Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

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Facultad de Ciencias Veterinarias -UNCPBA- Detección y aislamiento de Escherichia coli verocitotoxigénico en medias reses bovinas y porcinas Eguia, Valeria Raquel Fernandez Fellenz, Daniel - Elichiribehety, Elida. Agosto, 2017 Tandil

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Facultad de Ciencias Veterinarias

-UNCPBA-

Detección y aislamiento de Escherichia coli verocitotoxigénico en medias reses bovinas y

porcinas

Eguia, Valeria Raquel – Fernandez Fellenz, Daniel - Elichiribehety, Elida.

Agosto, 2017

Tandil

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Detección de Escherichia coli verocitotoxigénico en medias

reses bovinas y porcinas

Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos,

presentada como requisito para optar al título de grado de Licenciado del

estudiante: Eguia, Valeria Raquel

Director: Dr. Daniel Fernández Fellenz

Codirector: M. V. Elichiribehety Élida

Evaluador: Dra. Nora L. Padola

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DEDICATORIAS

A mis papas y hermano por su incondicional amor y sostén.

A Daniel por impulsarme a finalizar esta etapa y acompañarme en cada

momento y decisión.

A todos mis amigos, especialmente a Gisele, Lucrecia, Nadia, Damiana, Rocio,

Cintia, Celeste, Sandra, Mariana, Inés y Emilia por compartir los buenos y

malos momentos y siempre darme una palabra de apoyo para finalizar mis

estudios.

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AGRADECIMIENTOS

A la Dirección General de Bromatología y a todo el equipo que integra el

Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología la Facultad de Ciencias

Veterinarias, especialmente a la Dra. Nora L. Padola, por brindarme el espacio

donde llevar a cabo este trabajo de investigación.

A Lía Elichiribehety, por acompañarme y brindarme su apoyo en todo

momento.

A Daniel Fernandez, por aceptarme para realizar esta tesis bajo su dirección, y

dedicarme su tiempo y asesoría.

A Maria Rosa Ortiz, por siempre brindar su ayuda y su calidez humana.

A todas aquellas personas que compartieron sus conocimientos conmigo para

hacer posible la realización de esta tesis.

Todo este trabajo ha sido posible gracias a ellos.

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RESUMEN DE TESIS

Escherichia coli verocitotoxigénico (VTEC) es un patógeno causante de brotes y casos esporádicos de Colitis Hemorrágica (CH) y Síndrome Urémico Hemolítico (SUH). En Argentina, el SUH es endémico y en la ciudad de Tandil se han registrado varios casos. VTEC posee factores de virulencia que le confieren poder patógeno. Si bien VTEC se encuentra en el intestino de varias especies, el bovino es el mayor reservorio, y la carne es uno de los principales alimentos implicados en la transmisión de esta bacteria al hombre. El Código Alimentario Argentino, exige la ausencia de O157:H7 en la carne, por lo cual es importante conocer cuál es la situación de VTEC en medias reses. En este trabajo se detectó, aisló y caracterizó cepas VTEC positivas en medias reses bovinas y porcinas, destinadas a consumo minorista en el partido de Tandil, indicando que son fuente de VTEC potencialmente patógenos para el hombre. Los resultados obtenidos refuerzan la necesidad de incorporar medidas de control a lo largo de la cadena de producción de la carne para asegurar la calidad de los alimentos destinados al consumo y el control en el cumplimiento efectivo de las buenas prácticas. PALABRAS CLAVE: Escherichia coli, VTEC, media res, Tandil.

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INDICE

MARCO TEÓRICO .............................................................................................. - 1 -

Enfermedades Transmitidas por Alimentos ......................................................... - 1 -

Escherichia coli ................................................................................................... - 2 -

Aspectos morfológicos ..................................................................................... - 3 -

E. coli patógenas ............................................................................................. - 4 -

Escherichia coli verocitotoxigenico (VTEC) ..................................................... - 5 -

Importancia en la salud ................................................................................ - 6 -

Factores de virulencia .................................................................................. - 9 -

Alimentos y transmisión de VTEC al hombre ............................................. - 11 -

Reservorios de VTEC ................................................................................. - 12 -

Cerdos ........................................................................................................ - 12 -

Bovinos ...................................................................................................... - 13 -

Faena y distribución de carne ........................................................................... - 14 -

Métodos de caracterización molecular .............................................................. - 15 -

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ................................................ - 16 -

OBJETIVOS ...................................................................................................... - 18 -

Objetivo general ................................................................................................ - 18 -

Objetivos particulares ........................................................................................ - 18 -

MATERIALES Y METODOS ............................................................................. - 19 -

Obtención de muestras ..................................................................................... - 19 -

Procesamiento de las muestras ........................................................................ - 20 -

Reserva de muestras ..................................................................................... - 21 -

Metodología de tamizaje para la detección de VTEC .................................... - 21 -

Aislamiento y caracterización de colonias individuales .................................. - 23 -

Detección de factores de virulencia por PCR ................................................ - 24 -

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RESULTADOS .................................................................................................. - 26 -

Presencia de VTEC en medias reses ................................................................ - 26 -

Aislamiento de cepas VTEC .......................................................................... - 28 -

Detección de factores de virulencia por PCR ................................................ - 29 -

DISCUSIÓN ...................................................................................................... - 31 -

CONCLUSIONES .............................................................................................. - 34 -

BIBLIOGRAFIA ................................................................................................. - 35 -

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- 1 -

CAPITULO I

MARCO TEÓRICO

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) constituyen un serio

problema de salud pública a nivel mundial. Son causadas por la ingesta de

agua o alimentos contaminados con agentes patógenos o con sustancias

tóxicas producidas por estos (Zacarías, 1987).

Pueden ser dolencias pasajeras o llegar a presentar complicaciones,

enfermedades severas, dejar secuelas o provocar la muerte de las personas

afectadas (Arias Rojas, 2012).

Es imprescindible la prevención y el control de las ETA. Para conseguirlo es

necesario implementar buenas prácticas tanto agrícolas como de manufactura

de alimentos (BPM), la realización de procedimientos operativos

estandarizados de sanitización (POES), y la adopción de un sistema de análisis

de peligros y puntos críticos de control (HACCP, Hazard Analysis and Critical

Control Points) (Torres et al., 2005).

La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que cada año se producen

1.700 millones de episodios de diarrea que causan enfermedad en 76 millones

de personas, y provocan la muerte de 760.000 niños menores de cinco años

cada año. Por lo general son consecuencia de la exposición a alimentos o agua

contaminados. En todo el mundo, 780 millones de personas carecen de acceso

al agua potable, y 2.500 millones a sistemas de saneamiento apropiados

(OMS, 2013). En las áreas de salud pública de todo el mundo, se han

establecido como objetivos fundamentales las mejoras en los sistemas de

vigilancia y la detección rápida de los brotes de ETA (Gruber et al., 2015).

Entre los microorganismos patógenos que representan un alto costo económico

a la sociedad de muchos países se encuentran Escherichia coli productor de

verocitotoxinas (VTEC) de los serogrupos O157 y no-O157, Salmonella (no

tifoidea), Clostridium perfringens y Shigella entre otros (USDA, United State

Department of Agriculture).

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Más de 250 ETA son reconocidas y pueden producirse por diferentes causas.

Se pueden clasificar como tóxicas, infecciosas o toxo-infecciosas (Rivas et al.,

2008):

Las ETA tóxicas, o intoxicaciones, suceden a causa de la ingestión de toxinas

producidas por bacterias, hongos, plantas o animales. Estas toxinas de

naturaleza proteica son liberadas por los organismos durante su desarrollo; o

por compuestos químicos, tales como plaguicidas, aditivos alimentarios,

antibióticos, metales pesados u hormonas; y se incorporan a los alimentos ya

sea de manera accidental o intencional en algún momento entre su producción

y su consumo.

Las ETA de origen infeccioso son producidas al ingerirse alimentos que

contienen patógenos vivos, como por ejemplo Salmonella, E. coli, entre otros.

Las ETA toxo-infecciosas se presentan luego del consumo de alimentos

contaminados con microorganismos patógenos vivos que se adhieren,

colonizan ó invaden la mucosa intestinal, se multiplican y producen exotoxinas

que afectan al hospedador.

Escherichia coli

Es una bacteria descubierta en 1885 por el pediatra alemán Dr. Theodor

Escherich (Fig. 1), que se ha transformado en uno de los microorganismos más

estudiados en microbiología (Bettelheim, 2007). Fué denominada Bacterium

coli commune, y se aisló de heces de niños sanos con pocas horas de

nacimiento (Escherich, 1885) y luego fué rebautizada en 1919, en honor a su

descubridor, como Escherichia coli (Kaper, 2005). Este bacilo Gram negativo,

móvil y anaerobio facultativo pertenece al orden de las Eubacteriales, familia

Enterobacteriaceae, Tribu Escherichieae, genero Escherichia, especie coli

(Brenner, 1984). Es la especie anaerobia facultativa más abundante de la flora

normal del tracto intestinal del hombre y de algunos animales siendo una de las

primeras especies bacterianas en colonizar al recién nacido, quien adquiere las

primeras cepas del canal del parto y de las heces de su madre. Posteriormente

las colonizaciones son a causa de la ingestión de alimentos contaminados con

este microorganismo (Sussman, 1985).

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Figura 1. Dr. Theodor Escherich

E. coli puede sobrevivir en el agua y los alimentos (Bettelheim, 2007) siendo

su hábitat "normal" el colon de organismos de sangre caliente. Allí se produce

una simbiosis: el intestino brinda un ambiente propicio para la bacteria,

mientras que esta aporta nutrientes esenciales para el epitelio intestinal,

favorece una respuesta inmune en el huésped y beneficia la síntesis de

vitamina K. Al mismo tiempo, ciertas cepas de E. coli actúan como un factor de

inhibición de crecimiento de patógenos entéricos (Eckburg et al., 2005).

Aspectos morfológicos

Escherichia coli es un bacilo recto, móvil, gram-negativo. Mide entre 1 y 1,5 μm

por 2 a 6 μm, y puede aparecer aislado o en pares. Su estructura está

constituida por una pared bacteriana, fimbrias, flagelos perítricos y una

membrana externa. No obstante, sólo ciertas cepas poseen cápsula y flagelos,

y no se han descripto formas esporuladas (Blanco et al., 2001).

El antígeno superficial somático "O" se encuentra determinado por los azúcares

de las cadenas laterales del lipopolisacárido (LPS) que conforman la

membrana externa de las gram-negativas. Se trata de un polisacárido

termoestable, enmascarado por el antígeno K (capsular) en bacterias que

tienen cápsula (Blanco et al., 1996) (Fig. 2).

Los antígenos flagelares “H" se encuentran presentes en cepas que son

móviles. Tienen naturaleza proteica y son termolábiles, inactivándose a

100 °C/30 min. (Gyles, 2007).

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Figura 2. Estructura de la bacteria Escherichia coli en la que se representan los

antígenos de superficie O, K, H y algunos factores de virulencia. Basado en el

original de Johnson (Clin. Microbiol. Rev. 1991, 4, 80-128).

E. coli patógenas

Ciertas cepas de E. coli son capaces de adquirir genes de virulencia móviles

localizados en islas de patogenicidad, bacteriófagos integrados y/o plásmidos,

y por esto pueden volverse patógenas (Bell, 2002).

Según el tipo de infección que provocan pueden diferenciarse tres grupos de E.

coli patógenas. Un grupo se encuentra conformado por cepas uropatógenas,

causantes de infecciones en el tracto urinario; otro grupo por cepas que causan

sepsis y meningitis neonatal y un tercer grupo de cepas responsables de

infecciones gastrointestinales (Blanco et al., 2001).

Los patotipos asociados a enfermedades entéricas se clasifican en 6 tipos,

según factores de virulencia y mecanismos de acción (Nataro & Kaper, 1998;

Blanco et al., 1993):

E. coli de adherencia difusa (DAEC)

E. coli enteroagregativo (EAEC)

E. coli enteroinvasivo (EIEC)

E. coli enteropatogénico (EPEC)

E. coli enterotoxigénico (ETEC)

E. coli verototoxigénico (VTEC) o E. coli productor de toxina Shiga (STEC)

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En cada grupo las cepas presentan serotipos diferentes, mecanismos de

patogenicidad específicos y causan infecciones y sintomatologías distintas.

Escherichia coli verocitotoxigenico (VTEC) ó Shigatoxigénico (STEC)

Descubierta por el microbiólogo japonés Kishoshi Shiga (Fig. 3) a finales de

1800 al describir el agente causante de la epidemia de disentería ocurrida en

Japón en ese año. La denominó como Shigella dysenteriae. A continuación fue

descrita su toxina designada como toxina Shiga (Shiga, K., 1898) y a fines de

1970 se relacionó a la bacteria S. dysenteriae con la patología conocida como

síndrome urémico hemolítico (SUH), enfermedad que incluye falla renal,

trombocitopenia y anemia hemolítica (Koster et al., 1978).

Figura 3. Kishoshi Shiga

VTEC comprende un grupo importante de patógenos emergentes para seres

humanos; causante de diarrea, colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico

hemolítico (SUH) (Karmali, 1989; Paton & Paton, 1998).

E. coli puede serotipificarse a partir de diferentes combinaciones de los

antígenos superficiales O (somáticos) y H (flagelares), donde el antígeno O

determina el serogrupo y junto al antígeno H constituyen el serotipo de las

bacterias. Mundialmente el serotipo O157:H7 ha ganado notoriedad al

encontrarse involucrado en la mayoría de los casos de enfermedades en

humanos. En Argentina, como en el resto de Latinoamérica, también es

importante la presencia de otros serotipos no-O157:H7 dentro de ellos E. coli

O26:H11, O113:H21, O146:H21, O91:H-, O118:H16, O157:H7, O103:H2,

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O128:H2, O111:H-, O145:H-, algunos pertenecientes a los serogrupos O26,

O45, O103, O111, O121 y O145, referidos en la literatura como «Big Six

STEC», constituyen un problema creciente para la salud pública a nivel mundial

(Brooks, et al., 2005; Johnson et al., 2006).

Las cepas VTEC se encuentran en el tracto intestinal de una amplia variedad

de especies animales, siendo el bovino su principal reservorio. Se transmite al

hombre a través de la ingestión de agua o alimentos contaminados (como

cárnicos mal cocidos, lácteos sin pasteurizar) y a través del contacto directo

con dichos animales (Caprioli et al., 2005).

Importancia de VTEC en la salud pública

Este grupo bacteriano posee la capacidad de ocasionar enfermedad a partir de

una muy baja dosis infectiva estimada en menos de 100 unidades formadoras

de colonias por gramo de alimento (Paton & Paton, 1998); siendo el serotipo

O157 probablemente el más infeccioso, con una dosis infectiva de menos de

15 células (Teunis et al., 2008). Luego de 3 a 5 días de ingerida la bacteria los

síntomas clínicos aparecen (Griffin et al., 1998; López et al., 1998). Las

manifestaciones gastrointestinales comienzan con diarrea acuosa la cual puede

progresar a CH en 1 o 2 días con evidencia de edema y erosión de la mucosa

colónica (Riley, 1987) provocando un cuadro grave de dolor abdominal,

ocasionalmente náuseas y vómitos, y diarrea sanguinolenta (Griffin et al., 1990;

Tarr et al., 2005) no siendo la fiebre una característica de la infección (Thorpe,

2004). La duración media de los síntomas es de una semana y luego la

mayoría de los casos evoluciona hacia una resolución espontánea sin secuelas

evidentes, sin embargo, pueden ocurrir complicaciones como púrpura

trombocitopénica trombótica (PTT) o derivar, como sucede con el 15% de los

pacientes, en SUH con una letalidad del 2 al 5% (Nataro & Kaper, 1998; Karch

et al., 2005; Tarr et al., 2005; Rivas et al., 2003) (Fig.4).

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Figura 4. Imagen extraída de Fernández D y Padola NL (2012). Escherichia

coli verocitotoxigénico: Varias cuestiones... y los tambos también. Revista

Argentina de Microbiología 44, 312-323)

El SUH es un desorden multisistémico caracterizado por un cuadro clínico que

presenta insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y

trombocitopenia grave, con microangiopatía de localización renal y

manifestaciones de lesión isquémica en otros órganos como sistema nervioso

central, retina, miocardio, páncreas e intestino (Elliot et al., 2001; Rivero et al.,

2004).

El SUH es la principal causa de insuficiencia renal aguda y segunda causa de

insuficiencia renal crónica y trasplante renal en niños en la Argentina (Voyer &

Rivas, 1997; Voyer, 1998; Rivas et al., 2003). Es una enfermedad endémica y

presenta un aumento estacional de casos en primavera y verano, afectando a

niños eutróficos, de clase media, con buenas condiciones sanitarias y

ambientales entre los 6 meses y 5 años de edad (Voyer & Rivas, 1997).

Actualmente, el rango de mortalidad de niños con este síndrome es alrededor

del 5% (Rivero et al., 2013) (Fig. 5).

INGESTION DE VTEC

3-4 DÍAS

DOLOR ABDOMINAL

DIARREA ACUOSA

2 DÍAS

5-7 DÍAS

COLITIS HEMORRÁGICA

RESOLUCIÓN (95 % DE LOS

CASOS)

SÍNDROME URÉMICO HEMOLÍTICO

(5 % DE LOS CASOS)

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Figura 5. Distribución de los casos de SUH notificados según grupo etario.

Argentina. 2010-2013. N=1527. Boletín Integrado de Vigilancia, 2010-2013.

En la Argentina se producen entre 300 y 500 casos nuevos por año, con una

tasa de incidencia anual promedio de 1 caso cada 100.000 habitantes. Su

notificación al Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica se estableció

como obligatoria en el año 2000 (Resol. Nro. 346/00) (Rivas et al., 2006). El

año 2008 presentó el número más alto de casos del período 2005-2013 (543

casos), mientras que 2013 presentó el más bajo (319 casos). En el 2015, se

registraron 266 casos de SUH (Boletín Integrado de Vigilancia N°286) (Fig. 6).

Figura 6. Casos y Tasas de SUH. Argentina. 2005-2013.

Boletín Integrado de Vigilancia, E. D. B. I. (2014). Síndrome urémico hemolítico

(SUH) en Argentina, 2010-2013.

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En la Púrpura Trombocitopénica Trombótica (PTT) se observa daño a las

células endoteliales, producción de trombosis, trombocitopenia, aparición de

hemorragias y alteración funcional del órgano afectado (Exeni et al., 1994).

Esta manifestación es observada principalmente en adultos (Besser, 1999) e

incluye los síntomas clínicos del SUH, aunque el compromiso renal es menos

severo y no es precedido por episodios diarreicos.

Factores de virulencia

Los microorganismos patógenos son capaces de producir factores que influyen

en las funciones del hospedante para poder crecer; así, la habilidad de causar

enfermedad está relacionada con la capacidad del microorganismo para

expresar diferentes factores de virulencia (Prescott et al., 2002).

Las cepas patógenas de E. coli poseen distintos tipos de factores de virulencia

que contribuyen conjuntamente a potenciar su patogenicidad. El principal factor

de virulencia de VTEC son las verocitotoxinas (VTs) (Nataro & Kaper, 1998).

Su nombre deriva del efecto citotóxico sobre células de la línea VERO

procedentes de riñón de mono verde africano. También son conocidas como

Shiga-like toxins (Stx1 y Stx2) por su relación biológica y estructural con la

toxina Shiga; en consecuencia, las cepas productores de dichas toxinas se

conocen con el nombre de E. coli verocitotoxigénico (VTEC) o E. coli productor

de toxinas Shiga (STEC) siendo estos nombres equivalentes (Melton-Celsa &

O’brien, 1998). En este trabajo de tesis se adopta la terminología de

verocitotoxinas (VTs) para nombrar a las toxinas y VTEC para las cepas que

las producen. Estas toxinas se encuentran codificadas por bacteriófagos

integrados al genoma de la bacteria. El mecanismo de toxicidad implica la

inhibición de la síntesis proteica en células de varios tejidos, principalmente en

las células del endotelio renal, ya que la toxina producida en el intestino entra a

la circulación y afecta directa e indirectamente el riñón (Karmali et al., 2008).

Las VTs se clasifican en dos tipos VT1 y VT2. Existen diferentes variantes de

cada una de estas toxinas y que, a su vez, poseen distinto grado de

patogenicidad. La VT1 es relativamente homogénea, mientras que la VT2 se

muestra heterogénea y con numerosas variantes. Ambas tienen el mismo

modo de acción sobre las células blanco, pese a esto sus efectos son

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- 10 -

diferentes siendo VT2 mil veces más toxica que VT1 en células de

microvasculatura renal (Louise y Obrig, 1995; Gyles, 2007). Otro factor de

virulencia de algunos VTEC es la capacidad de adhesión y posterior

colonización del epitelio intestinal denominada lesión de adherencia y borrado

del enterocito ó “attaching and effacing” (A/E) lesión considerada la causa

principal de diarrea en el proceso de infección (Nataro & Kaper, 1998). Esta

lesión consiste en el acortamiento de las microvellocidades del enterocito;

adherencia intima de la bacteria a la superficie de la célula y la formación de

una estructura en forma de pedestal provocada por la acumulación de

componentes del citoesqueleto (Nataro & Kaper, 1998) (Fig. 8 y 9). Los genes

responsables de esta lesión están localizados en una isla de patogenicidad

cromosómica llamada LEE “Locus of enterocyte effacement”. Este sitio

contiene al gen eae que codifica a un factor de adherencia llamado intimina,

responsable de la lesión A/E (Paton & Paton, 1998) y genes codificantes del

sistema de secreción de tipo III, involucrado en la secreción de proteínas

bacterianas y la translocación de las enzimas hacia el interior del citosol de la

célula huésped (Kaper et al., 1998).

Existen otros factores de virulencia no codificados en la isla de patogenicidad

LEE; estos factores se encuentran en megaplásmidos. Entre ellos se pueden

identificar:

- Adhesina autoaglutinante de VTEC “Saa”: una proteína de membrana externa

que participa en la adherencia bacteriana codificada por el gen saa y presente

en cepas LEE negativas. Saa fue encontrado en mayor proporción en cepas

aisladas de bovinos comparada con cepas humanas (Jenkins et al., 2003)

pudiendo ser elemental para la colonización de la bacteria al intestino bovino.

- La hemolisina codificada en el operón hly del Mp se denomina hemolisina

enterohemorrágica (E-Hly), es una proteína que actuaría estimulando el

crecimiento bacteriano en el intestino, codificada por el gen ehxA, presente

tanto en cepas LEE negativas como positivas. Pertenece a la familia de las

RTX o citolisinas formadoras de poros. El operón hly es el mejor marcador de

la presencia del pO157, aunque también puede detectarse en los Mp de la

mayoría de las cepas de EHEC no-O157 (Brashears et al., 2003).

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Figuras 8 y 9. Lesión de A/E. Intima adherencia y borrado de las

microvellosidades intestinales. Kaper et al., (2004). Pathogenic Escherichia coli.

Nat. Rev. Microbiol. 2, 123-140.

Alimentos y transmisión de VTEC al hombre

La contaminación de alimentos por VTEC es un importante problema para la

salud pública.

La principal vía de contagio al hombre es a través de la ingesta de alimentos

contaminados de origen animal, como así también, de alimentos alterados por

contaminación cruzada durante la manipulación de los mismos (Gyles, 2007).

Las fuentes de infección por VTEC más importantes son: la carne vacuna,

principalmente la carne picada mal cocida y las hamburguesas (Griffin & Tauxe,

1991; Nataro & Kaper, 1998); lácteos no pasteurizados (leche, yogur, quesos)

provenientes de leche contaminada durante ordeñes con falta de higiene (Sanz

et al., 1998); embutidos fermentados; morcillas; mayonesa; sidra de manzana

no pasteurizada y agua entre otros (Rivas et al., 2003). De igual forma, existen

registros de alimentos de origen vegetal (papa, lechuga, brotes de soja y de

alfalfa) que han sufrido contaminación, tanto por el contacto directo de los

vegetales con heces de animales (durante el cultivo o manipulación) o por

contaminación cruzada (De Boer & Heuvelink, 2001; Cooley et al., 2007).

VTEC puede constituir la flora intestinal de distintas especies animales

incluyendo cerdos, gallinas, ovejas, cabras y perros, siendo el bovino su

principal reservorio.

En Argentina hay una alta prevalencia de VTEC en bovinos alimentados en

pastoreo y a corral (feed-lot), registrándose una prevalencia de 32,8% en

muestreos seriados en ganado alimentado en pastoreo y del 62,7% en ganado

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alimentado en feed-lot (Padola et al., 2004). Etcheverría et al., (2010) hallaron

un incremento en la proporción de muestras contaminadas con VTEC que va

desde un 17% en el matadero, un 25% en carnicerías llegando a un 45%

procesado como carne picada, indicando que el riesgo de contaminación

cruzada aumenta durante la manipulación.

Reservorios de VTEC

El bovino es el principal reservorio de VTEC, a su vez, también se encuentra en

el tracto gastrointestinal y es excretado en las heces de una amplia variedad de

especies animales como ovejas, cabras, perros, gatos, aves, cerdos, roedores,

insectos, especies de vida silvestre y animales de zoológico (Caprioli et al.,

2005; Rangel et al., 2005).

Cerdos

Los cerdos son considerados también una fuente de VTEC. Diferentes

serotipos han sido aislados de productos de carne de cerdo y se han asociadas

con infecciones humanas como la diarrea y el SUH (Sonntag et al., 2005,

Kaufmann et al., 2006, Trotz-Williams et al., 2012). Se han notificado

prevalencias de E. coli O157:H7 del 0,2 al 2% en Europa (Heuvelink et al.,

1999; Johnsen et al., 2001; Wasteson, 2001; Bonardi et al., 2003), Japón

(Nakazawa et al., 1999) y Estados Unidos (Feder et al., 2003). Por el contrario,

en Chile, Ríos et al. (1999) han encontrado que el 69% de los porcinos fueron

portadores de cepas VTEC pertenecientes a los serogrupos O157, O111 y

O26. Estudios realizados en nuestro país indicaron la presencia de VTEC en el

58,1% de los porcinos analizados, con un predominio del serogrupo O138 en

lechones (Notario et al., 2000; Parma et al., 2000).

Una investigación reciente reporta la prevalencia y caracterización de VTEC en

toda la cadena productiva del cerdo; en granjas (2,86%); durante la faena

(4,08%); en salas de desposte (6%) y en los puntos de venta (4,59%),

sugiriendo una transmisión vertical (Colello et al., 2016).

Con respecto a productos derivados, el Código Alimentario Argentino establece

especificaciones microbiológicas tanto para E. coli O157:H7 como para E. coli

no-O157 (de los serogrupos O145, O121, O26, O111 y O103) en chacinados y

embutidos. Los embutidos fermentados poseen estabilidad y bajo riesgo

sanitario gracias a la reducción de la actividad de agua; al rápido desarrollo de

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las BAL (bacterias ácido lácticas), que reducen el pH; y la adición de nitratos y

nitritos que contribuye a prevenir el crecimiento de microorganismos patógenos

y alterantes. Asimismo, los obstáculos presentes en los embutidos en general

son insuficientes para evitar el crecimiento de E. coli O157:H7 (Glass y col.,

1992; Nissen y Holck, 1998).

Se desconoce si la contaminación de los alimentos derivados del cerdo se

produce durante el procesamiento o por contaminación cruzada (Tseng et al.,

2014). Por lo que se considera importante conocer, aún más, el papel de los

cerdos como reservorio de VTEC y la transmisión en la cadena de producción

porcina (Ercoli et al., 2015).

Bovinos

Numerosos estudios han detectado VTEC en bovinos a nivel mundial (Blanco

et al., 1993; Miyao et al., 1998; Caprioli et al., 2005; Aidar-Ugrinovich et al.,

2007). Sanz et al. (1998), Parma et al. (2000), Meichtri et al. (2004), Padola et

al. (2004), Mercado (2006) y Fernández et al. (2012) demostraron que el

ganado bovino es el principal reservorio de esta bacteria en Argentina.

Diversos factores se asocian a la variación en la prevalencia de VTEC en

bovinos, entre los que se incluyen edad, destete, movimientos de hacienda,

estación del año, dieta, y la capacidad de la bacteria de persistir en el medio

ambiente (Cobbold & Desmarchelier, 2000; Fernández et al., 2012).

En otros países, diversos estudios de estacionalidad están referidos sólo al

serotipo O157:H7, siendo su excreción fecal baja en invierno, incrementándose

en primavera y alcanzando niveles pico en los meses de verano. Los brotes

humanos de infecciones con este serotipo imitan este modelo de excreción en

bovinos ocurriendo principalmente en meses de verano (Parry & Palmer 2000;

Wallace et al., 2000; Edrington et al., 2006).

En Argentina, Sanz et al., (1998) encontraron prevalencias del 32,8% de VTEC

en bovinos adultos en pastoreo y 44% en bovinos de matadero. También,

aislaron serotipos patógenos como O26:H11, O103H-, O103:H2 y 0111:H- de

materia fecal de terneros. En animales en pastoreo y prefaena, Parma et al.

(2000) el serotipo O157:H7 no fue aislado, sin embargo se encontraron

serotipos compartidos con alimentos cárnicos, como O20:H19, O91:H21,

O113:H21, O117:H7 y 0171:H2. Estudios realizados por Padola et al. (2004)

Page 21: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 14 -

confirman la liberación intermitente de VTEC al ambiente, lo que incrementa la

transmisión entre animales y permite la reinfección. Etcheverría et al. (2010),

determinaron la prevalencia de VTEC a lo largo de la cadena de producción de

carne en provincia de Buenos Aires detectando VTEC en el 12,3% de las reses

en frigorífico y en el 18,6% de las reses que llegaban a la cabina de control

sanitario.

Faena y distribución de carne

La carne bovina es el principal alimento implicado en la contaminación con

VTEC. Es un medio ideal para el desarrollo de microorganismos debido a sus

nutrientes, disponibilidad de agua y pH.

El Código Alimentario Argentino (CAA) en el Capítulo VI, Artículo 247, define:

“Con la denominación genérica de Carne, se entiende la parte comestible de

los músculos de los bovinos, ovinos, porcinos y caprinos declarados aptos para

la alimentación humana por la inspección veterinaria oficial antes y después de

la faena. La carne será limpia, sana, debidamente preparada, y comprende a

todos los tejidos blandos que rodean al esqueleto, incluyendo su cobertura

grasa, tendones, vasos, nervios, aponeurosis y todos aquellos tejidos no

separados durante la operación de la faena.” Entendiéndose por faena al

trabajo comprendido desde el sacrificio del animal, pasando por su entrada a

cámara frigorífica, hasta su expendio con destino al consumo o industrialización

de la res, las medias reses o cuartos (Decreto 4238/68, Articulo 1.1.13).

La contaminación de la carne con VTEC se da durante la faena del animal en el

frigorífico, fundamentalmente durante el desollado y evisceración, momento en

el cual llegan a la superficie de la media res cepas de E. coli procedente de la

flora intestinal (Meng & Doyle, 1998). Una sola fuente (un animal o el entorno

de uso) pueden contaminar las canales no sólo durante desuello, sino también

durante las etapas posteriores, siendo algunas zonas de la media res más

propensas que otras a la exposición y a la contaminación potencial o cruzada.

La variabilidad de la contaminación puede ser originada en factores tales como

el tamaño de la planta, el diseño, el equipo, la automatización, la velocidad de

la faena, las instalaciones, la ubicación geográfica, el tipo de animal y la

formación del personal (Etcheverría et al., 2010).

Page 22: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 15 -

Los establecimientos dedicados a elaborar carnes, subproductos y derivados

pueden ser oficiales o privados. En Argentina el CAA y el decreto reglamentario

4238/68 regulan normativamente a los establecimientos con habilitación

nacional, mientras que en la Provincia de Buenos Aires lo hace la ley 11.123

(Ley Provincial Sanitaria de Carnes) siendo el Ministerio de Asuntos Agrarios el

organismo de aplicación.

La ley 11.123 y su decreto reglamentario (2683/93) rige la habilitación y

funcionamiento de establecimientos donde se faenen animales, se elaboren,

depositen o transporten productos, subproductos y derivados de origen animal,

la habilitación de los vehículos o medios de transporte usados, como así

también, las distintas categorías y el ámbito de comercialización en el territorio

de la Provincia de Buenos Aires considerando:

Matadero A: Establecimiento donde se sacrifican animales, poseen Cámara

Frigorífica, pudiendo efectuar tareas de elaboración y/o industrialización e

incluye el tráfico federal y la exportación de los productos derivados de la faena

y las carnes industrializadas.

Matadero B: Su ámbito de actuación será el abastecimiento del territorio de la

Provincia de Buenos Aires.

Matadero C: Su ámbito de actuación será el abastecimiento del Partido dentro

del cual está instalado.

Matadero Rural: Su ámbito de actuación será el abastecimiento de la zona rural

donde funciona.

En la ciudad de Tandil, el abastecimiento de carne, tanto porcina como bovina,

procede de diez frigoríficos ubicados en distintas localidades dentro de la

Provincia de Buenos Aires (Dolores, Saladillo, Azul, General Madariaga,

Navarro, Ayacucho y Tandil), los cuales poseen habilitación de tipo B (transito

provincial).

Métodos de caracterización molecular

La elección del método a utilizar para la detección o recuento de

microorganismos debe privilegiar a aquellos métodos estandarizados y de alta

sensibilidad que hayan sido validados por organismos

Page 23: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 16 -

internacionales/nacionales de referencia. (Código Alimentario Argentino, Art.

1413 y 1414).

En los últimos años ha habido avances en el impulso de nuevas tecnologías

para la detección y la separación de microorganismos de los alimentos. El

desarrollo de diversas técnicas moleculares e inmunológicas brinda ventajas

sobre los métodos tradicionales, específicamente en lo que refiere a velocidad.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La técnica molecular de tipificación genética más empleada en la actualidad es

la de PCR (polymerase chain reaction ó reacción en cadena de la polimerasa),

utilizada para la detección de genes codificantes de factores de virulencia como

vt y eae. Esta técnica es un procedimiento específico, sensible y rápido que

consiste en la amplificación de un fragmento de ADN específico sitiado por

secuencias de ADN únicas, sobre las cuales se diseñan oligonucleótidos

cebadores o primers. Estos primers están diseñados de tal forma que uno de

ellos es complementario a una cadena de la molécula de ADN en uno de los

lados de la secuencia, y el otro es complementario a la otra cadena de la

molécula de ADN del lado opuesto. Posteriormente la ADN Taq Polimerasa

sintetiza cadenas de ADN nuevas empleando como molde la secuencia

localizada entre los primers. Finalmente se produce la repetición de ciclos de

desnaturalización a alta temperatura, la hibridación de los primers y la síntesis

enzimática de ADN dando como resultado una amplificación exponencial de la

secuencia original de ADN (Griffiths & Gupta, 2002).

Page 24: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 17 -

Teniendo en cuenta que:

Argentina tiene una alta incidencia de diarrea en niños y es el país con

mayor ocurrencia de casos de SUH a nivel mundial.

Un alto número de casos están asociados al consumo de carne bovina

contaminada con VTEC.

La ciudad de Tandil posee un clima ideal para la elaboración de

productos derivados de cerdo como son los chacinados embutidos, los

cuales, por lo general, no poseen los obstáculos suficientes para evitar

el crecimiento E. coli patógenas.

Durante las primeras 14 semanas del 2017 han sido notificados 57

casos de SUH en la provincia de Buenos Aires (Boletín Integrado de

Vigilancia - N° 356 – SE 16- 2017).

En la ciudad de Tandil han sido numerosos los casos de SUH y diarrea

denunciados, registrándose el fallecimiento de una menor en febrero del

año 2017 (“Nena que vivía en campo de Tandil falleció de Síndrome

Urémico”, 2017).

Se plantea la siguiente hipótesis:

“Las medias reses porcinas y bovinas que se destinan a consumo en la ciudad

de Tandil son fuente de VTEC potencialmente patógenos para el hombre”

Page 25: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 18 -

CAPITULO II

OBJETIVOS

Objetivo general

Detectar, aislar y caracterizar cepas VTEC O157:H7 y no-O157:H7 en

carne procedente de medias reses bovinas y porcinas destinadas a

consumo minorista en el partido de Tandil.

Objetivos particulares

Establecer el grado de contaminación por VTEC en medias reses de

bovinos y porcinos.

Aislar y caracterizar cepas VTEC pertenecientes a serotipos O157:H7 y

no-O157:H7 mediante la técnica de PCR.

Aportar datos que contribuyan a la implementación de estrategias para

la prevención y el control del SUH en Tandil.

Page 26: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 19 -

CAPITULO III

MATERIALES Y METODOS

Obtención de muestras

Durante los meses de marzo y abril del año 2016, en la Cabina Sanitaria que

corresponde al Servicio de Bromatología de la ciudad de Tandil, se tomaron

muestra de un total de 60 medias reses bovinas y 60 porcinas.

Las medias reses llegan a la ciudad de Tandil en camiones provenientes de

diez frigoríficos (A, B, C, D, E, F, G, H, I y J) procedentes de Ayacucho, Azul,

Dolores, General Madariaga, Marcos Paz, Navarro, Saladillo, y Tandil, de los

cuales cinco frigoríficos sólo transportan medias reses bovinas (A, B, C, E y J);

tres transportan tanto medias reses bovinas como porcinas (D, G y H); y dos

transportan sólo medias reses de cerdo (F e I).

Las muestras se tomaron aleatoriamente en función de la llegada de los

camiones a la Cabina Sanitaria de Bromatología, donde se registran

e inspeccionan (Tabla 1).

La toma de muestra se realizó mediante esponjados sobre diferentes regiones

de las medias reses. Para evitar contaminaciones durante la toma de muestra

se utilizaron esponjas de goma espumas estériles y secas, contenidas en

bolsas de nylon estériles (Fig. 10).

Por media res se utilizó una bolsa con dos esponjas; con una se tomó muestra

de la parte superior (cuello/pecho en media res bovina y cabeza/vientre en

porcina), mientras que con la otra, la zona inferior (cadera/falda en los bovinos

y lomo/jamón en el caso de medias reses porcinas).

Figura 10. Bolsa estéril con esponja para la toma de muestra.

Page 27: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 20 -

Frigorífico Cerdos Bovinos TOTAL

A - 7 7

B - 12 12

C - 7 7

D 15 9 24

E - 6 6

F 12 - 12

G 10 9 19

H 13 7 20

I 10 - 10

J - 3 3

TOTAL 60 60 120

Tabla 1. Tipos y números de muestra obtenidas de los distintos frigoríficos.

Procesamiento de las muestras

Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Inmunoquímica y

Biotecnología de la Facultad de Ciencias Veterinarias (FCV-UNCPBA-

CIVETAN).

Para el procesamiento de las muestras se utilizó un método rápido desarrollado

por Uyttendaele et al., (1998) para el procesamiento de carne picada (Fig. 11).

Cada muestra, contenida en bolsa, se cultivó en 100 ml de agua peptonada y

se incubó a 37°C durante 28 h con agitación a 100 RPM.

Se tomaron 1750 µl del cultivo anterior y se centrifugaron durante 4 min a

2000 RPM, para eliminar partículas del alimento.

Una alícuota del sobrenadante (1300 µl) se centrifugó durante 3 min a

11.600 RPM, para concentrar las bacterias.

El "pellet" se resuspendió en 34 µl de agua bidestilada estéril, se hirvió

durante 10 min. y se centrifugó durante 2 min. a 11.600 RPM, para

conseguir la lisis celular y liberación de ADN.

El sobrenadante (aproximadamente 40 µl) se reservó para PCR.

Page 28: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 21 -

Figura 11. Esquema del método de procesamiento de muestra.

Reserva de muestras

Se tomó una alícuota de 800 µl del cultivo de cada muestra con 200 µl de

glicerol y se conservó a -70 °C para futuros estudios.

Metodología de tamizaje para la detección de VTEC

Para la detección de genes codificantes de verocitotoxinas (vt1 y vt2) se

empleó PCR-multiplex utilizando el protocolo por Paton & Paton (2002).

Para la preparación de cada cocktail multiplex vt1-vt2 (vol. final: 25 µl) se

utilizaron:

Agua Bidestilada: 13, 2 µl

Buffer de reacción 10x: 2, 5 µl

Gelatina: 2, 5 µl

MgCl2 (INBIO, HighWay): 2 µl

Desoxinucleósidos trifosfatos (dNTPs) (INBIO, HighWay): 0, 2 µl

Primers para:

vtx1R: 0, 5 µl

vtx1F: 0, 5 µl

Método rápido

Enriquecimiento en agua peptonada

↓ 28hs

Centrifugar 4 min a 2000 RPM

Centrifugar sobrenadante - 3 min a 11.600 RPM

Resuspender el “pellet”

Hervir 10 min

Centrifugar sobrenadante - 2 minutos a 11.600 RPM

PCR múltiple

Page 29: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 22 -

vtx2R: 0, 5 µl

vtx2F: 0, 5 µl. (Tabla 2)

Taq ADN polímerasa (INBIO, HighWay): 0, 1 µl

ADN problema: 2, 5 µl

Gen Primers – secuencia (5’ – 3’) Tamaño del amplimero

(pb)

vt1 vt1F-ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC v1R-AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC

180

vt2 vt2F-GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC vt2R-TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT G

255

Tabla 2. Primers utilizados para la detección de genes de virulencia por PCR –

MULTIPLE (Paton & Paton, 2002).

El termociclado (Tabla 3) se realizó en cicladores térmicos programables:

Ivema modelo T17 y Multi Gene Thermal Cycler.

Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis en geles de

agarosa al 2% (p/v), se tiñeron con Bromuro de etidio y se visualizaron con luz

UV.

ciclos 1 a 9

1’ 2’ 1, 5’

95°C 65°C 72°C

ciclos 10 a 15

1’ 2’ 1, 5’

95°C 65°C a 60°C (-1°C/ciclo) 72°C

ciclos 16 a 24

1’ 2’ 1, 5’

95°C 65°C 72°C

ciclos 25 a 35 1’ 2’ 2, 5’

95°C 65°C 72°C

Tabla 3. Termociclado de la reacción PCR – MULTIPLE para la detección de

factores de virulencia (vt y vt2).

Page 30: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 23 -

Aislamiento y caracterización de colonias individuales

A partir de las muestras conservadas a -70°C se sembraron las que

resultaron vt positivas en placas de agar MacConkey y se incubaron 24 h a

37°C.

Se realizaron "pooles" de 5 colonias que se colocaron en 500 µl de agua

bidestilada estéril.

Cada pool se hirvió durante 10 min. y se centrifugó durante 2 min. a 11.600

RPM, para conseguir la liberación de ADN y detectar los genes vt1 y vt2

por PCR múltiple.

De los pooles positivos, cada colonia individual se cultivó en 800 µl de L/B,

durante 18 h a 37°C con agitación.

Luego, se colocó una anzada de cada colonia individual cultivada en L/B en

500 µl de agua bidestilada estéril, se hirvió durante 10 min. y se centrifugó

durante 2 min. a 11.600 RPM, para conseguir la liberación de ADN y volver

a detectar los genes vt1, vt2 por PCR múltiple.

Se analizaron aproximadamente 200 colonias de las muestras positivas.

(Fig. 12)

PCR múltiple para vt1 y vt2

vt1 / vt2 +

Siembra en agar MacConkey

Pooles de 5 colonias

PCR múltiple para vt1 y vt2

Figura 12. Metodología de tamizaje de VTEC por PCR, cultivo y separación

Page 31: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 24 -

Detección de factores de virulencia por PCR

En las muestras positivas a vt y vt2 aisladas se investigaron los genes

codificantes para vt1, vt2, eae, ehxA y saa.

Para la preparación de cada cocktail multiplex vt1-vt2 (vol. final: 45 µl) se

utilizaron:

Agua Bidestilada: 26, 4 µl

Buffer de reacción 10x: 5 µl

Gelatina: 5 µl

MgCl2 (INBIO, HighWay): 4 µl

Desoxinucleósidos trifosfatos (dNTPs) (INBIO, HighWay): 0, 4 µl

Primers para (Tabla 4):

vtx1R: 1 µl

vtx1F: 1 µl

vtx2R: 1 µl

vtx2F: 1 µl

saa DF: 1 µl

saa DR: 1 µl

eae1: 1 µl

eae 2: 1 µl

hlyAR: 1 µl

hlyAF: 1 µl

Taq ADN polímerasa (INBIO, HighWay): 0, 2 µl

ADN problema: 5 µl

Gen Primers – secuencia (5’ – 3’) Tamaño del

amplimero (pb)

vt1

vt1F-ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC v1R-AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC

180

vt2

vt2F-GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC vt2R-TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT G

255

eae

eaeAF-GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC eaeAR-CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG

384

Page 32: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 25 -

ehxA

hlyAF-GCA TCA TCA AGC GTA CGT TCC hlyAR-AAT GAG CCA AGC TGG TTA AGC T

534

saa

saaDF-CGT GAT GAA CAG GCT ATT GC saaDR-ATG GAC ATG CCT GTG GCA AC

119

Tabla 4. Primers utilizados para la detección de genes de virulencia por PCR –

MULTIPLE (Paton & Paton, 2002).

El termociclado (Tabla 5) se realizó en cicladores térmicos programables:

Ivema modelo T17 y Multi Gene Thermal Cycler.

Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis en geles de

agarosa al 2% (p/v), se tiñeron con Bromuro de etidio y se visualizaron con luz

UV.

ciclos 1 a 9

1’ 2’ 1, 5’

95°C 65°C 72°C

ciclos 10 a 15

1’ 2’ 1, 5’

95°C 65°C a 60°C (-1°C/ciclo) 72°C

ciclos 16 a 24

1’ 2’ 1, 5’

95°C 65°C 72°C

ciclos 25 a 35 1’ 2’ 2, 5’

95°C 65°C 72°C

Tabla 5. Termociclado de la reacción PCR – MULTIPLE para la detección de

factores de virulencia (vt, vt2, eae, ehxA y saa).

Page 33: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 26 -

CAPITULO IV

RESULTADOS

Características de los camiones frigoríficos

Las características de los camiones frigoríficos, operarios y medias reses eran

variables:

Se observaron camiones con mala higiene (pisos sucios con barro, pasto,

sangre) así como camiones perceptiblemente limpios y ordenados.

Operarios que presentaban sus vestimentas y calzados con restos de

sangre, barro y suciedad, mientras que otros lucían tanto indumentaria

como botas aseadas. También se diferenciaron comportamientos entre los

operarios con respecto a la manipulación de las medias reses, como por

ejemplo, algunos manipulaban las canales tomando directamente la carne

mientras que otros lo hacían desde los ganchos evitando tocar alguna zona

de la media res.

Las medias reses presentaban distintos grados de limpieza. Se pudo valorar

que luego de tomadas las muestras, algunas esponjas presentaban color

negro propio de suciedad; otras, color rojo correspondiente a sangre, y otras

no presentaban ningún tipo de coloración.

Las medias reses de cerdo y bovinos trasladadas en el mismo camión,

dependiendo del frigorífico proveedor, eran transportadas unas al lado de

las otras sin separación por especie, mientras que en otros camiones, se

encontraban separadas.

Un distribuidor de cerdo transportaba las unidades con la parte inferior

envuelta en un film y con etiqueta de trazabilidad.

Presencia de VTEC en medias reses

La presencia de VTEC se detectó en medias reses porcinas y bovinas

mediante el tamizaje por PCR específico para genes codificantes de

verocitotoxinas. De 120 medias reses muestreados, 13 (10,83%) fueron VTEC

positivos. La mayor presencia de VTEC fue detectada en medias reses

Page 34: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 27 -

bovinas. El número y porcentaje de muestras positivas a VTEC se detalla en la

tabla 1.

Tipo de muestra Total

muestreados

VTEC Positivos

(Nro.)

VTEC Positivos

(%)

Porcinos 60 3 5

Bovinos 60 10 16,66

TOTAL 120 13 10,83

Tabla 6. Número y porcentaje de muestras positivas a VTEC.

Las muestras positivas totales obtenidas de cada frigorífico fueron variables.

(Tabla 7). Los mayores porcentajes de muestras de bovinos VTEC positivos se

obtuvieron de los camiones procedentes de los frigoríficos A, H y D, el cual, a su

vez, fue el único transporte del cual se obtuvieron muestras de cerdos VTEC

positivos.

Frigorífico Cerdos (%) Bovinos (%) TOTAL (%)

A - 2/7 (28) 2/7 (28)

B - 1/12 (8,33) 1/12 (8,33)

C - 1/7 (14,3) 1/7 (14,3)

D 3/15 (20) 3/9 (33,33) 6/24 (25)

E - 0/6 (0) 0/6 (0)

F 0/12 (0) - 0/12 (0)

G 0/10 (0) 1/9 (11,11) 1/19 (5,26)

H 0/13 (0) 2/7 (28) 2/20 (10)

I 0/10 (0) - 0/10 (0)

J - 0/3 (0) 0/3 (0)

TOTAL 3/60 (5) 10/60 (16,66) 13/120 (10,83)

Tabla 7. Número y porcentaje de muestras positivas a VTEC de cada frigorífico.

Page 35: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 28 -

De los 5 frigoríficos que sólo transportan medias reses bovinas 3 fueron

VTEC positivos (60%).

No se detectó ningún cerdo VTEC positivo de los 2 frigoríficos que sólo

trasladan medias reses de cerdo (0%).

Muestras de los 3 frigoríficos que transportan tanto medias reses bovinas

como porcinas fueron VTEC positivas en las muestras de bovinos (100%) y

solo uno presento muestras de cerdos VTEC positivas (33,33%).

Aislamiento de cepas VTEC

El aislamiento de colonias individuales a partir de los resultados vt1-vt2

positivos en placas de agar MacConkey (Fig. 13).

Figura 13. Crecimiento de E.coli en agar MacConkey.

Se aislaron y analizaron más de 200 de colonias de las muestras positivas. De

5 muestras se pudieron aislar colonias VTEC positivas. De igual forma, hubo

muestras positivas de las que no se pudieron obtener aislamientos (Tabla 8).

Page 36: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 29 -

N° de muestra

(vt1-vt2 positivo) Especie Frigorífico origen Aislamientos

1 Bovino B 4

2 Bovino C -

3 Bovino D -

4 Bovino D 1

5 Porcino D -

6 Porcino D -

7 Porcino D -

8 Bovino G 4

9 Bovino H 1

10 Bovino H -

11 Bovino A 1

12 Bovino A -

13 Bovino D -

Tabla 8. Aislamientos de colonias a partir de muestras vt1-vt2 positivo.

Detección de factores de virulencia por PCR

Se obtuvieron 11 asilamientos de colonias VTEC positivas provenientes de 5

muestras vt1-vt2 positivas. Todos pertenecientes a muestras obtenidas de

bovinos.

Una muestra presentó el gen ehxA. No se detectó el gen eae en ninguno de los

aislamientos, asimismo, todos los aislamientos presentaron el gen saa (Fig. 14

y tabla 9).

Figura 14. Detección de genes codificantes para vt1, vt2, eae, ehxA y saa por

PCR.

Page 37: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 30 -

N° de referencia N° de muestra

(vt1-vt2 positivo) Frigorífico origen Genotipo

1 1 (1 de 4) B vt1, saa

2 1 (2 de 4) B vt1, saa

3 1 (3 de 4) B vt1, saa

4 1(4 de 4) B vt1, saa

5 8 (1 de 4) G vt2, saa

6 8 (2 de 4) G vt2, saa

7 8 (3 de 4) G vt2, saa

8 8 (4 de 4) G vt2, saa

9 9 H vt1, vt2, ehxA,

saa

10 4 D vt2, saa

11 11 A Vt1 (débil), saa

Tabla 9. Genotipos de virulencia de los aislamientos VTEC positivo.

Page 38: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 31 -

CAPITULO IV

DISCUSIÓN

En el Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología la Facultad de Ciencias

Veterinarias de la ciudad de Tandil se han llevado a cabo diversas

investigaciones sobre VTEC, tanto de su presencia en el medio ambiente de

granjas (Polifroni et al., 2012), tambos (Fernández, 2012); en agua de

bebederos y en materia fecal de bovinos (Polifroni et al., 2012); en terneros

recién nacidos, lactantes y en crecimiento (Fernández et al., 2012); en vacas

lecheras (Fernández et al., 2009; Fernández et al., 2010; Fernández et al.,

2013); durante las etapas del proceso de faena de pollos (Alonso et al., 2014),

en pollos, pollos de engorde y derivados (Alonso et al., 2011; Alonso et al.,

2012; Alonso et al., 2016); en cortes de carne bovina y productos crudos

(Etcheverría et al., 2010; Cadona et al., 2013); como también, en la cadena de

producción porcina (Colello et al., 2016), entre otros. En este trabajo se da a

conocer, por primera vez, la situación de este patógeno en medias reses

porcinas que transitan por la cabina de control sanitario de la ciudad, además

de aportar datos respecto a medias reses bovinas y la existencia de un posible

riesgo de contaminación cruzada entre ambas especies.

En esta investigación, el 10,83% del total de las muestras evaluadas fueron

VTEC-positivas.

Un 5% de las muestras obtenidas de medias reses de cerdo fueron positivas,

valores que se hallan en proximidad con estudios previos realizados por Colello

et al., (2016) en salas de desposte y en puntos de venta, donde se pudo hallar

una prevalencia de cepas VTEC en el 2,86% de las muestras obtenidas en

granjas; del 4,08% durante la faena; del 6% en salas de desposte y del 4,59%

en los puntos de venta.

De las muestras de bovinos, un 16,66% fueron positivas, valores inferiores a

las referencias locales previas obtenidas por Etcheverría et al., (2010) donde se

detectaron VTEC en el 18,64% de las muestras tomadas en la cabina sanitaria;

además del 12,34% de muestras en la faena y un 24,52% en muestras

obtenidas en carnicerías. En investigaciones previas realizadas por Sanz et al.,

(2007) se analizaron muestras de carne picada y hamburguesas en carnicerías

Page 39: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 32 -

detectando VTEC en el 43% de ellas. Si bien las diferencias climáticas y el

tamaño muestral podrían determinar estas variaciones, es preciso señalar la

exposición de la población a este patógeno.

Se pudieron aislar el 38,46% del total de muestras VTEC positivas detectadas.

Todas las muestras aisladas presentaron el gen saa, mientras que la presencia

de los genes codificantes para vt1 y vt2 fue variable; solo un aislamiento

presentó el gen ehxA y no se detectó el gen eae. En este estudio no se realizó

la serotipificación del microorganismo pero se recomienda su realización en

estudios futuros para poder identificar los serotipos de las VTEC aisladas.

El presente estudio no tenía como objetivo evaluar factores higiénicos –

sanitarios de los transportes que se acercaban al puesto sanitario, no obstante

es propio señalar que las diferentes características observadas entre los

camiones frigoríficos, los operarios y las medias reses, son factores que toman

relevancia ante la identificación de las únicas muestras de cerdos VTEC

positivas en un camión que transportaba bovinos también VTEC positivos,

indicando una posible contaminación cruzada entre ambas especies. Es

esencial la realización de más investigaciones para establecer esta relación y

plantear a futuro la separación entre las especies en los transportes y demás

puntos de la cadena. Cuestiones sumamente importantes en la ciudad de

Tandil donde el clima es ideal para la elaboración de chacinados y embutidos

secos, los cuales, pese a presentar obstáculos para el desarrollo

microbiológico, en general son insuficientes para evitar el crecimiento de E. coli

O157:H7 (Glass y col., 1992; Nissen y Holck, 1998). En un trabajo de

investigación realizado por Elichiribehety y Villalobo (2011) se aislaron

muestras VTEC positivas de un 4 % de muestras de procesadas de

chacinados, particularmente de salamín picado fino. Ante estos datos resulta

imprescindible la elaboración de productos cárnicos a partir de carnes libres de

VTEC.

En este trabajo tampoco se diferenció la zona de toma de muestra entre

cuartos traseros y delanteros, ya que se tomaron muestras de ambas zonas

por media res. Estudios previos indican que el riesgo de contaminación en la

parte delantera es mayor con respecto a otras partes de la res debido a

salpicaduras, drenaje de agua superficial, el manejo de la evisceración y por

Page 40: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 33 -

contacto con agentes y superficies (Gill, McGinnis & Jones, 1999), de igual

forma, otras investigaciones han detectado mayor presencia de VTEC en los

cuartos traseros (Etcheverría et al., 2010). Se recomienda la diferenciación de

la zona de toma de muestra en futuras investigaciones para poder determinar

la existencia de una zona con mayor riesgo de contaminación.

Page 41: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 34 -

CAPITULO IV

CONCLUSIONES

Se resaltan a continuación algunas de las conclusiones más importantes

obtenidas del presente trabajo:

Las medias reses porcinas y bovinas que se destinan a consumo son

fuente de VTEC potencialmente patógenos para el hombre.

Se lograron detectar mediante la técnica de PCR cepas VTEC positivas

en carne de medias reses bovinas y porcinas destinadas a consumo

minorista en el partido de Tandil.

Se logró determinar que el grado de contaminación por VTEC en medias

reses de bovinos es mayor que el observado en porcinos.

Se aislaron cepas VTEC y se realizó la detección de genes codificantes

para vt1, vt2, eae, ehxA y saa. El gen eae no se encontró en ninguno de

los aislamientos, mientras que el gen saa se detectó en todos.

Se reservaron cepas aisladas para realizar su serotipificación.

Los resultados indicarían que la contaminación cruzada es posiblemente

la causa principal de la presencia de VTEC en medias reses porcinas.

Sin embargo, es necesario la realización de más investigaciones para

poder determinar esta relación.

Los resultados obtenidos en el presente estudio refuerzan la necesidad

de incorporar medidas de control a lo largo de la cadena de producción

de la carne para asegurar la calidad de los alimentos destinados al

consumo humano; y el control en el cumplimiento efectivo de las buenas

prácticas.

Page 42: Detección y aislamiento de Escherichia coli ...

- 35 -

CAPITULO V

BIBLIOGRAFIA

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