INTRODUCIÓN A TECNOLOXIA DO ADN

RECOMBINANTE

¿Qué es la tecnología del ADN recombinante?

ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN.

Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. 

El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas de investigación: 1) el conocimiento de las enzimas de restricción, 2) la replicación y reparación de ADN, 3) la replicación de virus y plásmidos y 4) la síntesis química de secuencias de nucleótidos.

¿Cómo cortar y pegar el ADN? Tijeras moleculares: enzimas de restricción

Enzimas de restricción actúan como “tijeras moleculares”, cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas dio origen a la ingeniería genética.

Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos ( o pegajoso) son generados

cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena complementarios

entre sí. Por otro lado, los extremos romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos

extremos doble cadena.

¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?

• Los plásmidos (pequeñas moléculas de ADN circular presente en muchas bacterias) contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico.

Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un

plásmido

Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre

de clonación.Un clon es un grupo de células u

organismos genéticamente idénticas.

El uso fragmentos de ADN como vectores sirven para transferir material genético de un

organismo a otro.

¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa

invención de una técnica capaz de generar centenares de miles de copias de una secuencia sin la necesidad de clonarla en ningún tipo de vector,la reacción en cadena de la polimerasa.

Esta se basa en la separación de ambas hebras de ADN, la posterior unión de pequeños fragmentos (denominados primers) y la extensión de estos fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. Así se obtienen dos copias idénticas por cada molécula en cada ciclo de reacción

¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos: sondas y anticuerpos

Técnicas más empleadas para localizar fragmentos determinados del genoma (o la expresión de algún gen en particular por medio de la detección de la presencia de su correspondiente ARNm) es la hibridación in situ. Durante este proceso se incuba el ADN con una sonda (de ADN o ARN) complementaria a la secuencia buscada, y marcada radiactiva o químicamente.

La sonda “navega” por el interior de la célula hasta encontrar una secuencia complementaria a ella. Una vez que esto ocurra se formará una doble cadena que permitirá no sólo detectar la presencia de esta secuencia, sino indicar el lugar específico que

ocupa dentro de la célula.

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?

Separación de ácidos nucleicos y proteínas. Electroforesis en gelLa electroforesis en gel es uno de los métodos más utilizados en los

laboratorios para separar ácidos nucleicos o proteínas, de acuerdo con su tamaño. Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. La carga eléctrica sirve como fuerza impulsora que atrae las moléculas cargadas negativamente hacia el otro extremo del gel que posee carga positiva. Existen distintos tipos de gel

La separación de proteínas es un poco mas complicada, ya que éstas poseen una estructura tridimensional compleja y compacta, además de una carga neta que depende de la identidad de los aminoácidos que la componen. Esto hace más difícil separarlas sólo por su tamaño y por eso se emplea una versión modificada conocida como electroforesis en gel de poliacrilamida

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern, Northern y Western Blot

Técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado.

Se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominóNorthern Blot (en clara alusión al nombre del científico

inventor de la técnica basada en ADN).

¿Cómo sacar fotos de genes activados? Microarreglos

• Otra técnica que emplea la hibridación de sondas específicas marcadas es la de microarreglos (Microarrays), que consta de una membrana dividida en celdillas que poseen adheridas sondas que representan un gen en particular. En conjunto, estas celdillas contienen todos los genes conocidos de un organismo. De esta manera, cuando se coloca una muestra en estos chips se irá hibridando cada gen que se encuentre en la muestra con su sonda correspondiente en la casilla determinada. Cuando una celdilla da positivo, quiere decir que ese gen determinado está presente en la muestra.