DRM-Biotecnología SB 2012 1 BIOTECNOLOGÍA Tecnología del ADN recombinante Tecnología del ADN...

DRM-Biotecnología SB 2012 1

BIOTECNOLOGÍABIOTECNOLOGÍA

Tecnología del ADN Tecnología del ADN recombinanterecombinante Producción de insulinaProducción de insulinaOrganismos transgénicosOrganismos transgénicosClonacionesClonacionesGenómica y protéomicaGenómica y protéomica

2DRM-Biotecnología SB 2012

Tecnología del ADN Tecnología del ADN recombinanterecombinante

HerramientasHerramientas::

Células donantesCélulas donantes GenesGenes Células receptorasCélulas receptoras Vectores (Vectores (plásmidos, cósmidos, cromosomas plásmidos, cósmidos, cromosomas

artificiales, bacteriófagos, vectores de levadurasartificiales, bacteriófagos, vectores de levaduras)) Enzimas de restricciónEnzimas de restricción Transcriptasa reversaTranscriptasa reversa LigasasLigasas Sondas de ADN Sondas de ADN


Características de los vectores: los plásmidos


Enzimas de restricción o Enzimas de restricción o endonucleasasendonucleasas

Enzimas específicas que Enzimas específicas que reconocen ciertas secuencias reconocen ciertas secuencias blanco en el ADN llamadas blanco en el ADN llamadas palíndromospalíndromos y lo y lo cortan en fragmentos de variada longitudcortan en fragmentos de variada longitud (fragmentos de restricción). Las enzimas de (fragmentos de restricción). Las enzimas de restricción pueden cortar dejando extremos romos restricción pueden cortar dejando extremos romos o cohesivos.o cohesivos.

La variedad y cantidad de los fragmentos obtenidos La variedad y cantidad de los fragmentos obtenidos depende de las enzimas usadas. Esta característica depende de las enzimas usadas. Esta característica es única y difiere entre los individuos de una misma es única y difiere entre los individuos de una misma especie, por lo que sirve como identificación de especie, por lo que sirve como identificación de personas y se la conoce como personas y se la conoce como polimorfismo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricciónlongitud de fragmentos de restricción (RFLPs). (RFLPs).

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Cómo actúan las enzimas de Cómo actúan las enzimas de restricciónrestricción


Cómo se usan las enzimas de restricción para insertar genes en un plásmido



Técnicas frecuentemente usadas:Técnicas frecuentemente usadas:

Electroforesis en gel (Electroforesis en gel (agarosa o agarosa o poliacrilamidapoliacrilamida))

PCRPCR Southern blot, Northern blot, western Southern blot, Northern blot, western

blotblot Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN


Electroforesis en gelElectroforesis en gel Separación de moléculas según Separación de moléculas según

tamaño y carga aplicando corriente tamaño y carga aplicando corriente eléctrica.eléctrica.

Puede usarse para separar proteínas Puede usarse para separar proteínas o para separa fragmentos de ADN.o para separa fragmentos de ADN.

En gel de agarosa En gel de poliacrilamida


Separación de los fragmentos de ADN

DRM-Biotecnología SB 2012 12PCR

Southern blotting

PCR

TÉCNICAS FRECUENTES



Qué se puede hacer:Qué se puede hacer:

Insertar genes de procariotas a Insertar genes de procariotas a procariotas (procariotas (bacteria-bacteriabacteria-bacteria))

Insertar genes de eucariotas a procariotas Insertar genes de eucariotas a procariotas ((levadura/animal/vegetal – bacterialevadura/animal/vegetal – bacteria))

Insertar genes de eucariotas a eucariotas Insertar genes de eucariotas a eucariotas ((levadura/animal/vegetal -levadura/animal/vegetallevadura/animal/vegetal -levadura/animal/vegetal))

Construcciones de bibliotecas de ADN, Construcciones de bibliotecas de ADN, genómicas o de cDNAgenómicas o de cDNA


Aplicaciones de la Aplicaciones de la tecnología del ADN tecnología del ADN

recombinanterecombinante Ingeniería genéticaIngeniería genética Estudio de genes específicos responsables de Estudio de genes específicos responsables de

enfermedadesenfermedades Estudio de genes que codifican para enzimas Estudio de genes que codifican para enzimas

específicasespecíficas Identificación de personas (medicina forense – Identificación de personas (medicina forense –

antropología - desaparecidos)antropología - desaparecidos) Producción de proteínas o enzimas específicas Producción de proteínas o enzimas específicas

para la industria farmacéutica/láctea/vitivinícola, para la industria farmacéutica/láctea/vitivinícola, medicina preventiva, etc.medicina preventiva, etc.

Producción de fragmentos cortos de ADN Producción de fragmentos cortos de ADN (sondas, primers)(sondas, primers)


Aplicaciones de la tecnología Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinantedel ADN recombinante


Ingeniería genéticaIngeniería genética DefiniciónDefinición: : unun conjunto de conjunto de

metodologías que permite transferir metodologías que permite transferir genes de un organismo a otro y genes de un organismo a otro y expresarlos (producir las proteínas expresarlos (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de en organismos diferentes al de origenorigen. .

Algunas aplicacionesAlgunas aplicaciones En la industria farmacéuticaEn la industria farmacéutica En medicinaEn medicina En agricultura y ganaderíaEn agricultura y ganadería En limpieza del medio ambienteEn limpieza del medio ambiente


1)1) Ingeniería genética en Ingeniería genética en bacteriasbacterias:: Producción de insulina Producción de insulina

humana humana a escala industriala escala industrial


1. Se aísla el gen de la insulina a insertar2. Se aísla el plásmido con genes

marcadores de la bacteria y se lo corta con ER

3. Se incuba el plásmido abierto + gen + ligasa

4. Se introduce el plásmido recombinante en las bacterias

5. Se seleccionan las bacterias que hayan adquirido el plásmido recombinante deseado (en 2 pasos, ver diapo. siguiente.)

6. Se cultivan las bacterias en tanques fermentadores, donde se reproducen y sintetizan grandes cantidades de la proteína insulina

7. Se extrae y separa la proteína insulina, se la purifica, se la embotella y finalmente se la comercializa.

PASOS


Selección de las bacterias Supongamos que el plásmido contiene los genes marcadores Tet® y

Amp® (genes de resistencia a los antibióticos tetraciclina y ampicilina) y se quiere insertar el gen de la insulina en el lugar del gen Amp®. ¿Cómo sabemos qué bacterias cultivar en tanques?

1) Para discriminar entre bacterias que adquirieron o no el plásmido, se cultivan a las bacterias en un medio con el antibiótico tetraciclinatetraciclina.

2) Para diferenciar a aquellas bacterias que poseen el gen de la insulina insertado en el lugar correcto de las que lo tienen en otro lugar del plásmido, se cultivan a las bacterias sobrevivientes del caso anterior en un medio con ampicilinaampicilina.

Para esto se utiliza la técnica de transferencia; luego se marcan las colonias que poseen el plásmido deseado y se las cultiva aparte.


Del laboratorio a la industria


2) 2) Ingeniería genética en plantasIngeniería genética en plantas::Producción del maíz Bt

Qué se necesita:• Agrobacterium tumefaciens (bacteria que será

usada como vector natural). Esta bacteria tiene un plásmido con dos regiones importantes: Ti (inductor de tumores) y vir (le confiere la capacidad de infectar e introducirse en células vegetales).

• Bacillus thurigiensis (aporta el gen de resistencia al ataque de la plaga- el gen “insecticida” natural)

• Medios de cultivos con hormonas de crecimientopara células vegetales • Planta de maíz a modificar• Macetas en invernaderos – área de cultivo


En el caso particular de la producción de una variedad de maíz que resista el ataque de insectos, el organismo dador es la bacteria del suelo denominada Bacillus thuringiensis (Bt) de la cual se extrae el gen que determina la síntesis de la proteína insecticida, y el organismo receptor del gen es la planta de maíz. El vector usado es la bacteria Agrobacterium tumefaciens quien naturalmente posee la capacidad de infectar plantas causando tumores. En esta técnica, la Agrobacterium conserva la capacidad de infectar pero la información genética necesaria para causar tumores es removida.

Después de la transformación, se expone el tejido tratado al agente químico selectivo (antibiótico o herbicida). Sólo las células exitosamente transformadas, sobrevivirán. Se usan luego métodos de cultivo de tejidos para regenerar plantas viables de las pocas células sobrevivientes.

Este maíz transgénico se lo conoce en el mercado como maíz Bt.


Esquema resumido


Del laboratorio al campo


Maneras de insertar genes en células vegetales 1. Agrobacterium. Uso de una bacteria como "Ingeniero Genético Natural". La bacteria conteniendo el

plásmido recombinante, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética.

2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el plásmido recombinante, sobre la célula.

3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. La corriente, fuerza el paso de los plásmido recombinante al interior del núcleo.

4. Polietilenglicol. La exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN.


3) 3) Ingeniería genética en animalesIngeniería genética en animales::

algunos ejemplos


Técnicas en animales


Obtención de animales transgénicos: pharming• Se utilizan animales de granja

modificados tal que puedan dar leche que contenga alguna molécula de interés farmacéutico: hormonas, factores de crecimiento, de coagulación, etc.

• Luego se extrae la molécula de la leche para ser comercializada o se comercializa la leche directamente.

• Reemplaza a nivel industrial a las bacterias modificadas cultivadas en fermentadores.

• Se utiliza la técnica de implantación de embriones genéticamente modificados. Estos clones producirán la leche especial.


ClonaciónClonaciónUn Un clonclon es una copia genética es una copia genética

idéntica de otro individuo, sea idéntica de otro individuo, sea unicelular o multicelular.unicelular o multicelular.

La clonación puede ser: La clonación puede ser:

NaturalNatural: fisión binaria en : fisión binaria en bacterias y protistas, propagación bacterias y protistas, propagación vegetal, generación de gemelos vegetal, generación de gemelos idénticos.idénticos.

ArtificialArtificial: producida en : producida en laboratorios por medio de laboratorios por medio de manipulación de células y/o manipulación de células y/o embriones.embriones.

La clonación artificial puede La clonación artificial puede definirse como el proceso por el definirse como el proceso por el que se consiguen de que se consiguen de modo modo asexualasexual individuos individuos idénticos a un organismo adulto. idénticos a un organismo adulto.

Dentro de la clonación artificial, Dentro de la clonación artificial, existen 2 tipos:existen 2 tipos:

A) Clonación terapéuticaA) Clonación terapéuticaB) Clonación reproductivaB) Clonación reproductiva

3131DRM-Biotecnología SB 2012DRM-Biotecnología SB 2012

Clonación de DollyClonación de Dolly


Para qué sirve la clonación terapéutica

•generar células madre

•uso en la terapia génica (reemplazo de genes defectuosos por normales)

•reconstrucción de tejidos para implantes


Nuevas aplicaciones de la clonación


Comparación entre desarrollo normal y los diferentes tipos de clonación


Diferencia entre selección artificial y la ingeniería

genética


Células Células madre madre (stem (stem cells)cells)

• Se obtienen a partir de estadíos tempranos del desarrollo embrionario• Sirven para lograr varias líneas celulares

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