Universidad de Carabobo Sede AraguaEscuela de Medicina “Witremundo Torrealba”

Departamento de Bioquímica

Abril, 2015

TECNOLOGÍA DEL ADN

RECOMBINANTE

AGENDA

Explicar las principales aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante en la medicina.

Principales aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante en medicina:

1. Diagnóstico de algunas enfermedades de origen genético

2. Detección de carga viral en pacientes con VIH, Hepatitis viral y Dengue

3. Producción de medicamentos y vacunasTerapia génica: - En células germinales - En células somáticas - Utilización de oligonucleótidos antisentido

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

GENÉTICAS

Detección de las alteraciones o variaciones de la constitución genética de un individuo que están directa o indirectamente relacionadas con estados patológicos.

Diagnóstico

Molecular

DIRECTO INDIRECTO

Pretende la caracterización, con la

mayor precisión posible, del genotipo de un

individuo

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIRECTO

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

GENÉTICAS

El máximo nivel de precisión del diagnóstico directo se obtiene con la secuenciación de los nucleótidos correspondientes al locus mutado

Por lo general se realiza mediante el estudio de los cambios que se producen en:

La estructura primaria del ADN

(secuencia)

Las propiedades físico-químicas de la

molécula de ADN

Los cambios que se presentan en el producto génico

(ARNm o proteína)

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIRECTO

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

GENÉTICAS

Herramientas y metodologías para la detección de mutaciones

1. Las enzimas de restricción

2. Las técnicas de separación electroforética de ácidos nucleicos

3. La hibridación de ácidos nucleicos

4. La amplificación enzimática del ADN (PCR)

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIRECTO

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

GENÉTICAS

MÉTODOS DE DETECCIÓN DIRECTA DE MUTACIONES

Veremos a continuación mediante algunos ejemplos como se aplican estas técnicas básicas en el diagnóstico genético:

DETECCIÓN DIRECTA DE UNA MUTACIÓN QUE ALTERA UNA

DIANA DE RESTRICCIÓN

Figura 1. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001

Detección de la mutación que causa anemia falciforme mediante digestión con el enzima Mst I I .

Figura 2. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001

Detección de la mutación de anemia falciforme mediante PCR y digestión con el enzima Mst II.

DETECCIÓN DIRECTA DE LA SECUENCIA MUTADA

Detección de mutaciones en el gen de la fibrosis quística mediante oligonucleótidos específicos de alelo.

Figura 3. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001

DETECCIÓN DE MUTACIONES POR DELECIÓN

Mutación en el gen de la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)

Perdida en el tono muscular

El gen ocupa más de 2 megabases de ADN

A edades más avanzadas la

musculatura se debilitaTranscripción de 13

kb

Pérdida de nucleótidos en una secuencia de ADN

Figura 4. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001

PCR Multiplex, como método de detecciónDetección

simultánea de distintas

deleciones en el gen DMD

Se amplifican de forma

simultánea distintos exones

del gen

El resultado del PCR se analiza

en una electroforesis

DETECCIÓN DE MUTACIONES INESTABLES

Expansión de unidades de repetición de tres nucleótidos.

Genes humanos responsables de patologías neurológicas

La repetición puede localizarse tanto en los exones como en los intrones

Figura 5. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001

Detección de mutaciones dinámicas mediante PCR o

hibridación.

DETECCIÓN DE NUEVAS MUTACIONES

Detección de variantes polimórficas mediante PCR y polimorfismo de cadena sencilla (SSCP).

Detección de variaciones en el apareamiento

Detección de cambios de conformación

Detección de productos génicos alterados

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

GENÉTICASDIAGNÓSTICO MOLECULAR

INDIRECTO

Es independiente del conocimiento previo de la naturaleza molecular de la mutación a diagnosticar y para llevarlo a cabo solo es preciso conocer la localización cromosómica del locus implicado.

Figura 7. "El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan Fibla. Octubre, 2001

DETECCIÓN DE CARGA VIRAL

EN PACIENTES CON VIH, HEPATITIS VIRAL Y DENGUE

Carga viral es la cuantificación de la infección por virus.

El análisis comprobó que el VIH nunca está “latente” y que se multiplica constantemente.

Detectar virus varios días después de la infección.

Carga viral puede predecir cuánto tiempo una persona se mantendrá saludable.

Todas las técnicas difieren en sus formatos pero

principalmente se encargan de

detectar el virus dependiendo de la

cantidad.

RT-PCR

RT-PCR en tiempo real

AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA

DE ARN

AMPLIFICACIÓN DE SEÑAL

POR HIBRIDACIÓN MOLECULAR

Existen diversos métodos para la cuantificación

correcta de los virus (VIH, Dengue y Hepatitis).

Para estos virus, se pueden realizar las siguientes pruebas:

Esta prueba se basa en cinco procesos fundamentales:

• a) Extracción de ARN.

• b) Transcripción del ARN diana para generar ADN complementario.

• c) Amplificación por PCR de éste ADNc con iniciadores específicos.

• d) Hibridación de los productos amplificados con sondas oligonucleotídicas, específicas para las dianas.

• e) Detección por colorimetría de los productos amplificados y unidos a las sondas.

1. RT-PCR:

Se obtiene un patrón de cuantificación que pasa por las

fases de: Preparación de muestras, transcripción inversa, amplificación,

hibridación y detección.

• Usada solo para la Serotipificación.

• Consiste en una transcripción reversa inicial, en la que el ADN viral se convierte en ADN copia por la Transcriptasa reversa.

• Luego se amplifica una región conservada del virus.

• Consta de 3 Pasos:

PCR con Transcripción Reversa:

Pre- PCR

Transcriptasa Reversa

Post-PCR

Extracción del ARN.

ARN a ADN.

Punto final que indica si la prueba es positiva o no.

• Se usa para diagnóstico y serotipificación.

• Permite serotipificar y cuantificar el virus (Carga viral).

• Combina el PCR convencional con el uso de marcadores fluorecentes.

• Comparte los primero pasos del PCR convencional, excepto el punto final.

• Se observan curvas de amplificación y se obtiene un resultado cuantitativo.

• Los marcadores fluorecentes pueden ser: SYBR Green o sondas tipo TaqMan.

2. RT- PCR en tiempo real:

Existen múltiples formatos de sondas específicas, siendo las más frecuentemente utilizadas las sondas Taqman, FRET y “molecular beacons”.

• PCR en Tiempo Real (Carga Viral).

• Cuantificación del RNA del virus de la Hepatitis C por amplificación de ácidos nucléicos.

• Detección de fluctuaciones de la carga viral.

• Linealidad de: 43 a 69.0 millones UI/ml.

• Límite de detección: 15 UI/ml.

• Hepatitis C Viral:

La respuesta al tratamiento antiviral se evalúa con una carga viral basal (pre-tratamiento) y al menos una carga viral al término de éste y a las 24 semanas post

tratamiento.

• PCR en Tiempo Real (Carga Viral).

• Cuantificación de los niveles de DNA del virus de la Hepatitis B, para evaluación de la eficacia de la terapia antiviral.

• Linealidad de: 54.5 a 110.0 millones UI/ml.

• Límite de detección: 12 UI/ml Plasma (Carga Viral).

• Hepatitis B Viral:

• Las secuencias de ácidos nucleicos diana se pueden amplificar exponencialmente en condiciones isotérmicas(41ºC).

• Transcriptasa inversa, RNasa H, y una polimerasa ARN dependiente de ADN.

• Mimetiza el ciclo de replicación retroviral del ARN a través de un ADNc intermedio.

3. Amplificación isotérmica de ARN o NASBA:

Acumulación de copias de ADNc y ARNss de las secuencias diana.

• Es una técnica relativamente reciente, basada en la amplificación de señal que implica una serie de hibridaciones de ácidos nucleicos en la superficie del pocillo de una microplaca.

• Se pueden detectar hasta un mínimo de 500 partículas virales.

• Se basa en la amplificación de señales detectadas (CUANTIFICACIÓN DIRECTA) y no en la amplificación de secuencias diana.

4. Amplificación de señal por hibridación molecular o bDNA :

¿ TERAPIA GENÉTICA ?

Cuando hay algún trastorno

de origen proteico, se

recurre a una serie de técnicas

que permitan revertirlo

ADN

ARN

Introducción de material genético

funcional en sustitución de

uno o mas genes defectuosos en la célula diana de un organismo

TERAPIA GENÉTICA

TERAPIA GENÉTICA

Células no germinales

No heredable

Células somáticasCélulas

germinales

Mejora de gametos, heredable

No usada en humanos

TERAPIA GENÉTICA

Células germinale

s

TERAPIA GENÉTICA

Oligonucleótidos

anti-sentido artificialmente

diseñados que

interfieren con el flujo

de informac

ión genética

.

Secuencias antigen

Secuencias antisentidoRibozimas

BIBLIOGRAFÍA

"El diagnóstico de las enfermedades hereditarias” Dr. Joan Fibla Palazón. Departament de Ciències Mèdicas Bàsiques. Facultat de Medicina. Universitat de Lleida.

“Terapia Génica” C. L. RONCHERA-OMS J. Mª. GONZÁLEZ

http://www.aidsinfonet.org/fact_sheets/view/125?lang=spa

http://www.cibic.com.ar/medicos/metodos-carga-viral-hepatitis-c-en-contexto-nuevos-tratamientos/

¡Gracias por suatención!

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