Inducción de Mutantes en Escherichia Coli 1

8/11/2019 Induccin de Mutantes en Escherichia Coli 1

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MUTAGNESISHidroxilamina como agente mutagnico paraNeurospora crassaInduccin de mutantes en Escherichia coli

INSTITUTO POLITCNICONACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO DE GENTICA MICROBIANA

Grupo: 5QM2

Equipo:3 Seccin: 1


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Gen: Unidad fundamental dela herencia que ocupa unlocus en un cromosomaconcreto. Secuencia de DNAque codifica para unpolipptido.

Cromosoma: molcula de

DNA o RNA que constituye elgenoma. Almacenan lainformacin gentica.

Locus: lugar de un cromosoma

en donde se localiza un gen

Alelo: Formas alternativas deun gen. Figura 1.Gen Eucaritico


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Genoma: Conjunto de genes contenidos en loscromosomas . Totalidad de la informacin gentica.

Genotipo: Constitucin gentica de un organismo.

Fenotipo: Propiedades observables de unorganismo controladas genticamente.

Haploide: Clula u organismo que tiene una soladotacin de cromosomas .

Diploide: Clula u organismo con dos complementoscromosmicos.

Merodiploide: Organismo haploide que incorporaun segmento de DNA del exterior, de manera queahora posee dos copias de ese gen.


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MUTACIN Cambio de la

secuencia nucleotdicade una molcula deDNA que es heredabley NO se reproduce por

recombinacin.

Figura 4. Ejemplo de una mutacin.

IMPORTANCIA

Fuente primariade la variabilidad

gentica.

Materia prima dela evolucin

Anlisis gentico


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FRECUENCIADEMUTACIN

Es el nmero de mutaciones que aparecen por divisin celularen bacterias y organismos unicelulares

Ejemplo:Los genes vricos y bacterianos padecen un promedio de

mutaciones espontaneas en 1 de cada 100 millones (10-8) dedivisiones celulares aproximadamente.

La frecuencia de mutaciones espontneases de 10-7a 10-10.Sin embargo, en las mutaciones inducidas aumenta a unafrecuencia de 10-4a 10-7.


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POLIMORFISMOGENTICO Variaciones en una posicin o

regin especfica en la

secuencia de ADN que sepresentan en al menos un 1%de la poblacin.

Figura 2. Ejemplo de polimorfismo

gentico.

MARCADORGENTICO Segmento de ADN con una

ubicacin fsica identificable(locus) en un cromosoma ycuya herencia gentica sepuede rastrear.

Figura 3. Mapa gentico de tomatebasado en marcadores morfolgicos


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Antibiticos

Enzima conocida

mutacionesDeleccin

Insersin

Plsmido

Fenotipo

strsostrr

hisG+ o hisG-

his G 47

D lac pro

lac::amps

his -, arg-/F, lac+

His+o His -

NOMENCLATURADEGENESEn genotipo se escriben las tres iniciales del factor de crecimiento o

enzima de la que se trate con letras minsculas e italizadas his+o his-


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CLASIFICACIN

Grado de

lesin

Espontneas Inducidas

Orgen

Macrolesiones Microlesiones

Efectosobre el

fenotipo

Silenciosas Sentido equivocado Sin sentido


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MUTACIONES ESPONTNEAS

Son cambios en la secuencia nucleotdica de los genes y no

parecen tener causa conocida. Frecuencia de 10^-7 a 10^10(1 en 10 millones)

Errores por tautomerismo.

Daos oxidativos

TAUTOMRISMO Los cambios tautomricos pueden resultar en cambios en

el emparejamiento de bases, o mutaciones.

Ceto-enol en la Timina y Guanina

Amino-imino en la Citosina y Adenina


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Figura 5. Formas normales y tautomricas de las bases del DNA. La Adenina y

la Citosina pueden existir en la forma amino o en la rara forma imino; laguanina y la timina pueden presentarse en la forma ceto o en la mas rara enol.


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Figura 6. Comparacin de las relaciones de emparejamiento de bases normalescon las disposiciones producidas como resultado de cambios tautomericos. Laspuntas de flecha sealan los sitios de unin del azcar pentosido.


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MUTACIONESPORRADICALESLIBRES

Las formas activas de los radicales del oxigeno, como el

perxido de hidrgeno (H2O2) y los superxidos (O2)generan rupturas en el enlace glicosdico por la oxidacindel azcar generando sitios apurnicos o apirimidnicos .

Figura 7.efecto de radicales en bases nitrogenadas.


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MUTACIONES INDUCIDAS

Mutgeno:

agente externo, puede ser fsico oqumico, que interacta con elDNA causando mutaciones.

Mutagnesis:

Proceso de formacin de unorganismo mutante.

Figura 8. Mutacin inducidapor radiacin UV


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Agentesmutagnicos.

Fsicos

Rayos UV, X

Humedad

Temperaturaextrema

pH

Biolgicos.

Qumicos.


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RAYOSX YRADIACIONESIONIZANTES:

o Tienen mayor poder depenetracin que los rayos UV

o Difcil manejo, por lo que seemplean poco en bacterias

o Producen radicales libres dehidroxilo hiperreactivos,responsables de la abertura deun anillo de una base, o

fracturas monocatenarias obicatenarias en el ADN, estopuede ocasionar mutacionespor delecin .

LUZUV Causa la unin o

dimerizacin de pirimidinasadyacentes en el DNA.Siendo los dimeros de timinalos de mayor incidencia.

Figura 9. Dmeros de timina

por radiacin UV


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CURVADESOBREVIVENCIADEUNABACTERIADESPUSDELAEXPOSICINALARADIACINULTRAVIOLETA


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La exposicin del material gentico a temperaturas superioresa 37C produce mutaciones puntuales en el ADN. Ejemplosde esas mutaciones son la prdida de bases pricas, procesoque se denomina despurinizacin, o bien desaminaciones,que consisten en la prdida de grupos aminos de las bases.

TEMPERATURA

Figura 11. mutaciones inducidas por una alta temperaturacomo despurinizacin (izquierda) y desaminacin (derecha)


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BIOLGICOS.

Transposones:

Los transposones son segmentos mviles de DNA.

Los transposones contienen cortas repeticiones invertidasterminales que son esenciales para el mecanismo deinsercin y que se utilizan para definir los lmites deltransposn.

Todos los transposones activos contienen al menos un genque codifica una TRANSPOSASA, una enzima necesaria paraque se produzca el salto o transposicin


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Figura 12. Esquema de accin de los transposones


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DESPURINIZACIN

Prdida de purina en una molcula de doble cadena de DNA,se produce por rompimiento del enlace glucosdico que une alcarbono 1 de la desoxirribosa a la posicin 9 del anillodepurina

Figura 13. Prdida de una purina en un desoxinucletido.


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Rotura del enlace glicosdico entre la base nitrogenada y elazcar al que esta unida con prdida de una A o una G.

Figura 14. Despurinizacin por prdida de una guanina.


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DESAMINACIN:

Prdida de grupos amino.La C se convierte en U y ste se

empareja con A producindosetransiciones: GCAT.

El U no forma parte del ADN,la glucosidasa de uracilo se

encarga de detectar U en elDNA y retirarlo producindoseuna base apirimidnica.

La 5-Me-C por se convierte en T.

La T es una base normal en elDNA y no se retira, por tanto estoserrores no se reparan.

Figura 15.Transformacin de algunasbases por desaminacin


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ANLOGOSDEBASES

Son compuestos qumicos que pueden remplazar auna base determinada. Por ejemplo, el 5-Bromouracilo(5BU) es anlogo de la Timina (T) y puede remplazarla.

El 5-Bromouracilo puede provocar un error tras lareplicacin del DNA, es inestable y provocatransiciones .


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5-BROMOURACILO

Figura 16. Posibles apareamientos del 5-Bromouracilo.


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2-AMINOPURINA

La 2-Aminopurina (2AP) es anlogo de la Adenina (A). La 2APaparea con la Timina (T) pero en su forma imno (2AP*) emparejacon la Citosina (C). Esta alteracin produce transiciones.

Figura 17. Posibles apareamientos de la 2-aminopurina


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DESAMINANTES: HNO2

Provoca transiciones mediante la sustitucin degrupos amino de nucletidos por grupos ceto, comoconsecuencia la citocina de convierte en uracilo, laadenina en hipoxantina y la guanina en xantina

Figura 18. Sustitucin del grupo amino por el grupo carbonilo en una

desaminacin con HNO2


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Figura 19. Cambios provocados por la desaminacin con HNO2


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HIDROXILAMINA HA.

NHOH): Reacciona con la citosina donde el grupo amino esreemplazado por un grupo hidroxiamino. Este derivado de lacitosina se aparea con adenina producindose transicionesGC-AT.

Figura 20. Accin de la hidroxilamina en la citosina, provocandoun apareamiento con adenina


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ALQUILANTES. Etilmetanosulfonato (EMS): produce las sustituciones:

transiciones y transversiones.

Nitrosoguanidina NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina :produce transiciones y transversionesGCTA

Figura 21. Cambio en el apareamiento de guanina

provocado por la alquilacin.


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INTERCALANTESCOLORANTESDEACRIDINA

La proflavina y el naranja de acridina son planas, por lo que inician la

mutacin insertndose en la doble hlice del DNA, provocando sudeformacin; provocando adiciones y deleciones en la replicacin.

Figura 22.Molculas planas policclicas que se intercalan entre las bases.


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Figura 23.Esquema de la accin delos agentes intercalantes

Clasificacin de mutgenos por su dao direccin y efecto


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Clasificacin de mutgenos por su dao, direccin y efecto

Mutgeno Clasificacin Dao Direccin Efecto

Luz UV Fsico Dmeros depirimdinas

Unidireccional Insercin,delecin,sustitucin

Hidroxilamina Qumico Hidroxilante Unidireccional Transiciones deGC-AT

cido nitroso Qumico Desaminante Bidireccional Transiciones deGC-AT y

trasversionesAT-CG

EMS Qumico Alquilante Bidireccional Transiciones deGC-AT, AT-GC

5-Bromouracilo Qumico Anlogo de base Bidireccional Transiciones deGC-AT, AT-GC

Nitrosoguanidina Qumico Alquilante Unidireccional Transiciones deGC-AT

ICR-170 Qumico Intercalante Bidireccional Insercin odelecin

9-Aminoacridina Quimico Intercalante Bidirecccional Insercin odelecin


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MUTACINPORGRADODELESIN

Macrolesiones:

Alteraciones gravesen la molcula del

DNA o en unsegmento grande

En funcin de su magnitud, longitud o grado de lesin,permite clasificarlas en:

Microlesiones:

Alteracinproducida en una o

pocas bases delDNA.


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MICROLESIONES(PUNTUALES)

Sustituciones Transversiones Transiciones

Inserciones Deleciones Alteran el marco de

lectura


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SUSTITUCINEs aquella mutacin en la que donde debera haber una base seencuentra otra del mismo tipo. Por ejemplo, en lugar de la

citosina se instala una timina.

Figura 22. Esquema de las posiblestransversiones y transiciones


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INSERCIONESYDELECIONES

Este tipo de mutacin produce un corrimiento enel orden de lectura.

Pueden ser:

- Adiciones gnicas: Es la insercin de nucletidosen la secuencia del gen.

- Deleciones gnicas: Es la prdida de nucletidos.


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MARCOSDELECTURA

ORF: Secuencia nucleotdica organizada en tripletes quecodifica una secuencia aminoacdica de un polipptido,incluyendo un codn de inicio y un codn de terminacin.

Figura 23. Marco de lectura.


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Figura 24. Esquema de las consecuencias deuna delecin y de una insercin en la traduccin


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CORRIMIENTODELMARCODELECTURA.

Fig. 25Mutacin por corrimiento del marco de lectura.


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Mutacin Silenciosa:Son cambios sutiles en las secuencias de DNA,irrelevantes en un comienzo en cuanto a lacodificacin protenica, que poco a poco vancobrando importancia siendo determinantesen la enfermedad y la evolucin.

EFECTOSOBREELFENOTIPO

Figura 26. Esquema de una mutacin silenciosa donde sesintetiza el mismo aa.


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Mutacin Sin sentido

Son aquellas en las que tiene lugar una sustitucinde bases en un codn dado, en donde en vez deformar otro aminocido distinto, se crea uno de

los tres codones stop (UAA, UAG, UGA).

.

Fig. 27. Comparacin entre

un polipptido completo yuno truncado debido auna mutacin sin sentido alcambiar una guanina poruna adenina. (Tomada deSnyder & Champness,

2007, p. 157)


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Mutacin En sentido errneo

Mutaciones que cambian la secuencia de un codndado, sustituyendo una base por otra, lo que puede

producir que el aminocido codificado no sea el quese haba especificado antes.

.

Fig. 28. Cambio de una timina poruna citosina en una cadena deDNA, produciendo una mutacinen sentido errneo.(Tomada de

Snyder & Champness, 2007, p. 157)


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SELECCINDEMUTANTES.

Seleccin de auxtrofos.

Los organismos axtrofos son empleados con mayorrecurrencia para buscar un gen especficodefectuoso, motivo por el cual no puede sintetizar sus

factores de crecimiento.

Seleccin de prottrofos.

Estos microorganismos son empleados para lasecuenciacin del genoma del organismo en suforma silvestre.


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Seleccin de microorganismos susceptibles a antibiticos.

Los organismos susceptibles a antibiticos son estudiadospara poder identificar los genes que confieren esta

susceptibilidad y poder seguir posibles resistenciasadquiridas

Seleccin de microorganismos resistentes a antibiticosSon usados para estudio de los genes que confieren estaresistencia, ya que por medio de dichos estudios se puedenbuscar algunas alternativas de tratamiento.


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MUTACIONESNOREVERSIBLES(UNIDIRECIONALES)YREVERSIBLES(BIDIRECCIONALES).

Si se trata de una mutacin unidireccional noreversible, puede reemplazar al alelo del que seorigin. (A1 A2) pero muy a largo plazo.

Si se trata de una mutacin bidireccionalreversible, se puede establecer una situacin deequilibrio que depende solo de las tasas de

mutacin (u) y retromutacin (v) (A1 A2).

REVERSIN


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Es una segunda mutacin, se restaura total oparcialmente el genotipo y/o fenotipo daado por laprimera mutacin.

REVERSIN.

Verdadera: mutante que a revertido a su genotipoanterior, restauracin del genotipo (ADN) silvestre.

No verdadera (por supresin): reversin del fenotipo mutanteal silvestre a causa de una mutacin en otro lugar quesuprima o compense la deficiencia de la primera

Supresin intragnica: se produce cuando la segundamutacin se da dentro del mismo gen en que se dio laprimer mutacin.

Supresin intergnica: las segunda mutacin se da en un

gen diferente a donde se dio la primer mutacin.


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ARTCULO:

HIDROXILAMINACOMOAGENTEMUTAGNICODENEUROSPORACRASSA

H. V. MALLINGBiology 3' Division,

Oak Ridge National Laboratory),

Oak Ridge, Tenn. (U.S.A.)

(Received June 21st, I966)


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Neurospora crassa

o Es un hongo perteneciente a la divisin Ascomycota

o Es utilizado como organismo modelo por su haploida, su ciclode vida rpido y sencillo, y por la facilidad con la que sepuede cultivar.

o Un sistema preferido para estudiar el mecanismo de lamutacin es el gen ad-3, porque los mutantes ad-3 sonmorados y se detectan fcilmente.

Figura 29. Cultivo deNeurospora crassa.

I


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HA induce sustituciones en pares de bases GC- AT

La reaccin entre DNA y HA es con citocina y conRNA con uracilo

A un pH de 6.1 la reaccin es mas rpida concitocina que con uracilo

HA ha sido usada para inducir dao cromosmico

en clulas de mamferos

No se ha podido identificar la alteracin por HA eneucariotes a nivel molecular

INTRODUCCIN


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OBJETIVOS

Determinar la especificidad de HA paraproducir reversiones en mutantes

dependientes de adenina.

Obtener informacin ms detallada

sobre los efectos de HA en Neurospora

Prueba de Ames


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Prueba de Ames

Se basa en la observacin de que la exposicin delas bacterias mutantes a las sustancias mutagnicas

puede causar nuevas mutaciones que revierten elefecto de la mutacin original.

Figura 30. Prueba de Ames para observar revertientes.


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SELECCINDEMUTANTES.

Figura 31. Seleccin de mutantes por auxotrofa y Pototrofa


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RPLICAENPLACA

sta tcnicaconocida comorplica en placa,

(Joshua Lederberg),es una tcnica de

deteccin que haceposible determinarrpidamente si unadeterminada cepa

bacteriana es

auxtrofa paradado metabolito

Figura 32. Tcnica de rplica en placa para

seleccin de auxtrofo a X metabolito.

M


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MEDIODECULTIVO

Conidios

20ml de medioglicerolcompleto consulfato deadenina

Incubados1 da a30C, 6-9das a 25C

Conidios enagitacincon perlas

Rompimientode cadenas

suspendieronen solucinsalina (0.9%)

Filtrado en mallade platino

lavados 2veces porcentrifugacin

Resuspender ensolucin salina

Se utilizaron 7 cepas mutantes inducidas concido nitroso y una cepa de origen

espontneo.


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Mutantes Ad- 3difieren de las demspor el desarrollo de

un pigmentoprpura en el micelio

y conidios cuandocrece en glicerol

completo

La acumulacinde tal pigmento

se elimina al

agregar 250 mgde sulfato deadenina por

litro.

La densidad de suspensiones de conidios semidi en un fotocolormetro y el punto

mximo de absorcin se encontr a 750m.


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TRATAMIENTOS

Suspensin de conidiosen matraces deErlenmeyer en unagitador rotatorio enbao de agua a 25

5 min antes de

detener eltratamiento.

Despus delostratamientosNA, EMS oICR-170

Resuspender en suspensinsalina mnima de Friesajustada a un pH de 8 conNaOH.

Todos los tratamientos sellevaron a cabo consuspensiones conidiales(2X107/ml) en matracesErlenmeyer en un agitadorrotatorio


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TRATAMIENTOCONCIDONITROSO

Conidios fueron

suspendidos en0.05M de unregulador deacetato de sodiode un pH de 4.5

Cf: 0.005M de

NaNO2 y eltratamiento fueinactivado comoha sido descritopasados los 40minutos.

% S R/ 108

S


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TRATAMIENTO CON HIDROXILAMINA


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TRATAMIENTOCONHIDROXILAMINA

Antes deltratamiento

HA, los conidiosfueron

suspendidos enNaCl 3M

Dilucin 5 vecesen la mezcla de

reaccin HAconcentracin

final 1M

5 minutos antes de detenerel tratamiento, centrifug ydecantados y en el tiempode detener la reaccin (300minutos despus de

iniciado el tratamiento)

Los conidios

fueronresuspendidosen NaCl 3M

los conidios fueronresuspendidos en la

solucin salina mnima deFries ajustada a un pH de 8.

% S R/ S


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Tratamientocon ICR-170

Suspensin deconidios

Suspender en reguladorde fosfato 0.067M pH 7

Adicin de un volumen deICR-170 a 49 volmenes de

suspensin de conidia

Concentracinfinal de 10.58M

Tratamientoterminado130min.Despus

Procedimiento realizadoen luz Roja, y las cajas

incubadas en oscuridad

% S R/ S

ESTIMACINDE LAVIABILIDADDELOSCONIDIOS


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TRATADOSYNOTRATADOS.

Medios de cultivo

Fueron sembrados en medio mnimo deWestergaard suplementado con sorbosa(15g/l), glucosa (0.5 g/l), fructosa (0.5 g/l),cido casamino (200mg/l), una solucinvitaminada en glicerol completo (1 ml/l),y adenin sulfato (25 mg/l)

Para estimar el nmero derevertores los conidios fueronsembrados en el mismo sustratousado para los sobrevivientesanotados pero suplementado con0.2 mg/l de adenin sulfato en lugarde 25mg/l de adenin sulfato.


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CONTEO DE REVERTIENTES DESPUESDEL TRATAMIENTO CON NA, EMS E

ICR-170

Conidios sembrados a una densidad de106/ml y 2X105conidios/ml en unvolumen total de 100ml

CONTEO DE REVERTANTESDESPUES DEL TRATAMIENTO

CON HA

La densidad de los conidios fue de2X105en volumen total de 500ml

DETERMINACIN DESOBREVICENCIA

La densidad de los conidios fue de 5-10conidios por volumen de sustrato envolumen total alrededor de 100 mL

Supresores


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SEANALIZARON20 DIFERENTESMUTANTESINDUCIDOSENELLOCIAD-3PARAOBSERVARLAINCIDENCIADESUPRESORES

EXTRAGNICOSYNINGUNOFUEENCONTRADO.

PORLOTANTO, SEPUDEASUMIRQUELAREVERSINPORSUPRESINFUERADELOSLOCUSAD-3AAD-3BSONMUY

RAROSONOOCURREN.


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Alteraciones genticas inducidas por HA

Tabla 1: Porcentaje de sobrevivientes y frecuencias dereversin de las cepas despus del tratamiento conICR-170, NA, EMS e Hidroxilamina.


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Grafica 1: Incremento del nmero de reversiones (M)despus del tratamiento con HA sobre el nmero demutaciones espontneas (Mo) contra el tiempo de

tratamiento con HA.


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Grafica 2: Porcentaje de sobrevivientes contra eltiempo de tratamiento con HA.

L f i d i Hid il i i l l


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La frecuencia de reversin con Hidroxilamina no es proporcional altiempo en Neurospora, pero s para fagos.

Grafica 3: Cintica de las inducciones de reversiones por HA en lasustitucin par base de la cepa 2-17-155.

Frecuencia de las reversiones por 108 sobrevivientes contra elcuadrado del tiem o del tratamiento de HA.

Heterocarionte

Rpida penetracinde HA.

Reaccin con citosinocurre en dos pasos


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Prctica 2

Induccin demutantes enEscherichia coli


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OBJETIVOS

Conocer el manejo de algunas tcnicas paraproducir mutaciones

Analizar algunos parmetros que caracterizan

el proceso de mutacin como la frecuenciade mutacin y la relacin dosis-respuesta.

Caracterizar el dao producido por la luz UV yHA mediante pruebas de reversin.

MEDIOSDECULTIVO


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MACCONKEY MEDIOMNIMOLACTOSA Medio diferencial

Las bacterias capaces defermentar acidifican elmedio. Se formancolonias rojas o rosadas.

Medio mnimo

Slo crecenmicroorganismoscapaces de utilizar lalactosa como fuentede carbono.

Figura 30. Prueba positiva ynegativa de lactosa enmedio Mac Conkey

MEDIOLURIA(L)

Medio rico

Lac+ Lac-

CEPA


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Se trata de una enterobacteria que se encuentrageneralmente en los intestinos animales, y porende en las aguas negras, pero se lo puedeencontrar en todos lados, dado que es un

organismo ubicuo.

Escherichia coli W3350

Fenotipo: F-, Gal-, Su-, Sms

Escherichia coli

CEPA

DESARROLLOEXPERIMENTAL.T


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TRATAMIENTOCONHIDROXILAMINA

Colectarclulascultivo

E. coliW3350

4000 x g10 min

5 mlmedio L

1 ml

9200 x g3min

Tubo [ HA] MTapar con


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1 ml deHA pH 6

1 0.0

2 0.2

3 0.4

4 0.6

5 0.8

Tapar conpapel

aluminio.Incubar a 37C

en agitacin30 min.

9200 x g3min

Condicionesde

esterilidad

1 mlsol.

SalinaDeterminar el

numero de clulasviables en cada

tubo con dilucionesdecmales

0.5 ml

T b Dil i


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10-14.5 ml

medio L

Tubo Dilucin

1 10-5, 10-6

2 10-5, 10-6

3 10-4, 10-54 10-4, 10-5

5 10-4, 10-5

Sol.

salina

Por duplicado

0.1 ml

MacConkey

Incubar37C18 h

Incubar tuboscon dilucin 10-1

37C 18 h

DA1. TRATAMIENTOCONLUZULTRAVIOLETA


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Dilucin1:20 E.

coli

W3350

Medio L20 ml

Incubar a 37 conagitacin hasta

obtener una densidad

ptica de 60 unidadesKlett equivalente a

As600nm =1.12 (aprx15h)

4000 x g15 min

Resuspender6 ml Sol.salina

500 ul

4.5 ml

medio L 10-1


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5.5 ml Irradiar por 15, 30, 45 y 60 segundos

0.5 ml

4.5 mlmedio L

Tiempo deirradiacin

Dilucin

0 10-5, 10-6

15 10-5

, 10-6

30 10-5, 10-6

45 10-5, 10-6

60 10-4, 10-5

Sol.salina


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0.1 ml

MacConkey

Por duplicado

Incubar37C18 h

Incubar tuboscon dilucin 10-1

37C 18 h

DA2. CUENTADESOBREVIVIENTESYSIEMBRAPARASELECCIONARMUTANTES


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Cuenta desobrevivientes

colonias blancasLac-

Calcular el ttulode sobrevivientes ytrazar grfica de %

de sobrevivenciavs [HA] o tiempo

de irradiacin.

Prepara diluciones10-6, 10-7 y 10-8 De la

dilucin 10-1 Medio L

0.1 ml

MacConkey

Sembrar una cajade la dilucin 10-6 ydos de 10-7 y 10-8

incubar a 37C 18h

NOpicar lascolonias

DA3. REVERSINCalc lar frec encia de


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Cuenta desobrevivientes

colonias blancasLac-

NO

picar lascolonias

Calcular frecuencia demutacin (FM)

Elaborar la curva dosis-respuesta,considerando la dosis del mutgeno

empleadas y las frecuencias demutacin calculadas.

DETERMINACINDELTIPODEMUTACINPRODUCIDOPORLALUZUV Y HA


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UV YHA

Una coloniaaislada Lac-

0.5 ml medio L

Agar blandofundido

0.1 mL

Medio Mnimo Lactosa

Papel filtro estril


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Impregnar 20 ul

Estreptomicina y9-aminoacridina

Nitrosoguanidinay 5-bromouracilo

Hidroxilamina Nada

Incubar a 37C 5 das, observndolas diariamente para registrar laaparicin de revertantes. De acuerdo a los resultados obtenidos y

tomando en cuenta el tipo de lesin que produce cada mutgeno,proponer que tipo de lesiones produjeron la HA y la luz UV


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BIBLIOGRAFA

Klug W.S. (et. Al.), Conceptos de gentica, 5edicin, ED. PRENTICE HALL, Madrid (1999)pg. 411-412, 423-430

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d=S0718-34292009000300009#img01 http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/13agfisico

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Inducción de Mutantes en Escherichia Coli 1

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