Desarrollo de la Ingeniera gentica y la biotecnologa

Se logr manipular genticamente en los individuos

Propiciarles nuevas caractersticas

Molculas de ADN producidas por la unin de segmentos que provienen de diferentes fuentes biolgicas.

Tambin llamado Recombinacin gentica in vitro. Se basa en la insercin del DNA forneo al genoma de una clula hospedadora para que sta lo exprese como si fuera suyo.

Paul Berg

Herbert Boyer

Stanley Cohen Las primeras molculas de ADNr fueron generadas en 1973.

1978 El Dr. Herbert Boyer de la Universidad de California, San Francisco, construye una versin sinttica del gen de la insulina humana y lo introduce en la bacteria E. coli, permitiendo que sta produzca insulina humana.

Tcn

icas

del

ADN r

eco

mbinant

e

La rotura especfica del ADN mediante nucleasas

de restriccin

La secuenciacin rpida

La Hibridacin

La clonacin del ADN

La ingeniera gentica

Daniel Nathans

Hamilton Smith

Werner Arber

1978: Premio Nobel

Facilitando el estudio del ADN

Tipo I: Enzima formada por 3 subunidades Cortan el DNA en lugares al azar a cierta distancia

del sitio de restriccin, son cortes cohesivos. Accin de metilacin Requiere ATP Necesita de Mg++ y SAM como cofactor

Tipo III: Restriccin y metilacin Corte de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de

Reconocimiento Necesitan Mg++, ATP y SAM(S- adenosil-metionina)

Tipo II: Hamilton Smith No necesitan ATP Cortan el DNA en la misma secuencia de reconocimiento

las secuencias reconocidas son palindrmicas. No metilacin Solo requieren de Mg++ como cofactor.

Endonucleasas de restriccin

Obtenidas de procariontes FUNCION: Eliminar ADN forneo

Reconocer secuencia especifica de nucletidos: 4 a 8 pares de bases .

Cortar el DNA en sitios de restriccin: Hidrolizar enlace fosfodister en cada hebra

Existen aisladas y caracterizadas casi 200 enzimas de restriccin

Segn el tipo de corte: Extremos cohesivos o adherentes: Corte asimtrico, dejando lo extremos de cada hebra se simple cadena complementarias entre si. tiles en la construccin de molculas de ADN hibridas o quimricas Extremos romos: Corte de dos hebras por el mismo lugar

Cataliza la formacin de puentes fosfodiester entre los extremos adyacentes 3OH y 5 fosfato en el DNA Requiere Mg++

Aislar el ADN de inters e insertar en un vector, multiplicndose el ADN Seleccionar el fragmento de ADN-

tecnica de PCR Seleccionar el vector Ligacin , gracias al DNA ligasa Insercin -Bacterias- transformacion -Celulas - transfeccion Propagacin o cultivo Purificacion

Vectores para ADN recombinante

Dependiendo del tamao del ADN que se inserta y del propsito del experimento

es posible utilizar distintos vectores de clonacin para generar molculas recombinantes

Los vectores ms usados son: a) un plsmido (fragmento extra de ADN bicatenario circular de unos 4,3 kb, que existe en algunas especies de bacterias). b) un csmido (similar al plsmido pero de mayor longitud, unos 40 kb). c) un virus vector ( en este caso el ADN extrao que se quiere transferir se incorpora al ADN vrico y funciona como ADN recombinante).

descubierta por Fred Griffith en 1928

Transformacin es la captacin de un plsmido y la posterior incorporacin de esta molcula al cromosoma de la clula receptor en una forma heredable.

Transformacin natural

las bacterias se lisan y liberan fragmentos de DNA al medio que las rodea.

Clula competente(capta DNA y se transforma)

La competencia es un fenmeno muy complejo y depende de diversas condiciones.(p.e. S.pneumoniae - fase exponencial- segregan factor de competencia

La transformacin natural se ha descubierto hasta la fecha en ciertos gneros de bacterias grampositivas y gramnegativas:

Streptococcus, Bacillus, Thermoactinomyces, Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Azotobacter y Pseudomonas

Transformacin artificial

Se induce la competencia artificialmente.

xito en especies que no son competentes de forma natural, E.coli.

tratamiento de las clulas con Cl2Ca, que aumenta la permeabilidad de sus membranas al DNA, los iones neutralizan la repulsin entre cabezas de fosfolpidos y grupos fosfatos de DNA.

El choque trmico estimula la entrada de DNA.

Introduccin de ADN exgeno a una clula eucariota mediante plasmidos, vectores viricos (transduccion)

Mtodos qumicos Fosfato clcico Polmeros

catinicos(DEAE dextrano)

Lpido catinicos

Mtodos fsicos Microinyeccin

directa Electroporacin Microproyeccin o

biobalstica

Transfeccin mediante fosfato de calcio (Graham & Van der, 1973). Mtodo ms barato y ptimo Se utiliza una solucin salina que

contiene iones fosfato y se combina con una solucin de cloruro de calcio que contiene el ADN a transfectar.

Ambas se combinan y se forma un precipitado de calcio (+) y el fosfato cargado(-)

A esta suspensin se aade las clulas que se quieren transfectar . las clulas endocitan/fagocitan parte del precipitado, y junto con l, el ADN.

Mtodo del DEAE dextrano

Basado en la obtencin de complejos entre la resina DEAE y el DNA.

Los polmeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas molculas de DNA.

El DNA acomplejado se introduce en las clulas mediante choque osmtico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes.

Microinyeccin directa.

Es una tcnica muy efectiva aunque laboriosa, slo es utilizado sobre ovocitos o cigotos.

Se introduce el ADN recombinante en el interior celular con una micropipeta.

La microinyeccion es normalmente realizada bajo un microscopio optico llamado micromanipulador.

Electroporacin

Una solucin con clulas y ADN recombinante es sometida a descargas elctricas de alto voltaje. Esto altera la permeabilidad de la membrana, permitiendo la entrada del ADN recombinante.

Microproyeccin o biobalstica: Se utiliza microesferas de metal impregnadas de ADN. Se proyecta a una gran velocidad sobre las clulas, estos integran espontneamente los genes a su genoma. Se da en clulas de plantas

Proceso mediante el cual ADN exogeno es introducido en una celula mediante un vector viral(bacterifagos).

PROTENA RECOMBINANTE

Definicin

Es aquella protena cuya sntesis se realiza en una especie o una lnea celular distinta al organismo nativo.

Para su produccin se utilizan tcnicas de ADN recombinante y Biologa molecular que permiten extraer el material gentico de una clula que codifica para la protena de inters que luego de ser insertada en un vector apropiado va a internalizarse en clulas o bacterias donde ocurren la expresin.

Sistemas de expresin

Organismo hospedero.

Vector de expresin que poseen elementos gnicos necesarios para realizar los procesos de transcripcin y traduccin, este recibe las molculas de DNA recombinante.

Sistemas de expresin

Clulas Procariotas (Bacterias) Escherichia coli

Bacillus subtilis

Clulas eucariontes Hongos

Levaduras Saccharomyces cerevisiae

Pichia pastoris y otros metilotrficos

Hongos filamentosos: del gnero Aspergillus

Clulas animales en cultivo

Plantas

Los sistemas bacterianos, los ms utilizados para producir PROTENAS

RECOMBINANTES

VENTAJAS

+ Fcilmente manipulables genticamente.

+ Se propagan rpidamente.

+ Econmicos.

+ Requieren entrenamiento mnimo.

+ Permiten su automatizacin

Los vectores que se emplean en E. Coli son los Plsmidos (

DESVENTAJAS

1.Las protenas de eucariotas expresadas en cel. procariotas generalmente no logran una buena expresin o no son funcionales (inestables, sin actividad biolgica).

2.No es capaz de llevar a cabo modicaciones postraduccionales de la protena recombinante que permitan, por ejemplo su glicosilacin, necesaria para su estabilidad y actividad biolgica.

3.Pueden llegar a agregarse en el citoplasma en los llamados CUERPOS DE INCLUSIN.

4.Contaminantes procariticos.

Sistemas de expresin en levaduras

VENTAJAS: Protenas bien caracterizadas

gentica y fisiolgicamente. Plsmido natural (2m) Eucariotas, s ocurren

modificaciones post-transduccionales.

Segregan algunas protenas. No patgeno.

Los vectores apropiados son los

plsmidos o los YACs (100-300Kb)

DESVENTAJAS:

Inestabilidad de plsmidos en gran escala.

Vectores episomales. Superglicosilacin de protenas.

Puede alterar la actividad de la protena. Protenas secretadas quedan atrapadas en periplasma

(entre la membrana y la pared celular).

Sistemas de expresin en cultivos celulares

Se emplean cultivos derivados de lneas celulares de mamferos, como la lnea celular BHK (Baby Hamster Kidney), HEK293 (Human Embryonic Kidney) y principalmente la lnea celular CHO (Chinese Hamster Ovary).

Este tipo de sistema de cultivo se utiliza principalmente para la sntesis de un 60% de las protenas teraputicas.

Los vectores habituales son virus SV40, YACs y HACs.

PROCESO DE OBTENCIN DE

PROTENAS RECOMBINANTES

En trminos generales, la produccin de protenas recombinantes sigue el siguiente esquema:

1) Tratamiento con enzimas de restriccin de un vector de clonacin y del ADN que contiene el gen que codifica la protena de inters. 2) Ligamiento del gen con el vector para obtener el ADN recombinante (ADNr). 3) Internalizacin y replicacin (clonacin) del ADNr en una clula hospedera. 4) Expresin del gen en la protena.

Identificacin y seleccin del gen responsable de la produccin de la protena de inters.

Se coloca dicho gen en el plsmido e insertarlo dentro del hospedero(bacteria, levadura o cel. animal)

Se debe aislar copias idnticas de la clulas transformadas y aquellas que producen la protena de inters en mayores cantidades son subcultivadas,

colocadas en crio-viales denominado banco maestro.

Un vial de este banco maestro es subcultivado nuevamente para poder producir el banco de trabajo y de este se utilizarn los viales para la produccin, sirven de inculo para expresar a la protena de inters.

Esquema general del proceso

Banco Maestro

Banco de trabajo

Preparacin de inculo

Cultivos de inoculacin

Cultivo

Obtencin del gen de inters

Cultivo Si el producto es intracelular

Si el producto es extracelular

Recuperacin de clulas

Ruptura de clulas

Remocin de debris

Concentracin y purificacin

Remocin y eliminacin de clulas

Sobrenadante

PURIFICACIN:

Aspecto muy importante en la produccin y normalmente el ms caro. El objetivo de la purificacin es obtener la mayor cantidad de producto con respecto al inicial, con el menor desperdicio posible y con la pureza exigida como mnima para el producto.

Si el producto es intracelular: - Ruptura celular. - Remocin de restos celulares. - En el medio quedan protenas recombinantes.

Si el producto es extracelular: Solo se remueven a las clulas en cuestin quedando la PR.

En el caso de frmacos, se necesita una purificacin de aproximadamente un 90%.

CONCENTRACIN DE LA MUESTRA:

Se necesita que sea: Robusta, eficiente.

Qu protenas se pueden producir con la tecnologa del ADN recombinante?

De todo tipo, protenas membranales, protenas solubles, protenas de bajo o de alto peso molecular.

Protena Tipo de vector

Gen de inters

Seleccin

Obtencin y clonacin de

PROTENAS RECOMBINANTES EN LAS

ENFERMEDADES CRNICAS

ENFERMEDAD CRNICA: Enfermedades de larga duracin y por lo general de progresin lenta.

BIOFRMACOS: Molcula biolgica con fines teraputicos obtenida a partir de un organismo vivo.

La primera PR obtenida en la E. Coli fue la somatostatina, por ser una protena pequea y fcil de producir fue un xito cientfico pero al mismo tiempo un fracaso econmico.

Ms tarde se realiz insulina in-vitro, y esto s supuso una gran revolucin, puesto que es una protena que necesitan 170 millones de diabticos. Antes de ser generada in vitro era producida a partir del pncreas del cerdo y vaca, se logr obtener a partir de la Sacharomyces cerevisae.

La hormona del crecimiento humana (hGH) es caracterstica de cada especie; la fuente de la que se la obtena anteriormente eran cadveres humanos. Su escasa disponibilidad, an a pesar de sus muchas aplicaciones clnicas, ha constituido un factor condicionante del desarrollo de la investigacin sobre la misma.

Se utiliza para tratamiento de desordenes de crecimiento en nios y deficiencia en el crecimiento en adultos

El gen del Factor VIII, una protena involucrada en la coagulacin de la sangre, est alterado en individuos con hemofilia. Antes de que se dispusiera de Factor VIII por ingeniera gentica, muchos hemoflicos murieron de SIDA o hepatitis debido a que contrajeron la enfermedad por transfusiones con sangre contaminada o con Factor VIII aislado a partir de sangre contaminada.

EN VACUNAS

El sistema tradicional de obtencin de vacunas es a partir de microorganismos patgenos inactivos o atenuados, pero esto puede comportar un riesgo potencial.

Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniera gentica.

Como la mayora de los factores antignicos son proteinas lo que se hace es clonar el gen de la proteina correspondiente.

Un aspecto importante de estas protenas de uso teraputico es que son especficas contra padecimientos que antes se consideraban incurables, o bien cuando el medicamento existente solo lograba controlarla enfermedad, en la mayora de los casos de manera ineficaz. Un claro ejemplo es el interfern b-1 y 1b, el cual ha elevado la calidad de vida de los pacientes diagnosticados con esclerosis mltiple.

El uso de protenas teraputicas o biofrmacos en el tratamiento de diversas enfermedades crnicas o deficiencias hereditarias, se ha venido implementando cada vez ms en los ltimos 30 aos.

Las protenas teraputicas son producidas en sistemas heterlogos in-vitro mediante tecnologa de ADN recombinante permitiendo que se puedan combatir enfermedades crnicas.

1) Expresar o fabricar la protena para la cual encierran informacin. 2) Perpetuar esa informacin durante la divisin celular.

La Terapia Gnica se define como una tcnica teraputica mediante la cual se inserta un gen funcional en las clulas de un paciente humano para corregir un defecto gentico o para dotar a las clulas de una nueva funcin.

TERAPIA GNICA DE CLULAS GERMINALES

TERAPIA GNICA SOMTICA

En funcin del TIPO CELULAR

DIANA:

Se lleva a cabo en el embrin temprano en la fase del desarrollo embrionario que se corresponde con las primeras divisiones, o en los gametos (ovocitos y sobretodo espermatozoides) y, por tanto, es transmisible a la descendencia.

Las legislaciones actuales prohben esta terapia y los bioeticistas la condenan.

Aquella dirigida a modificar la dotacin gentica de clulas no germinales, es decir, de las clulas somticas o constituyentes del organismo. Por ello, la modificacin gentica no puede transmitirse a la descendencia.

METODOS DE TRANSFERENCIA

Directos

Sistemas Qumicos

Transferencia con fosfato de calcio

Sistemas Fsicos

Microinyeccin

Electroporacin

DNA desnudo

Indirectos

Vectores virales

Retrovirus

Adenovirus

Herpesvirus

Vectores no virales

Complejos ADN liposomas

Cromosomas artificiales humanos

INCORPORAR GENES NUEVOS

INDIRECTOS-VECTOR

Vectores virales mas utilizados

Esta metodologa comienza en 1968 cuando se demuestra que los virus son capaces de infectar clulas de mamfero.

Los vectores virales pueden ser utilizados tanto "in vivo" como "ex vivo".

COMPLEJO ADN LIPOSOMAL

Consiste en la introduccin del gen mediante un vehculo para que lo inserte en las clulas del paciente.

Con esta estrategia, sin embargo, no es posible controlar la eficacia de la transferencia

Consiste en extraer clulas de un paciente, cultivarlas y modificarlas in vitro. Luego se reimplantan esas clulas en el paciente. En este caso, el riesgo de rechazo del implante por parte del sistema inmunitario es mnimo.

Marcaje gnico: El marcaje gnico tiene como objetivo, no la curacin del paciente, sino hacer un seguimiento de las clulas, es decir, comprobar si en un determinado sitio del cuerpo estn presentes las clulas especficas que se han marcado.

Terapia de enfermedades monognicas hereditarias: Se usa en aquellas enfermedades en las que no se puede realizar o no es eficiente la administracin de la protena deficitaria. Se proporciona el gen defectivo o ausente.

Terapia de enfermedades adquiridas: Entre este tipo de enfermedades la ms destacada es el cncer. Se usan distintas estrategias, como la insercin de determinados genes suicidas en las clulas tumorales o la insercin de antgenos tumorales para potenciar la respuesta inmune.

Recombinant DNA Advisory Committee-RAC

La Terapia Gnica todava est en desarrollo, motivo por el cual su aplicacin se lleva principalmente a cabo dentro de ensayos clnicos controlados.

Produccin de protenas teraputicas Bacterias y levaduras Un ejemplo de estos polipptidos producidos son hormonas como la insulina, hormona del crecimiento, glucagn, interfern, factores de la coagulacin, factor VIII, etc. Incorporar protenas de la leche materna a la leche de las vacas Introduciendo una protena por generacin 80% de las protenas de la leche humana ( la leche artificial)

Expresin de la hormona de crecimiento humana (hGH) en E.coli. a tratamiento de desordenes de crecimiento en nios y deficiencia en el crecimiento en adultos.se debe utilizar sistemas eucariontes para su produccin. Los vectores de expresin utilizados en este caso pueden utilizarse clulas de levaduras, algas, plantas, insectos, gusanos de la seda (Bombix mori) y mamferos.

Vacunas: Las protenas pueden producirse completamente libres del agente infeccioso y se elimina as todo riesgo de infeccin. Primera vacuna recombinante que fue producida de forma satisfactoria fue la vacuna contra el virus de la hepatitis B. El virus contiene un antgeno de superficie (HBsAg, llamado tambin antgeno australiano) cuyo ADN ha sido aislado. Pero debido al hecho de que la protena est glicosilada, no puede ser producida en Escherichia coli (porque las bacterias no pueden glicosilar protenas). Por lo tanto, se utiliza un sistema de expresin en levaduras (clula eucarionte) para producir la forma glicosilada de la protena.

Animales transgnicos Hace veinte aos se lograron obtener los primeros ratones transgnicos mediante transferencia gnica por inyeccin directa de ADN extrao en un cigoto obtenido por fecundacin in vitro Es decir, se trataba de una transmisin gentica horizontal, tambin llamada transgnesis. El ADN extra pasa a las clulas germinales y luego es transferido a la progenie derivada de estas clulas comportndose como un gen nuclear regular. Permite la evaluacin de estrategias teraputicas en modelos de enfermedades humanas

Terapia gnica Actualmente est en experimentacin en enfermedades cardiovasculares, SIDA, cncer, autoinmunidad y otras patologas. En humanos, se han logrado algunos xitos en patologas asociadas al pulmn y a tumores de piel, pero la gran mayora de tratamientos se encuentran en fase experimental en animales de laboratorio

Deteccin prenatal de enfermedades Extraccin de una muestras del liquido amniotico Extraccin de una pequea muestra de tejido del corion(membranas de proteccin embrionaria El material gentico de estas clulas puede ser sometido a enzimas de restriccin y mediante tecnologa del ADN recombinante se hacen cultivos de genes de inters

Cncer Algunos organismos presentan enzimas endo-exonucleassas aisladas de E. coli encargadas d reparacin del DNA y muerte celular Posibilidad de introducir el gen q la codifica en clulas cancerosas conducira a reparacin in vivo de la secuencia mutada Enzimas estudiadas por ADN recombinante y PCR