revisado exhaustivamente (56).

Figura 3. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteroinvasiva. EIEC entra a la submucosa a través de las células M y tras replicarse en macrófagos, invade el lado basolateral; dichos procesos son mediados por efectores secretados en las células huésped por el sistema de secreción tipo III (19).

EIEC se libera de los macrófagos muertos a la submucosa, donde invaden

el lado basolateral de los colonocitos con la ayuda de efectores que son

secretados por el T3SS. Los efectores clave, como IpaC, activan las quinasas

Page 30: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

21

SRC en el sitio del contacto bacteriano para finalmente reclutar el complejo

ARP2/3 y causar la polimerización de la actina y la formación de ondulaciones de

la membrana para la entrada bacteriana (57).

RAC1, que puede promover la formación de ondulaciones en la membrana

y puede activarse por el mimetismo del factor de intercambio guanina-nucleótido

(IpgB1) y RhoG en la vía ELMO–DOCK180 (engullimiento y motilidad celular-

dedicador de la proteína 1 de citocinesis) o directamente, por actividad deIpgB1

(20, 21, 58). Otros efectores, como IpgD, IpaA y VirA, están involucrados en la

desestabilización de la actina y los microtúbulos para promover la invasión a un

fagosoma, en tanto que el escape de los fagosomas depende de los efectores

IpaB, IpaC, IpaD y IpaH (56).

Una vez libre en el citoplasma de las células epiteliales, EIEC promueve su

supervivencia mediante el uso de efectores para subvertir los procesos de la

célula hospedadora (Figura 3). Para prevenir el recambio de células epiteliales

intestinales, IpaB media la detención del ciclo celular apuntando a MAD2L2, que

es un inhibidor de la anafase (59), y se ha demostrado que OspE interactúa con la

quinasa unida a la integrina (ILK) para prevenir el desprendimiento de células

epiteliales (60). También IpgD evita la apoptosis (61), que puede estimular la

fosfoinositida 3-quinasa y activar las proteínas Akt, que regulan la supervivencia

celular. Estos tres mecanismos previenen la muerte celular y el desprendimiento,

proporcionando un nicho replicativo para que EIEC mantenga una infección.

Page 31: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

22

Para persistir dentro de los colonocitos, este patotipo debe evadir la

respuesta inmune innata, para lo que utiliza al menos cuatro efectores. Uno de

estos, OspG, se une a proteínas E2 ubiquitiladas, lo que evita la degradación del

inhibidor del factor nuclear-κB (NF-κB) subunidad-α (IκBα) y, por lo tanto, inhibe la

activación de NF-κB (62). Además, OspF se dirige al núcleo, donde desfosforila

irreversiblemente las proteínas quinasas activadas por mitógenos requeridos para

la transcripción de los genes regulados por NF-κB (63). IpaH también se dirige al

núcleo, donde interactúa con un factor de empalme involucrado en la expresión de

citoquinas inflamatorias (64-66).

El cuarto efector, OspB, actúa con OspF para reducir los niveles de

interleucina-8 (IL-8) mediante el reclutamiento de factores del huésped que

remodelan la cromatina (67). En conjunto, estos cuatro efectores están

involucrados en la atenuación de la respuesta inflamatoria y, por lo tanto, permiten

la persistencia bacteriana. Un mecanismo de defensa del huésped es la autofagia,

dirigida a las células presentes en el citosol, mediante el reconocimiento de VirG

de autofagia con proteína 5 (ATG5). Curiosamente, el efector secretado IcsB

puede unir a VirG y secuestrarlo, evitando así otro aspecto de la defensa del

huésped (68).

Page 32: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

23

3.2.5. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)

Aunque se considera un patógeno emergente, EAEC es el agente etiológico

más frecuente de la diarrea del viajero (después de ETEC) tanto en los países

desarrollados como en los países en desarrollo. EAEC también se está

reconociendo comúnmente como una causa de diarrea endémica y epidémica en

todo el mundo. La diarrea causada por EAEC suele ser acuosa, pero puede ir

acompañada de moco o sangre. La colonización por EAEC puede ocurrir en la

mucosa de los intestinos en personas de todas las edades, lo que puede llevar a

una leve inflamación en el colon (3). La comprensión de la biología de EAEC y su

patogenia es limitada, en parte debida a la escasez de modelos animales

adecuados y la heterogeneidad de los factores de virulencia.

El fenotipo característico de EAEC es la adherencia agregativa, que implica

la disposición de las células en un patrón de ladrillos apilados sobre células HEp-2

y está mediado por genes localizados en el plásmido de virulencia pAA. Este

plásmido de 100 kb codifican los genes necesarios para las fimbrias de adherencia

agregativa (AAF), que están relacionadas con la familia de adhesinas Dr y median

la adherencia de la EAEC a la mucosa intestinal (Figura 4). La adherencia

mediada por AAF y flagelina induce una secreción de IL-8, que conduce a la

transmigración de los neutrófilos (69, 70).

Page 33: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

24

Figura 4. Mecanismo de patogenicidad en E. coli enteroagregativa. Este patotipo se adhiere a los enterocitos tanto en el intestino delgado como en el grueso a través de fimbrias de adherencia agregada (AAF) que estimulan una fuerte respuesta de IL-8, permitiendo la formación de biopelículas en la superficie de las células. La toxina codificada por el plásmido (Pet) es una SPATE que se dirige a la α-fodrina (también conocida como SPTAN1), alterando el citoesqueleto de actina e induciendo la exfoliación (19).

Se han identificado cuatro variantes de AAF (AAF/I, AAF/II, AAF/III y Hda)

(71, 72). Los receptores para los AAF son desconocidos, pero los datos recientes

muestran que AAF/II puede unirse a la fibronectina (73). Se piensa que la

extensión de los AAF cargados positivamente (lejos del lipopolisacárido cargado

negativamente) ocurre a través de una proteína secretada llamada dispersina. La

dispersión se asocia con el lipopolisacárido a través de interacciones

electrostáticas y se especula para enmascarar la carga negativa del

lipopolisacárido, permitiendo así que el AAF se extienda lejos de la superficie

bacteriana en lugar de colapsar sobre ella. Esto promueve la dispersión de EAEC

a través de la mucosa intestinal, al contrarrestar la agregación excesiva mediada

por AAF entre otras células de EAEC (19).

Page 34: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

25

Las biopelículas formadas por EAEC son distintas de las formadas por E.

coli no patógenas, ya que pueden formarse independientemente de factores

comunes como curli, flagelo y antígeno 43 (Ag43) (74). La biopelícula de EAEC en

la superficie de los enterocitos está encerrada en una capa de moco espeso. Se

cree que EAEC puede penetrar ésta a través de la actividad mucolítica de la

proteína autotransportadora Pic (75). Se han identificado algunos genes, tanto de

proteínas plasmáticas como cromosómicas, que codifican y participan en la

formación de biopelículas, incluidos los genes que codifican un sistema de

secreción de tipo VI (93).

EAEC causa daño a la mucosa al secretar citotoxinas, aunque no todas las

toxinas se encuentran en todos los aislados. La toxina codificada por el plásmido

(Pet) es una SPATE que se dirige a α-fodrina (también llamada SPANT1),

interrumpe el citoesqueleto de actina, e induce la exfoliación (9). La toxina se

internaliza por un mecanismo de endocitosis basado en clatrina y posteriormente

se transporta a través del retículo endoplásmico al citosol (76, 77). Otras toxinas

descritas son la enterotoxina 1 de Shigella (ShET1) y EAST1, cuya presencia

también varía entre los aislamientos EAEC, sin embargo, su papel en la

patogénesis no se conoce completamente.

Page 35: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

26

3.2.6. Escherichia coli adherente difusa (DAEC)

DAEC es un grupo heterogéneo que genera un patrón de adherencia difuso

en las células HeLa y HEp-2. Este patrón está mediado por proteínas codificadas

por una familia de operones relacionados, que incluyen tanto adhesinas fimbriales

(por ejemplo, Dr y F1845) como afimbriales (Afa), denominadas colectivamente

adhesinas Afa-Dr (78). Los aislamientos de DAEC que expresan cualquiera de las

adhesinas Afa-Dr (que se denominan Afa-Dr DAEC) colonizan el intestino delgado

y están implicados en la diarrea en niños entre las edades de 18 meses y 5 años,

así como en casos de infecciones del tracto uterino en adultos (78).

Todas las adhesinas Afa-Dr interactúan con el factor de aceleración de la

descomposición del complemento (DAF) asociado al borde del cepillo, que se

encuentra en la superficie de las células epiteliales intestinales y urinarias (Figura

5). La unión a DAF da como resultado la agregación de moléculas de DAF debajo

de las bacterias adherentes. También desencadena una cascada de señalización

dependiente de Ca2+, que provoca el alargamiento y el daño de las

microvellosidades de borde en cepillo a través de la desorganización de

componentes clave del citoesqueleto (78).

Page 36: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

27

Figura 5. Mecanismo de patogenicidad en E. coli adherente difusa.

DAEC forma un patrón de unión difuso en enterocitos del intestino delgado, mediado por las adhesinas Afa-Dr. La mayor parte de estos factores de colonización se unen para complementar el factor acelerador de la descomposición (DAF). La toxina autotransportada Sat se ha implicado en lesiones de uniones estrechas (TJ) en DAEC que expresan Afa-Dr, así como en una mayor permeabilidad (19).

Además, junto con flagelos, la interacción entre las adhesinas Afa-Dr y DAF

induce la secreción de IL-8 de los enterocitos, lo que promueve la transmigración

de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) a través de la capa epitelial de la mucosa.

Esto estimula la regulación positiva de DAF en la superficie apical de las células

epiteliales, proporcionando a DAEC más receptores para una adherencia más

íntima (79). La interacción de DAEC con PMN, mediada por Afa-Dr, conduce a una

tasa acelerada de apoptosis de PMN y una tasa disminuida de fagocitosis

mediada por PMN (80).

Page 37: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

28

Una subclase de fimbrias Afa-Dr interactúa con miembros de la familia de

receptores de la molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno

carcinoembriónico (CEACAM) que se encuentran en las superficies de las

membranas, en particular en balsas lipídicas (78). Las interacciones con CEACAM

activan CDC42, lo que lleva a la agregación de CEACAM debajo de las bacterias

adherentes y al efacelamiento de las microvellosidades de borde en cepillo (81).

Estas lesiones alteran varias enzimas del borde en cepillo que participan en la

secreción y absorción intestinal, lo que puede contribuir a la diarrea (78).

Recientemente se demostró que las interacciones entre las adhesinas Dr y las

CEACAM provocan que los dímeros de CEACAM se disocien, de modo que Dr

pueda interactuar con la forma monomérica del receptor (82).

Esto puede servir para manipular las rutas de la célula huésped a través de

la respuesta mediada por la interrupción de los dímeros CEACAM. Las

interacciones de la adhesina Afa-Dr con CEACAM y con DAF pueden participar en

la captación de células DAEC dependiente de microtúbulos, tras lo cual las

bacterias pueden sobrevivir en vacuolas (83).

A diferencia de otros patotipos de E. coli, el mecanismo de daño de DAEC

parece estar mediada a través de las interacciones de la adhesina Afa-Dr con las

células huésped. La toxina autotransportadora secretada (Sat) se ha implicado en

lesiones de uniones estrechas que se encuentran con la infección por Afa-Dr

DAEC y en el aumento de la permeabilidad (84). No se han identificado sistemas

de secreción u otros factores de virulencia en los aislamientos típicos de Afa-Dr

DAEC.

Page 38: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

29

De acuerdo con lo anterior, se sabe que existen genes que codifican para

diferentes factores de virulencia particulares para cada uno de los patotipos de

DEC y esta es la única manera de clarificarlos en cada una de las patovariantes

mencionadas anteriormente. Un resumen de estos factores de virulencia se

presenta en el cuadro 1.

Cuadro 1. Factores de virulencia de E. coli diarreogénica.

Gen Mecanismo de patogenicidad involucrado Patotipo de E. coli

relacionado

eae

bfp

Anclado y efacelamiento de las microvellosidades del

enterocito EPEC

aafII

aggR Adherencia y agregación EAEC típica

pcvd432

aap Adherencia y agregación EAEC atípica

lt

stII Enterotoxinas ETEC

daaE Adhesina fimbrial DAEC

virF

ipaH Invasividad celular EIEC

stx1

stx2 Toxinas EHEC o STEC

hlyA

rfbEO157

fliCH7

Hemolisina

Producción de lipopolisacárido

Flagelo

EHEC

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30

Además de los reportes que existen de DEC y sus factores de virulencia

típicos (mínimo criterio para determinar E. coli causante de diarrea), también

existen otros factores que le otorgan a E. coli cierta virulencia (sus mecanismos de

patogenicidad aún no se han estudiado de manera precisa) codificados por sus

respectivos genes, estos son llamados Genes Suplementarios de Virulencia (GSV)

los cuales se describen brevemente en el siguiente apartado.

3.3. Factores de virulencia suplementarios en E. coli

Como se mencionó de manera general que existen otros factores en E. coli

cuyo papel en la virulencia no está directamente relacionada con la patogenicidad;

como lo menciona Vargas en el 2015 donde encontraron E. coli no DEC con la

presencia de GSV, probablemente debido a la capacidad de esta bacteria de

intercambiar material genético entre las cepas patógenas e inocuas como se ha

descrito en otros géneros bacterianos (85). Por otro lado estos GSV pueden

favorecer de manera secundaria el daño al huésped participando como factores de

virulencia putativos. Entre estos factores se han descrito adhesinas, proteínas con

diversas actividades biológicas como proteasas y toxinas.

También se pueden encontrar estos factores de virulencia entre proteínas

dela familia SPATE, ya que son una familia creciente de proteínas implicadas en la

virulencia secretadas por bacterias Gram negativas y que desempeñan una serie

de funciones en la patogénesis tales como adhesinas, toxinas, proteasas y

mediadores de la motilidad intracelular (86). La mayoría de estas proteínas

Page 40: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

31

comprenden tres dominios funcionales básicos, una secuencia líder amino-

terminal, un dominio "pasajero" secretado y un núcleo carboxi-terminal.

Como ya se mencionó, algunos autotransportadores también tienen motivos

de serina proteasa dentro de sus dominios de pasajeros; esta es una

característica común de las moléculas de esta clase producidas miembros de la

familia Enterobacteriaceae y, por lo tanto, se denominan proteínas SPATE (87).

A continuación, se presenta una revisión de los factores de virulencia

suplementarios de E. coli abordados en este trabajo, categorizados con base en

su actividad biológica: factores de colonización (aida-1, cah, ehaA, ehaB, ehaC,

ehaD, sab, tibA, efa/lifA, kps, agg4A y nleB), citotoxinas (espC, pet y sat) y

proteínas que degradan sustratos (eatA, epeA, espI, espP y pic).

3.3.1. Factores de virulencia suplementarios de E. coli

relacionados con mecanismos de colonización

Los siguientes factores de virulencia se relacionan con mecanismos de

colonización de E. coli en la célula huésped: El gen aida-I codifica para una

proteína (adhesina) de DAEC que participa en el patrón de adherencia difusotípico

de esta variante patógena (88). Por otro lado el gen cah codifica para una proteína

(antígeno 43) de EHEC, la cual tiene la capacidad de unirse al antígeno de unión a

calcio homogéneo (89).

Los genes: ehaA, ehaB, ehaC, ehaD codifican para proteínas

autotransportadoras descritas en la cepa E. coli O157: H7 EDL933 (90). Los

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32

genes, ehaA y ehaB codifican para las proteínas EhaA y EhaB que median la

autoagregación, la formación de biopelículas y la adhesión a las células epiteliales

(90). EhaA es una proteína del sistema de secreción tipo V y EhaB se adhiere a

proteínas como el colágeno y laminina de la célula huésped (91, 92).

Las proteínas EhaC (proteína autotransportadora C) y EhaD están

codificadas por los genes ehaC y ehaD que sintetizan adhesinas de EHEC,

implicadas en la adhesión y formación de biofilms (90, 93).

El gen sab (2496 pb) codifica para la proteína Sab de 1,431 aminoácidos,

perteneciente a la familia SPATE y que contribuye en la formación de biofilms en

la cepa STEC O113:H22 98NK2 (94).

El gen efa1 codifica la adhesina Efa1 (385 kDa) y se encuentra en una PAI

similar a la isla genómica O 122 (OI-122) de EHEC O157: H7 cepa EDL933 (95-

97). Este gen es el mismo que lifA, que codifica la linfostatina (LifA) en la cepa

EPEC E2348/69 (98, 99). LifA inhibe la proliferación de linfocitos de sangre

periférica y linfocitos gastrointestinales, así como la producción de linfocinas. El

gen fue designado efa1/lifA. Por otro lado el gen nleb codifica la proteína efectora

NleE, aunque no está presente en la PAI LEE.

Por otro lado, también se ha reportado que la isla de patogenicidad OI-122

contiene el gen virulencia efa1-lifA y nleB que parece estar implicado en la

colonización de la mucosa intestinal y en la inhibición de la respuesta inmune del

huésped (97, 99, 100).

Page 42: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

33

Dentro de las estructuras implicadas en la colonización de EAEC, se ha

descrito la proteína codificada por el gen kps (cápsula). Este gen fue usado como

marcador genético para el escrutinio de cepas potencialmente virulentas de EAEC

en Río de Janeiro Brasil. El gen kps se encontró en 70.6% de cepas aisladas de

pacientes con diarrea y no se amplificó en las cepas recuperadas de los pacientes

controles (101).

Por otro lado, el gen tibA está relacionado con el patotipo ETEC. El gen tibA

codifica para la adhesina TibA, miembro de la familia SPATE. El gen tibA está

codificado en el cromosoma en el loci tib, y codifica una proteína

autotransportadora relacionada con la formación de biofilms, adherencia y

autoagregación en ETEC. Un estudio mostró que la cepa de E. coli HB101

transformada con tibA, se adhirió e invadió células HCT-8 (epitelio ileocecal

humano) (102).

El gen agg4A se describió en el patotipo EAEC y codifica para una fimbria

tipo IV que participa en la adhesión a células epiteliales (103).

3.3.2. Factores de virulencia suplementarios de E. coli con

actividad citotóxica

La proteína EspC (110 kDa) se describió en la cepa EPEC E2348/69 y está

codificada por el gen espC presente en una isla de patogenicidad en el

cromosoma bacteriano (104, 105). Esta proteína ejerce efectos enterotóxico y

citotóxico, así como degradar las proteínas fodrina, hemoglobina, pepsina, factor

de coagulación V y es parte de la familia SPATE (104, 106).

Page 43: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

34

Sat es una proteína SPATE (142 kDa) descrita en la cepa UPEC CFT073 y

codificada por el gen sat (107). Otras bacterias en las que se ha descrito la

presencia de Sat han sido Shigella, EAEC, DAEC y E. coli que causa septicemia

neonatal. El gen está constituido por 3885 pb y se encuentra en una isla de

patogenicidad (106).

El gen sat se ha encontrado en cepas de E. coli daaC positivas, aisladas de

heces de niños con diarrea en Brasil y Francia (84, 88, 108). Por otro lado, se

afirma una correlación entre la presencia de DAEC y sat (84). Se ha hipotetizado

que las cepas DAEC pueden adquirir genes de virulencia presentes en UPEC, ya

que algunos factores de virulencia de DAEC como adhesinas y hemolisinas, se

encuentran en aislados de UPEC (89).

Las cepas UPEC que portan sat, provocan vacuolización y daño glomerular,

como se demostró en un modelo murino CBA (por sus siglas en ingles Cross of a

Bagg Albino)de ITU ascendente, lo que indica que Sat es una citotoxina

vacuolizante (107). Si Sat es un factor de virulencia que contienen algunas clonas

de DAEC, las lesiones observadas en el tracto urinario podrían ser similares en el

tejido intestinal, induciendo diarrea (108). En los aislados DAEC recuperados de

pacientes con diarrea y asintomáticos, el gen sat se ha encontrado de manera

equitativa en ambos grupos (109). Por otro lado, otro estudio ha reportado la

presencia del el gen sat en DAEC aislada de niños con diarrea (109).

Page 44: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

35

3.3.3. Factores de virulencia suplementarios de E. coli con

actividad proteolítica

El gen eatA codifica para una proteína autotransportadora de la que se

tiene poco conocimiento sobre su mecanismo de virulencia, aunque se sabe que

es muy importante su participación como serina proteasa y tiene relación con

enfermedades intestinales severas contribuyendo a la virulencia de ETEC (110).

También se tienen reportes de que EatA es un péptido que actúa como sustrato

de la catepsina G, una serina proteasa producida por leucocitos

polimorfonucleares que modula o escinde una gran variedad de productos

extracelulares incluyendo a los proteoglicanos (111). Por otro lado, EpeA es una

proteína SPATE de alto peso molecular con actividad proteasa y mucinasa

identificada en el patotipo EHEC (112).

EspI (también conocida como NleA) es una proteína autotransportadora

descrita en EPEC y EHEC, codificada por el gen espI (fuera de LEE) (113). En

EPEC, EspI contribuye en la interrupción de las uniones estrechas (114) y se ha

identificado recientemente dentro de una isla de patogenicidad presente en cepas

STEC eae-negativas (115).

EspP (por sus siglas en inglés extracellular serine protease plasmid) está

codificada en el gen espP de E. coli O157:H7 cepa EDL933 y también es parte de

la familia SPATE con actividad proteolítica. Entre las moléculas diana sobre las

que ejerce su actividad biológica están la pepsina, el factor V, la apolipoproteína

así como las proteínas del complemento C3/C3b y C5 (106).

Page 45: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

36

Otro de los factores accesorios de virulencia de EAEC es la proteína Pic

(codificada por el gen pic), serina proteasa (secretada también por Shigella

flexneri) involucrada en la colonización intestinal y crecimiento de EAEC en el

moco intestinal (116); también forma biofilms (asociada a la presencia de los

genes pic, sepA y agg4A), donde las proteínas que se expresan de estos genes

tiene actividad mucinolítica, hemaglutinación y resistencia sérica (117, 118). Un

estudio en el 2017, se identificó EAEC y los genes de virulencia con relación

diarrea persistente (≥14 días) en niños Daneses; la diarrea persistente se asoció

con cepas que carecen del gen pic (p = 0.002) y la combinación de los genes pic,

sat y ausencia del gen aggA (p = 0.05). También en este mismo estudio se reportó

que los genes pic, aggR, aap y aggA se asociaron con diarrea aguda (119). Un

estudio brasileño identificó la presencia de los genes pet y aafA en EAEC y se

relacionaron con el grupo de niños diarreicos y la presencia de los genes agg4A y

ORF61 con el grupo de niños sanos (120).

En el cuadro 2 se resumen los genes de los otros factores de virulencia de

E. coli con importancia en epidemiología y clínica como se describió

anteriormente.

Page 46: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

37

Cuadro 2. Genes de virulencia suplementarios de E. coli investigados en este estudio.

Gen Mecanismo de patogenicidad involucrado

Patotipo de E. coli

relacionado

Referencia

Colonización aida-I Adhesina implicada en la

adherencia difusa y formación de biofilms

DAEC (121)

Cah Formación de biofilms y autoagregación

EHEC (122)

ehaABCD Formación de biofilms (90) Sab Formación de biofilms (94) tibA Formación de biofilms

adherencia y autoagregación (102)

efa1/lifA Adherencia Efa1/ linfostatina lifA .

aEPEC (123)

Kps Capsula de EAEC. Estructura superficial

EAEC (101)

agg4A Subunidad fimbrial AAF/IV EAEC (124) nleB La proteína NleE B aEPEC (123)

Citotoxicidad espC Actividad enterotóxica, escisión

de espectrina, pepsina y factor V

EPEC (104)

Pet Proteína con actividad enterotóxica

EAEC (87)

Sat Toxina Autotransportadora Secretada

Implicado en lesiones de uniones estrechas.

DAEC (108)

Proteólisis eatA Proteína autotransportadora

EatA Serina proteasa

Actúa como sustrato de catepsina G

ETEC (110)

epeA Proteasa y actividad mucinolítica

EHEC (112)

espI Degradación de proteínas plasmáticas

(115)

espP Escisión de espectrina, pepsina y factor V

(125)

Pic Mucinasa y secretagogo de moco intestinal

EAEC (126)

Page 47: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

38

3.4. Epidemiología de DEC

La diarrea sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad a

nivel mundial, especialmente entre lactantes y niños pequeños. Durante 2010 se

registraron más de 1,700 millones de episodios de diarrea en todo el mundo, de

los cuales 700,000 provocaron la muerte en niños menores de 5 años (2, 127). En

2016, a nivel mundial la diarrea fue la 8va causa de muerte en población de todas

las edades y la quinta entre los menores de 5 años (4). Entre los agentes

etiológicos de diarrea, el rotavirus fue responsable de la mayor cantidad muertes

por diarrea (228,047), sin embargo, las bacterias son los agentes más frecuentes

de diarrea, siendo en ese mismo año las muertes causadas por Shigella las que

siguieron a rotavirus (212,438), V. cholerae, Salmonella no causante de tifoidea,

Campylobacter y los patotipos de E. coli, principalmente ETEC y EPEC; éstos

últimos causaron 51,186 y 12,337 (respectivamente) muertes en ese año (4). Con

estos datos, los diferentes patotipos de DEC constituyen una causa importante de

diarrea, particularmente en los países en desarrollo (2).

Aunque los patotipos DEC son agentes causales de diarrea, por tanto, son

de importancia para la salud pública, este tipo de bacterias no se buscan

rutinariamente como patógenos entéricos en los laboratorios clínicos, por lo que el

número de casos puede estar subestimado. Por lo tanto, la prevalencia de diarrea

causada por cepas de DEC generalmente se desconoce, particularmente en áreas

donde se cree que las cepas de DEC son endémicas (128).

La mayoría de los casos de diarrea reportados en México, Colombia y

Nicaragua están asociados con ETEC. Por otro lado, EAEC ha sido la patovariante

Page 48: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

39

más prevalente en Brasil, Paraguay y Perú, en tanto que EPEC (aEPEC o tEPEC)

prevalece en Venezuela, Chile, Argentina y Uruguay. Para el caso de EHEC,

particularmente el serotipo O157:H7, ha tenido impacto regional en la parte sur del

continente y está representado por el predominio del serotipo O157:H7 (129).

En América del Sur, particularmente en Argentina, el patotipo EHEC O157:

H7 sigue siendo un importante patógeno transmitido al humano por los alimentos,

por lo que es el serotipo dominante en los casos de SUH. Se ha informado que la

incidencia de esta enfermedad en Argentina es de 12.2 casos por cada 100,000

niños menores de 5 años; Además, el SUH es la causa principal de insuficiencia

renal aguda en niños y es responsable del ∼20% de los trasplantes de riñón en

niños y adolescentes en aquel país (130).

Aunque se han identificado varios factores de riesgo para las infecciones

por EHEC en Argentina (ingerir carne de res poco cocida y el contacto con niños

<5 años de edad con diarrea) (130), la alta incidencia de infecciones por EHEC

O157 y los casos de SHU en este país se consideran un problema de salud

pública porque existe la posibilidad de que este patógeno pueda exportarse a

otros países. De hecho, en algunas zonas de Argentina, se ha informado de la

presencia casi exclusivamente de cepas de E. coli O157 pertenecientes al clado

hipervirulento 8, que muestran homogeneidad en los genotipos EHEC O157 que

se detectan en aislamientos humanos y bovinos, representando un factor de

riesgo para los humanos (131).

Page 49: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

40

Debido al impacto de esta enfermedad humana en la salud pública de

Argentina, en el año 2000 el SUH se convirtió en una enfermedad notificable;

desde el 2013, se conmemora como día nacional al 19 de agosto celebrándose la

lucha contra el SUH aprobada como ley en ese país.

Con respecto a las cepas híbridas, los esfuerzos para identificar estos tipos

de aislamientos en América Latina se incrementaron después de la aparición de la

cepa EHEC / EAEC O104:H4 en un brote de Europa. Los estudios prospectivos

identificaron a un niño que ingresó a un hospital en Argentina y que padecía

diarrea aguda. A partir de las heces de este niño, se aisló E. coli y se caracterizó

en un laboratorio de referencia. Los resultados la identificaron como EAEC del

serotipo O104:H4; en tanto que se identificaron los factores de virulencia

relacionados con EAEC, pero negativo para los genes de la toxina Shiga (132). La

aparición de este serotipo ha reforzado la necesidad de implementar mejores

métodos de detección para todas las patovariantes de E. coli en América Latina

(133).

En México, durante casi dos décadas (1998-2018), las infecciones

intestinales bacterianas y virales han sido la segunda causa de morbilidad entre la

población mexicana (134). En el 2015, fue la segunda causa de morbilidad en

niños de 5 a 14 años y en el 2016 se reportó como la cuarta causa de mortalidad

entre los niños menores de cinco años (134, 135). Esta tendencia también se

observa en el noreste mexicano, dado que en Sinaloa, las infecciones intestinales

fueron la segunda causa de morbilidad entre niños de 5-14 años, solo por debajo

de las infecciones respiratorias agudas (Figura 6). Durante 2017 en este estado,

Page 50: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

41

este tipo de infecciones se ubicó como la segunda causa de morbilidad, afectando

principalmente a personas de 25-44 años (17%), seguido de los niños de 1-4 años

(16.5%) (134).

Figura 6. Las infecciones intestinales, segunda causa de morbilidad en niños de 5-14 años en Sinaloa, México. Las infecciones intestinales abarcan a las infecciones intestinales bacterianas (CIE A04), las infecciones intestinales debidas a virus, excepto rotavirus (CIE A08) y diarrea de presunto origen infeccioso (CIE A09) (136). CIE, código internacional de enfermedades.

Sin embargo, hay escasos estudios sobre la etiología de la diarrea

infecciosa, particularmente sobre la prevalencia de los patotipos DEC por grupos

de edad. Algunos estudios mostraron la presencia (28%) de cepas DEC en niños

menores de 2 años hospitalizados (127). Otro trabajo mostró la presencia de DEC

Page 51: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

42

entre estudiantes estadounidenses que viajaron a México y se reportó que ETEC

fue la que se presentó en mayor proporción (36%) (137-139). Un estudio hecho en

Yucatán (2007 al 2011), reportó un 28% de E. coli diarreogénicas, las que se

asociaron con diarrea aguda en niños menores de 5 años que requirieron

hospitalización, los patotipos DAEC, EAEC y EPEC fueron los más frecuentes (35,

24 y 19%, respectivamente). De manera interesante, entre los niños afectados con

las variantes diarreogénicas de E. coli, 30% presentaron diarrea moderada, en

tanto que 14% tuvieron enfermedad diarreica severa. También encontraron que

los genes de virulencia suplementarios (aatA, astA, pet y cdt), los cuales fueron

más prevalentes en las cepas DEC que las E. coli no diarreogénicas(140).

Con el propósito de identificar a los agentes etiológicos, un estudio hecho

con 1037 pacientes que padecieron diarrea aguda en Sinaloa, reveló una

prevalencia de 23.3% de E. coli diarreogénica, siendo la variante EAEC la más

frecuente, seguida de EPEC y ETEC (12.2, 5.1 y 4.3%, respectivamente). El grupo

más afectado fue el de los niños menores a 2 años, de quienes se aisló

principalmente EPEC. Más del 90% de los aislados exhibieron resistencia a la

tetraciclina, ampicilina y trimetoprima-sulfametoxazol(141).

En Sinaloa también se han identificado cepas de E. coli en alimentos (7.9%),

siendo el 13.6% de éstas diarreogénicas. Los productos lácteos fueron los que

exhibieron mayor prevalencia de DEC (2.8%), siendo EPEC la más frecuente

(78.5%) (128).

Page 52: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

43

3.5. Epidemiología de E. coli diarreogénica en pacientes asintomáticos

Se ha reportado el aislamiento de E. coli con factores de virulencia aunque

de pacientes asintomáticos, quienes no presentaron un cuadro clínico diarreico u

otro tipo de infección. En este sentido, existen diversos estudios donde han

aislado diferentes patotipos de E. coli diarreogénica de niños con diarrea y sin

diarrea (asintomáticos). Un trabajo realizado en Brasil en el 2007, reportó un

25.4% de prevalencia de DEC en el grupo de sujetos con diarrea, en tanto que

entre los asintomáticos, la prevalencia fue de 18.7%, sin embargo, dicha diferencia

no fue significativa (142). Por otro lado, se reportó en el año 2011, un trabajo

hecho en África, donde se encontró DEC en niños menores de 5 años con diarrea

(45%) y niños asintomáticos (29%) la cual hubo asociación significativa entre DEC

y diarrea (p<0.001) (143). La interpretación de la frecuencia de patógenos en

muestras de diarrea frente a las de control, es bastante compleja. La colonización

asintomática puede ser el resultado de varios factores (del patógeno, del huésped

o del ambiente) (127).

La presencia de un patógeno en heces en niños asintomáticos puede

explicarse considerando diversos factores del huésped como la edad, o los

derivados de la edad temprana como la lactancia, los anticuerpos

transplacentarios o factores protectores a mayor edad, como el desarrollo de

inmunidad adquirida en función de las infecciones previas (127).

Page 53: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

44

3.6. Grupos filogenéticos de E. coli

El trabajo de Whittam y colegas (1983) reveló la existencia de una

subestructura genética en Escherichia coli y estudios posteriores han confirmado

la existencia de una extensa subestructura en la especie (144, 145). Esta

subestructura genética mostró que las cepas de diferentes filogrupos de E. coli no

se distribuían aleatoriamente con respecto a su fuente de aislamiento. Es decir, los

patotipos causantes de infección extraintestinal se agruparon entre los filogrupos

B2 o D que en A o B1 (146, 147). Este hecho posibilitó la idea de que este sería

un método simple para asignar aislamientos a un filogrupo de terminado. Esto

condujo al desarrollo y validación de un ensayo de reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) para detectar tres marcadores moleculares como los genes

chuA (gen que codifica una proteína de transporte hemorreguladora de hierro por

sus siglas en ingles E. coli haem-utilization), yjaA (su mecanismo es desconocido

pero se sabe que su secuencia génica se encuentra en el genoma completo de la

cepa E. coli K-12) y el fragmento de ADN TspE4.C2 (gen de la lipasa esterasa),

con el propósito de asignar cada cepa de E. coli a un grupo filogenético

determinado (148).

En base a la presencia o ausencia de estos tres fragmentos, una cepa de E.

coli podría asignarse a los filogrupos, A, B1, B2 o D (149). Este esquema se ha

utilizado ampliamente como un método simple y económico para determinar el

grupo filogenético de un aislado de E. coli; además, es una herramienta que ha

mostrado que las cepas de diversos filogrupos difieren en sus características

Page 54: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

45

fenotípicas y genotípicas, las características de su nicho ecológico, rasgos de su

historia de vida así como la capacidad para causar enfermedades (150, 151).

Desde el año 2000 se han incrementado los datos sobre los tipos de

tipificación secuencia multilocus (por sus siglas en ingles Multi Locus Secuence

Typig –MLST-) para E. coli, esto a partir de diferentes huéspedes y hábitats. Estos

datos permitieron validar de manera más efectiva la utilidad del método de PCR

triple para la asignación de filogrupos (148). Este estudio demostró que el 80-85%

de las asignaciones de filogrupos son correctas. Sin embargo, también demostró

que una fracción significativa de cepas con genotipos particulares de PCR triple

(A0, D1, D2) se asignó incorrectamente.

Los extensos conjuntos de datos MLST disponibles, aunado al creciente

conocimiento de datos del genoma, han permitido una mejor comprensión sobre la

subestructura genética en E. coli. Por ejemplo, se estableció el filogrupo E, que de

acuerdo al esquema anterior estaba conformado por un conjunto de cepas de

filogrupo desconocido, de las cuales el patotipo O157: H7 es el miembro más

conocido (150).

Por otro lado, también se creó el filogrupo F que alberga cepas que

conforman un grupo hermano del filogrupo B2 (152, 153). Más recientemente, se

propuso el filogrupo C para aquellas cepas estrechamente relacionadas, pero

distintas del filogrupo B1 (153, 154). Walk y colegas (2009) notaron nuevos linajes

(nuevas especies) de Escherichia genéticamente distintos pero fenotípicamente

indistinguibles de E. coli (155). Al menos uno de estos linajes crípticos,

Page 55: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

46

Escherichia clado I, también debe considerarse un filogrupo de E. coli en función

del grado de recombinación detectado entre cepas pertenecientes al clado I y E.

coli (156). Por tanto, en la actualidad el esquema se extendió a ocho filogrupos

reconocidos de E. coli, siete de los cuales pertenecen a E. coli en sentido estricto

(A, B1, B2, C, D, E, F) y uno corresponde a Escherichia clado I (Figura 7).

Dadas las limitaciones del método triple desarrollado por Clermont y

colegas en 2000, aunado a que el método no fue diseñado para detectar

filogrupos distintos de A, B1, B2 y D, estos investigadores consideraron apropiado

una modificación del método para superar estas limitaciones.

Al plantear modificaciones a este primer método de PCR triple, se

mantuvieron los marcadores chuA, yjaA y TspE4.C2.Los nuevos datos disponibles

del genoma se usaron para modificar las secuencias del cebador chuA, yjaA y

TspE4.C2 para evitar polimorfismos en la secuencia de nucleótidos utilizada para

la identificación del cebador y excluir la amplificación de TspE4.C2 y chuA en

cepas que pertenecen al clado críptico I y los clados III, IV y V respectivamente

(157). Además, se agregó el marcador genético arpA, por lo que el nuevo método

ahora es una PCR cuádruplex.

Page 56: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

47

Figura 7. Dendograma de la filogenia de E. coli. Árbol de máxima verosimilitud que representa la estructura de los filogrupos de Escherichia coli. El árbol se construyó mediante el modelo general de evolución reversible (158).

La inclusión de arpa tuvo dos propósitos. Primero, actuar como control

interno de la calidad del ADN, ya que se espera que todas las cepas de E. coli y

clado I produzcan al menos un producto de PCR mediante el esquema de PCR

cuádruplex. En segundo lugar, la inclusión de este marcador permite que las

cepas pertenecientes al filogrupo F, anteriormente mal identificadas como cepas D

(chuA, yjaA -, TspE4.C2 -), se distingan porque arpA está presente en todas las E.

Page 57: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

48

coli con la excepción de las pertenecientes a los filogrupos B2 y F (158). El

marcador arpA está ausente en los clados crípticos II, III, IV, V, así como en E.

albertii y E. fergusonii (158). Finalmente, para identificar las cepas que pertenecen

a los filogrupos C y E, se diseñaron dos pares adicionales de cebadores de PCR

específicos de alelo (159).

3.7. E. coli y su resistencia a antibióticos

La resistencia a los antimicrobianos (AMR) es la capacidad de un

microorganismo (como bacterias, virus y algunos parásitos) para evitar que un

antimicrobiano (como antibióticos, antivirales y antipalúdicos) actúen contra él;

como resultado, los tratamientos estándar se vuelven ineficaces, las infecciones

persisten y pueden extenderse a otros.

Están surgiendo y extendiéndose nuevos mecanismos de resistencia a nivel

mundial, amenazando nuestra capacidad para tratar las enfermedades infecciosas

comunes, lo que deriva en enfermedades prolongadas, discapacidad y muerte. Sin

antimicrobianos efectivos para la prevención y el tratamiento de infecciones, los

procedimientos médicos como el trasplante de órganos, la quimioterapia contra el

cáncer, el control de la diabetes y la cirugía mayor (por ejemplo, cesáreas o

reemplazos de cadera) se convierten en un riesgo muy alto.

La resistencia a los antimicrobianos aumenta el costo de la atención médica

con estadías más prolongadas en los hospitales y se requieren cuidados más

Page 58: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

49

intensivos. Este fenómeno supone un riesgo para alcanzar los objetivos de

desarrollo sostenible (160).

La resistencia a los antimicrobianos ocurre naturalmente con el tiempo,

generalmente a través de cambios genéticos. Sin embargo, el mal uso y el uso

excesivo de antimicrobianos están acelerando este proceso. Los microbios

resistentes a los antimicrobianos se encuentran en personas, animales, alimentos

y el medio ambiente (en el agua, el suelo y el aire). Se pueden propagar entre

personas y animales, incluso a partir de alimentos de origen animal y de persona a

persona. El control deficiente de la infección, las condiciones sanitarias

inadecuadas y la manipulación inadecuada de los alimentos fomentan la

propagación de la resistencia a los antimicrobianos(160).

Los pacientes con infecciones causadas por bacterias resistentes a los

medicamentos tienen un mayor riesgo de peores resultados clínicos y muerte, y

consumen más recursos de atención médica que los pacientes infectados con

cepas no resistentes de la misma bacteria. Por otro lado, la resistencia bacteriana

a menudo resulta en el fracaso del tratamiento, lo que puede tener serias

consecuencias, especialmente en pacientes críticos. La terapia antibacteriana

empírica inadecuada, definida como el uso inicial de un agente antibacteriano al

que el patógeno causante no era susceptible, se ha asociado con mayores tasas

de mortalidad en pacientes con infecciones del torrente sanguíneo debido a

Pseudomonas aeruginosa resistente, Staphylococcus aureus, K. pneumoniae,

Page 59: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

50

Enterobacter spp, estafilococos coagulasa negativos, enterococos y E. coli (161,

162).

La terapia prolongada con agentes antimicrobianos, como la vancomicina o

el linezolida, también puede conducir al desarrollo de resistencia de bajo nivel que

compromete la terapia, pero que puede no ser detectada por los métodos de

prueba de sensibilidad de rutina utilizados en los laboratorios del hospital (163). La

mayoría de los agentes antimicrobianos utilizados para el tratamiento de

infecciones bacterianas se pueden clasificar de acuerdo con su mecanismo de

acción, de los que existen 4 variantes: (1) interferencia con la síntesis de la pared

celular, (2) inhibición de la síntesis de proteínas, (3) interferencia con la síntesis de

ácido nucleico e (4) inhibición de una vía metabólica (164).

Los medicamentos antibacterianos que funcionan inhibiendo la síntesis de

la pared celular bacteriana incluyen los β-lactámicos, como las penicilinas,

cefalosporinas, carbapenemas y monobactamicos, y los glucopéptidos, que

incluyen vancomicina y teicoplanina (164, 165). Los agentes β-lactámicos inhiben

la síntesis de la pared celular bacteriana al interferir con las enzimas requeridas

para la síntesis de la capa de peptidoglucano (165). La vancomicina y la

teicoplanina también interfieren con la síntesis de la pared celular, pero lo hacen

uniéndose a los residuos terminales de D-alanina de la cadena naciente de

peptidoglucano, evitando así los pasos de reticulación necesarios para la síntesis

estable de la pared celular (165).

Page 60: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

51

Los macrólidos, aminoglucósidos, tetraciclinas, cloranfenicol,

estreptograminas y oxazolidinonas producen sus efectos antibacterianos al inhibir

la síntesis de proteínas (164, 165). Los ribosomas bacterianos difieren en

estructura de sus contrapartes en las células eucariotas. Los agentes

antibacterianos aprovechan estas diferencias para inhibir selectivamente el

crecimiento bacteriano. Los macrólidos, aminoglucósidos y tetraciclinas se unen a

la subunidad 30S del ribosoma, mientras que el cloranfenicol se une a la

subunidad 50S.

Las fluoroquinolonas ejercen sus efectos antibacterianos al interrumpir la

síntesis de ADN y causar roturas letales de ADN de doble cadena durante la

replicación del ADN (166), mientras que las sulfonamidas y trimetoprima (TMP)

bloquean la vía para la síntesis de ácido fólico, lo que finalmente inhibe la síntesis

de ADN (167). La combinación común de fármacos antibacterianos de TMP, un

análogo del ácido fólico, más sulfametoxazol (SMX) (una sulfonamida) inhibe 2

pasos en la ruta enzimática para la síntesis de folato bacteriano.

La interrupción de la estructura de la membrana bacteriana puede ser un

quinto mecanismo de acción, aunque menos bien caracterizado. Se postula que

las polimixinas ejercen sus efectos inhibitorios al aumentar la permeabilidad de la

membrana bacteriana, causando fugas del contenido bacteriano (168). La

daptomicina del lipopéptido cíclico aparentemente inserta su cola lipídica en la

membrana celular bacteriana (169), causando la despolarización de la membrana

y la eventual muerte de la bacteria.

Page 61: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

52

3.7.1. Mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos

Las bacterias pueden manifestar resistencia a los medicamentos

antibacterianos a través de una variedad de mecanismos. Algunas especies de

bacterias son innatamente resistentes a ≥1 clase de agentes antimicrobianos. En

tales casos, todas las cepas de esa especie bacteriana son igualmente resistentes

a todos los miembros de esas clases antibacterianas. De mayor preocupación son

los casos de resistencia adquirida, donde las poblaciones inicialmente

susceptibles de bacterias se vuelven resistentes a un agente antibacteriano y

proliferan y se propagan bajo la presión selectiva del uso de ese agente. Varios

mecanismos de resistencia a los antimicrobianos se propagan fácilmente a una

variedad de géneros bacterianos (170).

Primero, el organismo puede adquirir genes que codifican enzimas, como

las lactamasas, que destruyen el agente antibacteriano antes de que pueda tener

un efecto. En segundo lugar, las bacterias pueden adquirir bombas de flujo que

extruyen el agente antibacteriano de la célula antes de que pueda alcanzar su sitio

objetivo y ejercer su efecto. En tercer lugar, las bacterias pueden adquirir varios

genes para una vía metabólica que finalmente produce paredes celulares

bacterianas alteradas que ya no contienen el sitio de unión del agente

antimicrobiano, o las bacterias pueden adquirir mutaciones que limitan el acceso

de los agentes antimicrobianos al sitio objetivo intracelular a través de la

regulación descendente de genes de porina.

Page 62: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

53

Por lo tanto, las poblaciones de bacterias normalmente susceptibles pueden

volverse resistentes a los agentes antimicrobianos a través de la mutación y la

selección, o al adquirir de otras bacterias la información genética que codifica la

resistencia. El último evento puede ocurrir a través de varios mecanismos

genéticos, incluida la transformación, la conjugación o la transducción. A través de

estos mecanismos de intercambio genético, muchas bacterias se han vuelto

resistentes a múltiples clases de agentes antibacterianos, y estas bacterias con

resistencia a múltiples fármacos (definidas como resistencia al menos a 3 clases

de antimicrobianos) se han convertido en un motivo de grave preocupación,

particularmente en hospitales y otras instituciones de atención médica donde

tienden a ocurrir con mayor frecuencia.

Como se señaló anteriormente, las bacterias susceptibles pueden adquirir

resistencia a un agente antimicrobiano a través de nuevas mutaciones(165).

Dichas mutaciones espontáneas pueden causar resistencia al (1) alterar la

proteína objetivo a la que se une el agente antibacteriano modificando o

eliminando el sitio de unión (p. ej., cambio en la proteína de unión a penicilina 2b

en neumococos, lo que resulta en resistencia a la penicilina), (2) regulación

positiva la producción de enzimas que inactivan el agente antimicrobiano (p. ej.,

eritromicina ribosomal metilasa en estafilococos), (3) regulan negativamente o

alteran un canal de proteína de membrana externa que el medicamento requiere

para la entrada celular (p. ej., OmpF en E. coli), o (4) bombas de regulación

positiva que expulsan el fármaco de la célula (flujo de fluoroquinolonas en S.

aureus)(165).

Page 63: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

54

En todos estos casos, las cepas de bacterias portadoras de mutaciones que

confieren resistencia se seleccionan mediante el uso de antimicrobianos, que mata

a las cepas susceptibles pero permite que las cepas recientemente resistentes

sobrevivan y crezcan. La resistencia adquirida que se desarrolla debido a la

mutación y selección cromosómica se denomina evolución vertical.

Las bacterias también desarrollan resistencia a través de la adquisición de

nuevo material genético de otros organismos resistentes. Esto se denomina

transferencia horizontal y puede ocurrir entre cepas de la misma especie o entre

diferentes especies o géneros bacterianos. Para cada uno de estos procesos, los

transposones pueden facilitar la transferencia e incorporación de los genes de

resistencia adquiridos en el genoma del huésped o en los plásmidos.

Durante la conjugación, una bacteria Gramnegativa transfiere genes de

resistencia que contienen plásmidos a una bacteria adyacente, a menudo a través

de una estructura proteica alargada denominada pilus, que se une a los 2

organismos. La conjugación entre bacterias Grampositivas generalmente se inicia

mediante la producción de feromonas sexuales por el par de apareamiento, que

facilita la agrupación de organismos donantes y receptores, permitiendo el

intercambio de ADN. Durante la transducción, los genes de resistencia se

transfieren de una bacteria a otra a través de bacteriófagos (virus

bacterianos)(170).

Page 64: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

55

Ahora se cree que este es un evento relativamente raro. Finalmente, la

transformación, es decir, el proceso mediante el cual las bacterias adquieren e

incorporan segmentos de ADN de otras bacterias que han liberado su

complemento de ADN en el medio ambiente después de la lisis celular, pueden

mover genes de resistencia a cepas previamente susceptibles(170).

La mutación y la selección, junto con los mecanismos de intercambio

genético, permiten que muchas especies bacterianas se adapten rápidamente a la

introducción de agentes antibacterianos en su entorno. Aunque una sola mutación

en un gen bacteriano clave puede reducir ligeramente la susceptibilidad de la

bacteria huésped a ese agente antibacteriano, puede ser suficiente para permitir

su supervivencia inicial hasta que adquiera mutaciones adicionales o información

genética adicional que resulte en una resistencia completa al antibacteriano

agente (165).

Sin embargo, en casos raros, una sola mutación puede ser suficiente para

conferir resistencia de alto nivel y clínicamente significativa a un organismo (p. ej.,

resistencia a rifampicina de alto nivel en S. aureus o resistencia a fluoroquinolona

de alto nivel en Campylobacter jejuni).

Aunque E. coli es intrínsecamente susceptible a muchos antibióticos, su gran

capacidad para adquirir genes de resistencia la han convertido en una bacteria de

importancia en salud pública mundial, dado que este fenómeno se ha observado

tanto en cepas aisladas de humanos y animales, por lo que el papel de estos

Page 65: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

56

huéspedes como acarreadores de estas bacterias es preocupante, aunado al uso

indiscriminado de antibióticos que se ha presentado con ambos organismos (171).

Page 66: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

57

IV. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

E. coli es una bacteria comensal que coexiste con los mamíferos, sin embargo

y dada su plasticidad genética, algunas clonas como las E. coli diarreogénicas

(DEC´s) pueden llegar a ser patógenas al hombre, dado que albergan factores de

patogenicidad implicados en el daño al huésped, afectando principalmente a

individuos inmunocomprometidos o que no han estado en contacto con dichas

variantes. Aunado a ello, se ha advertido su alta capacidad para resistir a los

antibióticos. Una herramienta para caracterizar a dicha bacteria a nivel genético es

el sistema de clasificación filogenética, que ha permitido distinguir grupos de E.

coli implicados en enfermedad.

En México, las infecciones intestinales bacterianas son la segunda causa

de morbilidad, afectando principalmente a la población infantil. En Sinaloa, este

tipo de infecciones también se ubican como la segunda causa de morbilidad entre

niños de 6-12 años; sin embargo, hay escasos estudios sobre uno de los

principales agentes etiológicos, como las DEC´s, sobre su perfil de virulencia, tales

como la presencia de genes típicos y suplementarios de virulencia en pacientes

con diarrea y asintomáticos. Además poco se conoce también sobre el perfil de

resistencia a los antimicrobianos, elemento necesario para elegir el mejor

esquema de tratamiento, además del nulo conocimiento sobre su clasificación

filogenética.

Page 67: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

58

V. JUSTIFICACIÓN

El presente trabajo contribuirá al conocimiento sobre la prevalencia de E. coli

diarreogénica en niños sanos y con diarrea de Sinaloa, México, los rasgos de

patogenicidad de las DEC recuperadas en ambos grupos para determinar

diferencias entre los perfiles de virulencia, su capacidad de daño citotóxico, su

resistencia a los antimicrobianos y los filogrupos a los que pertenecen. La

determinación de dichos perfiles permitirá entender las características biológicas

de las E. colicausante de diarrea que colonizan a niños del noreste mexicano y

plantear hipótesis sobre otros factores que originan la diarrea causada por las

DEC.

Page 68: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

59

VI. HIPÓTESIS

Existe mayor prevalencia de DEC´s en niños con diarrea que en

asintomáticos.

Las cepas DEC tienen mayor cantidad de genes accesorios de

virulencia que las cepas no-DEC.

Las cepas con genes para citotoxinas causan un mayor daño celular

que las cepas que carecen de dichos genes.

Las cepas DEC´s de pacientes diarreicos son resistentes a una

mayor cantidad de antibióticos, respecto de las aisladas de niños

asintomáticos.

Las cepas DEC pertenecen a los filogrupos D y B2.

Page 69: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

60

VII. OBJETIVOS

General

Caracterizar Escherichia coli diarreogénica aisladas de niños con un cuadro

clínico diarreico y asintomático en Sinaloa.

Específicos

1. Aislar E. coli de niños con diarrea y asintomáticos e identificar genes de

virulencia típicos/suplementarios.

2. Determinar el daño celular de Escherichia coli aisladas de niños con y sin

diarrea.

3. Determinar el perfil de resistencia a antibióticos en E. coli diarreogénicas

aisladas entre niños con y sin diarrea.

4. Determinar la clasificación filogenética de E. coli aisladas de niños con y sin

diarrea de Sinaloa.

Page 70: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

61

VIII. MATERIALES Y MÉTODOS

8.1. Población de estudio

Niños sanos. Durante 2014 se reclutaron 203 niños sanos, de 6-12 años de

edad, de la escuela primaria Hermanos Flores Magón (clave 25DPR1800E)

ubicada en Culiacán, Sinaloa; los niños cumplieron los siguientes criterios de

inclusión: no presentar vómito, diarrea, fiebre o pérdida del apetito, dolor

abdominal; no estar bajo tratamiento con antibióticos y tener el consentimiento

informado y firmado por los padres para participar en el proyecto. La información

clínica y epidemiológica se capturó mediante cuestionarios.

Niños con diarrea: Las cepas de E. coli aisladas de niños con diarrea,

provienen del estudio hecho por el grupo de trabajo del CIASaP y disponible en la

literatura científica (172). En el citado trabajo, la colecta de heces se hizo de

enero 2011 a diciembre 2014, a partir de 114 niños de 6-12 años de 17

municipios de Sinaloa, quienes acudieron a las unidades de salud atención

primaria de dichos municipios, por presentar diarrea aguda, con al menos tres

evacuaciones líquidas al día.

8.2. Aislamiento e identificación de cepas de E. coli

A partir de los niños sanos, se colectaron aproximadamente 5 g de heces

en recipientes de plástico de boca ancha y con tapa estéril (Cohmedic,

Zapopan, México), se etiquetaron y colocaron en una nevera con hielo. Las

heces de los niños con diarrea se colectaron con hisopos rectales y se colocaron

Page 71: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

62

en medio de transporte de Cary-Blair (COPAN, California, EUA). Todas las

muestras se trasladaron (en un tiempo no mayor a 2 h) en neveras al laboratorio

para su procesamiento. Las muestras fueron sembradas en agar MacConkey

(Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania) para la selección de colonias

fermentadoras de lactosa (presuntivas de E. coli). Para la identificación

bioquímica se empleó el sistema API 20E® (Biomeriux, Carolina del Norte, EUA)

siguiendo las indicaciones del fabricante, en tanto para la identificación molecular,

se amplificó el gen ARNr 16S mediante PCR; dichos cebadores identifican

secuencias homologas en las regiones V3 (cebador 16E1) y V6 del gen 16S

(cebadores 16E2 o 16E3) (173). Las especificaciones de los cebadores se

muestran en el cuadro 3.

Cuadro 3. Oligonucleótidos para amplificar el gen ARNr 16S en E. coli.

Oligonucleótido

5’-3’ Secuencia 5’-3’

Concentración

final (en 25 l)

Tamaño

Producto

(pb)

16 E1 GGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTC 0.4 M

16 E2 TTCCCGAAGGCACATTCT 0.4 M 584

16 E3 TTCCCGAAGGCACCAATC 0.4 M

Las reacciones se prepararon con 12.5 µL de Go Taq Green Master Mix

(Promega, Fitchburg, EUA), 1 µL de cada oligonucleótido (con una concentración

de 0.5 µM), 1 µL del lisado bacteriano y agua estéril libre de nucleasas c.b.p. 25

Page 72: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

63

µL. Las reacciones se colocaron en un termociclador (BIORAD T-100, California,

EUA) bajo las siguientes condiciones: 35 ciclos de 94°C por 20 s, 60°C por 20 s y

72°C por 30 s respectivamente; la extensión final fue de 72°C por 2 min. Los

productos de PCR se separaron con electroforesis en gel de agarosa al 2%

(Thermo Scientific, California, EUA), con 90 volts durante 60 min. Los geles se

tiñeron con GelRed® (Biotium, California, EUA) durante 15 min. y la banda de 584

pb se reveló con un fotodocumentador (Fotodyne Fisher Scientific, California,

EUA). Las cepas de E. coli confirmadas se conservaron en caldo Luria Bertani

(LB) con glicerol al 20% a -80º C.

8.3. Cepas de referencia

Se emplearon cepas prototipo de las DEC (usadas en todo el mundo) y que

forman parte de la colección de nuestro laboratorio (128). Los patotipos

empleados con sus genes típicos fueron: E. coli enteropatógena (EPEC

E2348/69; eae+ y bfpA+), E. coli enterotoxigénica (ETEC; lt+, st+), E. coli

enteroinvasiva (EIEC; ipaH+, virF+), E. coli enterohemorrágica (EHEC O157:H7

EDL933; eae+, hlyA+, stx1+, stx2+), E. coli de adherencia difusa (DAEC; daaE+),

E. coli Enteroagregativa (EAEC O42; aggR+, aap+, pCVD432+, y aafII+). Como

controles negativos se usaron E. coli HB101 y E. coli ATCC 25922.

8.4. Extracción de ADN

Los análisis genéticos se hicieron con cinco colonias aisladas de E. coli por

muestra. Para obtener el ADN total, las cepas se cultivaron en 3 mL de caldo LB

durante 18 h, el paquete celular bacteriano se obtuvo por centrifugación a 10,000

Page 73: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

64

x g durante 10 min y se resuspendió en 300 µL de agua destilada grado biología

molecular. Se mantuvieron en baño maría a 100 °C durante 10 min, se agitó en

vórtex por 10 s y se centrifugó nuevamente a 12,000 x g por 3 min. El lisado se

transfirió a tubos estériles (Eppendorf, Alemania) de 0,5 mL y se almacenaron a

-20 °C hasta su uso.

8.5. Detección de genes típicos y genes suplementarios de virulencia

(GSV) en E. coli por PCR.

Se prepararon reacciones de PCR multiplex (para los genes típicos) o

monoplex (para los GSV) con 12.5 µL de Go Taq Green Master Mix (Promega,

Fitchburg, EUA), 1 µL de cada oligonucleótido (con una concentración de 0.5 µM),

1µL del lisado bacteriano y agua estéril libre de nucleasas c.b.p. 25 µL. Los

oligonucleótidos y condiciones de PCR para los genes típicos se muestran en el

cuadro 4, en tanto que para los GSV en el cuadro 5.

Los resultados fueron capturados en Excel y con los datos de la

presencia/ausencia de los genes suplementarios, se calculó el puntaje de

virulencia por cada cepa, dividiendo el número de genes que fueron amplificados

entre el total de genes suplementarios buscados (N=20); el cociente se multiplicó

por 10 como lo describió Lefort y colaboradores (174).

Page 74: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

65

Cuadro 4. Oligonucleótidos para la detección de genes típicos de E. coli diarreogénicas.

Mezcla de iniciadores Secuencia de los iniciadores (5´-3´) Objetivo

genético

Producto de PCR

(pb)

Condiciones de PCR DEC Referencia

M1

TTATTTTAAATTGGGTTCGGAT AATTTAATGCCTTGTCATCGG

TTTACTACCAGTCTGCGTCT ATGCCGCTTTATCCAACCTG

eae

bfp

365

282

95 °C 45 s, 54 °C 45 s,72 °C

45 s 30 ciclos

EPEC (128)

M2

CACAGGCAACTGAAATAAGTCTGG ATTCCCATGATGTCAAGCACTTC

ATTCCCATGATGTCAAGCACTTC

GTATACAAAGAAGGAAGC

aafII

aggR

378

254

94 °C 30s, 56 °C 30s,72 °C

30s

30 ciclos

EAEC (175, 176)

M3

CTGGCGAAAGACTGTATCAT CAATGTATAGAAATCCGCTGTT

ATGAAAAAAATTAAGTTTGTTATCTT TTATTTAACCCATTCGGTTAGAGC

pcvd432

aap

630

351

94 °C 50s, 54 °C 50s,72 °C

50s

30 ciclos

EAEC (177, 178)

M4

GCACACGGAGCTCCTCAGTC TCCTTCCTTTCAATGGCTTT

AAAGGAGAGCTTCGTCACATTTT AATGTCCGTCTTGCGTTAGGAC

lt

stII

218

129

94 °C 30s, 60 °C 30s,72 °C

30s

30 ciclos

ETEC (176)

M5 GAACGTTGGTTAATGTGGGGTAA TATTCACCGGTCGGTTATCAGT

daaE 542

94 °C 1 min, 60 °C 1

min,72 °C 1 min

30 ciclos

DAEC (176)

M6

AGCTCAGGCAATGAAACTTTGAC TGGGCTTGATATTCCGATAAGTC

CTCGGCACGTTTTAATAGTCTGG GTGGAGAGCTGAAGTTTCTCTGC

virF

ipaH

618

933

94 °C 1.5 min, 60 °C 1.5

min,72 °C 1.5 min

35 ciclos

EIEC (176)

M7 CAAAGACGTATGTAGATTCGC TTCGTTCAACAATAAGCCGTA

stx1

192

95 °C 45 s, 54 °C 45 s,72 °C

EHEC o (128)

Page 75: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

66

TATTATTTAAATGGGTACTGTGC CATAACTTTGTTGGGTCGAAA

stx2

96

45 s

30 ciclos

STEC

M8

AGCTGCAAGTGCGGGTCTG TACGGGTTATGCCTGCAAGTTCAC

CTACAGGTGAAGGTGGAATGG ATTCCTCTCTTTCCTCTGCGG

TACCATCGCAAAAGCAACTCC GTCGGCAACGTTAGTGATACC

hlyA

rfbEO157

fliCH7

569

327

247

95 °C 40s, 60 °C 40s,72 °C

40s

30 ciclos

EHEC (179)

M=mezcla; m=minuto; s=segundos.

Page 76: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

67

Cuadro 5. Oligonucleótidos para la amplificación de GSV en E. coli. Mezcla de iniciadores Secuencia de los iniciadores (5´-3´) Objetivo

genético Producto de

PCR (pb) Condiciones de PCR DEC Referencia

M1 GTTCTCTCTGATGGTTATGC AACATTGACCATACCGCCG

aida-I 342 94 °C 60s, 60 °C

60s,72 °C 2 m 30 ciclos

DAEC (93)

M2 CGTATCGCTGTGCCCGATAAC CCGTATACGAGTTGTCAGAATCA cah 707

95 °C 60s, 58 °C 60s,72 °C 20s

72°C 10m, 30 ciclos

EHEC (126)

M3

CACAGATGACAGAAGGGAC GTTTACCCCACTCGTCAG

ehaA 326

94 °C 60s, 60 °C 60s,72 °C 2 m

30 ciclos EHEC (93)

M4

CAGGGTTATGAGTGGGAAG CCACTTGCTGCCGTTGTT

ehaB 423

M5

TAATGACGGCAAAGGTGGT CATTCATCAGGGAGTTGCT

ehaC 599

M6

GGCAGTTGACACGATTATTA CTGTCGCTTTGCCATTATC

ehaD 821

M7

GGTGGATACAGCAGGTAATG TATCTCACCACCTGCTATCG

sab 163 94 °C 60s, 59 °C

60s,72 °C 2 m 30 ciclos

EHEC (93)

M8

ATGGTTGGCAGTGACGGTA GGTTGTTGACGGACGGAAA

tibA

480

94 °C 60s, 58 °C 60s,72 °C 2 m

30 ciclos ETEC (93)

M9 AGAATGGAAGATCACACCAG ATAATGCCTTTCATCCACAC efa1/lifA 310

94° C 2 min, 94°C 5 s, 55 ° C 5 s, y 72 ° C

10s, 30 ciclos

aEPEC (123)

M10 CCATCGATACGATCATTGCACG ATTGCAAGGTAGTTCAGACTCA kps 400

94 ° C 10 min, 94 °C 1 min, 60 ° C 1min, y 72

° C 1 m, 72 °C 5 m. EAEC (180)

Page 77: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

68

30 ciclos

M11 TGAGTTGTGGGGCTAGCTGGA CACCATAAGCCGCCAAATAAGC

agg4A

169

95 °C 2 m, 94 °C 50s, 72 °C,1.5m, 72 °C, 1.5

m, 72 °C, 10 m 35 ciclos

EAEC (103)

M12 TCGCCATCAACAAAAATACC GCTTTCACCGATAAGGACAAC nleB 273

94° C 2 min, 94°C 5 s, 55 ° C 5 s, y 72 ° C

10s, 30 ciclos

aEPEC (123)

M13 TAGTGCAGTGCAGAAAGCAGTT AGTTTTCCTGTTGCTGTATGCC espC 301

95 °C 60s, 55 °C 60s,72 °C 20s

72°C 10m, 30 ciclos

EPEC (126)

M14 GGCACAGAATAAAGGGGTGTTT CCTCTTGTTTCCACGACATAC pet 302

95 °C 60s, 58 °C 60s,72 °C 20s

72°C 10m, 30 ciclos

EAEC (126)

M15 TCAGAAGCTCAGCGAATCATTG

CCATTATCACCAGTAAAACGCACC sat

930

94 °C 60s, 59 °C 60s,72 °C 2 m

30 ciclos DAEC (117, 181)

M16 CAGGAGTGGGAACATTAAGTCA CGTACGCCTTTGATTTCAGGAT eatA 743

95 °C 60s, 58 °C 60s,72 °C 20s

72°C 10m, 30 ciclos

ETEC (126)

M17 GGGAGAGTTCAGGCATTTA CAGCGTTACCTTACTTGAG epeA 783

94 °C 60s, 58 °C 60s,72 °C 2 m

30 ciclos

EHEC (93)

M18 ATGGACAGAGTGGAGACAG GCCACCTTTATTCTCACCA espI 560 94 C 60s, 52 C 60s,

72 C 60s EHEC (115)

M19 GTCCATGCAGGGACATGCCA TCACATCAGCACCGTTCTCTAT espP 547

95 °C 60s, 55 °C 60s,72 °C 20s

72°C 10m, 30 ciclos

EHEC (126)

M20 ACAACGATACCGTCTCCCG GGGTATTGTCCGTTCCGAT pic 1176

94 °C 60s, 60 °C 60s,72 °C 1 m

40 ciclos EAEC (117)

M=mezcla; m=minuto; s=segundos.

Page 78: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

69

8.6. Ensayo de citotoxicidad

Para este ensayo se seleccionaron algunas cepas DEC con GSV y no-DEC

con y sin GSV. La citotoxicidad de las cepas se evaluó con un estuche comercial

llamado LDH citotoxicity assay (Thermo Scientific, California, EUA), que mide la

cantidad de lactato deshidrogenasa liberada cuando las células eucariotas son

dañadas. Para ello se cultivaron células HT-29 (ATCC® HTB-38™) de

adenocarcinoma colorectal en botellas de cultivo celular de 25 cm2, con medio

McCoy 5A 1X modificado con L-glutamina (Gibco Thermo Fisher Scientific,

Bremen, Alemania) suplementado con suero fetal de bovino al 10% (Corning,

Virginia, EUA) y mezcla de antibióticos: penicilina 5000 U + estreptomicina 5 mg +

neomicina 10 mg (Sigma, Ohio, EUA) en una atmósfera humidificada con 5% de

CO2, a 37ºC. Cuando alcanzaron el 80-90% de confluencia, las células se

desprendieron con 500 µl de tripsina al 0.25%, EDTA 2.21 mM y bicarbonato de

sodio 1X (Corning, Virginia, EUA) y se homogenizaron en 3 mL de medio McCoy

suplementado. De esta suspensión, se preparó una dilución 1:2 con el colorante

azul de tripano al 1% y se contabilizaron las células viables en cámara de

Neubauer; posteriormente, se transfirieron 20,000 cel/mL (contenidas en 110

µL/pozo) a cada pozo de una microplaca de 96 (Corning, Virginia, EUA) y se

reincubaron en las condiciones mencionadas anteriormente.

Paralelamente, se sembraron dos colonias aisladas de las cepas de E. coli en

4 mL de caldo triptona al 1% y se incubaron a 37º C durante 18 h. Previa a la

infección de las células eucariotas, se retiró el medio McCoy, se hicieron dos

lavados con PBS 1X estéril y se añadieron 110 µL/pozo de medio McCoy sin suero

Page 79: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

70

ni antibióticos. Las células se infectaron con 1 x 107 Unidades Formadoras de

Colonias (UFC/mL) de las bacterias contenidas en 10 µL de suspensión bacteriana

y se reincubaron en atmósfera humidificada con 5% de CO2, a 37 ºC durante 12 h.

A los pozos destinados como control de actividad máxima de LDH, se añadieron

15 µL de buffer de lisis (10X) 45 min. antes de finalizar las 12 h de incubación.

También se destinaron tres pozos empleados como blanco, los que únicamente se

agregaron 150 µL de medio McCoy. Al término de las 12 h de incubación, se

centrifugó la microplaca a 4000 rpm por 5 min. y se transfirieron 50 µL del

sobrenadante a una microplaca nueva y se añadió un volumen igual de mezcla de

reacción (sustrato), se incubó durante 30 min. en oscuridad. Finalmente, la

reacción se detuvo con 50 µL de solución de paro y se determinó la absorbancia a

490 nm en un lector para microplacas. Las absorbancias se capturaron en una

hoja de cálculo y el porcentaje de citotoxicidad se calculó conforme a la fórmula

siguiente descrita por el fabricante:

Dónde: Ab=absorbancia

El porcentaje de citotoxicidad se representó en un gráfico, colocando en el eje

de las abscisas las cepas (variable independiente) y en las ordenadas el % de

citotoxicidad (variable dependiente). Mediante la prueba de ANOVA de una vía se

determinaron diferencias entre los grupos de E. coli DEC con GSV, E. coli no-DEC

Page 80: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

71

con GSV y cepas no-DEC sin GSV; como controles se usaron E. coli HB101

(control negativo) y EHEC O157:H7 (control positivo).

Page 81: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

72

8.7. Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos

Para determinar la sensibilidad o resistencia a los agentes antimicrobianos, se

empleó el método de difusión en disco de Kirby-Bauer, de acuerdo a lo establecido

por el Instituto de Estandarización para Laboratorios Clínicos (CLSI por sus siglas

en inglés) (182). Los sensidiscos utilizados (Becton Dickinson, Heidelberg,

Alemania) fueron: ampicilina (AMP: 10 μg), cefotaxima (CTX: 30 μg), ceftazidima

(CAZ: 30 μg), gentamicina (GEN: 10 μg) tetraciclina (TET: 30 μg), ciprofloxacino

(CIP: 5 μg), ácido nalidíxico (NAL: 30 μg), trimetoprima-sulfametoxazol (SXT 1,25

μg/ 23,75 μg) y cloranfenicol (CHL: 30 μg).

A partir de cultivos axénicos, se inocularon 1-3 colonias aisladas en caldo

Müeller-Hinton y se incubaron hasta alcanzar la turbidez 0.5 del estándar de

McFarland. Posteriormente se introdujo un hisopo estéril en la suspensión

bacteriana y se sembraron placas de agar Müeller-Hinton de forma masiva. Luego

de 10 min. de reposo, se colocaron ocho discos de antibióticos por placa y se

incubaron a 37 ° C durante 18-20 h. Las zonas claras de inhibición del crecimiento

se midieron (en milímetros) con un vernier digital de precisión (Absolute, Mitutoyo,

Japón). Las cepas se agruparon como resistente, intermedio o susceptible a los

antibióticos, de acuerdo al criterio establecido por el CLSI (Becton Dickinson,

Heidelberg, Alemania) (cuadro 6).

Page 82: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

73

Cuadro 6. Antibióticos usados y valores de corte.

Diámetro del halo de inhibición (mm)

Categoría de antibiótico Antibiótico S I R

Beta lactamicos Ampicilina ≥17 14-16 ≤13

Cefalosporinas Cefotaxima ≥26 23-25 ≤22

Ceftazidima ≥21 18-20 ≤17

Aminogucosidos Gentamicina ≥15 13-14 ≤12

Tetraciclinas Tetraciclina ≥15 12-14 ≤11

Quinolonas y

Fluoroquinolonas

Ciprofloxacino ≥21 16-20 ≤15

Ácido nalidíxico ≥19 14-18 ≤13

Inhibidores de la vía del

folato

Trimetoprima-

sulfametoxazol

≥16 11-15 ≤10

Fenicoles Cloranfenicol ≥18 13-17 ≤12

Para determinar los fenotipos de resistencia adquirida, las cepas se

catalogaron como resistente o susceptibles a los antibióticos, cuando la bacteria

exhibió un resultado resistente o no al antibiograma. Por otro lado para categorizar

las cepas DEC en multi-fármaco resistentes (MDR) y extremadamente-fármaco

resistentes (XDR) se hizo de acuerdo a Magiorakos y colaboradores en el 2012

(183). Es decir si las cepas resultaron resistentes a ≥3 categorías diferentes de

antibióticos las cepas se clasificaron como MDR; o si las cepas resultaron

resistentes a ≥6 categorías diferentes de antibióticos se clasificaron como XDR.

Page 83: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

74

8.8. Determinación de grupos filogenéticos en E. coli

La clasificación filogenética de las cepas de E. coli se hizo con un primer

escrutinio mediante la detección por PCR punto final de los marcadores arpA,

chuA, yjaA y TspE4.C2 (400, 288, 211 y 152 pb, respectivamente). Las cepas que

requirieron un análisis adicional fue para aquellas cepas cuyo resultado preliminar

fue dicotómico: A o C, D o E y E o Clado I (184). Las reacciones se prepararon

con 12.5 µL de Go Taq Green Master Mix (Promega, Fitchburg, EUA), 1 µL de

cada oligonucleótido, 1µL del lisado bacteriano y agua estéril libre de nucleasas

c.b.p. 25 µL. La detección de los marcadores moleculares se hizo con las

siguientes condiciones: desnaturalización 4 min a 94º C, 30 ciclos de 5 s a 94º C,

alineamiento de 20 s a 57º C para el grupo E, o 59º C para el cuádruplex y grupo

C, extensión final de 5 min a 72º C. Los cebadores usados y el esquema para

asignar los filogrupos de las cepas fueron de acuerdo a lo establecido previamente

(184).

8.9. Análisis estadístico

Para el registro de información se construyó una base de datos en Excel y se

capturaron variables paramétricas como la edad, así como nominales como el

cuadro clínico (sano o con diarrea), tipo de E. coli (DEC o comensal), marcadores

filogenéticos (presencia/ausencia), genes típicos y accesorios de virulencia

(presencia/ausencia), perfil de susceptibilidad antimicrobiana (susceptible y

resistente) y fenotipos de resistencia adquirida (MDR y XDR). Se empleó la prueba

Page 84: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

75

de Kolmogorov-Smirnoff para evaluar la normalidad de la muestra y la prueba U

de Mann-Whitney para comparar las medias de la edad.

Las asociaciones entre las variables nominales se analizaron con la prueba

exacta de Fisher y/o chi cuadrada. Las diferencias en el puntaje de virulencia y el

nivel de citotoxicidad de las cepas de E. coli se determinó mediante análisis de

varianza de una vía. La significancia estadística se determinó cuando p≤0.05; los

análisis se hicieron con el programa IBM® SPSS® Statistics (versión 20, Armonk,

Nueva York, EUA); los gráficos se construyeron con el programa SigmaPlot

versión 12 (Systat software Inc., San José, California, EUA).

Page 85: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

76

IX. RESULTADOS

9.1. Aislamiento de E. coli

En este estudio se reclutaron un total de 317 niños de Sinaloa, México; de

éstos, 114 tuvieron diarrea y 203 fueron asintomáticos. La edad promedio de los

niños fue de 8.3 (±1.92) años.

A partir de las heces de los niños, se aislaron e identificaron con base en su

perfil bioquímico 317 cepas de E. coli, las que se confirmaron como E. coli a nivel

molecular, dado que todas exhibieron el amplicón de 584 pb, típico de esta

especie (173) (anexo 1).

9.2. La prevalencia de DEC fue de 18.6% en niños de Sinaloa, México,

siendo los patotipos EAEC y EPEC los más frecuentes.

La búsqueda mediante PCR, de los genes típicos de virulencia (anexo 2) en

las cepas de E.coli recuperadas (N=317), permitió identificar la presencia de

dichos genes en 18.6% de ellas, por lo que se categorizaron como DEC; el resto

de las cepas (81.4%) carecieron de tales genes típicos de virulencia, por lo que se

consideraron cepas no-DEC. De acuerdo a la condición clínica de los niños, se

observó una asociación significativa entre la presencia (p=0.004) de DEC con la

diarrea, dado que hubo una mayor proporción de este tipo de cepas en los niños

afectados en comparación con los sanos (27.2 y 13.8%, respectivamente) (cuadro

7).

Page 86: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

77

Cuadro 7. Distribución de E. coli y sus patotipos de acuerdo a la condición clínica de niños de Sinaloa, México.

Tipo E. coli Total

(n=317) (%)

Diarrea

(n=114) (%)

Asintomático

(n=203) (%)

P

No-DEC 258 (81.4) 83 (72.8) 175 (86.2) 0.004*

DEC 59 (18.6) 31 (27.2) 28 (13.8)

Patotipos DEC

tEAEC 13 (22.1) 8 (25.8) 5 (17.9) 0.001**

aEAEC 7 (11.8) 3 (9.7) 4 (14.3)

tEPEC 2 (3.4) 2 (6.5) 0 (0.0)

aEPEC 18 (30.5) 4 (12.9) 14 (50.0)

ETEC 10 (16.9) 10 (32.3) 0 (0.0)

DAEC 8 (13.6) 3 (9.7) 5 (17.9)

EIEC 1 (1.7) 1 (3.2) 0 (0.0)

* Valor de P calculado con la prueba de chi cuadrada de Pearson.

** Valor de P calculado con la prueba Exacta de Fisher.

Al analizar la distribución de los patotipos DEC de acuerdo a la condición

clínica de los niños, se observó que en los niños con diarrea exhibieron una mayor

variedad de patotipos DEC (n=7), en comparación con los niños asintomáticos

(n=4), aunque solo se observó una diferencia estadística en la asociación de

aEPEC y DAEC con los niños asintomáticos (cuadro 7).

Page 87: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

78

9.3. De acuerdo a los GSV, las cepas de E. coli se agruparon en tres

categorías, siendo las E. coli no-DEC con GSV las más frecuentes.

La búsqueda de genes suplementarios de virulencia (GSV; N=20: 12 que

codifican genes de colonización, 3 para citotoxinas y 5 para proteasas) (anexo 3)

entre las cepas de E. coli, permitió identificar la presencia de al menos un GSV en

90% de las cepas (n=279), en tanto que 31 cepas no exhibieron algún GSV. De

esta manera, las cepas de E. coli (N=310) se pudieron conformar en tres grupos:

cepas de E. coli DEC con GSV (n=58; 18.7%), cepas de E. coli no-DEC con GSV

(n=221; 71.3%) y E. coli no-DEC sin GSV (N=31; 10%). Al analizar la cantidad de

GSV presentes entre las cepas de E. coli, se observó que las cepas DEC aisladas

de niños con diarrea fueron las que exhibieron significativamente la mayor

(p=0.002) cantidad de GSV (8 y 9 GSV; 16.7 y 10%, respectivamente), en

comparación con las DEC aisladas de niños asintomáticos. Así mismo se observó

una asociación entre la presencia de 8-9 genes, mientras que hubo una mayor

proporción de no-DEC de niños con diarrea con 5 GSV (18.1%), en comparación

con las no-DEC de niños asintomáticos (5.2%). Por otro lado, las cepas DEC de

niños con diarrea exhibieron significativamente (P=0.001) una mayor proporción

de 5 y 6 GSV de colonización (46.7 y 13.3%, respectivamente), en comparación

con las DEC de niños asintomáticos (10.7 y 3.6%, respectivamente).

Las cepas no-DEC de niños con diarrea tuvieron significativamente una

mayor proporción de 1 GSV de proteasas (67.5%) en comparación con las no-

DEC de niños asintomáticos (8%); no se observaron diferencias significativas de

Page 88: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

79

los GSV que codifican citotoxinas entre las DEC y no-DEC, aisladas de niños con

diarrea o asintomáticos (Cuadro 8).

Page 89: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

80

Cuadro 8. GSV en E. coli aisladas de niños de Sinaloa, México.

Los valores de P se calcularon con la prueba Exacta de Fisher.

E. coli (N=310)

DEC (n=58)

No-DEC (n=252)

GSV (n=20) Diarrea (n=30)

No diarrea (n=28)

Diarrea (n=80)

No diarrea (n=172)

0 31 (10.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (1.3) 30 (17.4) Algún gen 279 (90.0) 30 (100.0) 28 (100.0) P 79 (98.8) 142 (82.6) P 1 42 (13.5) 0 (0.0) 3 (10.7) 0.002 1 (1.3) 38 (22.1) <0.001 2 33 (10.6) 1 (3.3) 1 (3.6) 10 (12.5) 21 (12.2) 3 39 (12.6) 2 (6.7) 1 (3.6) 15 (18.8) 21 (12.2) 4 40 (12.9) 0 (0.0) 4 (14.3) 11 (13.8) 25 (14.5) 5 56 (18.1) 5 (16.7) 9 (32.1) 25 (31.3) 17 (9.9) 6 33 (10.6) 5 (16.7) 8 (28.6) 8 (10.0) 12 (7.0) 7 17 (5.5) 8 (26.7) 0 (0.0) 3 (3.8) 6 (3.5) 8 11 (3.5) 5 (16.7) 1 (3.6) 3 (3.8) 2 (1.2) 9 6 (1.9) 3 (10.0) 1 (3.6) 2 (2.5) 0 (0.0) 10 1 (0.3) 1 (3.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 11 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (1.3) 0 (0.0)

Page 90: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

81

Los valores de P se calcularon con la prueba Exacta de Fisher.

Genes de colonización (n=12)

E. coli total (N=313)

Diarrea (n=30)

No diarrea (n=28)

Diarrea (n=83)

No diarrea (n=172)

0 40 (12.8) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (2.4) 38 (22.1) Algún gen 273 (87.2) P P 1 57 (18.2) 1 (3.3) 4 (14.3) 0.001 11 (13.3) 41 (23.8) 0.001 2 47 (15.0) 1 (3.3) 3 (10.7) 17 (20.5) 26 (15.1) 3 59 (18.8) 1 (3.3) 9 (32.1) 15 (18.1) 34 (19.8) 4 59 (18.8) 7 (23.3) 8 (28.6) 22 (26.5) 22 (12.8) 5 41 (13.1) 14 (46.7) 3 (10.7) 15 (18.1) 9 (5.2) 6 8 (2.6) 4 (13.3) 1 (3.6) 1 (1.2) 2 (1.2) 7 2 (0.6) 2 (6.7) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Genes de citotoxinas (N=3)

E. coli total (N=317)

Diarrea (N=31)

No diarrea (N=28)

P Diarrea (N=83)

No diarrea (N=175)

P

0 164 (51.7) 4 (12.9) 7 (25.0) 0.538 54 (65.1) 99 (56.6) 0.675 Algún gen 153 (48.3) 1 110 (34.7) 21 (67.7) 14 (50.0) 21 (25.3) 54 (30.9) 2 35 (11.0) 5 (16.1) 5 (17.9) 7 (8.4) 18 (10.3) 3 8 (2.5) 1 (3.2) 2 (7.1) 1 (1.2) 4 (2.3) Genes de proteasas (N=5)

E. coli total (N=314)

Diarrea (N=31)

No diarrea (N=28)

P Diarrea (N=80)

No diarrea (N=175)

P

0 205 (65.3) 12 (38.7) 17 (60.7) 0.187 16 (20.0) 160 (91.4) <0.001 Algún gen 109 (34.7) 1 92 (29.3) 16 (51.6) 8 (28.6) 54 (67.5) 14 (8.0) 2 14 (4.5) 3 (9.7) 3 (10.7) 7 (8.8) 1 (0.6) 3 3 (1.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (3.8) 0 (0.0)

Page 91: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

82

9.4. El 44% de GSV se asociaron con las cepas DEC, principalmente

los que codifican para factores de colonización y citotoxinas.

En relación al tipo de GSV entre las cepas de E. coli, se observó que los

genes de colonización ehaD, ehaA, kps, ehaC y ehaB fueron los más frecuentes

(54.9, 48.3, 45.9, 44.2 y 36.9%, respectivamente). De los genes que codifican para

citotoxinas, el gen espC fue el más prevalente (33.4%), en tanto que de los que

codifican para proteasas fueron los genes pic y eatA (14.3 y 13.9%,

respectivamente). Los genes sab y epeA no se identificaron en ninguna de las

cepas de E. coli analizadas. De los GSV presentes en las cepas, casi la mitad de

éstos (N=8/18; 44.4%) se asociaron significativamente con las cepas DEC; en

comparación con las E. coli no-DEC con GSV (Cuadro 9).

Page 92: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

83

Cuadro 9. Distribución de GSV en E. coli aisladas de niños en Sinaloa, México.

GSV E. coli (317) n (%)

DEC con GSV (59)

n (%)

No-DEC con GSV (224)

n (%) P

Colonización aida-1 4 (1.3) 1 (1.7) 3 (1.3) 1.000 Cah 25 (7.9) 6 (10.2) 19 (8.4) 0.195 ehaA 153 (48.3) 46 (78.0) 107 (47.1) <0.01 ehaB 117 (36.9) 21 (35.6) 96 (42.3) 0.376 ehaC 140 (44.2) 45 (76.3) 95 (41.9) <0.01 ehaD 174 (54.9) 40 (67.8) 134 (59.0) 0.235 tibA 10 (3.2) 0 (0.0) 10 (4.4) 0.224

efa/lifA 8 (2.5) 6 (10.2) 2 (0.9) 0.001 Kps 144 (45.9) 36 (61.0) 108 (48.2) 0.107 nleB 60 (19.1) 32 (54.2) 28 (12.5) <0.01

agg4A 6 (1.9) 5 (8.6) 1 (0.4) 0.002 Sab 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Citotoxinas espC 106 (33.4) 33 (55.9) 73 (32.2) 0.001 Pet 36 (11.4) 15 (25.4) 21 (9.3) 0.002 Sat 62 (19.6) 16 (27.1) 46 (20.3) 0.288

Proteasas eatA 44 (13.9) 12 (20.3) 32 (14.1) 0.310 espI 23 (7.3) 4 (6.8) 19 (8.4) 1.000 espP 22 (6.9) 2 (3.4) 20 (8.8) 0.270 Pic 45 (14.3) 18 (30.5) 27 (12.1) 0.001

epeA 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Los valores de P se calcularon con la prueba Exacta de Fisher.

En relación a la distribución de los GSV según el cuadro clínico de los

niños, se observó también que casi la mitad de los genes se asociaron con diarrea

(N=8/18; 44.4%), siendo los genes de colonización ehaA, ehaB, kps y agg4A los

que se asociaron con la diarrea; además, casi todos los genes que codifican para

las proteasas investigados aquí, se asociaron con la diarrea; sin embargo, ninguno

de los genes que codifican para citotoxinas se asociaron con dicha alteración

gastrointestinal (cuadro 10).

Page 93: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

84

Cuadro 10. Distribución de GSV de acuerdo a la condición clínica de los niños de Sinaloa, México.

GSV Diarrea (114) n (%)

Asintomático (203) n (%)

P

Colonización aida-1 0 (0.0) 4 (2.3) 0.156 Cah 12 (10.6) 13 (7.5) 0.396 ehaA 73 (64.6) 80 (46.2) 0.003 ehaB 74 (65.5) 43 (24.9) 0.000001 ehaC 56 (49.6) 84 (48.6) 0.904 ehaD 72 (63.7) 102 (59.0) 0.458 tibA 3 (2.7) 7 (4.0) 0.745

efa/lifA 6 (5.3) 2 (1.2) 0.063 Kps 74 (65.5) 70 (41.2) 0.000064 nleB 30 (26.5) 30 (17.6) 0.077

agg4A 5 (4.5) 1 (0.6) 0.039 Sab 0 (0.0) 0 (0.0)

Citotoxinas espC 41 (36.3) 65 (37.6) 0.900 Pet 9 (8.0) 27 (15.6) 0.068 Sat 22 (19.5) 40 (23.1) 0.557

Proteasas eatA 40 (35.4) 4 (2.3) <0.01 espI 20 (17.7) 3 (1.7) <0.01 espP 18 (15.9) 4 (2.3) 0.000041 Pic 26 (23.6) 19 (11.0) 0.005

epeA 0 (0.0) 0 (0.0) Los valores de P se calcularon con la prueba Exacta de Fisher.

Dado que casi la mitad de GSV se asociaron con las DEC, se analizó la

distribución de dichos genes entre los patotipos de E. coli identificados en este

trabajo. El gen aida-I únicamente se identificó en las cepas EAEC (5%), en tanto

que los genes efa/lifA y espI se identificaron solo en EAEC y EPEC. Sin embargo,

prácticamente todos los GSV estuvieron presentes en todos los patotipos de DEC

identificados, aunque el gen ehaB se asoció con ETEC, en tanto que el gen pic

con EAEC (cuadro 11).

Page 94: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

85

Cuadro 11. Distribución de GSV en cepas DEC aisladas de niños en Sinaloa, México.

GSV EAEC n (%)

EPEC n (%)

DAEC n (%)

ETEC n (%)

EIEC n (%)

P

Colonización aida-1 1 (5.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1.000

cah 4 (20.0) 1 (5.0) 1 (12.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0.357 ehaA 16 (80.0) 15 (75.0) 6 (75.0) 8 (80.0) 1 (100.0) 1.000 ehaB 5 (25.0) 8 (40.0) 0 (0.0) 7 (70.0) 1 (100.0) 0.008 ehaC 15 (75.0) 14 (70.0) 6 (75.0) 9 (90.0) 1 (100.0) 0.798 ehaD 15 (75.0) 14 (70.0) 4 (50.0) 6 (60.0) 1 (100.0) 0.707

efa/lifA 4 (20.0) 2 (10.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0.398 kps 14 (70.0) 11 (55.0) 3 (37.5) 7 (70.0) 1 (100.0) 0.472

nleB 12 (60.0) 10 (50.0) 4 (50.0) 6 (60.0) 0 (0.0) 0.880 agg4A 3 (15.8) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (20.0) 0 (0.0) 0.185

Citotoxinas espC 11 (55.0) 8 (40.0) 4 (50.0) 9 (90.0) 1 (100.0) 0.073

pet 5 (25.0) 7 (35.0) 3 (37.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0.199 sat 4 (20.0) 7 (35.0) 4 (50.0) 1 (10.0) 0 (0.0) 0.294

Proteasas eatA 4 (20.0) 5 (25.0) 1 (12.5) 2 (20.0) 0 (0.0) 0.974 espI 2 (10.0) 1 (5.0) 0 (0.0) 1 (10.0) 0 (0.0) 1.000

espP 1 (5.0) 1 (5.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1.000 pic 12 (60.0) 4 (20.0) 0 (0.0) 1 (10.0) 1 (100.0) 0.001

Los valores de P se calcularon con la prueba Exacta de Fisher.

Page 95: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

86

9.5. Las cepas de E. coli aisladas de niños con diarrea (DEC y no-DEC)

exhibieron un mayor puntaje de virulencia que las E. coli aisladas

de niños asintomáticos (DEC y no-DEC).

La determinación del puntaje de virulencia de las cepas reveló que el grupo

conformado por las DEC aisladas de niños con diarrea (n=30) fue el que exhibió el

mayor puntaje de virulencia y fue significativamente mayor con respecto a las DEC

recuperadas de niños asintomáticos (n=28) y de las E. coli no-DEC con GSV

aisladas de niños con y sin diarrea (n=79 y 142, respectivamente); de manera

similar, las cepas no-DEC con GSV aisladas de niños con diarrea tuvieron un

mayor puntaje de virulencia con respecto a este mismo tipo de cepas aunque

aisladas de niños asintomáticos; las cepas DEC aisladas de niños asintomáticos y

las E. coli no-DEC GSV de niños con diarrea exhibieron puntajes de virulencia

similares, por lo que no mostraron diferencias significativas entre estos grupos

(Figura 8).

Page 96: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

87

Figura 8. Comparación del puntajes de virulencia entre grupos de E. coli aisladas de niños con diarrea y asintomáticos.

Se compararon diferencias entre grupos de cepas DEC de niños con y sin diarrea así como no-DEC GSV aisladas de niños con y sin diarrea. La comparación se hizo mediante ANOVA de una vía basada en rangos.

Diarrea Asintomático Diarrea Asintomático

Pu

nta

je d

e v

iru

len

cia

0

1

2

3

4

5

6

DEC No-DEC GSV

*

*

*

*

*

Page 97: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

88

9.6. Las cepas DEC aisladas de niños con o sin diarrea, exhibieron

mayor citotoxicidad que las E. coli no-DEC

Dado que se observó que las cepas de niños con diarrea exhibieron un

mayor puntaje de virulencia en comparación con las aisladas de niños

asintomáticos, se hipotetizó que las primeras provoquen un mayor daño citotóxico.

Para ello se determinó el efecto citotóxico de algunas cepas DEC y no-DEC

aisladas de niños con/sin diarrea, con perfiles de GSV específicos. Los resultados

mostraron que las cepas DEC de niños con diarrea y asintomáticos fueron las que

provocaron mayor daño citotóxico, en comparación con las E. coli no-DEC

aisladas de cada caso clínico; las cepas de E. coli no-DEC de niños asintomáticos

y sin genes típicos de virulencia ni GSV no provocaron daño citotóxico (Figura 9).

Page 98: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

89

Figura 9. Citotoxicidad de E. coli aisladas de niños con diarrea y asintomáticos de Sinaloa, México.

En el ensayo se analizaron cinco cepas DEC con GSV aisladas de niños con diarrea (círculos negros), cuatro cepas DEC con GSV de niños asintomáticos (círculos grises), cinco cepas no-DEC con GSV de niños con diarrea (triángulos negros), cuatro cepas no-DEC con GSV de niños asintomáticos (triángulos grises) y cinco cepas no-DEC sin GSV de niños asintomáticos (diamantes blancos). Como controles se usaron E. coli HB101 y EHEC O157:H7. El perfil de GSV de cada cepa (sobre eje de las abscisas) se muestra con cuadros que indican la presencia de los genes (color gris) o ausencia de ellos (color blanco). Se inocularon en células HT29 y se cuantifico la LDH a través de la absorbancia a 490 nm, los datos fueron representados como el porcentaje de LDH en cada ensayo.

Page 99: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

90

Para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas del

daño citotóxico exhibido individualmente por las cepas de E. coli (Figura 9), se

conformaron los grupos DEC y no-DEC (aisladas de niños con/sin diarrea) y se

analizaron mediante ANOVA de una vía. El análisis mostró que el conjunto de

cepas DEC de niños con o sin diarrea fueron las que exhibieron mayor daño

citotóxico, seguido de los grupos de E. coli no-DEC con GSV de niños con o sin

diarrea; se observaron diferencias significativas entre todos los grupos, excepto

entre las DEC de niños con/sin diarrea y entre las no-DEC con GSV de niños

con/sin diarrea (Figura 10).

Figura 10. Citotoxicidad de grupos de E. coli aisladas de niños con diarrea y asintomáticos en Sinaloa, México.

Se evaluaron el grupo de cepas DEC (cuadro rojo) de niños con y sin diarrea (n=5 y 4, respectivamente); E. coli no-DEC con GSV (cuadro azul) de niños con y sin diarrea (n=5 y 4, respectivamente) y E. coli no-DEC de niños sin diarrea (n=5). Se inocularon en células HT29 y se cuantifico la LDH a través de la absorbancia a 490 nm, los datos fueron representados como el porcentaje de LDH en cada ensayo.

Diarrea Sin diarrea Diarrea Sin diarrea Sin diarrea

Cito

toxi

cida

d po

r LD

H (%

)

0

2

4

6

8

10

DEC No-DEC GSV

*

*

*

*

No-DEC sin GSV

*

Page 100: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

91

Puntaje de virulencia

0 1 2 3 4 5 6

Cito

toxi

cid

ad p

or

LD

H (

%)

0

2

4

6

8

10

Rヲ=ヰ.ヴヴヴ

┞=ヰ.8ヱヵン┝+ヱ.ヵヶヰン P = <ヰ.ヰヰヱ

No-DEC con GSV (diarrea)

No-DEC sin GSV (asintomático)

El análisis de regresión lineal determinó una relación directamente

proporcional (estadísticamente significativa) entre el puntaje de virulencia y el

daño citotóxico de dichas cepas, dado que en el grupo de cepas DEC aisladas de

niños con/sin diarrea fueron las que exhibieron mayor puntaje de virulencia y

mayor citotoxicidad; en tanto el grupo de las no-DEC con GSV (de niños con/sin

diarrea) se ubicaron tras el grupo DEC, mientras que el grupo de las E. coli no-

DEC sin GSV de niños asintomáticos no causaron daños citotóxicos (Figura 11).

Figura 11. Regresión lineal entre el puntaje de virulencia de cepas de E. coli aisladas de niños con/sin diarrea y el porcentaje de citotoxicidad.

El análisis de regresión consideró cepas DEC aisladas de niños con diarrea y asintomáticos (círculos negros y grises, respectivamente), cepas no-DEC con GSV aisladas de niños con diarrea y asintomáticos (triángulos negros y grises, respectivamente) y cepas no-DEC sin GSV aisladas de niños asintomáticos (diamantes).

DEC con GSV (diarrea)

DEC con GSV (asintomático)

No-DEC con GSV (asintomático)

Page 101: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

92

9.7. Perfil de susceptibilidad a antimicrobianos

Se evaluó la susceptibilidad de las cepas DEC (n=59) a 9 antibióticos, los

que pertenecen a 7 categorías de antimicrobianos. Los resultados mostraron que

prácticamente todas las cepas DEC exhibieron resistencia a algún antimicrobiano

(n=54; 91.5%), siendo la resistencia a dos y cuatro antibióticos las más frecuentes

(18.6% cada uno); la resistencia de las DEC´s hacia algún antibiótico fue similar

en las aisladas de niños con diarrea o asintomáticos (87.1 y 96.4%,

respectivamente), por lo que no hubieron diferencias significativas a los

antibióticos. Las cepas DEC de niños con diarrea exhibieron resistencia

principalmente a cuatro y cinco antibióticos, en tanto que las recuperadas de niños

asintomáticos, la resistencia más frecuente fue a tres antibióticos (cuadro 13).

Del total de DEC (n=59), se encontró que el 59.3% de las cepas resultaron

resistentes a tetraciclinas, el 54.2% resistentes a ácido nalidíxico, seguido de

Trimetoprima-sulfametoxazol con 52.5%, ampicilina y cefotaxima con 50.8% cada

uno; Por otro lado se observó una mayor proporción significativa de resistencia a

la tetraciclina y ampicilina (40.7 y 35.6%, respectivamente) en cepas DEC aisladas

de niños con diarrea, en comparación a las recuperadas de niños asintomáticos;

por el contrario, una mayor proporción significativa de resistencia a la ceftazidima

(10.2%) se observó en las DEC aisladas de niños asintomáticos, en comparación

con las obtenidas de niños con diarrea (3.4%).

Con respecto a los resultados de resistencia a antibióticos con relación a los

patotipos de DEC las cepas EPEC (n=20) el 70% resultaron resistentes a ácido

Page 102: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

93

nalidíxico, seguido de tetraciclinas y trimetoprima-sulfametoxazol con un 50 y 45 %

respectivamente; por otro lado las cepas EAEC (n=20) resultaron resistentes a

ácido nalidíxico, trimetoprima-sulfametoxazol y tetraciclina cada una con un 60%.

De acuerdo a las definiciones de resistencia adquirida (183) y en base a los

datos expuestos anteriormente, se logró clasificar el total de las cepas DEC (n=59)

en MDR y XDR con un 47.4% y 8.5% respectivamente; con respecto a los

patotipos del total de EAEC (n=20) el 50%, EPEC (n=20) el 45%, DAEC (n=8)

50% y EIEC (n=1) 100% de las cepas resultaron MDR y con respecto DAEC (n=8)

el 37.5% de las cepas resultaron XDR. Por otro lado hubo dos cepas DEC que

resultaron resistentes a 7 y 8 antibióticos las cuales pertenecieron al patotipo

EPEC (cuadro 13).

Page 103: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

94

Cuadro 12. Resistencia a categorías de antimicrobianos de cepas DEC aisladas de niños con diarrea y asintomáticos en Sinaloa, México.

Resistencia a antimicrobianos de cepas DEC aisladas de niños con diarrea y asintomáticos Categoría

/Antibiótico Cepas totales aisladas DEC=59 Patotipos DEC resistentes n (%)

EAEC 20 (33.9)

EPEC 20 (33.9)

DAEC 8 (13.6)

ETEC 10 (16.9)

EIEC 1 (1.7)

D A Total D A Total D A Total D A Total D A Total D A Total

31 (52.5) 28 (47.5) 59 (100) 11

(55.0) 9

(45.0) 20

(100) 6

(30.0) 14

(70.0) 20

(100) 3

(37.5) 5

(62.5) 8 (100)

10 (100)

0 (0.0)

10 (100)

1 (100) 0 (0.0)

1 (100)

Aminoglucósidos Gentamicina 6 (10.2) 7 (11.9) 13 (22.0) 1

(9.1) 2

(22.2) 3

(15.0) 2

(33.3) 5

(35.7) 7

(35.0) 2

(66.7) 0 (0.0) 2

(25.0) 1

(10.0) 0

(0.0) 1

(10.0) 0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

Quinolonas y fluoroquinolonas

Ciprofloxacina

3 (5.1)

2 (3.4) 5 (8.5) 1

(9.1) 0

(0.0) 1

(5.0) 1

(16.7) 2

(14.3) 3

(15.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

1 (10.0)

0 (0.0)

1 (10.0)

0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

Ácido nalidíxico 13 (22.0) 19 (32.2) 32 (54.2)

8 (72.7)

4 (44.4)

12 (60.0)

2 (33.3)

12 (85.7)

14 (70.0)

2 (66.7)

3 (60.0)

5 (62.5)

1 (10.0)

0 (0.0)

1 (10.0)

0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

Sulfonamidas y sulfonamidas potenciadas

trimetoprima-Sulfametoxazol

18 (30.5) 13 (22) 31 (52.5) 8 (72.7)

4 (44.4)

12 (60.0)

5 (83.3)

4 (28.6)

9 (45.0)

3 (100.0)

5 (100.0)

8 (100) (10.0) 0 (0.0)

10 (100)

1 (100.0)

0 (0.0)

1 (100.0)

Tetraciclinas Tetraciclina

24 (40.7)* 11 (18.6) 35 (59.3)

8 (72.7)

4 (44.4)

12 (60.0)

6 (100.0)

4 (28.6)

10 (50.0)

3 (100.0)

3 (60.0)

6 (75.0)

6 (60.0)

0 (0.0)

6 (60.0)

1 (100.0)

0 (0.0)

1 (100.0)

Beta lactámicos Ampicilina

21 (35.6)*

9 (15.3) 30 (50.8) 7

(63.6) 2

(22.2) 9

(45.0) 6

(100.0) 3

(21.4) 9

(45.0) 2

(66.7) 4

(80.0) 6

(75.0) 5

(50.0)

0 (0.0)

5 (50.0)

1 (100.0)

0 (0.0)

1 (100.0)

Cefalosporinas Ceftazidima

2 (3.4) 6 (10.2)** 8 (13.5) 0

(0.0) 1

(11.1) 1

(5.0) 2

(33.3) 4

(28.6) 6

(30.0) 0 (0.0)

1 (20.0)

1 (12.5)

0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

Cefotaxima 11 (18.6) 19 (32.2) 30 (50.8)

3 (27.3)

5 (55.6)

8 (40.0)

4 (66.7)

9 (64.3)

13 (65.0)

2 (66.7)

5 (100.0)

7 (87.5)

2 (20.0)

0 (0.0)

2 (20.0)

0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

Fenicoles Cloranfenicol 6 (10.2) 3 (5.1) 9 (15.2)

1 (9.1)

0 (0.0)

1 (5.0)

1 (16.7)

1 (7.1) 2

(10.0) 1

(33.3) 2

(40.0) 3

(37.5) 2

(20.0) 0

(0.0) 2

(20.0) 1

(100.0) 0

(0.0) 1

(100.0)

Sensible 4 (12.9) 1 (3.6) 5 (8.5) 1

(9.1) 1

(11.1) 2

(10.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

3 (30.0)

0 (0.0)

3 (30.0)

0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

Resistente a algún ant. 27 (87.1) 27 (96.4) 54 (91.5)

10 (90.9)

8 (88.9)

18 (90.0)

6 (100.0)

14 (100.0)

20 (100.0)

3 (100.0)

5 (100.0)

8 (100.0)

7 (70.0)

0 (0.0)

7 (70.0)

1 (100.0)

0 (0.0)

1 (100.0)

MDR 17 (54.8) 11 (39.3) 28 (47.5) 5

(45.5) 5

(55.6) 10

(50.0) 5

(83.3) 4

(28.6) 9

(45.0) 2

(66.7) 2

(40.0) 4

(50.0) 4

(40.0) 0

(0.0) 4

(40.0) 1

(100.0) 0

(0.0) 1

(100.0)

XDR 2 (6.5) 3 (10.7) 5 (8.5) 1

(9.1) 0

(0.0) 1

(5.0) 0 (0.0) 1 (7.1) 1 (5.0)

1 (33.3)

2 (40.0)

3 (37.5)

0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

0 4 (12.9) 1 (3.6) 5 (8.5) 1

(9.1) 1

(11.1) 2

(10.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

3 (30.0)

0 (0.0)

3 (30.0)

0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

1 2 (6.5) 4 (14.3) 6 (10.2) 0

(0.0) 3

(33.3) 3

(15.0) 0 (0.0) 1 (7.1) 1 (5.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

2 (20.0)

0 (0.0)

2 (20.0)

0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

2 5 (16.1) 6 (21.4) 11 (18.6) 4

(36.4) 0

(0.0) 4

(20.0) 0 (0.0)

6 (42.9)

6 (30.0)

0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1

(10.0) 0

(0.0) 1

(10.0) 0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0)

3 3 (9.7) 7 (25.0) 10 (16.9) 0

(0.0) 2

(22.2) 2

(10.0) 1

(16.7) 3

(21.4) 4

(20.0) 0 (0.0)

2 (40.0)

2 (25.0)

2 (20.0)

0 (0.0)

2 (20.0)

0 (0.0) 0

(0.0) 0 (0.0)

Page 104: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

95

4 7 (22.6) 4 (14.3) 11 (18.6) 2 (18.2)

2 (22.2)

4 (20.0)

2 (33.3)

2 (14.3)

4 (20.0)

1 (33.3)

0 (0.0) 1 (12.5)

1 (10.0)

0 (0.0)

1 (10.0)

1 (100.0)

0 (0.0)

1 (100.0)

5 7 (22.6) 2 (7.1) 9 (15.3) 3 (27.3)

1 (11.1)

4 (20.0)

2 (33.3)

0 (0.0) 6 (30.0)

1 (33.3)

1 (20.0)

2 (25.0)

1 (10.0)

0 (0.0)

1 (10.0)

0 (0.0) 0 (0.0)

0 (0.0)

6 2 (6.5) 3 (10.7) 5 (8.5) 1 (9.1)

0 (0.0)

1 (5.0)

0 (0.0) 1 (7.1) 1 (5.0) 1 (33.3)

0 (0.0) 1 (12.5)

0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0) 0 (0.0)

0 (0.0)

7 1 (3.2) 0 (0.0) 1 (1.7) 0

(0.0) 0

(0.0) 0

(0.0) 1

(16.7) 0 (0.0) 1 (5.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0) 0 (0.0)

0 (0.0) 0 (0.0)

8 0 (0.0) 1 (3.6) 1 (1.7) 0

(0.0) 0

(0.0) 0

(0.0) 0 (0.0) 1 (7.1) 1 (5.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0) 0 (0.0)

0 (0.0) 0 (0.0)

D= Diarrea; A= Asintomático; ant= antibiótico. *p<0.05 con respecto a cepas DEC de niños asintomáticos; **p<0.05 con respecto a cepas DEC de niños con diarrea; MDR= Multifarmacoresistente, resistente ≥ 3 diferentes categorías de antibióticos; XDR= Extremadamente farmacoresistente ≥ 6 diferentes categorías de antibióticos. Los valores de P se calcularon con la prueba Exacta de Fisher.

Page 105: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

96

9.1. Filogenia de E. coli aisladas de niños de Sinaloa

De acuerdo al esquema de clasificación filogenética, las cepas de E. coli

pueden ubicarse en 7 filogrupos mediante la presencia/ausencia de los

marcadores moleculares; la figura 12 muestra un gel representativo de los

principales marcadores amplificados en las cepas de E. coli analizadas.

Figura 12. Grupos filogenéticos representativos de E. coli aisladas en Sinaloa, México. La imagen representa un gel de agarosa al 2% teñido con el colorante gel Red 1000X, la imagen fue captada por un fotodumentador de luz U.V. Carril: 1, gen arpA en E. coli A08; 2, genes arpA + TspE4.C2 en E. coli B10; 3, gen chuA en E. coli A64; 4, genes chuA + yjaA en E. coli A34; 5, genes arpA + yjaA en E. coli C80; 6, genes arpA + chuA en E. coli C12. MPM: marcador de peso molecular; pb: pares de bases.

MPM 1 2 3 4 5 6

A B1 F B2 A o C D o E

Page 106: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

97

Del total de cepas de E. coli (N=317), más de la mitad pertenecieron al

grupo A, (53.9%), seguido de los grupos B1 y D (13.9% cada uno) (Cuadro 14).

Cuadro 13. Distribución de los grupos filogenéticos de E. coli aisladas de niños de Sinaloa, México.

Grupo filogenético n (%)

A 171 (53.9)

B1 44 (13.9)

B2 11 (3.5)

C 15 (4.7)

D 44 (13.9)

E 5 (1.6)

F 6 (1.9)

Clado I 9 (2.8)

Clado I-II 1 (0.3)

Desconocido 11 (3.5)

Total 317 (100.0)

Page 107: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

98

La distribución de los filogrupos entre los diferentes grupos de E. coli de

acuerdo a la presencia de GSV, reveló que más de la mitad de las cepas DEC y

no-DEC pertenecieron al filogrupo A, en tanto que el filogrupo D fue el segundo

más frecuente entre las cepas DEC (18.6%). El filogrupo B1 fue el segundo más

frecuente entre las cepas no-DEC con GSV y las cepas no-DEC sin GSV (15.4 y

9.7%, respectivamente) (Cuadro 15).

Cuadro 14. Grupos filogenéticos de acuerdo a los GSV de E. coli aisladas de niños en Sinaloa, México.

Grupo filogenético DEC con GSV n (%)

No-DEC con GSV n (%)

No-DEC sin GSV n (%)

A 34 (57.6) 118 (52.0) 19 (61.3) D 11 (18.6) 31 (13.7) 2 (6.5) B1 6 (10.2) 35 (15.4) 3 (9.7) C 3 (5.1) 11 (4.8) 1 (3.2)

Clado I 3 (5.1) 5 (2.2) 1 (3.2) E 1 (1.7) 3 (1.3) 1 (3.2) F 0 (0.0) 5 (2.2) 1 (3.2)

B2 1 (1.7) 10 (4.4) 0 (0.0) Clado I-II 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (3.2)

Desconocido 0 (0.0) 9 (4.0) 2 (6.5) Total 59 (100.0) 227 (100.0) 31 (100.0)

De acuerdo a la condición clínica, más de la mitad de cepas de E. coli

aisladas de niños con diarrea o asintomáticos pertenecieron al filogrupo A, aunque

en proporciones similares (57 y 52.2%, respectivamente); de igual manera las

proporciones del filogrupo B1 fueron similares (10.5 y 15.8%, respectivamente) de

E. coli aisladas de niños con o sin diarrea. Sin embargo, se observó una mayor

proporción de cepas de E. coli aisladas de niños con diarrea dentro del filogrupo D

con respecto a la de niños asintomáticos (19.3 y 10.8%, respectivamente) (cuadro

16).

Page 108: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

99

Cuadro 15. Grupos filogenéticos de E. coli aisladas de niños de Sinaloa, México, de acuerdo a la condición clínica.

Grupo filogenético Niños con diarrea n (%)

Niños asintomáticos n (%)

P

A 65 (57.0) 106 (52.2) 0.028 D 22 (19.3) 22 (10.8) B1 12 (10.5) 32 (15.8)

Clado I 5 (4.4) 4 (2.0) F 3 (2.6) 3 (1.5)

B2 3 (2.6) 8 (3.9) Clado I-II 0 (0.0) 1 (0.5)

Desconocido 0 (0.0) 11 (5.4) C 3 (2.6) 12 (5.9) E 1 (0.9) 4 (2.0)

Total 114 (100.0) 203 (100.0) Los valores de P se calcularon con la prueba Exacta de Fisher.

Page 109: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

100

X. DISCUSIÓN

De acuerdo a la Secretaría de Salud, desde hace más de tres décadas la

diarrea de etiología infecciosa ha sido la segunda causa de morbilidad que aqueja

a los mexicanos, solo detrás de las infecciones de vías respiratorias (136). En

Sinaloa, esta tendencia es semejante, siendo los infantes menores de 5 años el

grupo de edad más afectado por dicha enfermedad (136). El grupo que estudia la

carga global de enfermedades, informó que durante 2016, el rotavirus fue el

agente etiológico líder de diarrea infecciosa, de 13 agentes infecciosos

reconocidos como los más prevalentes. De estos, más de la mitad son bacterias

(61.5%), seguidas de los virus y protozoarios (23 y 15.3%, respectivamente).

Dentro de las bacterias, Shigella fue la que causó más muertes, seguida de V.

cholerae (212,438 y 107,290 casos, respectivamente). De las E. coli

diarreogénicas, ETEC y EPEC figuran dentro de estos agentes bacterianos, las

que causaron 51,186 y 12,337 muertes en aquél año (4).

Esta tendencia también se ha presentado en México, siendo ETEC la de mayor

prevalencia, seguida de EAEC y EPEC (185). Sin embargo, en México, hay

escasos estudios sobre E. coli causante de diarrea en el grupo de edad de 6-12

años, aunado al perfil biológico de dichas bacterias recuperadas de casos con

diarrea y asintomáticos. En este trabajo se determinó que la prevalencia general

de DEC en niños de Sinaloa fue de 18.6%, aunque la encontrada en niños con

diarrea fue mayor significativamente (27.2%) con respecto a la encontrada en

niños asintomáticos (13.8%) (p<0.05; cuadro 7). El estudio publicado previamente

por nuestro grupo de trabajo, reportó que entre los casos de diarrea analizados

Page 110: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

101

(N=1,037), la mayor prevalencia de DEC se observó enlos menores de 2 años

(26%) y fue mayor significativamente con respecto a los otros grupos de edad

analizados (172). Esta tendencia fue similar a lo reportado en un estudio en

menores de 5 años en el sureste mexicano, donde la prevalencia de DEC´s fue

similar en infantes de zonas rural y urbana (19.1 y 13.8%, respectivamente),

siendo EAEC el patotipo más frecuente, seguido de EPEC (7.9 y 5.6%,

respectivamente)(186). También en el sureste mexicano, en Yucatán, México, se

reportó una prevalencia de DEC´s de 28%, incluso por encima de los

enteropatógenos Salmonella y Shigella (12 y 9%, respectivamente); los patotipos

DAEC, EAEC y EPEC (35, 24 y 19%, respectivamente) fueron los más prevalentes

(85). Otro trabajo de casos y controles hecho en Brasil, informó que la prevalencia

de DEC´s en niños con diarrea superó a la de los controles (25.4 y 18.7%,

respectivamente). Además, informaron que los patotipos EAEC y aEPEC fueron

los más prevalentes (10.7 y 9.4%, respectivamente), sin embargo, estos patotipos

se aislaron en proporciones similares entre los casos y controles (187).

Por otro lado, un trabajo que investigó la presencia de DEC´s en niños

menores de 2 años de la ciudad de México con y sin diarrea, reveló una mayor

prevalencia de este tipo de bacterias entre los niños asintomáticos en

comparación con quienes padecieron diarrea (73 y 27%, respectivamente), los

diferentes patotipos aislados fueron más prevalentes (significativamente) entre los

niños sanos que los que tuvieron diarrea; las cepas aEPEC se asociaron con

episodios de diarrea en los menores de 12 meses (188). Un reporte reciente sobre

el análisis de cepas DEC´s recuperadas en Brasil durante 6 años (2011-2016),

Page 111: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

102

mostró que la prevalencia de estos patógenos fue de 13.7% (n=693/5,047

muestras de heces), siendo los más frecuentes EPEC y EAEC (52.6 y 32.5%,

respectivamente); de las cepas EPEC, prácticamente todas se clasificaron como

atípicas (189). Otro informe en el que se analizaron heces de niños hospitalizados

con diarrea en China, mostró que la prevalencia de DEC fue de 7.9%, siendo

nuevamente EPEC el patotipo más frecuente (50%) y de las cuales la subvariante

dominante fue también EPEC atípica (77.8%) (190). Otro estudio hecho en niños

peruanos de comunidades rurales, reveló que no hay diferencias significativas en

la prevalencia de DEC entre los casos y controles (50 y 42.6%, respectivamente);

sin embargo, la diferencia únicamente se observó con el patotipo EPEC (19.6 y

9.2% para los casos y controles, respectivamente) (191).Por otro lado, Devi,

Durairaj (192) mostraron en personas menores de 18 años en la India, una mayor

prevalencia de DEC´s en pacientes con diarrea que los controles (22.94 y 6.39%,

respectivamente); la prevalencia de EPEC y EAEC fue también mayor entre los

casos (10 y 8.82%, respectivamente) que en los controles (4.26 y 2.13%,

respectivamente); las cepas típicas de EPEC únicamente se recuperaron entre los

casos (4.12%), en tanto que la prevalencia de EPEC atípica fue también mayor

entre los casos que en los controles (5.88 y 4.26%, respectivamente).

Los patotipos EAEC y EPEC fueron los de mayor prevalencia en este trabajo

(33.1% cada uno), tendencia que fue señalada por los trabajos citados arriba.

Además, se encontró una asociación entre aEPEC y DAEC con la infección

asintomática (cuadro 7). Este hallazgo también se observó en niños sanos de la

Page 112: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

103

ciudad de México, entre quienes la prevalencia de aEPEC fue de 75%, en

comparación con la encontrada en niños con diarrea (25%) (188).

La elevada prevalencia de EAEC y EPEC (por encima de otros patotipos)

registrada en el presente estudio, así como en otras regiones del mundo, pudiera

obedecer a la plasticidad genómica que se ha observado particularmente en estas

variantes patógenas y que han favorecido la aparición de brotes importantes; por

ejemplo el serotipo O104:H4 de EAEC (con genes de EAEC y STEC) que causó

46 muertes, 782 casos de síndrome urémico hemolítico y 3,128 casos de

gastroenteritis aguda en Alemania durante el 2011 (193). Un fenómeno similar

ocurre en EPEC, dado que comparten características como serotipos, adherencia

y factores de virulencia con las cepas EHEC (194). Aunado a ello, se ha reportado

que el plásmido EAF (codifica para el pilus bfp en EPEC) puede transmitirse de

cepas EPEC típicas a las atípicas mediante conjugación (195). Dado que EAEC y

EPEC fueron los patotipos más frecuentes en este trabajo, sería deseable

determinar otros rasgos de virulencia como el patrón de adherencia a células

epiteliales, que para las cepas EAEC se hipotetiza exhiban un fenotipo agregativo,

en tanto que para las cepas EPEC atípicas un patrón semejante al localizado

(196).

Este trabajo mostró que los patotipos EAECt y ETEC se asociaron con diarrea.

Resultados similares fueron reportados en un estudio hecho en niños de Mongolia,

en quienes la prevalencia de cepas EAEC típicas (aggR+) fue mayor

significativamente en aquellos con diarrea con respecto a los asintomáticos (8.0 y

1.4%, respectivamente); esta diferencia no se observó con las cepas EAEC

Page 113: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

104

atípicas (con diarrea: 7.1%, asintomáticos: 4.3%) (197). Las cepas EAEC también

ocasionan diarrea aún en países desarrollados. Un trabajo hecho en niños suizos

menores de 16 años mostró una mayor prevalencia de EAEC en niños con diarrea

(10.2%) que en aquellos asintomáticos (2.2%) (198). Sin embargo, un reporte de

casos y controles en niños de 2-36 meses de edad en Brasil, informó que la

prevalencia de EAEC fue igual en ambos grupos (41.0%) (120).

Como se mostró en los resultados expuestos en el presente trabajo, las

cepas ETEC únicamente se aislaron de niños con diarrea (32.3%; cuadro 7).

Resultados similares fueron reportados en el estudio mencionado previamente, en

niños con diarrea menores de 2 años de la ciudad de México, en quienes la

prevalencia de este patotipo fue de 29%; sin embargo, entre los niños sanos la

prevalencia fue mayor (71%); aquellos autores reportaron que la mayor parte de

cepas aisladas solo exhibió el gen lt, lo que quizá explique tales diferencias (188).

En contraste, otro estudio hecho con 177 estudiantes americanos que viajaron a

México, mostró que 33.9% de ellos desarrollaron diarrea del viajero debido a

cepas ETEC con el gen lt, en tanto que solo 5.1% de los casos fueron causados

por ETEC con el gen st; la mayoría de estos pacientes mostraron la presencia de

anticuerpos IgG anti-lt (74.1%) (199).

Para evaluar los perfiles de virulencia de genes suplementarios entre

ambos grupos de cepas DEC aisladas de niños con y sin diarrea, se buscó la

presencia de 20 GSV, principalmente aquellos que codifican factores de

colonización (n=12), seguido de toxinas (n=3) y proteasas (n=5). Los resultados

revelaron que todas las cepas DEC (aisladas de niños con y sin diarrea) tuvieron

Page 114: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

105

al menos un gen o más GSV, en tanto que la mayoría de cepas no-DEC aisladas

de niños con y sin diarrea (98.8 y 82.6%, respectivamente), tuvieron algún GSV.

De las 310 cepas analizadas, la mayoría albergó cinco GSV, seguidas de las

cepas con seis GSV (18.1 y 10.6%, respectivamente). Las cepas DEC aisladas de

niños con diarrea exhibieron la mayor cantidad de GSV (ocho, nueve y diez genes)

y esta diferencia fue significativa con respecto a las DEC aisladas de niños sin

diarrea (cuadro 10). El análisis ANOVA usado para analizar todas las cantidades

de GSV encontrados en las cepas de E. coli aisladas de niños con y sin diarrea,

permitió corroborar que las cepas DEC aisladas de niños con diarrea tuvieron el

mayor puntaje de virulencia, en comparación con las no-DEC aunque éstas

hubieran tenido GSV (Figura 8). Un reporte en el que se analizaron 20 genes de

virulencia (incluyendo adhesinas, sideróforos, protectinas y toxinas) en 280 cepas

de E. coli aisladas de sujetos sanos de ≥18 años de edad, residentes de París,

determinó un puntaje de virulencia promedio de 5.9, encontrando cepas desde

cero hasta un puntaje de 17, encontrando además que el puntaje de las cepas que

pertenecieron al filogrupo B2 fue mayor con respecto a los otros, en tanto que las

cepas del filogrupo D exhibieron un mayor puntaje significativo, con respecto a los

filogrupos A y B1(200). Otro trabajo en el que se analizaron 394 aislados clínicos

de E. coli recuperados de pacientes europeos, se categorizaron en tres grupos por

su capacidad de formar biopelículas: G1 (fuerte), G2 (moderado) y G3 (débil); tras

determinar la presencia de factores de virulencia que codifican adhesinas (n=8),

toxinas (n=7), sideróforos (n=5), capsulares (n=5) y funciones misceláneas (n=7),

encontraron que los aislados del G1 tuvieron un mayor puntaje de virulencia que el

G3 (201). El hecho de que cepas comensales de E. coli alberguen genes de

Page 115: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

106

virulencia, sugiere que pueden fungir como reservorio de esta carga génica que

puede transmitirse a cepas de E. coli patógenas (200). La mayor cantidad de GSV

exhibido por las cepas DEC y reflejada en un mayor puntaje de virulencia, quedó

demostrado in vivo al observar que las cepas DEC de niños con diarrea (con el

mayor puntaje de virulencia) causaron la mayor citotoxicidad significativa sobre

células HT-29, en comparación con las no-DEC aisladas de casos de diarrea o no

(Figuras 9 y 10); de hecho, se observó una relación directamente proporcional

entre el puntaje de virulencia con la citotoxicidad (Figura 11). De manera similar, el

análisis de 174 cepas de E. coli (81 procedentes de muestras clínicas y de

alimentos y 93 del medio ambiente), reveló que la mayoría de los aislados clínicos

y alimentos (97%) y menos de la mitad de las del medio ambiente (41%) causaron

daños citotóxicos sobre células Vero; aquellos investigadores encontraron que la

citotoxicidad se relacionó con la presencia de genes stx y en menor medida del

gen hly(202).

Algunos de los estudios que han determinado la cantidad y tipo de genes de

virulencia entre cepas de E. coli se mencionan a continuación. Un trabajo en el

que se buscaron seis genes de virulencia en 103 cepas UPEC y 70 cepas DEC

aisladas de pacientes que acudieron a clínicas ambulatorias en Egipto, reportó

que las UPEC exhibieron los seis genes de virulencia, en tanto que las DEC hasta

cuatro genes; el gen fimH, que codifica una adhesina, fue el más prevalente en

aquellos patógenos (66.9 y 91.4%, respectivamente) (203). Un estudio hecho en

Irán con 126 cepas UPEC aisladas de casos clínicos atendidos en hospitales,

mostró que más de la mitad de las cepas tuvieron cuatro genes de virulencia,

Page 116: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

107

siendo los genes fimH y sfaque codifican adhesinas, los más prevalentes (99.2 y

79.4%, respectivamente) (204). Otro reporte mostró esta misma tendencia

respecto a una mayor cantidad de genes de patogenicidad en cepas recuperadas

de casos de enfermedad; por ejemplo, el gen lpfAO157/H54 y aquellos involucrados

en la fijación de hierro iucA, fep e irp-2 fueron más prevalentes en E. coli patógena

aviar (APEC) con respecto a las E. coli aisladas de pollos sanos (205).

Respecto al tipo de GSV hallados en este trabajo, los genes de colonización

asociados con DEC fueron ehaA, ehaC, efa/lifA, nleB y agg4A (cuadro 9), en tanto

que los asociados con diarrea fueron ehaA, ehaB, kps y agg4A (cuadro 10). En

otro trabajo, un análisis in silico identificó la presencia del gen ehaA tanto en cepas

comensales y cepas DEC (206). Una prevalencia similar de efa/lifA (13.6%) fue

reportada en cepas de E. coli aisladas de niños menores de 5 años con diarrea en

Nairobi, Kenia (207). Un estudio de casos (n=251) y controles (n=210) en niños

menores de 5 años de Noruega, reveló que la presencia del gen efa/lifA en cepas

aEPEC, se asoció fuertemente con diarrea (p=0.0008), además del gen nleB

(208). En nuestro trabajo se encontró además que el gen efa/lifA estuvo presente

únicamente en cepas EAEC y EPEC (20 y 10%, respectivamente; cuadro 11). De

manera similar, el estudio de Makobe, Sang (207) reveló que la mayor prevalencia

de este gen se observó en EPEC y ETEC, seguidos de EAEC, STEC y EIEC. La

presencia de efa/lifA en distintos patotipos DEC probablemente obedezca a los

mecanismos de transferencia genética de dicho gen desde la isla de

patogenicidad (207). Por otro lado, en esta tesis se mostró que el gen agg4A, otro

de los GSV implicados en colonización, se asoció con la presencia de diarrea

Page 117: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

108

(cuadro 10). En contraste, un estudio de casos y controles en Brasil reportó una

asociación del gen agg4A con las cepas de EAEC aisladas de niños sin diarrea

(120).

La presencia del gen agg4A en el patotipo ETEC reportada aquí, pudiera

deberse a los mecanismos de transmisión horizontal que se han observado entre

cepas de E. coli, como la cepa Stx-EAEC O59: NMH19 reportada en Argentina, un

híbrido que comparte genes de STEC (stx2a, iha, lpfO26, lpfO113) y EAEC

(aggR, aatA, aap, pic, pet, sigA y agg4A) (209).

En cuanto a los genes que codifican toxinas y proteasas, los genes espC y

pet se asociaron con las DEC, en tanto que de las proteasas, únicamente el gen

pic se asoció con este patógeno (cuadro 9). Un estudio en cepas de E. coli

aisladas de 831 niños en Yucatán, mostró que la proporción de los genes aatA,

astA, pet y cdt fue más alta en cepas DEC que las no-DEC (36 y 26%,

respectivamente) (85). De los genes que codifican proteasas, los genes eatA,

espI, espP y pic se asociaron con diarrea. En el estudio reportado por Restieri,

Garriss (210) se hizo notar también una asociación entre el gen espC y las cepas

de E. coli diarreogénicas. De manera similar, un trabajo de casos y controles en

Brasil también asoció la presencia de pet entre los casos de diarrea (Nunes Lima,

2013). Entre los patotipos DEC, el gen sat se encontró con mayor prevalencia en

DAEC (50%), seguido de EPEC, EAEC y ETEC (cuadro 11). El gen sat se

describió primeramente en cepas UPEC y codifica la proteína Sat, que pertenece

a la familia SPATE y con actividad citopática sobre células Vero, Hep-2 y HK-2 de

vejiga (211). La distribución heterogénea de sat en varios de los patotipos DEC

Page 118: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

109

detectados en este trabajo, es similar a lo reportado por Boisen, Ruiz-Perez (181),

quienes registraron la presencia de este gen principalmente en EAEC (74.5%),

aunque también en DAEC, EHEC y E. coli no patógena (30.0, 20.0 y 8.3%,

respectivamente); también revelaron una alta prevalencia de sat en Shigella (75%)

(181).

De manera similar a lo reportado aquí, un trabajo hecho con cepas 128

cepas EAEC aisladas de un estudio de casos y controles en Brasil, mostró que la

frecuencia del gen pic fue mayor entre aislados de EAEC (n=35) en comparación

con aquellos que fueron negativos (n=2) para la sonda que detecta este patotipo

(212). En relación al hallazgo de genes que codifican proteínas

autotransportadoras (como cah, ehaA, ehaB, ehaC, ehaD, espC, pet, sat, pic) en

diferentes patotipos DEC (cuadro 11), otros autores han reportado también la

presencia de algunos genes que codifican de estas proteínas en EPEC; por

ejemplo, el gen ehaC se asoció con aEPEC, en tanto que los genes ehaJ y pet

con tEPEC; además, también reportaron asociaciones significativas de ehaB,

ehaJ, espC y pet con tEPEC que expresaran los antígenos flagelares H6 o H34,

en tanto que los genes eatA y ehaA se asociaron con tEPEC con el antígeno

flagelar H2; aquellos autores concluyeron que dichos genes no pueden

considerarse marcadores génicos de los patotipos en los que fueron descubiertos

(93). Un reporte más en Brasil, mostró la presencia del gen pic y pet en cepas

DAEC (7.1 y 54.8%, respectivamente), en tanto que el gen pic se encontró en

40.8% de las cepas EAEC y pet en 55.3% (213).

Page 119: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

110

Respecto a los resultados de la resistencia antimicrobiana, los datos

mostrados en este trabajo son preocupantes ya que la mayoría de las cepas DEC,

aisladas de niños con y sin diarrea, fueron resistentes al menos a un antibiótico.

De los nueve antimicrobianos probados (cuadro 13). En cuanto a las categorías de

antibióticos, la mayoría de cepas DEC de niños con diarrea fueron resistentes a

las penicilinas y a tetraciclina; de manera similar las DEC de niños asintomáticos,

fueron resistentes a las cefalosporinas (32.2% para cefotaxima); en tanto que al

ácido nalidíxico lo fueron en un 54.2%; la mayoría de las cepas DAEC fueron

resistentes al ácido nalidíxico, al trimetoprima-sulfametoxazol y a la cefotaxima

(cuadro 13). Este comportamiento de resistencia permitió distinguir que gran parte

de las cepas DEC fueran del fenotipo MDR (54.8 y 39.3% para las aisladas de

niños con y sin diarrea, respectivamente). De manera similar a nuestro hallazgo,

un estudio con 1,200 cepas de E. coli aisladas de 280 niños y adultos con diarrea

en Brasil, reportó también una elevada resistencia de cepas DAEC a la

cefotaxima, así como al cotrimoxazol y ampicilina (75% cada uno); también

observaron que más de la mitad de cepas EPEC, fueron resistentes al menos a

ocho de antimicrobianos probados (213). La elevada resistencia a antimicrobianos

incluso se ha reportado en cepas de E. coli aisladas de sujetos sanos, como se

informó en un estudio en Vietnam, donde se analizaron 103 cepas; la mayoría de

ellas fueron resistentes a estreptomicina, seguida de tetraciclina y ampicilina (80.6,

67 y 65%, respectivamente); además, 15/18 cepas que albergaron genes de

virulencia se catalogaron como MDR (214). Otro estudio hecho en aislados de E.

coli recuperados de niños de la India, mostró una prevalencia del fenotipo MDR de

41.4%, siendo la resistencia a las cefalosporinas la más elevada (83%) (215). Otro

Page 120: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

111

trabajo en cepas DEC aisladas de pacientes hospitalizados en China, reveló

también una alta resistencia a los antibióticos, principalmente a la cefotaxima y

ampicilina (88.89% para cada antibiótico) entre las cepas DAEC y al ácido

nalidíxico en cepas DAEC y EAEC (77.7 y 100%, respectivamente); estos autores

reportaron además que todas las cepas DEC fueron MDR (216). Un estudio más

hecho en pacientes suizos con diarrea, reportó una elevada resistencia de las

cepas EAEC a la ampicilina y sulfametoxazol (80% para cada antibiótico);

además, encontraron que 60% de estas cepas exhibieron resistencia al menos a

tres clases distintas de antibióticos (217). Ante los resultados obtenidos en este

trabajo, es necesario plantear en el futuro la detección de genes implicados en la

resistencia antimicrobiana, como los que codifican las beta lactamasas.

Este estudio encontró que el filogrupo A fue el más frecuente entre las

cepas de E. coli aisladas de niños de Sinaloa, seguido de los filogrupos B1 y D

(cuadro 14). Esta tendencia se observó entre los diferentes tipos de E. coli, sin

embargo, entre las DEC el filogrupo D fue el segundo más frecuente. Al analizar la

distribución del filogrupo de las cepas de acuerdo a la condición clínica, se

observó nuevamente que el filogrupo A fue el más frecuente, aunque entre los

niños con diarrea, el filogrupo D fue el segundo más frecuente, incluso en mayor

proporción con respecto a los aislados de niños asintomáticos. Un estudio

mencionado previamente aquí, señaló que entre las cepas DEC y UPEC, el

filogrupo A1 fue el más prevalente, seguido de los filogrupos A0, B2 y D1, sin

embargo, no observaron diferencias significativas en la distribución de los

filogrupos (203). Otro análisis hecho con 103 cepas de E. coli aisladas de heces

Page 121: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

112

de sujetos sanos, encontró que la mayoría de cepas pertenecieron al filogrupo A

(44.7%), seguido del B1 y B2; sin embargo, aunque fueron recuperadas de

individuos sin enfermedad, dichas cepas exhibieron genes de virulencia y alta

resistencia a los antibióticos (214). Otro estudio que analizó 100 cepas aisladas de

pacientes con diarrea, encontró que dichos aislados pertenecieron al filogrupo A

(35%), seguido de los filogrupos D y B1 (29 y 26%, respectivamente) (218). Los

resultados en relación a los filogrupos de este trabajo, permiten hipotetizar que las

cepas de E. coli poseen una constitución génica similar, quizá favorecido por la

distribución heterogénea de los GSV; probablemente las cepas no-DEC

representan un reservorio de genes de virulencia que pueden ser adoptados por

las cepas DEC, fomentando que el huésped humano pueda ser colonizado con

cepas con alto contenido de cepas de E. coli virulentas; sin embargo, es necesario

también plantear estudios enfocados a la presencia de dichas bacterias en el

ambiente que rodea a los niños en Sinaloa, así como analizar la capacidad de

respuesta inmune adaptativa de las personas que viven en el noreste mexicano.

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113

XI. CONCLUSIONES

La prevalencia de DEC en niños de 6-12 años fue de 18.6%

Las cepas DEC se asociaron con diarrea en los niños, en tanto que la

proporción de cepas E. coli no-DEC con GSV fue similar en niños con o sin

diarrea.

Los patotipos EAEC y EPEC fueron los más prevalentes entre las cepas

DEC (33.9% cada una), siendo las EAEC típicas y EPEC atípicas las más

frecuentes.

Las cepas EAEC típicas se asociaron con la diarrea, en tanto que las EPEC

atípicas con los niños asintomáticos.

Las cepas DEC exhibieron mayor cantidad de GSV que las no-DEC, siendo

las DEC aisladas de diarrea con 8 y 9 GSV las de mayor proporción que las

DEC aisladas de niños sin diarrea

Los GSV de colonización (ehaA, ehaC y efa/lifA), de toxinas (espC y pet) y

pic (proteasa) se asociaron con las DEC.

Los GSV ehaA, ehaB, kps, agg4A (colonización) y eatA, espI, espP y pic

(proteasas) se asociaron con diarrea.

El gen ehaB se asoció con ETEC y el gen pic con EAEC.

Las cepas DEC fueron las que exhibieron el mayor puntaje de virulencia y

fue proporcional al daño citotóxico sobre células HT-29.

La mayoría de cepas DEC de niños con diarrea fueron resistentes a la

ampicilina y tetraciclina, en tanto que las DEC de niños asintomáticos

fueron resistentes al ácido nalidíxico y cefalosporinas.

Page 123: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

114

Casi la mitad de las cepas DEC (47.5%) fueron multi farmaco-resistentes.

El filogrupo A fue el más frecuente, seguido de los filogrupos B1 y D.

Entre las cepas DEC, el filogrupo A fue el más frecuente, seguido del

filogrupo D.

Page 124: Caracterización de Escherichia coli diarreogénicas en ...

115

XII. BIBLIOGRAFÍA

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ABREVIATURAS

A/E Unión y borrado

ADN Acido Desoxirribonucleico

BHI Infusión Cerebro Corazón caldo

c.b.p. Concentración bastante para

CIASaP Centro de Investigación Aplicada para la Salud Pública

CR Citrobacter rodentium

DAEC Escherichia coli adherente difusa

DEC Escherichia coli diarreogénica

DMEM Medio de Cultivo Eagle Modificado de Dulbecco

E.coli

aEPEC

tEPEC

Escherichia coli

EPEC atípica

EPEC típica

EAEC Escherichia coli enteroagregativa

EDTA ácido etilendiaminotetraacético

EHEC Escherichia coli enterohemorrágica

EIEC Escherichia coli enteroinvasiva

EPEC Escherichia coli enteropatógena

ETEC Escherichia coli enterotoxigénica

FBS Suero Bovino Fetal

g Gravedades

GI Islas genómicas

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GSV Genes Suplementarios de Virulencia

h Hora

IRB Junta de Revisión Institucional

ITU Infecciones de Tracto Urinario

kb Kilobases

LB Luria-Bertani

LPF Fimbrias Polares Largas

LT Termolábiles

MGE Elementos genéticos Móviles

Min Minutos

ml Mililitros

mo Microorganismos

MOI Multiplicidad de infección

NaCl Cloruro de sodio

PAI Islas de patogenicidad

PBS Solución Salina Amortiguada por Fosfatos

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa

RNAr Ácido Ribonucleico Ribosomal

s Segundos

ST termoestables

STEC Escherichia coli productora de toxina Shiga

Stx Toxina Shiga

SUH Síndrome urémico hemolítico

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TEER resistencia eléctrica epitelial /transepitelial

UAS Universidad Autónoma de Sinaloa

UPEC Escherichia coli Uropatógena

USA Estados Unidos de América

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ANEXOS

Anexo 1. Amplificación del gen ARNr 16S en cepas de E. coli de referencia. Las

cepas de referencia usadas se muestran de izquierda a derecha: EAEC 042,

EPEC E2348/69, EIEC (ipaH+, virF+), DAEC (daaE+), ETEC (lt+, st+), EHEC

O157:H7 y E. coli HB101. El MPM usado fue la escalera de 100 pb.

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135

1.

Anexo 2. Genes típicos de virulencia en E. coli. A (de izquierda a derecha), genes:

eae (365 pb de EPEC E2348/69), aafII, pCVD432 y aap (378, 630 y 351 pb,

respectivamente de EAEC 042), lt (218 pb de ETEC), daaE (542 pb de DAEC),

hlyA (569 pb de EHEC O157:H7), ipaH y virF (933 y 618 pb, respectivamente de

EIEC); B (de izquierda a derecha), bfp (EPEC E2348/69), aggR (EAEC 042), stx1,

stx2, hlyA, rfbEO157 y fliCH7 (EHEC O157:H7). El MPM usado fue la escalera de

100 pb.

A B

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136

Anexo 3. Genes suplementarios de virulencia en E. coli. A (de izquierda a

derecha), genes implicados en colonización: aida-I (342 pb de DAEC), cah (707 pb

de EHEC O157:H7), ehaA, ehaB, ehaC y ehaD (326, 423, 599 y 821 pb,

respectivamente de EHEC O157:H7), tibA (480 pb de ETEC), efa/lifA (310 pb de

EPEC E2348/69), kps (400 pb de EAEC 042), agg4A (169 pb de EAEC 042) y

nleB (273 pb de EPEC); B (de izquierda a derecha), genes implicados en

citotoxicidad: espC (301 pb de EPEC E2348/69), pet (302 pb de EAEC 042) y sat

(930 pb de DAEC); C (de izquierda a derecha), genes implicados en proteólisis:

eatA (743 pb de ETEC), epeA (783 pb de EHEC O157:H7), espI y espP (560 y 547

pb, respectivamente de EHEC O157:H7), pic (1176 pb de EAEC 042). El MPM

usado fue la escalera de 100 pb.

A B C

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Anexo 4. Frecuencia y porcentajes de tipos de E. coli aisladas.

Tipo E. coli Frecuencia Porcentaje

DEC 59 18.6

No-DEC con GSV 227 71.6

No-DEC sin GSV 31 9.8

Total 317 100.0

Anexo 5. Frecuencia y porcentajes de tipos de DEC.

Tipo de DEC Frecuencia Porcentaje

EAEC 20 33.9

Típica 12 20.3

Atípica 8 13.6

EPEC 20 33.9

Típica 2 3.4

Atípica 18 30.5

DAEC 8 13.6

ETEC 10 16.9

EIEC 1 1.7

Total 59 100.0