BIOSINTESIS DE AMINOÁCIDOS EN ESCHERICHIA COLI

E.A.P. Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

Resumen

Se tiene conocimiento de que todos los aminoácidos provienen de intermediarios, del ciclo del acido cítrico o de la vía de las pentosas fosfato, sobre esta base se realizo el siguiente trabajo.

Los distintos organismos presentan considerables diferencias en su capacidad para sintetizar los 20 aminoácidos estándar. Mientras que la mayor parte de bacterias y plantas pueden sintetizar los 20 aminoácidos, los mamíferos solo pueden sintetizar la mitad, generalmente aquellos cuyas vías metabólicas son sencillas, estos son los denominados aminoácidos no esenciales, que no son necesarios obtenerlos en la dieta, ya que el organismo con simples reacciones puede sintetizarlos. El resto, los aminoácidos esenciales, deben obtenerse de la dieta. Existen

microorganismos como E. Coli que puede fabricarse sus propios aminoácidos a partir de amoniaco.

En el presente informe se presentan las vías de la biosíntesis de aminoácidos, en un cultivo de E. Coli; a la cual se le añadió glucosa marcada con 14C y un sustrato carbonado o aminoácidos no radioactivos, en donde se demuestra la radioactividad de estos compuestos sobre los aminoácidos.

Con este trabajo deducimos que los aminoácidos competidores son precursores de la biosíntesis de otros aminoácidos (los aminoácidos no esenciales), que por procesos de transaminación y aminación reductiva de los intermediarios del ciclo de Krebs y el piruvato. Así obtuvimos 3 familias: Familia del Ácido Aspártico, Familia de Ácido Glutámico y Familia de la Serina.

Palabras clave: Aminoácidos, transaminación, intermediarios, radiactividad.

Abstract

It is known that all amino acids come from intermediaries, citric acid cycle or the pentose phosphate pathway, on this basis took place the next job. Individual agencies have considerable differences in their ability to synthesize the 20 standard amino acids. While the majority of bacteria and plants can synthesize the 20 amino acids, mammals can synthesize only half, generally those whose metabolic pathways are simple, they are called non-essential amino acids, which are not required to obtain them in the diet, since the organism can synthesize simple reactions. The remainder, essential amino acids, be obtained from the diet. There are microorganisms such as E. Coli can be manufactured

their own amino acids from ammonia. This report presents the pathways of biosynthesis of amino acids in a culture of E. Coli, to which glucose was added 14C and a carbon substrate or non-radioactive amino acids, where it shows the radioactivity of these compounds on the amino acids. With this work we conclude that amino acids are precursors competitors for the biosynthesis of other amino acids (nonessential amino acids), which processes transamination and reductive amination of the Krebs cycle intermediates and pyruvate. So we got 3 families: Family of Aspartic Acid, Glutamic Acid Family and Family of Serine.

Keywords: Amino acids, transamination, brokers, radioactivity.

Introducción

La síntesis de aminoácidos se desarrolla a un ritmo variable, dependiente de las necesidades que existan que existan en la célula respecto a cada aminoácido en particular. En los mamíferos existen rutas anabólicas para los aminoácidos considerados como esenciales (Alanina, Arginina, Asparragina, Aspartato, Cisteina, Glutamato, Glutamina, Glicina, Prolina, Serina, Tirosina)

Los 20 aminoácidos estándar(o proteinogénicos) se dividen en 5 familias en relación a su biosíntesis. Los miembros de cada familia derivan a partir de precursores comunes generados en el ciclo de Krebs, en la glicólisis o en la vía de las pentosas fosfato.

Los aminoácidos glucogénicos son los que dan lugar a una producción neta de piruvato o intermediarios del Ciclo del TCA, tales como α-cetoglutarato u

oxaloacetato, que son precursores de la glucosa vía gluconeogénesis. Todos los aminoácidos excepto la lisina y la leucina son al menos en parte glucogénicos. La lisina y la leucina son los únicos aminoácidos que son solamente cetogénicos, dando lugar solamente a acetil-CoA o a acetoacetil-CoA, ninguno de los cuales puede traer la producción neta de la glucosa.

Un grupo pequeño de aminoácidos comprendidos por isoleucina, fenilalanina, treonina, triptófano, y tirosina dan lugar a precursores de la glucosa y de ácidos grasos y así son caracterizados como glucogénicos y cetogénicos. Finalmente, debe ser reconocido que los aminoácidos tienen un tercer posible destino. Durante etapas de hambruna los esqueletos de carbono reducidos se utilizan para la producción energética, con el resultado que se oxida a CO2 y H2O.

Materiales y Métodos

En el experimento realizado para investigar las vías de la biosíntesis de aminoácidos, un cultivo de Escherichia coli que crecía exponencialmente en un medio de glucosa con sales fue dividido en dieciocho cultivos separados.

Se añadió a cada cultivo, glucosa marcada con 14C y un sustrato carbonado (oxalacetato, α-cetoglutarato, piruvato, acetato y semialdehído glutámico) o un aminoácido (ác. aspártico, ác. glutámico, homoserina, serina, acetato, treonina, valina, arginina, isoleucina, glicina, leucina y prolina) no radioactivo.

Después de crecer por una generación, los organismos fueron lisados, aislando luego fracciones de lípidos, ácidos nucleícos y proteínas residuales. Se usaron solo las fracciones proteicas las que fueron primero, hidrolizadas en medio básico y a altas temperaturas, para romper el enlace peptídico, obteniendo

aminoácidos. Los aminoácidos fueron separados por cromatografía bidimensional, en la cual se hizo una cromatografía ascendente vertical y otra horizontal (girando el papel 90º), usando solventes distintos.

A los aminoácidos separados se los reconoció usando la ninhidrina (reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8), dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido. La prolina da coloración amarilla. Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoración cuantitativa de aminoácidos por colorimetría.

Los aminoácidos separados fueron eluídos individualmente, determinándose su concentración y midiéndose la

radioactividad en una alícuota de la muestra por medio de un fotocolorímetro.

Resultados

La actividad específica de cada aminoácido, se determino sabiendo la radioactividad de cada aminoácido. La actividad específica de los aminoácidos se encuentra en la Tabla I.

Tabla I. El efecto de Competidores Sobre la Incorporación de C14 Glucosa en Aminoácidos.

ala arg asp cys glu gly ile leu lys met pro ser thr valControl 1600 1300 820 220 2500 550 340 1500 800 510 1100 450 650 600

Acetato 1580 ---- 680 ---- 1510 ---- ---- ---- ---- ---- 660 ---- 540 ----

Alanina 320 ---- ---- 215 ---- 560 ---- 1520 ---- ---- ---- 455 ---- 590

Arginina 1610 60 840 ---- 2520 ---- ---- ---- ---- ---- 1090 ---- ---- ----

Acido Aspartico 1590 ---- 205 ---- 1760 ---- 205 ---- 480 230 790 ---- 160 ----

Acido Glutamico 1570 150 375 ---- 200 550 ---- ---- ---- ---- 85 ---- 325 ----

1600 1290 810 ---- 2480 ---- ---- ---- ---- ---- 90 ---- ---- ----

Glicina 1620 1320 820 225 2520 275 ---- 1490 ---- ---- 1100 450 ---- 610

Homoserina 1560 ---- 825 ---- ---- ---- 120 ---- 800 100 ---- ---- 30 ----

Isoleucina 1630 ---- 830 ---- ---- ---- 122 ---- 805 500 ---- ---- 645 ----

α-cetoglutarato 1610 ---- 570 ---- 1550 ---- ---- ---- ---- ---- 650 ---- 470 ----

Leucina 1560 ---- 220 ---- 560 ---- 0 ---- ---- ---- 440 ---- 600

Oxalacetato 1220 1280 580 ---- 1620 ---- ---- ---- ---- ---- 715 ---- 455 ----

Prolina 1600 ---- 820 ---- 2500 550 ---- ---- ---- ---- 50 ---- ---- ----

Piruvato 650 ---- 700 215 1850 555 ---- 615 ---- ---- 790 450 540 270

Serina 960 ---- ---- 10 ---- 270 ---- 1130 ---- ---- ---- 25 ---- 450

Treonina 1580 ---- 810 ---- ---- ---- 118 ---- 800 510 ---- ---- 30 ----

Sustrato Carbonado o Aminoacido no

Radiactivo

Actividad específica de los Aminoácidos (cpm/μmol)

Semialdehido Glutamico

La actividad específica de cada aminoácido debería calcularse como un porcentaje del valor control, encontrando de esta manera el porcentaje de inhibición de cada uno de los aminoácidos y sustratos carbonaos no radioactivos sobre la glucosa marcada.

Tabla II. El efecto en porcentaje de Competidores Sobre la Incorporación de C14 Glucosa en Aminoácidos.

ala arg asp cys glu gly ile leu lys met Pro ser thr val

Control 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Acetato 99 --- 83 --- 60 --- --- --- --- --- 60 --- 83 ---

Alanina 20 --- --- 98 --- 100 --- 100 --- --- --- 100 --- 98

Arginina 100 5 100 --- 100 --- --- --- --- --- 99 --- --- ---

Ácido Aspártico 99 --- 25 --- 70 --- 60 --- 60 45 72 --- 25 ---

Ácido Glutámico 98 12 46 --- 8 100 --- --- --- --- 8 --- 50 ---

100 99 99 --- 99 --- --- --- --- --- 8 --- --- ---

Glicina 100 100 100 100 100 50 --- 99 --- --- 100 100 --- 100

Homoserina 98 --- 100 --- --- --- 35 --- 100 20 --- --- 5 ---

Isoleucina 100 --- 100 --- --- --- 36 --- 100 98 --- --- 99 ---

α-cetoglutarato 100 --- 70 --- 62 --- --- --- --- --- 59 --- 72 ---

Leucina 98 --- --- 100 --- 100 --- 0 --- --- --- 98 --- 100

Oxalacetato 76 --- 71 --- 65 --- --- --- --- --- 65 --- 70 ---

Prolina 100 98 100 --- 100 100 --- --- --- --- 5 --- --- ---

Piruvato 41 --- 85 98 74 100 --- 41 --- --- 72 100 83 45

Serina 60 --- --- 5 --- 49 --- 75 --- --- --- 6 --- 75

Treonina 99 --- 99 --- --- --- 35 --- 100 100 --- --- 5 ---

Valina 99 --- --- 100 --- 100 --- 40 --- --- --- 100 --- 1

Sustrato Carbonado o

Aminoacido no Radiactivo

Actividad específica de los Aminoácidos (cpm/μmol)%

Semialdehído Glutámico

1) Según los resultados la Tabla I y la Tabla II, vemos como los aminoácidos afectan la radioactividad del mismo aminoácido y no de otro más.

Alanina Arginina Glicina Isoleucina Leucina Prolina

2) En los resultados de las tablas también podemos observar que algunos aminoácidos aparte de afectar la radioactividad del mismo aminoácido, afectan a otros diferentes a él y que otros aminoácidos que no son parte de las proteínas también afectan la radioactividad de otros aminoácidos que si forman parte de las proteínas. A estos aminoácidos los llamaremos competidores.

Grafico I. Aminoácidos presentes en cadena proteica

Grafico II. Aminoácidos no presentes en cadena proteica

Ácido Aspártico

Aspartato

Glutamato

Isoleucina

Lisina

Metionina

Prolina

Treonina

Ácido Glutámico

Arginina

Aspartato

Glutamato

Prolina

Treonina

Serina

Alanina

Cisteina

Glicina

Leucina

Serina

Valina

Treonina

Isoleucina

Treonina

Valina

Leucina

Valina

Homoserina

Isoleucina

Metionina

Treonina

Semialdehido Glutamico

Prolina

3) También trabajamos con alfa cetoácidos (α-cetoglutarato, oxalacetato, piruvato, acetato), observamos que estos compuestos también tienen efecto sobre la radioactividad de ciertos aminoácidos. Por conocimientos de la vía metabólica de ciclo del acido cítrico, sabemos que intermediarios de esta vía por reacciones química se convierten a ciertos aminoácidos.

Grafico III. α-cetoacidos que tienen efecto sobre la radioactividad de los aminoácidos.

4) Revisando los resultados de la Tabla II y los Gráficos I, II y por último el III, nos dimos

cuenta de que uno de los aminoácidos que más efecta o inhibe la síntesis de otros aminoácidos era el acido aspártico, lo relacionamos con un aminoácido, pudimos percatarnos que la mayoría de los aminoácidos que eran afectados por la Homoserina (Ile, Met,Thr) también eran afectados por el Ác. Aspártico, luego observamos que la Treonina afecta la radioactividad de un aminoácido (Ile), aparte del mismo afecta, con quien se acaba la síntesis ya que como se señaló en el primer punto, es una proteína de fi n de ciclo. Para ver mejor estos resultados, elaboramos la Tabla III, que nos mostrara la relación entre los aminoácidos.

5) Otro aminoácido que afecta a varios aminoácidos es el Ácido Glutámico (Arg, Asp, Glu, Pro, Thr), el único aminoácido que afecta la síntesis de aminoácidos coincidentes con el Ac. Glutámico es el Semialdehído Glutámico (Pro).

6) Y por último, observamos que la Serina también es otro aminoácido que afecta la síntesis de varios aminoácidos aparte del mismo (Ala, Cys,Gly, Ala,Leu, Val) y vemos que coincide con un aminoácidos que afecta la Valina (Leu ) aparte del mismo.

Acetato

Aspartato

Glutamato

Prolina

Treonina

α-cetoglutarato

Aspartato

Glutamato

Prolina

Treonina

Oxalacetato

Alanina

Aspartato

Glutamato

Prolina

Treonina

Piruvato

Alanina

Aspartato

Glutamato

Leucina

Prolina

Treonina

Valina

A continuación la siguiente tabla nos mostrara mejor los resultados obtenidos.

Tabla III. El efecto de los Aminoácidos Competidores sobre la incorporación de C14 Proveniente de la glucosa

Aminoácido Competidor

Asp 75Thr 75Met 55Ile 40Lys 40

(Glu)* 30(Pro)* 28

HomoserinaThr 95 AspMet 80 LysIle 65

TreoninaThr 95 AspIle 65 Met

LysGlu 92Pro 92Arg 88

(Asp)* 54(Thr)* 50

Pro 92 ArgGlu

Serina

Ser 94Cys 95Gly 51Ala 40Leu 25Val 25

ValinaVal 99

Aminoácidos Afectados Inhibiciόn Otros aminoácidos significativos

no afectados

Ácido aspártico

Acido Glutámico

Semialdehído Glutámico

()* No se están considerando estos aminoácidos pues probablemente provengan de un proceso de transaminaciόn de algún intermediario del ciclo de Krebs.

Discusión

Ahora discutiremos los resultados obtenidos para llegar a las conclusiones de nuestro trabajo:

En el punto 1) observamos que habían aminoácidos que solo afectaban la síntesis de los mismo aminoácidos, como por ejemplo Alanina que inhibe a la misma en un 80%, y a ningún otro aminoácido mas. Así también la Glicina que inhibe a la misma en un 50%, no afecta a ningún otro aminoácido más. Entonces llegamos podemos decir que estos aminoácidos no son precursores de ningún otro, si no que son el producto final, son los que terminan la vía metabólica de la biosíntesis de aminoácidos.

En el punto 2) observamos que había aminoácidos que aparte de inhibir la síntesis del mismo, afectaban a más aminoácidos, como por ejemplo el ác. aspártico que inhibe a la isoleucina y lisina en un 40%, asi como también inhibe a la Metionina en un 55% y a la treonina en un 75%, aunque en los resultados de la tabla también aparece que afecta al glutamato y a la prolina, no podemos asegurar esto, pues también tenemos conocimiento de que los aminoacidos se sintetizan a partir de los intermediarios del ciclo de Krebs, por una reacción química que será explicada más adelante. Entonces podemos deducir que estos aminoácidos participan en la síntesis de esos aminoácidos a los que inhiben, a estos aa los llamamos competidores.

En el punto 3), observamos que los cetoácidos (α-cetoglutarato, oxalacetato, piruvato) utilizados en el trabajo inhibían también la síntesis de los aminoácidos. Y de esto tenemos conocimiento pues sabemos que los intermediarios del ciclo de Krebs pueden llegar a convertirse en aminoácidos.

Basado en la vía catabólica en la que participen, los aminoácidos pueden tener un destino en el cual  sus esqueletos de Carbono sean incorporados en intermediarios metabólicos que puedan posteriormente transformarse en glucosa, estos son los aminoácidos glucogénicos. Los aminoácidos también pueden ser cetogénicos, y en este caso sus esqueletos de C son en forma de acetoacetato, el mismo que se puede transformar posteriormente en acetil-CoA.

Tenemos conocimiento de que algunos aminoácidos se forman gracias a intermediarios del Ciclo del Acido Cítrico o Ciclo de Krebs, por un proceso llamado Transaminaciόn.

La reacción de aminotransferasa ocurre en dos pasos:

1.- el grupo amino de un aminoácido es transferido a la enzima, produciendo el correspondiente a-ceto ácido y la enzima aminada

Aminoácido + enzima D → a-ceto ácido + E-NH2

2.- El grupo amino es transferido al α-ceto ácido aceptor (ej. α-cetoglutarato) formando el producto aminoácido (ej. Glutamato) y regenerando la enzima

α-cetoglutarato + enzima-NH2 D → enzima + glutamato

Por ejemplo tenemos que el glutamato se sintetiza a partir de NH4+ y α-cetoglutarato por medio

de la glutamato deshidrogenasa. La reacción es la siguiente:

N H 4+¿+α−cetoglutarato+NAPH +¿+H+ ¿→glutamato+ NADP

+¿+H2

O ¿¿¿¿

Otro ejemplo es el Aspartato y por este se explica porque no tomamos en cuenta al glutamato como un aminoácido que inhibe el ác. Aspártico:

Oxalacetato+glutamato → aspartato+α−cetoglutarato

Como vemos por el mismo proceso de transaminaciόn, el glutamato transfiere su grupo amino al oxalacetato para convertirlo en Aspartato. Por este motivo no tomamos en cuenta al glutamato.

Un último ejemplo es la Alanina, que se forma gracias a la adición de un grupo amino al piruvato, la reacción es la siguiente:

Piruvato+glutamato → alanina+α−cetoglutarato

Aunque se ha demostrado que en ciertas especies la serina se puede convertir en piruvato mediante una reacción catalizada por la desaminación de serina/treonina deshidratasa, esta actividad de la enzima parece faltar en los seres humanos.

Entonces ya después de esta discusión, por ultimo podemos establecer la familia de síntesis de aminoácidos:

Familia del Acido Aspártico

De los datos obtenidos vemos que el Acido Aspartico afecta síntesis de Treonina, Metionina, Isoleucina y Lisina.

La Homoserina afecta a síntesis de Treonina, Metionina e Isoleucina.

La Treonina participa en la síntesis de Isoleucina.*No se considera a la glutamato pues se sabe que es producto de las reacciones de los intermediarios del ciclo de Krebs, desde Oxalacetato que llega a ser α-cetoglutarato y por transaminaciόn se convierte a glutamato.*La prolina no se considero, pues no es totalmente seguro que el ácido aspártico participe en la síntesis de este aminoácido, pues su porcentaje de inhibición es demasiado bajo, mucho mas que la inhibición del propio Aspartato.

Relacionándolos:

Familia del Ácido Glutámico

Metionina

Homoserina

Treonina Isoleucina

Acido Aspártico

Lisina

De los datos obtenidos en clase nos damos cuenta que el Acido Glutámico afecta la síntesis del mismo Acido Glutámico, de la Prolina, de la Arginina, del Acido Aspártico y de la Treonina.

Continuamos con el α-Cetoglutarato que a su vez afecta al Acido Glutámico, a la Prolina, a la Treonina y al Acido Aspártico.

Mientras que el Semialdehído Glutámico afecta prácticamente solo la síntesis de Prolina, es decir la Prolina.

*No se consideró a la Treonina ni al Aspartato, pues por intermediarios de ciclo de Krebs y el proceso de transaminaciόn el Ácido Glutámico es solo un camino, mas no es su precursor.

Relacionándolos:

  

 Fa milia de la

Serina

Serina participa en la síntesis de Alanina, Cisteina, Glicina, Leucina, Valina. Valina afecta la síntesis de Leucina. Serina se convierte a Piruvato. Piruvato participa en la síntesis de Alanina, Valina.

  Relacionándolos:

ProlinaSemialdehído Glutámico

Glutaminaα-Cetoglutarato Treonina

Ácido Aspártico

Ácido Glutámico

Arginina

Como nuestra base para el trabajo, fue el conocimiento previo de que los intermediarios del Ciclo del Ácido Cítrico eran precursores de la mayoría de aminoácidos. El siguiente gráfico nos permitirá entender la relación de esta vía metabólica con la síntesis de aminoácidos.

CisteínaAlanina

Serina Piruvato Valina Leucina

Glicina

Conclusiones

Los aminoácidos que no inhiben la síntesis de otro aminoácido que no sea el mismo, son aminoácidos de fin de síntesis, son los que terminan la vía metabólica.

Los aminoácidos que inhiben la síntesis de otros aminoácidos aparte de a ellos mismos se les denomina competidores, y participan en la síntesis de otros aminoácidos.

Los aminoácidos también se sintetizan a partir de intermediarios del ciclo del ácido cítrico, por un proceso simple, la transaminaciόn.

Los esqueletos carbonados de los aminoácidos provienen de intermediarios de la glicolisis (piruvato), de las vías de las pentosas fosfato o del ciclo del ácido cítrico (α-cetoglutarato, oxalacetato, fumarato, succinato)

Las reacciones de transaminaciόn intervienen en la síntesis de la mayoría de aminoácidos.

Bibliografía

Armstrong, F Bioquímica. Editorial Reverte, S.A. Barcelona España. 1982 Stryer, Lubert et al, Bioquímica, Quinta Edición, Editorial W.H. Freeman, EEUU. http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/interconversion%20aminoacidos.html