BIOTECNOLOGÍA

1­ Biotecnología 2­ Concepto de ingeniería genética 2.1­ Técnica del ADN recombinante 2.2 –Técnica de secuenciación del ADN 2.3­ Reacción en cadena de la polimerasa 3­ Aplicaciones de la IG 3.1 Aplicaciones médicas 3.2 Aplicaciones en agricultura 3.3 Aplicaciones en ganadería 4­Concepto de clonación 5­ Proyecto genoma humano 6­ Riesgos y aspectos éticos de las técnicas de ingeniería genética

1. BIOTECNOLOGÍA La biotecnología, en un sentido amplio se puede definir como la aplicación de organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y servicios. Esto significa que desde hace miles de años, la humanidad ha venido realizando biotecnología, si bien hasta la época moderna, de un modo empírico, sin base científica: ­ La domesticación de plantas y animales ya comenzó en el período Neolítico. ­ Las civilizaciones Sumeria y Babilónica (6000 años a.C.) ya conocían cómo elaborar cerveza. ­ Los egipcios ya sabían fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C.

­ Otros procesos biotecnológicos conocidos de modo empírico desde la antigüedad: fabricación de queso, alimentos y bebidas fermentadas: yogur…etc Por supuesto, hasta la llegada de la moderna biología, y en muchos casos hasta el siglo XIX, la base de muchos de estos procesos era desconocida. Desde la década de 1940, las técnicas de ingeniería química, aliadas a la microbiología y a la bioquímica, permiten la producción de antibióticos, ácidos orgánicos, esteroides, polisacáridos y vacunas. La penicilina comenzó a fabricarse en plena II Guerra Mundial, como resultado de avances importantes en técnicas de esterilización a gran escala, mejora de las instalaciones de fermentación (incluyendo la cuestión de la aireación), cultivo del hongo, etc. A partir de entonces se diseñaron estrategias para mejorar genéticamente las cepas microbianas industriales. ­ Las décadas de los 60 y 70 vieron la mejora de procesos de obtención de pequeños metabolitos como nucleósidos, aminoácidos y vitaminas. ­ Polímeros microbianos como xantanos y dextranos se obtuvieron industrialmente, con aplicaciones en el campo de la alimentación (como aditivos). Pero incluso bien avanzado el siglo XX, cuando la Genética había resuelto el misterio de la naturaleza del material de la herencia, las posibilidades que había para actuar

sobre dicho material eran limitadas: cruces entre plantas y animales de la misma especie (o de especies similares), selección de los individuos con rasgos deseados, retrocruzamientos (un proceso largo y lento), mutaciones con agentes físicos (rayos UV, rayos X) o químicos, con ulterior búsqueda (selección o rastreo ­screening) de alguna variante de interés (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc. Debemos esperar a la década de los 70 para que surja un conjunto de técnicas de laboratorio revolucionarias que por primera vez permiten modificar el ADN de acuerdo a diseños previos y objetivos concretos (de ahí el nombre popular de Ingeniería Genética). La Ingeniería Genética (I.G.), mejor llamada tecnología del ADN recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro provecho.

2. CONCEPTO DE INGENIERÍA GENÉTICA Se trata de una serie de técnicas que se basan en la introducción de genes en el genoma de un individuo que no los presente. Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño en un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular. La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan:

La tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio. Se abre un campo que nos ofrece además la posibilidad de utilizar plantas y animales transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el propio planeta.

2.1. TÉCNICA DEL ADN RECOMBINANTE Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir

que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas básicas: 1. Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Podemos definirlas como conjunto de enzimas que cortan las moléculas de ADN en o cerca de unas secuencias de reconocimiento llamadas secuencias palindrómicas( se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha), generalmente estas secuencias son de 4 a 8 nucleótidos. Estas enzimas se aislaron en bacterias, al ser atacadas por virus (bacteriófagos) que inyectan su material genético en la célula, algunas bacterias se defienden produciendo enzimas de restricción. Estas cortan fragmentos bicatenarios de ADN en otros más pequeños que no son infecciosos, los enlaces cortados son entre el hidroxilo 3’ de un nucleótido y el fosfato 5’ del siguiente. EL ADN de la bacteria no es afectado por estas enzimas ya que las metilasas añaden grupos metilo al ADN bacteriano, de forma que las enzimas de restricción no reconocen secuencias en el ADN bacteriano. Por tanto las enzimas de restricción presentan dos características: ­Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN. ­ Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción. En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.

En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción. Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente. 2. Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. ∙ Plásmidos. Son moléculas de ADN circular bicatenario, que se encuentran en algunas bacterias portadoras, con un tamaño menor que el del cromosoma bacteriano. Las ventajas de utilizar plásmidos son que por un lado se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación; y por otro muchos de ellos presentan genes para enzimas que confieren resistencia a los antibióticos. Esta última característica es importante porque supone un marcador genético para las células que tengan el plásmido recombinante. Las desventajas principales de los plásmidos son que limitan el tamaño del gen que puede ser insertado en ellos a unos 5000 pares de bases, los genes procariotas tienen este tamaño aproximadamente, pero los genes eucariotas son mayores. Por otro lado los plásmidos tienen un solo origen de replicación que además difiere de los orígenes de replicación de eucariotas. Además se necesitan medios para forzar la entrada del plásmido en las células eucariotas. En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido.

Figura a

En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

∙

Figura b

En la figura b, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

∙

Figura c

La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN­ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

Las proteínas que más interés despiertan son las producidas por eucariotas, pero la inserción de los genes precursores en procariotas plantea problemas, como por ejemplo la presencia de intrones en el genoma eucariota. Para resolver este problema, se aísla el ARN mensajero maduro de la proteína que interesa, a continuación se obtiene su ADN complementario utilizando una transcriptaza inversa, que produce ADN a partir de ARN. De este modo se obtiene un ADN sin intrones.

∙ Bacteriófagos ( virus) . El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura d) Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo (figura f). En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN. Para ADN eucarionte son más apropiados los virus como vectores, si eliminamos los genes que causan la muerte de las células huéspedes porque se pueden insertar genes mayores y porque no hay que forzar la entrada del virus en la célula.

∙ Cósmidos. Son plásmidos que contienen el fragmento de DNA deseado y unos bordes cohesivos procedentes del genoma del fago lambda (extremo cos), que les permite introducirse en la cápsida del fago λ y así pasar al interior de la bacteria. Se construye el cósmido uniendo los tres elementos génicos, y el resultado final es poder introducir en la célula receptora fragmentos largos de ADN.

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia. ∙ Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador. ∙ Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota. 3. Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto. Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente. En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:

∙ Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos. La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. ∙ Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus. En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.

4.Clonado del ADN. Una vez que se ha conseguido la población de bacterias transformadas, (recuerda que llevan además del gen de interés un gen por ejemplo de resistencia a un antibiótico por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina), por lo que las bacterias que se consideran transformadas, serán aquellas que sobrevivan. El siguiente paso es poner a las bacterias en un medio de cultivo apropiado para que se multipliquen. A la vez que se reproducen las bacterias lo hace también el plásmido con el gen que interesa, el resultado es que se obtiene un clon de células que llevan todas ese gen de interés. Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de interés para el hombre. Este conjunto de clones se denomina biblioteca genómica. 2.2 TÉCNICA DE SECUENCIACIÓN DE ADN Otra técnica propia de la Ingeniería Genética es la determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN, conocida como secuenciación de dicho ácido nucléico.

Se ha conseguido gracias a las enzimas de restricción y a la posibilidad de obtener numerosas copias de un ácido nucléico por clonación. Se pueden conseguir muchos fragmentos , de diversos tamaños y lo que se trata es de recomponer la molécula original como si se tratase de un puzzle. Así se han secuenciado genes, desde virus hasta el genoma humano. El método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica de terminación de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conociéndose actualmente como la técnica del didesoxi. Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos (figura 1), que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2 vemos un nucleótido normal con el grupo alcohol en el carbono 3'.

Como los nucleótidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay que pensar que si nos encontramos con un didesoxinucleótido será imposible que se una otro nucleótido y la cadena terminará aquí. Figura 3 (Es necesario tener esto presente para comprender la técnica del didesoxi)

Figura 3 Abreviadamente, éste sería el método a seguir: Como la técnica se basa en la síntesis de ADN, para hacer la reacción de secuenciación se necesita:

∙ Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar ∙ Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadena. ∙ desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP. ∙ didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación. Al añadir la ADN­polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido (Figura 4).

Figura 4 Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen de la situación del didesoxinucleótido incorporado. En el caso expuesto en el dibujo, esta reacción de secuenciación se hace con un didesoxi de ADENINA, lo que significa que cuando se incorpore esta Adenina no podrá continuarse la polimerización de nuevos nucleótidos, nos queda por tanto un pequeño fragmento de ADN que termina en la ADENINA, lo que nos dice que en el ADN original, en ese lugar estará el nucleótido complementario que lleva TIMINA. En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14 nucleótidos (sin contar el cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA, nos permite interpretar que en el

ADN original, en esas situtaciones tendremos TIMINA. Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un didesoxi distinto. Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí, dan la secuencia del ADN. (Figura 5)

Figura 5 2.3 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas. La reacción es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores. La reacción es un proceso cíclico: 1. La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras. 2. Cada una de las hebras es copiada por la ADN­polimerasa. (Se utiliza la ADN­polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). 3. Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se obtiene el número de copias deseado.

La potencialidad de esta técnica es impresionante, a partir de una sola molécula de ADN, la PCR puede generar 100000 millones de moléculas idénticas en una tarde. El ADN puede proceder de una muestra de tejido de un hospital, de una gota de sangre o semen en la escena de un delito, o de un cerebro momificado. Algunas de las aplicaciones de la PCR son: 1. Secuenciación

Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho mas sencillo y rapido que la clonación en células. 2. Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos. El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. 3. Huellas dactilares del ADN. La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye una de las aplicaciones mas interesantes de la PCR. Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos. También se utiliza en las pruebas de paternidad. 3. APLICACIONES DE LA IG 3.1 APLICACIONES MÉDICAS 3.1.1. Obtención de proteínas de mamífero Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulación, etc ... tienen un interés médico y comercial muy grande. Antes, la obtención de estas proteinas se realizaba mediante su extracción directa a partir de tejidos o fluidos corporales. En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN recombinante, se clonan los genes de ciertas proteinas humanas en microorganismos adecuados para su fabricación comercial. Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina humana. 3.1.2. Obtención de vacunas recombinantes El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniería genética. Como la mayoría de los factores antigénicos son proteínas lo que se hace es clonar el gen de la proteína correspondiente. 3.1.3. Diagnóstico de enfermedades de origen genético Conociendo la secuencia de nucleótidos de un gen responsable de una cierta anomalía, se puede diagnosticar si este gen anómalo está presente en un determinado individuo. En el siguiente dibujo se explica brevemente la base del diagnóstico.

Este proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades como el cáncer y diagnosticarlo incluso antes de que aparezcan los primeros síntomas. 3.1.4. Obtención de anticuerpos monoclonales Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogéneo producido por una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral. Los anticuerpos monoclonales (Mab, del inglés monoclonal antibody), son anticuerpos idénticos porque son producidos por un solo tipo de célula del sistema inmune, es decir, todos los clones proceden de una sola célula madre. Es posible producir anticuerpos monoclonales que se unan específicamente con cualquier molécula con carácter antigénico. Este fenómeno es de gran utilidad en bioquímica, biología molecular y medicina. Para producir anticuerpos monoclonales, primero se extraen células B del bazo de un animal que ha sido expuesto al antígeno. Estas células B son fusionadas en presencia de PEG (polietilenglicol) con células tumorales de mieloma múltiple (un tipo de cáncer) que pueden crecer indefinidamente en cultivo celular. Esta fusión hace a las membranas celulares más permeables. Estas células fusionadas híbridas, llamadas hibridomas pueden multiplicarse rápida e indefinidamente, puesto que son células tumorales después de todo y pueden producir gran cantidad de anticuerpos. Los hibridomas son suficientemente diluidos y cultivados para obtener un número diferente de determinadas colonias, las cuales producen sólo un tipo de anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes colonias son analizados para conocer su capacidad de unirse a un antígeno determinado, por ejemplo con un tipo de test llamado ELISA, y para seleccionarse y aislarse de la manera más efectiva. Las aplicaciones terapéuticas constituyen el campo más importante de los anticuerpos monoclonales, ya que son capaces de erradicar ciertas infecciones y destruir células,

incluidas las tumorales, mediante distintos mecanismos. Por esta razón, son excelentes sustancias para el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, el cáncer o en trasplantes para evitar el rechazo. Existen varios anticuerpos monoclonales aprobados para su uso en determinadas enfermedades 3.1.5. Terapia génica Consiste en la introducción de genes en seres humanos con el fin de corregir una enfermedad de origen genético, restaurando la función del gen defectuoso. Se pueden distinguir dos tipos de terapia génica: Terapia de células germinales: se introduce el gen en los gametos o sus precursores, o en el cigoto. De este modo quedan modificadas todas las células del organismo al que den origen estas células. Debido a sus implicaciones éticas no está permitido en ningún país.

Terapia en células somáticas: se introduce el gen en un grupo más o menos amplio de células somáticas, de este modo la corrección no pasa a la descendencia. 3.2 APLICACIONES EN AGRICULTURA Mediante la ingeniería genética han podido modificarse las características de gran cantidad de plantas para hacerlas más útiles al hombre, son las llamadas plantas transgénicas. Las primeras plantas obtenidas mediante estas técnicas fueron un tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas semanas después de haber sido cosechados. Recordando que la célula vegetal posee una rígida pared celular, lo primero que hay que hacer es obtener protoplastos (los protoplastos son células desprovistas de pared celular, que se consigue empleando enzimas que destruyen la lámina media y desorganizan la parte de celulosa). Después se realizan técnicas de modificación genética que permiten introducir nuevos genes en el genoma de la planta. Las técnicas de modificación genética en cultivos celulares se clasifican en directas e indirectas. 1. Entre las técnicas indirectas cabe destacar la transformación de células mediada por Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria puede considerarse como el primer ingeniero genético, por su particular biología. Biología de Agrobacterium tumefaciens Esta bacteria, presente en el suelo, es patógena de muchas plantas a las que produce un tumor conocido como "agalla de cuello". Penetra en los tejidos vegetales causando una proliferación celular. Durante el contacto con las células vegetales la bacteria transfiere a las células vegetales un plásmido llamado Ti (inductor de tumores). Este plásmido se integra en el ADN del cromosoma de la célula vegetal. Este plásmido transferido o

T­ADN contiene los genes oncogénicos (onc) cuya expresión provoca una mayor producción de hormonas de crecimiento, éstas son las que inducen las divisiones celulares que dan origen a la formación del tumor o agalla.

Este fenómeno natural es empleado para utilizar a la bacteria Agrobacterium tumefaciens como vector de los genes que se desean introducir en una célula vegetal, con lo que se transforma dicha célula, la cual puede regenerar, por micropropagación, una planta entera que será transgénica. Si en el plásmido Ti se eliminan artificialmente los genes onc y se sustituyen por otros genes que interese clonar, se habrá obtenido un sistema muy eficaz para introducir ADN interesante a la planta, al mismo tiempo que se habrá evitado la aparición de la enfermedad. 1. 2. Entre las técnicas directas, se pueden citar la electroporación, microinyección, liposomas y métodos químicos. Entre los principales caracteres que se han transferido a vegetales o se han ensayado en su transfección, merecen destacarse: a) Resistencia a herbicidas: Se dispone de semillas de algodón, que son insensibles a herbicidas. b) Resistencia a los insectos: se utilizan cepas de Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina ­ Bt) dañina para las larvas de muchos insectos, de modo que no pueden desarrollarse sobre las plantas transgénicas con este gen. c) Resistencia a la infección por virus: Respecto a los virus se ha demostrado que

las plantas transgénicas con el gen de la proteína de la cápsida de un virus, son resistentes a la invasión de dicho virus. d)En el maíz se ha conseguido: * Resisten heladas.­ incorporación de un gen de un pez resistente al frío. * Resisten plagas.­ incorporación de un gen del trigo. * Resisten herbicidas.­ incorporación de un gen bacteriano. e) Incremento del rendimiento fotosintético: Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C4 que es más eficiente. g) Síntesis de productos de interés comercial: Existen plantas transgénicas con genes que les permiten producir anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables h) Asimilación de nitrógeno atmosférico : se ensaya la transfección del gen nif responsable de la nitrogenasa, existente en microorganismos fijadores de nitrógeno, y que permitiría a las plantas que hospedasen dicho gen, crecer sin necesidad de nitratos o abonos nitrogenados, aumentando la síntesis de proteínas de modo espectacular. 3.3. LA INGENIERÍA GENÉTICA Y LA PRODUCCIÓN ANIMAL Llamamos organismos transgénicos a aquellos que se desarrollan a partir de una célula en la que se han introducido genes extraños. El objetivo de estas técnicas es obtener características "útiles" de otros organismos. La técnica más empleada es la de microinyección (introducción de ADN mediante microjeringa y micromanipulador). En los animales estas técnicas se emplean más en peces porque la fecundación es externa. Las técnicas más comunes son: * La microinyección de los genes en el zigoto. * Campos eléctricos que hacen permeable la membrana y permiten la entrada de material genético. Mediante estas técnicas se han obtenido o se está en vías de obtener: * Carpas transgénicas que crecen de un 20 a un 40% más rápido. Se consiguen introduciendo el gen de la hormona del crecimiento de la trucha arco iris. Se estimula añadiendo Cinc a la dieta. * Salmones transgénicos.­ Resisten mejor las temperaturas bajas. Se consigue por incorporación de un gen de una especie de platija del ártico. * En mamíferos se han conseguido ratones que carecían de la hormona del crecimiento por mutación del gen productor de la misma por introducción en el zigoto de estos ratones del gen de la hormona del crecimiento de la rata. Los ratones transgénicos conseguidos producen 800 veces más hormona que los normales. El gen de la rata no se introduce en el lugar propio, sino en otro.

Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgen, se introduce en zigotos, y

los embriones que hayan integrado el ADN extraño en su genoma, previamente a la primera división , producirán un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la linea germinal (gametos). Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar:

La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación.

Manipular de forma específica la expresión génica in vivo. Estudiar la función de genes específicos. Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteínas

humanas. La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica.

La transgénesis puede efectuarse siguiendo dos estrategias distintas: a) Transgénesis por microinyección de zigotos

Desde que en 1982 se obtuviera un ratón transgénico, la producción de animales transgénicas es cada vez más cotidiana, existiendo ya animales transgénicos de las siguientes especies: ratón, rata, conejo, cerdo, vaca, cabra y oveja. La técnica se realiza, fundamentalmente por microinyección y se realiza de la siguiente forma:

En la primera fase, se aíslan un número grande de óvulos fertilizados. Se consigue sometiendo a las hembras a un tratamiento hormonal para provocar una superovulación.

La fertilización puede hacerse in vitro o in vivo. En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan uno a uno y con una

micropipeta a modo de aguja, se introduce una solución que contiene ADN. En la tercera fase, estos óvulos son reimplantados en hembras que actuarán

como nodrizas permitiendo la gestación hasta término. Por último, tras el destete de los recién nacidos, éstos se chequean, para ver si ha ocurrido la incorporación del transgén.

b) Transgénesis por manipulación de células embrionarias. Una estrategia más poderosa para la transgénesis implica la introducción de ADN extraño en células embrionarias totipotentes(células ES) o células embrionarias madres (células EM). Estas células se toman del interior de la blástula en desarrollo y se pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se conseguirá que las células no se diferencien, y se mantiene su estado embrionario. El ADN extraño se introduce en las células ES mediante diversas técnicas, posteriormente las células transfectadas son reintroducidas en una blástula y ésta reimplantada en una hembra. Con esta técnica los neonatos son quimeras ; pero mediante el cruce de éstas se consiguen animales transgénicos con aquellas quimeras que hayan incorporado el transgén en su línea germinal

Cuando la integración del transgén ocurre después de la primeradivisión celular, el animal es quimérico, lo que quiere decir que lascélulas de su cuerpo tienen diferentes características, según tengan ono el transgén, así en la "ovecabra" quimera entre oveja y cabra,

las células de su piel, unas producían lana y otras pelo 4. CONCEPTO DE CLONACIÓN Hay que diferenciar el uso de la palabra clonación en distintos contextos de la biología: *Si nos referimos al ámbito de la Ingeniería Genética, clonar es aislar y multiplicar en tubo de ensayo un determinado gen o, en general, un trozo de ADN. *En el contexto a que nos referimos, clonar significa obtener uno o varios individuos a partir de una célula somática o de un núcleo de otro individuo, de modo que los individuos clonados son idénticos o casi idénticos al original. 4.1 CLONACIÓN DE SERES VIVOS La clonación en plantas ocurre continuamente en la naturaleza , las plantas pueden

reproducirse asexualmente, al igual que algunos animales. En los animales superiores, la única forma de reproducción es la sexual, por la que dos células germinales o gametos (óvulo y espermatozoide) se unen, formando un zigoto (o huevo), que se desarrollará hasta dar el individuo adulto. La reproducción sexual fue un invento evolutivo (del que quedaron excluidas las bacterias y muchos organismos unicelulares), que garantiza que en cada generación de una especie van a aparecer nuevas combinaciones de genes en la descendencia, que posteriormente será sometida a la dura prueba de la selección y otros mecanismos evolutivos. Las células de un animal proceden en última instancia de la división repetida y diferenciación del zigoto. Las células somáticas, que constituyen los tejidos del animal adulto, han recorrido un largo camino "sin retorno", de modo que, a diferencia de las células de las primeras fases del embrión, han perdido la capacidad de generar nuevos individuos y cada tipo se ha especializado en una función distinta (a pesar de que, salvo excepciones, contienen el mismo material genético). El primer experimento de clonación en vertebrados fue el de Briggs y King (1952), en ranas. En los años 70, Gurdon logró colecciones de sapos de espuelas (Xenopus laevis) idénticos a base de insertar núcleos de células de fases larvarias tempranas en ovocitos (óvulos) a los que se había despojado de sus correspondientes núcleos. Pero el experimento fracasa si se usan como donadoras células de ranas adultas. Desde hace unos años se vienen obteniendo mamíferos clónicos, pero sólo a partir de células embrionarias muy tempranas, debido a que aún no han entrado en diferenciación (y por lo tanto poseen la propiedad de pluripotencia). No es extraño pues el revuelo científico cuando el equipo de Ian Wilmut, del Instituto Roslin de Edimburgo comunicó que habían logrado una oveja por clonación a partir de una célula diferenciada de un adulto. Esencialmente el método (que aún presenta una alta tasa de fracasos) consiste en obtener un óvulo de oveja, eliminarle su núcleo, sustituirlo por un núcleo de célula de oveja adulta (en este caso, de las mamas), e implantarlo en una tercera oveja que sirve como “madre de alquiler” para llevar el embarazo. Así pues, Dolly carece de padre y es el producto de tres "madres": la donadora del óvulo contribuye con el citoplasma (que contiene, además mitocondrias que llevan un poco de material genético), la donadora del núcleo (que es la que aporta la inmensa mayoría del ADN), y la que parió, que genéticamente no aporta nada. Científicamente se trata de un logro muy interesante, ya que demuestra que, al menos bajo determinadas circunstancias es posible "reprogramar" el material genético nuclear de una célula diferenciada (algo así como volver a poner a cero su reloj, de modo que se comporta como el de un zigoto). De este modo, este núcleo comienza a "dialogar" adecuadamente con el citoplasma del óvulo y desencadena todo el complejo proceso del desarrollo intrauterino. El principio de la clonación está en la obtención de organismos idénticos genéticamente, y por tanto morfológic y fisiológicamente, como lo son dos gemelos univitelinos. Esto ha sido el sueño de muchos ganaderos, que han deseado que todo su ganado tuviera las cualidades de algún ejemplar especialmente bueno. Se pueden utilizar dos métodos para conseguir clones de animales:

1. Por DISGREGACIÓN DE CÉLULAS EMBRIONARIAS.Se basa en el mismo principio por el que nacen gemelos de forma natural.Se pueden separar las células de un embrión en diferentes estados de desarrollo, desde el estado de 2 células hasta el estado de mórula. Cada célula separada puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar un individuo completo.

2. Por TRANSFERENCIA NUCLEAR. Se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, obtenidas por disgregación, se cultivan in vitro,y después se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el núcleo.

3. Se provoca la fusión de las dos células animales de modo que el núcleo de la célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo éste empezar a funcionar como un zigoto. Así se han obtenido 470 embriones clónicos de terneros de un único embrión donante de células.

Cuanto más diferenciadas estén las células donantes de material genético, más difícil es conseguir la reprogramación de dicho material genético para que pueda iniciar la diferenciación de la célula receptora. Actualmente es posible obtener clones de células totalmente diferenciadas de un animal adulto que actúan como donantes de su material genético, como ocurrió en el caso de la famosa oveja Dolly.

4.2 CLONACIÓN TERAPÉUTICA En algunas enfermedades es necesario realizar un transplante, de órganos , tejidos o células, el problema en estos casos es encontrar donantes compatibles, para evitar el rechazo en el receptor. Una solución podría se clonar células del paciente en el laboratorio, de modo que dieran origen al órgano, tejido o célula que se necesita. La dificultad estriba en que las células del paciente están diferenciadas y es difícil que se transformen en otro tipo. Las terapias en que se están ensayando en estos casos son las relacionadas con las células madre (terapia celular), antes de explicarlas definiremos tres tipos de células en función de su capacidad para diferenciarse en un número mayor o menor de tejidos:

­ Células totipotentes: pueden generar por completo un nuevo individuo organizado y estructurado. Esta capacidad es exclusiva de las células madre embrionarias.

Céluas pluripotentes: capaces de diferenciarse en cualquier tipo de tejido , pero no pueden originar un individuo completo. Existen células madre pluripotentes embrionarias y adultas.

­Células multipotentes: capaces de generar exclusivamente el tejido del que proceden. La utilización de células madre embrionarias ( las únicas que son totipotentes) plantea un problema ético, pues en elproceso se destruyen embriones humanos. Una parte de la sociedad considera que el embrión ya es un ser humano que merece la misma protección legal que el adulto. Además las células madre embrionarias pueden favorecer la aparición de tumores en los receptores, debido a su alta capacidad de proliferación. De ahí la importancia del descubrimiento de células multipotentes en los seres humanos( Catherine Verfaillie 20001) , las primeras se encontraron en la médula ósea, después se descubrieron también en la grasa del tejido adiposo, el cordón umbilical, la placenta, el cerebro, músculo cardiaco etc… Estas células son fáciles de conseguir, no presentan problemas de histocompatibilidad y no originan tumores. Algunas enfermedades que se espera curar son diabetes( por regeneración de células β de los islotes del páncreas, leucemia infantil ( por regeneración de médula ósea) y el infarto de miocardio( por regeneración de los tejidos necrosados del corazón) 5. PROYECTO GENOMA HUMANO El Genoma Humano es el conjunto de todos los genes que posee nuestra especie distribuidos entre los 23 pares de cromosomas que tenemos en nuestras células. A principios de los años 90 del siglo XX y a instancias de J. Crick, uno de los descubridores de la estructura del DNA, se puso en marcha un ambicioso proyecto, el Proyecto Genoma Humano, concebido para localizar, secuenciar y estudiar la función de todos los genes de la especie humana.

En este Proyecto se involucraron centros de investigación de todo el mundo y surgió uno de los casos más llamativos de competencia entre investigación privada e investigación financiada con fondos públicos. Esta situación fue debida a que ciertas multinacionales estadounidenses se sumaron a la carrera con la idea de patentar genes y obtener beneficio de las posibles aplicaciones de ese conocimiento, lo que ha desatado en algunos momentos una cierta polémica.

Los objetivos del Proyecto son:

1. Conocer la secuencia de bases de todo el ADN

2. Obtener un mapa genético de los cromosomas, es decir, localizar y situar todos los genes de cada cromosoma.

3. Secuenciar cada gen, es decir, averiguar la secuencia de nucleótidos que lo forman.

4. Determinar la función de los genes.

Las aplicaciones prácticas del Proyecto son enormes, pensando en la posibilidad de detectar y curar enfermedades genéticas antes de que se produzcan, cambiar genes defectuosos, etc. Estas posibilidades también han levantado enormes recelos en amplios sectores de la sociedad, puesto que existen otras posibilidades menos aceptables, tales como la posibilidad de que se conozca con antelación qué enfermedades puede desarrollar una persona, o discriminar a alguien por sus genes. Esto hace que las cuestiones bioéticas que rodean al Proyecto constituyan una de las partes fundamentales del mismo, razón por la que existen ciertas reticencias ante la intervención de empresas privadas. 6. RIESGOS Y ASPECTOS ÉTICOS DE LAS TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA Desde las publicaciones de los primeros experimentos en ingeniería genética, en la década de los setenta, una enorme controversia se abrió en el mundo científico y social de aquella época. Las perspectivas que abrían los nuevos descubrimientos variaban desde un mundo maravilloso sin enfermedades, con un increíble rendimiento agrícola y ganadero, todo tipo de nuevos fármacos, hasta un mundo catastrofista dominado por una minoría desaprensiva. En 1975 se celebró una Reunión Internacional en el Centro de Conferencias Asimolar de Pacific Grove, en California, en la que se estableció unas directrices para el trabajo con el ADN recombinante, normas que regulaban el confinamiento de los experimentos a "microcosmos" controlados. Como ninguno de los peligros previstos llegó a materializarse, se suavizaron sus lineas directrices. El inicio de la investigación genética en la especie humana, clonación de embriones, etc., ha llevado a nuevas reflexiones y a la creación de un Comité Internacional de Bioética, dependiente de la UNESCO, en 1993. Se ha acuñado el término bioseguridad , formándose incluso un

Comité Institucional de Bioseguridad que pretende llegar a acuerdos internacionales en el terreno de la investigación y en la aplicación de los descubrimientos científicos obtenidos. Frente a los múltiples beneficios que ofrece este campo, se encuentran algunos problemas que puede presentar la aplicación de la Ingeniería Genética: ∙ Problemas sanitarios. Pueden aparecer nuevos microorganismos patógenos que provoquen enfermedades desconocidas, o el uso de fármacos de diseño provoquen efectos secundarios no deseados. ∙ Problemas ecológicos. La liberación de nuevos organismos en el ambiente puede provocar la desaparición de especies contra las cuales se lucha, con consecuencias aún desconocidas, ya que cumplen una función en la cadena trófica de la naturaleza. Se puede pensar en posibles nuevas contaminaciones debidas a un metabolismo incontrolado. ∙ Problemas sociales y políticos. Las aplicaciones de la Biotecnología en el campo de la producción industrial, agrícola y ganadera, pueden crear diferencias aún más grandes entre países ricos y pobres. El sondeo génico en personas puede llevar a consecuencias nefastas en la contratación laboral, por ejemplo, y atenta contra la intimidad a que tiene derecho toda persona. ∙ Problemas éticos y morales. La experimentación en la especie humana puede atentar contra la dignidad de la misma. Poder conocer y modificar el patrimonio genético humano puede ser una puerta abierta al eugenismo. En el campo de la Terapia Génica es defendible este procedimiento cuando se utilice en células somáticas para corregir enfermedades. En la línea germinal se pide su prohibición en todo aquello que sea recomponer un programa genético humano. Los trabajos con embriones humanos con fines puramente experimentales se consideran un atentado a la dignidad de la especie humana. Por todo ello, es preciso que los conocimientos y avances en Ingeniería Genética se consideren patrimonio de la humanidad, y que los Organismos Internacionales creados para ello sean capaces de vencer las reticencias que crean los intereses políticos y económicos, logrando una legislación adecuada y justa.