La tecnología del ADN recombinanteLa tecnología del ADN recombinante

Cuando los científicos comprendieron la estructura de los Cuando los científicos comprendieron la estructura de los genes y cómo la información que portaban se traducía en genes y cómo la información que portaban se traducía en funciones o características, comenzaron a buscar la forma de funciones o características, comenzaron a buscar la forma de aislarlos, analizarlos y modificarlos hasta transferirlos de un aislarlos, analizarlos y modificarlos hasta transferirlos de un organismo a otro con el objetivo de conferirle una nueva organismo a otro con el objetivo de conferirle una nueva característica (distinta a la de origen). Precisamente, la característica (distinta a la de origen). Precisamente, la disciplina que aborda esto, es la disciplina que aborda esto, es la ingeniería genéticaingeniería genética . Así . Así pues, el ADN que combina organismos distintos se denomina pues, el ADN que combina organismos distintos se denomina ADN recombinanteADN recombinante..

Para obtener ADN recombinante:Para obtener ADN recombinante:- Se corta el ADN( enzimas de restricción) y se procede a la recombinación Se corta el ADN( enzimas de restricción) y se procede a la recombinación

de piezas( enzimas ligasas).de piezas( enzimas ligasas).

- Las piezas modificadas se pueden ampliarLas piezas modificadas se pueden ampliar..

Enzimas de restricciónEnzimas de restricción Sus descubridores fueron Hamilton Smith y Daniel O.Smith. Estaban Sus descubridores fueron Hamilton Smith y Daniel O.Smith. Estaban

estudiando la forma en la que la bacteria estudiando la forma en la que la bacteria Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae se defiende se defiende del ataque de virus bacteriófagos.del ataque de virus bacteriófagos.

Descubrieron que esta bacteria tiene una enzima que corta el ADN de los Descubrieron que esta bacteria tiene una enzima que corta el ADN de los virus.virus.

  

Sus principales características son:Sus principales características son:

      Cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una Cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.secuencia que reconocen.

Permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias Permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).

  Son extraídas  de organismos procarióticos donde actúan como un Son extraídas  de organismos procarióticos donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.  Las bacterias tienen la capacidad de metilar su entre en la célula.  Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el ADN ADN lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio.  Las enzimas de restricción no pueden cortar ADN metilado, de propio.  Las enzimas de restricción no pueden cortar ADN metilado, de este modo solo afectan el ADN extranjero y no el ADN bacterial.este modo solo afectan el ADN extranjero y no el ADN bacterial.

Las enzimas de restricción al cortar el ADN pueden producir 2 tipos de cortes:Las enzimas de restricción al cortar el ADN pueden producir 2 tipos de cortes:

Introducción del ADN recombinante en las bacteriasIntroducción del ADN recombinante en las bacterias

Se usarán plásmidos , que son pequeños cromosomas circulares Se usarán plásmidos , que son pequeños cromosomas circulares de ADN bacteriano.de ADN bacteriano.

El corte del ADN circular se realizará con las enzimas de El corte del ADN circular se realizará con las enzimas de restricción.restricción.

La unión del gen que se quiere insertar en el interior del plásmido La unión del gen que se quiere insertar en el interior del plásmido se hará con las enzimas ligasas.se hará con las enzimas ligasas.

Para la identificación de la célula que contendrá el ADN Para la identificación de la célula que contendrá el ADN recombinante, se procede a la comprobación de la resistencia a un recombinante, se procede a la comprobación de la resistencia a un antibiótico de las bacterias. Los plásmidos que le otorguen antibiótico de las bacterias. Los plásmidos que le otorguen resistencia a antibióticos son los que sus células transformadasresistencia a antibióticos son los que sus células transformadas

( plásmido con ADN recombinante) sobrevivirán.( plásmido con ADN recombinante) sobrevivirán.

En el concepto de clon ( en la ilustración anteriormente mostrada) En el concepto de clon ( en la ilustración anteriormente mostrada) se refiere a las bacterias que son genéticamente iguales.se refiere a las bacterias que son genéticamente iguales.

Amplificación del ADN. Reacción en cadena de la polimerasaAmplificación del ADN. Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se basa en la replicación en cientos La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se basa en la replicación en cientos de miles y millones de veces, en pocas horas e in vitro pequeñas cantidades de ADN. de miles y millones de veces, en pocas horas e in vitro pequeñas cantidades de ADN.

El método se basa en la realización de 3 reacciones sucesivas llevadas a cabo a El método se basa en la realización de 3 reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas:distintas temperaturas:

1) La muestra se calienta hasta la separación de sus 2 cadenas de ADN 1) La muestra se calienta hasta la separación de sus 2 cadenas de ADN (desnaturalización).(desnaturalización).

2)Se reduce la temperatura para permitir el apareamiento de cada una de las 2)Se reduce la temperatura para permitir el apareamiento de cada una de las cadenas cortas de nucleótidos con cada una de las hebras separadas del ADN molde.cadenas cortas de nucleótidos con cada una de las hebras separadas del ADN molde.(La ADN polimerasa usará dNTPs agregados a la mezcla de la reacción).(La ADN polimerasa usará dNTPs agregados a la mezcla de la reacción).

3) Su temperatura estará condicionada a la que trabaje la ADN polimerasa. 3) Su temperatura estará condicionada a la que trabaje la ADN polimerasa. Se producirá la extensión.Se producirá la extensión.

Al cabo de las reacciones anteriormente descritas, el tramo de ADN elegido se ha Al cabo de las reacciones anteriormente descritas, el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para un segundo duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para un segundo ciclo. El resultado de la ampliación de numerosos ciclos en cadena da lugar a la ciclo. El resultado de la ampliación de numerosos ciclos en cadena da lugar a la ampliación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primersampliación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers..

En la imagen se En la imagen se muestran las 3 etapas muestran las 3 etapas de la técnica del PCR, de la técnica del PCR, así como su repetición.así como su repetición.

Algunos de los usos de la técnica del PCR:Algunos de los usos de la técnica del PCR:

-Identificación de personas. -Identificación de personas.

-Permite detectar agentes infecciosos como los virus. Así pues, ha sido aplicada -Permite detectar agentes infecciosos como los virus. Así pues, ha sido aplicada para diagnosticar la presencia o ausencia de VIH en recién nacidos.para diagnosticar la presencia o ausencia de VIH en recién nacidos.

-Diagnostico de enfermedades.(Hemofilias A y B, distrofia muscular, fibrosis -Diagnostico de enfermedades.(Hemofilias A y B, distrofia muscular, fibrosis quística y mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológicas).quística y mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológicas).

Imanes biológicos: sondas y anticuerposImanes biológicos: sondas y anticuerpos

Una de las técnicas más utilizadas para localizar fragmentos determinados Una de las técnicas más utilizadas para localizar fragmentos determinados del genoma( o la expresión de un gen en particular por medio de la del genoma( o la expresión de un gen en particular por medio de la detección de la presencia de su correspondiente ARN-m) es la detección de la presencia de su correspondiente ARN-m) es la hibridación hibridación in situ.in situ.

Durante este proceso se incuba el ADN con una sonda (ADN o ARN) Durante este proceso se incuba el ADN con una sonda (ADN o ARN) complementaria a la secuencia buscada, y marcada reactiva o complementaria a la secuencia buscada, y marcada reactiva o químicamente.químicamente.

La sonda transcurre de un lado a otro de la célula hasta encontrar La sonda transcurre de un lado a otro de la célula hasta encontrar una secuencia complementaria a ella. Cuando esto ocurra, se formará una una secuencia complementaria a ella. Cuando esto ocurra, se formará una doble cadena que no solo permitirá detectar la presencia de esta doble cadena que no solo permitirá detectar la presencia de esta secuencia, sino que también, indicar el lugar específico que ocupa dentro secuencia, sino que también, indicar el lugar específico que ocupa dentro de la célula.de la célula.

Otra técnica que cabe destacar, son los anticuerpos que utilizará una técnica parecida a la de las sondas(se comenzará por una colonia de bacterias que contengan y expresen el gen ADNc. Se tratará a las bacterias con un anticuerpo marcado, que se unirá a la colonia que sintetice la proteína deseada. De esta manera se localizará el gen en cuestión y se clonará).

Gráficos de hibridación in situGráficos de hibridación in situ

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?

La La electroforesis en gelelectroforesis en gel es una técnica sencilla empleada de forma es una técnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorio para separar moléculas biológicas especialmente rutinaria en laboratorio para separar moléculas biológicas especialmente ADN, ARN y proteínas.ADN, ARN y proteínas.

Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración. El tamaño de los permite observar el resultado de ésta migración. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas.  bandas de diferentes muestras biológicas. 

Electroforesis en gelElectroforesis en gel

Electroforesis de poliacrilamidaElectroforesis de poliacrilamida

Esta electroforesis es para proteínas, que es más compleja que en el caso Esta electroforesis es para proteínas, que es más compleja que en el caso de los ácidos nucleicos( electroforesis en gel) debido a la estructura de los ácidos nucleicos( electroforesis en gel) debido a la estructura compleja y compacta que éstas poseen.compleja y compacta que éstas poseen.

Se trata de un método convincente, rápido y económico a nivel de Se trata de un método convincente, rápido y económico a nivel de muestra( se requieren unos microgramos de proteína).muestra( se requieren unos microgramos de proteína).

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?

Método de Edward M. SouthernMétodo de Edward M. Southern

Se trata de un método diseñado para la detección de genes específicos Se trata de un método diseñado para la detección de genes específicos del ADN celular.del ADN celular.

Pasos a ejecutar:Pasos a ejecutar:

1)1) Extracción del ADN.Extracción del ADN.

2)2) Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción ( enzima de Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción ( enzima de restricción).restricción).

3)3) Electroforesis en gel de agarosa.Electroforesis en gel de agarosa.

4)4) Preparación ensayo SouthernPreparación ensayo Southern

Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana

de nailon, realizando así una copia. de nailon, realizando así una copia.

Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, la copia del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis. 

5)Hibridación con sonda radiactiva: El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de  sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.

6)Exposición a la película fotográfica

7) Identificación de fragmentos.

Método de Northern BlotMétodo de Northern Blot

Se trata de una técnica que se utiliza para identificar las secuencias de Se trata de una técnica que se utiliza para identificar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.sonda.

Así pues, es una prueba para detectar la presencia del ARN mensajero en Así pues, es una prueba para detectar la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripción de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo trascripción de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en particular membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente de cADN o rARN del gen de interés.  generalmente de cADN o rARN del gen de interés. 

Método de Western BlotMétodo de Western Blot

Técnica empleada para la determinación de proteínas específicas en una Técnica empleada para la determinación de proteínas específicas en una muestra determinada. muestra determinada.

1 ) Mediante electroforesis en gel, se preparan proteínas atendiendo al 1 ) Mediante electroforesis en gel, se preparan proteínas atendiendo al criterio deseado (peso molecular, estructura…)criterio deseado (peso molecular, estructura…)

2) Son transferidas a una membrana adsorbente( formada por nitrocelulosa o 2) Son transferidas a una membrana adsorbente( formada por nitrocelulosa o PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.contra ella.

3) Se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, 3) Se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática,

fluorescencia…fluorescencia…

4) Con esto, 4) Con esto, se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas. analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas.

¿Cómo sacar fotos de genes activados?. Microarreglos¿Cómo sacar fotos de genes activados?. Microarreglos

Los microarreglos son Los microarreglos son soportes sólidos en los cuales se encuentran inmovilizados, soportes sólidos en los cuales se encuentran inmovilizados, en un área pequeña,  de cientos a en un área pequeña,  de cientos a milesmiles de  de genesgenes de manera ordenada. Los  de manera ordenada. Los soportes sólidos pueden ser laminillas de vidrio para microscopio, laminillas de soportes sólidos pueden ser laminillas de vidrio para microscopio, laminillas de silicona o membranas de nylon. En los silicona o membranas de nylon. En los microarreglosmicroarreglos, el ADN puede ser impreso, , el ADN puede ser impreso, depositado o sintetizado directamente sobre la superficie sólida. Esta colección de depositado o sintetizado directamente sobre la superficie sólida. Esta colección de ácidos nucléicos (blancos) impresos con un orden específico, representan una parte ácidos nucléicos (blancos) impresos con un orden específico, representan una parte o todos los o todos los genesgenes de un organismo. Cada secuencia  presente en cada una de las  de un organismo. Cada secuencia  presente en cada una de las alícuotas depositadas en la superficie sólida corresponde a un gen diferente. alícuotas depositadas en la superficie sólida corresponde a un gen diferente.

Otra de sus características es que son una versión paralela y masiva a las técnicas Otra de sus características es que son una versión paralela y masiva a las técnicas de Northern y Southern Blot. Sin embargo, en vez de que las sondas de que de Northern y Southern Blot. Sin embargo, en vez de que las sondas de que nucleótidos sean reconocidas a lo largo de un gel de ADN o ARN, en el microarreglo nucleótidos sean reconocidas a lo largo de un gel de ADN o ARN, en el microarreglo las sondas son inmovilizadas en una superficie sólida. Además, la muestra se marca las sondas son inmovilizadas en una superficie sólida. Además, la muestra se marca con colorantes fluorescentes que pueden detectarse por un escáner.con colorantes fluorescentes que pueden detectarse por un escáner.

Por último, es necesario aludir a que en esta técnica los resultados nunca Por último, es necesario aludir a que en esta técnica los resultados nunca deberían ser concluyentes, sino que deberían ser validados con otras técnicas.deberían ser concluyentes, sino que deberían ser validados con otras técnicas.

Ilustración de las celdas de los microarreglosIlustración de las celdas de los microarreglos