Expresión de ADN

recombinante II

Biología Molecular - Licenciatura en Biotecnología

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas - UNR

Dra. María Gabriela Mediavilla

2018

Clarificación y purificación

• Objetivos: preparación de la muestra para su ulteriorpurificación, remoción de material particulado y otroscontaminantes (ADN, lípidos) no compatibles concromatografía.

______________________________________

• Si es secretada al medio, generalmente es suficiente unacentrifugación o filtración.

• En general, se deben extraer de la célula productora quedebe lisarse lo que depende del tipo celular y la densidaddel cultivo.

Forma de conservación en Apéndice

Elección del tampón de pH para lisis

• Estabilidad de la proteína con respecto al pH y el compuesto

buffer

• Compatible con el proceso de purificación subsiguiente: no sería

recomendable un paso adicional de cambio de buffer.

• Se usan en concentración 20-50 mM

Tabla completa en el apéndice

Observaciones (tampones)

• La mayoría muestran dependencia de pH con la temperatura.Especialmente los que contienen TRIS. El pKa cambia de 8,06 a 25ºCa 8,85 a 0ºC.

• HEPES interfiere con el ensayo de Lowry para determinarconcentración de proteínas (no con el de Bradford). Puede formarradicales bajo varias condiciones (no se debe usar cuando se estudianradicales). (tabla de interferencias en el apéndice)

• TRIS posee una amina potencialmente reactiva y participa en variasreacciones enzimáticas. Su pH es afectado, además de la T, por laconcentración: decrece 0,1 unidades luego de una dilución de 10veces.

• Los tampones fosfato son incompatibles con el uso de cationesdivalentes (ej. iones Mg2+).

Aditivos

• Para mejorar la estabilidad de la proteína

• Para mantenerla en solución

SÓLO USAR

CUANDO

ES REALMENTE

NECESARIO

Inhibidores de proteasas• La disrupción de la célula lleva a la liberación de enzimas proteolíticas que pueden disminuir el

rendimiento. Para controlar la proteólisis no deseada puede ser necesario agregar un “cocktail”

de proteasas a la suspensión celular. Algunos de estos compuestos no son muy estables en

solución acuosa por lo que es muy importante que sean agregados al tampón de lisis a partir de

una solución madre en agua o un solvente orgánico (metanol, etanol, isopropanol o DMSO)

inmediatamente antes de usar. Se pueden agregar al medio de cultivo.

AEBSF0,1-1 mM

E-64 5-40 µM 10mM DMSO

aminopeptidasa B

leucina aminopeptidasa

Bestatin 40-400 µM 4 mM DMSO

Observaciones(inhibidores de proteasas)

• PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) tiene una vida

media corta en solución acuosa. La solución stock debe

diluirse inmediatamente antes de usar. Pefablock es una

alternativa menos tóxica y más soluble y estable.

• El uso de EDTA y EGTA no es compatible con la

presencia de iones Mg2+ (requeridos para la unión de

nucleótido) en el tampón o con la cromatografía de

afinidad en columnas de Ni2+.

Tampón de lisis

• A pesar de que es imposible dar una solución de lisis general un

buen tampón de partida sería:

Mammalian cells

1-10 mM AEBSF

0,8-8 μM Aprotinin

40-400 μM Bestatin

14-140 μM E-64

20-200 μM Leupeptin

15-150 μM Pepstatin A

Método descripción E. coli Levaduras Insectos

Sonicación Pulsos cortos: 5-10’’, con intervalos en

hielo, 10-30’’ (calentamiento). Rotura ADN

(no hace falta DNAsa).

1-6 L; <50 g

células

Homoge_

neización

Con prensas: las células se presurizan y

la presión es liberada de golpe (clásico

French Press); mantener frío, evitar la

formación de espuma.

Con homogeneizadores manuales (tipo

Dounce) o eléctricos (ej. Ultra-Turrax)

Prensa: 2-3

pasadas,

6000-10000

psi.

Prensa: >3

pasadas,

6000-10000

psi.

Dounce: 10-20

golpes, (0,1%

Tritón X-100 o

NP-40).

>25 mL se usa

uno eléctrico.

Congelar y

moller

con N2 líquido y mortero. El polvo se

puede guardar indefinidamente a -80ºC y

se reconstituye con 5 vol. de buffer.

sí sí

Enzimas

líticas de

pared

digestión de la pared (se requiere

permeabilizar la membrana externa: TRIS,

EDTA). Se debe usar DNAsa. Para

grandes volúmenes resulta costoso.

Lisozima: Tris

(permeabiliza

ME) y EDTA.

Combinado

con sonicación

Zimolasa/

liticasa:

produce

esferoblastos.

No tienen

pared celular

Autólisis Se mezcla con tolueno (o compuestos

como el hidróxido de amonio) a T.A. por

24-48 hs. Evita crecimiento bacteriano,

permeabiliza membrana con liberación de

hidrolasas.

El más

antiguo. No

recomendable,

libera mucha

proteasas.

Vortexeado

+ cuentas

de vidrio

0,4-0,5 mm. Varios ciclos de 30-60 seg

(enfriando en hielo). Ruptura del 50-95 %.

15 mL (se escala con aparato especial).

Muy usado

Homogeneización

Dounce

French Press

Ultra-turrax

Modern homogenizers are often

continuous and can be operated

at higher pressures. Avestin

Emulsiflex-C5 efficiently lyzes E.

coli cells in one passage at

15,000 psi (100 MPa) and Pichia

pastoris cells in 3-5 passage at

30,000 psi (200 MPa).

Remoción del ADN

• Digestión enzimática por adición de DNAsa I (1

µg/ml) al lisado celular. En hielo, 10-15 min.

• Tratamiento para precipitación con polietilenimina

(0,1% (p/v)) or sulfato de protamina (1% (p/v))

seguido de centrifugación. Agregar al lisado e incubar

30 min a 4°C.

• Pasos generales:

1. Remoción de células no lisadas por centrifugación a bajavelocidad (20 min- 10.000 g).

2. Aislamiento de partículas de membrana (del sobrenadante)por ultra-centrifugación (60 min- >100.000 g).

3. Lavado de las partículas para eliminar la proteína soluble.

4. Solubilización de las proteínas con detergente. Depende deltipo y concentración: optimizar experimentalmente.

Más datos en el apéndice

CuantificaciónMétodos espectrofotométricos: tres categorías

1. Unión de colorante:

• Bradford: une Coomassie (G-250) en medio acídico, que sufre un corrimiento en su espectro de absorbancia (de marrón, máx. 465 nm, a azul, máx. 605 nm); se lee a 595 nm y es proporcional a la concentración de proteínas. Phe, Pro, Arg y Trp.

• NanoOrange: muy sensible, fluorescente.

2. Ion cobre en medio alcalino:

• Biuret: los Cu2+ son quelados por la unión peptídica y se reducen a Cu+ dando color lila (545 nm). Reacción dependiente de temperatura.

BIURET

BRADFORD

Cuantificación

• Lowry: ulterior detección del Cu+ con reactivo de Folin -Ciocalteu (ácido fosfomolíbdico/fosfotungsténico), color azul, 650-750 nm. Grupos fenólicos: tirosina y triptófano.

• BCA: ulterior detección con ácido bicinconínico. C/ Cu+-BCA

3. Abs 280 (Nanodrop)

• Amino ácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano)

LOWRY

BCA

Cuantificación

• Curva de calibración siempre (BSA).

• Bradford (5’ TA) NanoOrange (5’ a 95°C), Nanodrop rápidos.

Los demás requieren incubación en baño a 37°C (generalmente

30’).

• Estabilidad del color y lectura de todas las muestras en un

rango de tiempo.

Otro sitio para obtener información

http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/Comparision_of_Methods.htm

Biuret 5 – 160 mg/mL

Electroforesis de proteínas

• Objetivo: separación de proteínas en base a su PM ycarga.

• Método analítico. Aunque se puede eluir del gel unaproteína separada y obtenerla en solución.

• Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE),electroforesis en gel de poliacrilamida. Técnicaampliamente utilizada para separar macromoléculas(proteínas y ácidos nucleicos) de acuerdo a su movilidadelectroforética. Esta movilidad es función de su longitud,conformación y carga.

Electroforesis de proteínas

• Muestras: cualquier material conteniendo proteínas (o ác. nucleicos) tanto de origen

biológico (fracciones sub-celulares, células, tejidos procariotas o eucariotas, virus,

muestras ambientales, proteínas purificadas) como sintético.

• Puede ser tratada con un agente desnaturalizante (SDS) o analizadas en su forma

nativa (muchas veces seguido de tinción enzimática).

• SDS: sodium dodecyl sulfate; detergente aniónico que desnaturaliza las estructuras

secundarias y terciarias no unidas por puentes disulfuro. Se une proporcionalmente a la

masa de la proteína confiriéndole una carga neta negativa según su peso molecular y

otorgándole una forma de habano por lo que la relación carga/masa es igual para todas

las proteínas en la mezcla y por lo tanto migran según su PM.

• Se suele calendar a temperatura cercana a la ebullición en presencia de un agente

reductor (ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoetanol/β-ME)), para

reducir los puentes disulfuro presentes en algunas estructuras terciarias y cuaternarias

(separando subunidades de oligómeros): reducing SDS-PAGE.

Electroforesis de proteínas

0,75 – 1 – 1,5 mm

Electroforesis de proteínas

(funciones de los componentes)

‣ diversos porcentajes de acrialmida para

diferentes rangos de tamaños de

proteínas

‣ pH 8,8: los iones Cl- y glicina corren por

delante de las proteínas.

gel separación

gel concentración

‣ bajo porcentajes de acrialmida

‣ pH 6,8: los iones glicina y Cl- corren

casi a la misma velocidad por detrás y

por delante de las proteínas,

respectivamente, comprimiendo la

zona.

200 V ~35’

20 mA 1 h

PAGE/SDS

Western blot

PVDF o NC

Electrotransferencia

húmeda

Código de color negro/rojo

Electrotransferencia

semi-seca

EVITAR BURBUJAS!!!

Video en https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-

library/pierce-protein-methods/western-blot-transfer-methods.html

• cátodo (-)

• papel filtro

• PAGE

• membrana

• papel filtro

• ánodo (+)

15V 30’

30V ON o 100V 1h

Western blot (revelado)• Bloqueo de la membrana: leche en polvo descremada (libre de

lípidos) al 5% en PBS

• Incubación con el anticuerpo primario

• Incubación con el anticuerpo secundario conjugado a enzima

que permite la visualización (reacción de color o emisión de

luz):

1. HRP (peroxidasa de rabanito): H2O2 con: a) DAB, precipitado color

rojo-marrón o; b) luminol, emisión de fotones.

2. AP (fosfatasa alcalina): NBT y

BCIP, precipitado color lila.

Isoelectroenfoque (IEF)

• Isoelectric focusing (IEF), electrofocusing

• Técnica para separar moléculas en base a las diferencias en sus puntos isoeléctricos (pI)

• Es un tipo de electroforesis de zona. Generalmente para proteínas en gel, toma ventaja del hecho de que la carga neta de la molécula es función del pH del ambiente en el que se encuentra.

• Se agrega una solución de anfolitos (ej. proteínas) a un gel de gradiente de pH inmovilizado (IPG gel). Es un gel de acrilamida (sacarosa o agarosa) de poros grandes co-polimerizado con un gradiente de pH que resulta completamente estable (salvo a pHs >12). Se usan poros grandes para evitar un efecto de tamiz y artefactos en la determinación del pI por diferencias en la migración debidas al tamaño.

• Se aplica una corriente eléctrica creando un extremo positivo (ánodo) y otro negativo (cátodo) y las proteínas migran hacia un extremo u otro dependiendo de su carga neta que a su vez depende del pH que censa y que va cambiando a medida que la molécula se mueve en este medio. Entonces, la proteína deja de moverse y se enfoca cuando no tiene carga neta, es decir, en el punto del gradiente en el que el pH = pI. Alta resolución (separa proteínas con diferencias de 0,01 en su pI).

Isoelectroenfoque (IEF)

Tiras, tubo, gel con calles

Primera dimensión de un 2D

Geles 2D

Existen también:

➢ Far-Western Blot (para analizar interacciones proteína-proteína)

➢ Eastern Blot (para analizar modificaciones post-traduccionales)

Apéndice I

Almacenamiento de las proteínas purificadas

• Después de tanto trabajo Ud. querrá conservar su proteína en las mejores condiciones por el mayor tiempo

posible. Esto depende de la estabilidad de la proteína y del momento en que se quiera usar la misma luego de

la purificación. Se deben evitar condiciones cercanas al límite de estabilidad de la proteína (ej. pHs extremos

o cercanos al pI) y evitar el agregado de aditivos que puedan interferir en el análisis posterior y requieran su

remoción.

1. Corto plazo (≤24 h), la mayoría se pueden mantener a 4°C

2. Tiempos >24 h a 4°C, probablemente se requiera esterilizar por filtración (0,2 µm de poro) o agregar

agentes bacteriostáticos (ej. azida de sodio 0,1%). No todas son estables.

3. Más de 1 semana. Se requiere congelar la proteína. Se hace de manera muy rápida (sumergir en N2

líquido o en mezcla hielo seco/etanol) para evitar la desnaturalización. Separar en alícuotas pequeñas

para evitar ciclos repetidos de descongelamiento/congelamiento que afecta la función y la estructura. Se

puede incluir glicerol (5-50%), BSA (10 mg/mL), agentes reductores (DTT 1 mM) y cofactores.

4. Varios meses a -20°C. Mejor agregar glicerol 50% (se evita el congelamiento).

5. Meses a años. A -70°C o en N2 líquido. Aunque el glicerol no evita el congelamiento a estas

temperaturas puede servir para estabilizar a la proteína.

• Métodos alternativos:

✓ Como precipitado en sulfato de amonio a 4°C

✓ Liofilizada (no se puede con todas) a 4°C

Columnas de cromatografía de afinidad

para purificación de proteínas de fusión

Relación detergente/proteína:

• A baja relación (1:10) se forman grandes complejosproteína-membrana-detergente.

• A relaciones 10:1 a 20:1 se forman complejos proteína-detergente, libres de lípidos de membrana.

• Variar tanto las concentraciones de detergente como lasde proteínas.

Solubilización de proteínas de membrana

Observaciones:

• La solubilidad es afectada por la fuerza iónica. Usualmente se incluye NaCl 150 mM.

• Los polioles estabilizan la proteína solubilizada. Las concentraciones típicas de glicerol

empleadas varían 5-50% (v/v). A altas concentraciones se incrementa la viscosidad lo que

puede causar problemas durante la ultra-centrifugación y en columnas cromatográficas.

• La concentración de los tampones puede afectar la solubilidad y estabilidad de las proteínas.

Especialmente los tampones fosfato son conocidos por sus propiedades de solubilización.

En concentaciones 0,1-0,5 M incrementan la solubilidad.

• La presencia del detergente tendrá un efecto significativo en los pasos de cromatografía

siguientes.

Electroforesis de proteínas

• Las proteínas se separan según su PM pero puede ocurrir migración aberrante de algunas, por ejemplo: glicoproteínas.

• También, las proteínas pueden teñirse diferencialmente lo que interfiere si se quiere usar para cuantificación de las bandas.

• PAGE/SDS puede usarse como técnica preparativa para purificar proteínas, por ejemplo mediante electroelución.

Electroforesis de proteínas

• Los geles de poliacrilamida poseen varias características electroforéticamente deseables: es un gel sintético, termo-estable, transparente, resistente, relativamente inerte desde el punto de vista químico y se puede preparar en un amplio rango de tamaños de poro-promedio. Puede soportar gradientes de alto voltaje, varios procedimientos de tinción y desteñido, puede ser digerido para extraer fracciones separadas o secado para autorradiografía o registro permanente.

• El tamaño del poro es determinado por la cantidad total de acrilamida presente (%T) y la cantidad de entrecruzante (% bisacrilamida); con el tamaño decreciente a medida que se aumenta el %T. Un 5% de bis-acrilamida da el poro más pequeño y, si se disminuye o incrementa este porcentaje, el tamaño del poro aumenta (función parabólica con punto de vertex en el 5%).

Electroforesis de proteínas (componentes)

• Tampón químico. Su elección afecta la movilidad electroforética de los contra-iones y, por lo tanto, la resolución del gel. Debe ser

no reactivo y no modificar o reaccionar con las proteínas. Se usan varios tampones para cátodo y ánodo (el mismo o distintos) según

la aplicación. Los más comunes incluyen Tris, Bis-Tris o imidazol.

• Contraión. Balancea la carga intrínseca del ión del tampón y, a su vez, afecta la fuerza del campo eléctrico durante la

electroforesis. En general, se evitan los iones muy cargados y móviles en el tampón del cátodo en PAGE/SDS pero pueden ser

incluidos en la trama del gel donde migran por delante de las proteínas. Contraiones muy populares son la glicina y la tricina. La

glicina se usa como fuente de ión “trailing” (que va dejando cola; es decir rápido y que arrastra a las proteínas tras de sí) o lento

porque su pKa es 9,69 y la movilidad del glicinato se puede fijar en un valor menor al de las proteínas más lentas conocidas (pH 6,8

del gel de concentración). El pH mínimo de este rango es aproximadamente 8.

• Acrilamida (C3H5NO; PM: 71,08). Cuando se disuelve en agua se auto-polimeriza espontanea pero muy lentamente. Los

monómeros se unen en forma cabeza-cola en largas cadenas lineales que no se entrecruzan. La presencia de sistemas

generadores de radicales libres acelera la polimerización. La solución se vuelve viscosa pero no forma un gel a menos que se

entrecrucen estas cadenas. Se recomienda guardar la solución acuosa en un lugar fresco, oscuro y seco para evitar la auto-

polimerización u hidrólisis. Acrilamida es una neurotoxina.

• Bisacrilamida (N,N′-Methylenebisacrylamide) (C7H10N2O2; PM: 154,17). Es el crosslinker más frecuentemente usado para PAGE.

Químicamente puede imaginarse como dos moléculas de acrilamida unidas cabeza-cabeza por sus extremos no reactivos, y

entonces puede entrecruzar dos cadenas de poliacrialmida lineales generando un gel.

• Dodecil sulfato de sodio (SDS) (C12H25NaO4S; PM: 288,38). (Sólo en geles PAGE desnaturalizantes) Es un detergente fuerte

usado para desnaturalizar proteínas nativas y generar polipéptidos individuales desplegados. Cuando una mezcla de proteínas es

calentada a 100°C en presencia de SDS, éste envuelve el esqueleto polipeptídico. Se une a los polipéptidos en una proporción

constante de 1,4 g SDS/ g de proteína. En este proceso, las cargas intrínsecas se vuelven despreciables. Entonces, después del

tratamiento los polipéptidos adquieren estructura de cigarro con una densidad de carga uniforme. Las movilidades electroforéticas de

estas proteínas es una función lineal de los logaritmos de su peso molecular. Sin SDS (geles nativos) proteínas con PM similar

migrarán diferentemente debido a diferencias en la relación carga-masa y en la conformación tridimensional que poseen.

• Persulfato de amonio (APS) (N2H8S2O8; PM: 228,2). APS es una fuente de radicales libres y se usa como iniciador de la formación

del gel.

• TEMED (N, N, N′, N′-tetrametiletilendiamina) (C6H16N2; PM: 116,21). TEMED estabiliza los radicales libres y mejora la

polimerización. La velocidad de polimerización y las propiedades del gel resultante dependen de las concentraciones de radicales

libres; un exceso da un largo promedio de polímero más corto, incremento en la turbidez y menor elasticidad, mientras que su

defecto provoca el efecto inverso. Las menores concentraciones que permitan la polimerización en un tiempo razonable (15-40 min)

se deben usar. El APS y el TEMED se usan típicamente en concentraciones equimoleculares (1-10 mM).

Electroforesis de proteínas (componentes)

• Colorante de trazado. Durante la corrida las proteínas son incoloras y es difícil seguir el grado

de avance. Entonces, se agrega un colorante aniónico (al tampón de siembra de la muestra) de

movilidad electroforética conocida. El azul de bromofenol es el más usado (3',3”,5',5”

tetrabromofenolsulfoftaleína), es coloreado a pH neutro y levemente alcalino, cargado

negativamente se mueve hacia el ánodo más rápidamente que la mayoría de las proteínas.

Cuando llega al extremo del gel la corrida se detiene. Puede pegarse débilmente a algunas

proteínas dándoles un leve color azul.

• Asistencia en la siembra. La mayoría de los sistemas de PAGE se cargan en pocillos en la

parte superior del gel. Para asegurar que la muestra se hunda en el fondo del pocillo y no flote se

suplementa con aditivos que aumentan la densidad de la misma. Deben ser no-iónicos y no-

reactivos (glicerol y sacarosa).

• Coomassie Brilliant Blue R-250 (C45H44N3NaO7S2; PM: 825,97). Es el más popular para el

teñido de estos geles. Es aniónico se une inespecífica e irreversiblemente a las proteínas. Es no

polar, se usa en solución alcohólica (etanol, metanol, isopropanol) acidificada con ácido acético

(que además fija las proteínas en el gel). El gel se tiñe completamente y se destine con la misma

solución pero sin colorante. Las proteínas se visualizan como bandas azules sobre un fondo

transparente.

• Tinción con plata. Es mucho más sensible (unas 50 veces) que el Coomassie (50 ng

proteína por banda). Se desconoce el mecanismo de tinción. Las proteínas se tiñen de acuerdo a

sus propias características en colores desde el amarillo al marrón oscuro. Se recomienda el uso

de recipientes muy limpios, reactivos muy puros y guantes para asegurar el éxito de la técnica.

Apéndice II

_______________________EjemploI______________________

✓ Hepatocitos primarios que luego serán injertados en parénquima de hígados receptores (se los marca con un compuesto fluorescente verde para distinguirlo de los hepatocitos endógenos).

✓ Transfección transiente. PEI (polietilenimina, es un policatión); Jet-PEI(Qbiogen GDSP10110).

HO-(CH2)2-(CH2-CH2-NH)n-(CH2)2-OH

✓ Plásmidos: pCH110 (β-gal, se usa como control) y pKM4 (deriv.pcDNA3, expresa FNR). Purificados con kit PureFection®: A260/A280=1,79 y 1,72. 450 µg y 750 µg totales.

✓ Detección: Actividad β-galactodidasa (X-gal, tinción azul) eImmunodetección transgén (FNR, tinción roja).

Transfección

✓ Células quiescentes a confluencia (para líneas continuas se usa 50-60% confluencia en placa). Sembradas 18h antes.

✓ N/P (relación nitrógenos del PEI a fosfatos del ADN) se usó 5 paraJetPEI (según instructivo) y de 9 para PEI (según literatura). Volúmende complejo PEI/plásmido < 1/10 medio de cultivo.

✓ 0,5-2 μg/ 106 células. 4 h (con o sin SFB). Luego agregar medio (lascélulas sufren). (10 μg ADN/ 106 células para líneas)

✓ Inmunocitoquímica 24 horas a 7 días. (se detectó hasta las 96 h)

________________Ejemplo I_________________

0,155 ± 0,23 % 0,09 ± 0,15 %

Hepatocitos en cultivo que no fueron injertados, para control de la eficiencia de transfección.

________________Ejemplo I_________________

ControlFNR detección rojiza Fluorescencia verde

células injertadas

Transfectados

Corte histológico y tinción de hematoxilina/eosina de hígados que recibieron hepatocitos.

_______________________Ejemplo II______________________

✓ Línea celular (Cos-7).

✓ Transfección estable (sistema Ori-SV40/antígeno T SV40).

✓ Plásmidos: pcDNA3 (vacío), pKM4 y pKM9 (gen Fld).

✓ Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668-027).

✓ Selección G418.

✓ Detección de expresión (si o no) por RT-Real Time PCR.

Transfección

✓ Células a 90-95% confluencia. Sembradas 18 h antes.

✓ 0,4 μg ADN/ μL Lipof. 4 h (sin SFB) y agregar medio con SFB.

✓ Selección: a las 24h despegar, diluir al menos 1/10. A las 48h agregarG418 hasta muerte de la monocapa control sin transfectar (unas 2-3semanas).

_______________________Ejemplo II______________________

Dosis del agente de selección (G418)

Velocidad de crecimiento

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1,600

24h 48 h 72 h

Time (h)

MT

T (

AU

)

Cos-7

pcDNA3 (+ G418)

pcDNA3 (- G418)

pKM4 (+ G418)

pKM4 (- G418)

pKM9 (+ G418)

pKM9 (- G418)

Tinción con azul de metileno de la monocapa de

células Cos-7 luego de 3 semanas de exposición

a G418 a las dosis indicadas. Se eligió 250 µg/mL,

menor dosis que mata el cultivo (sin la

resistencia del plásmido).

Las líneas crecen con la misma tasa de

duplicación. Cos-7 sin transfectar crece más

rápido pero su medio de cultivo no contiene

G418 (no serían viables).

__________________Ejemplo II________________

Cos-7 Cos-7/pcDNA3

Cos-7/pKM4 Cos-7/pKM9

Exámen morfológico

Detección de ARNm(RT-Real Time PCR)

Gen

Línea

Celular

β-act

(Ct)

FNR

(Ct)

Fld

(Ct)

Cos-7 15,53 > 37 > 38

Cos-7/ pcDNA3 15,33 N/A > 35,9

Cos-7/ pKM4 15,3 19,7 > 31,2

Cos-7/ pKM9 16,13 > 37,6 18,1

Todas tienen morfología

conservada respecto a Cos-7.

Como FNR y Fld no existen en Cos-7 no hay

comparación de niveles de transcripto. Se

observa que el Ct para β-actina es similar para

todas las muestras (se usó cantidad similar de

ADNc) y que el Ct de FNR para Cos-7/pKM4 es de

19,7 y el de Fld para Cos-7/pKM9 es de 18,1 (hay

trasncripto detectable). En cambio, para las

líneas que no contienen el gen específico los Cts

son muy altos y, por lo tanto, se considera que el

molde no está presente.

_____________________Ejemplo III_____________________

✓ Línea cellular: IHH (hepatocitos humanos inmortalizados).

✓ Transfección estable (sistema Ori-SV40/antígeno T SV40).

✓ 4 plásmidos: 3 derivados de p3X-FLAG y p3X-FLAG vacío.Purificados con columna Sigma.

✓ Lipofectamine 2000. Selección G418.

✓ Western blot (Ac. específico transgén/ Ac. anti-FLAG).

Transgén

✓ Ref-1: proteína con NLS (señal de localización nuclear) que esprocesada in vivo. Existe en IHH (hay proteína endógena sin tagFLAG).

✓ In vivo: se detectan dos especies (37- 33 kDa) con y sin NLS.

✓ plásmidos: 1- gen proteína wt-FLAG (40,7 kDa)

2- gen proteína sin NLS-FLAG (36,6 kDa)

3- gen proteína mutada-FLAG (no se puede digerir

la NLS) (40,4 kDa)

PM proteína endógena

APE1/Ref-1 wt 37 kDa

APE1/Ref-1 ND33 wt 33 kDa

PM proteína transfectada

Ref-1-Flag 40,7 kDa

Ref-1 ND33-Flag 36,6 kDa

Ref-1-31-34 ALA-Flag 40,4 kDa

Anti-FLAG Anti-Ref-1 monoclonal

48 kDa

34 kDa

HSP70

_______________________Ejemplo III______________________