TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

Fernando Salcedo Biólogo, M.Sc. e-mail: fsalcedo@unilibrebaq.edu.co

Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

Aplicación en medicina •  La biotecnología tiene diversas aplicaciones: en la alimentación, la prevención de enfermedades

hereditarias, la terapia génica y la producción de sustancias terapéuticas y la elaboración de vacunas.

•  A partir del cultivo de microorganismos, se obtienen importantes sustancias como la penicilina

(extraída de un hongo), la insulina (extraída de bacterias-1982)).

•  Se han obtenido a través de plantas y animales transgénicos, el factor VIII, que interviene en la coagulación de la sangre.

•  Producción de hormonas humanas para tratar muchas enfermedades carenciales, como el enanismo por déficit de hormona del crecimiento.

•  Las vacunas se obtienen cultivando virus en células vivas en el laboratorio, los cuales se matan o

se debilitan para preparar vacunas contra la hepatitis B, contra el sida y el paludismo.

La ingeniería genética Comprende un conjunto de técnicas biotecnológicas entre las que se

destacan: •  La tecnología del ADN recombinante: que permite aislar y manipular un fragmento

de ADN de un organismo para introducirlo en otro. •  Secuenciación del ADN: permite conocer secuencia de los nucleótidos que forman

parte de un gen. •  Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): permite aumentar el número de

copias de un fragmento determinado de ADN, a partir de una mínima cantidad de muestra.

TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE

q  Es un término que agrupa una gran variedad de técnicas empleadas en el laboratorio para manipular las moléculas de ADN con el fin de estudiarlas.

q  Consiste en la introducción de genes extraños en el material genético de otra célula.

q  Requiere de cultivos celulares, enzimas de restricción, vectores de

clonación, laboratorios equipados y personal bien entrenado.

Esta tecnología es muy i m p o r t a n t e p a r a l a investigación en biología celular y molecular.

Cultivo celular •  Proceso mediante el cual, células procariotas  o  eucariotas, pueden

cultivarse en condiciones controladas. •  Los "cultivos celulares" hacen referencia a la siembra de células aisladas de

eucariotas pluricelulares, especialmente células animales., para cultivo de órganos y tejidos.

Cultivo de células humanas en medios enriquecidos con aminoácidos, vitaminas y factores de crecimiento

Medios de cultivo sólidos para siembra de las células (Variedad de agares)

Procesamiento de cultivo de células madre

5 pasos de la tecnología del ADN recombinante

Vector de clonación

Selección del ADN con el gen de interés

Corte con enzima de restricción

Plásmido recombinado Cromosoma

bacteriano

Plásmido dentro de la bacteria

cultivo de bacteria recombinada

Ø Corte del ADN en posiciones precisas (secuencias palíndromes) con endonucleasas de restricción, Ø Unión de fragmentos por la ADNligasa,

Ø Selección de un fragmento de ADN capáz de autoreplicarse,

Ø Insertar los vectores de clonación a células específicas que contienen toda la maquinaria genética para la expresión de la información contenida en el vector. Ø Selección o identificación de las células que contienen al ADN recombinante.

" Las 2 moléculas de ADN son digeridas con la misma endonucleasa de restricción, " La enzima corta extremos complementarios que se aparean, " La ligasa repara hebras cortadas de ADN y rehace las nuevas bicatenarias.

Manipulación del ADN

Enzimas de restricción v Catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodíester de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en sitios específicos. v Ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleícos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.

Corte de hebras por enzimas restrictivas

extremo o adhesivo o pegajoso

Secuencia palíndrome se lee igual en ambos sentidos

Vectores de clonación

Bacteriófagos: son virus que sirven de portadores de Material genético a bacterias.

Plásmidos son moléculas de ADN extra cromosómico de forma circular en bacterias.

Cósmidos son vectores sintéticos que combinan características del fago lambda que posee extremos cohesivos o regiones cos.

Son moléculas que transportan y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.

Virus bacteriófagos q Partículas infectantes de bacterias, q Algunos (Lambda y M13) han sido utilizados por biólogos moleculares, que han modificado oportunamente sus genomas. q  Pueden tener efecto lìtico o lisogènico en las bacterias.

Actividad de los virus bacteriófagos

Clonación molecular •  CLON significa copia exacta de una célula o molécula de ADN, •  Las secuencias a clonar se introducen en células bacterianas por

medio de vectores. •  Los plásmidos, los virus bacteriofagos  y los cósmidos se usan como

vectores; •   Para clonar genes específicos se elaboran bibliotecas génicas que

son colecciones de fragmentos de ADN genómicos, clonados en vectores (plásmidos, bacteriófagos o cósmidos), que representan el  genoma entero del organismo.

•  Los cósmidos son son vectores artificiales obtenidos de levaduras y de bacterias.

•  Las bibliotecas de  cDNA  representan la colección completa de

los mRNA que se sintetizan en un momento en una célula dada.

Manipulación de células humanas

Utilidad de la biotecnología

bacteriófagos)

Utiliza microorganismos modificados geneticamente, asi como plantas y animales transgénicos para elaboración de antibióticos, hormonas y variedad de sustancias de utilidad para el hombre.

Como se aplica la tecnología • Aislamiento del ADN de las 2 fuentes diferentes. •  Tomar en cuenta la complementariedad de bases

púricas y pirimídicas para la formación de puentes de hidrógeno.

• Aplicar enzimas de restricción, para el corte del ADN e inserción de nuevo ADN.

• Utilización de plásmidos para la clonación. •  La hibridación molecular entre ADN-ADN y ADN-ARN.  •  En la transcripción inversa que permite la síntesis de

ADN a partir de ARN  para obtener cADN (ADN complementario).

•  La necesidad de primers o cebadores para la síntesis de las nuevas cadenas.                                   ·                                             •  ·                      

Utilidad en la medicina

El desarrollo de la Genómica y la Proteómica, así como la aplicación de la Biotecnología a la Medicina, ha permit ido identificar genes alterados productores de enfermedades y elaborar fármacos para reducir la incidencia de patologías genéticas. La investigación biotecnológica

permitió antes de 2010, conocer la predisposión que tiene cada individuo a padecer un tipo de cáncer y detectar tumores antes de que existan, por la posibilidad de examinar los mas de 30.000 genes que t iene cada ser humano.

HIBRIDACION MOLECULAR •  Técnica que permite la formación de cadenas

complementarias de ADN-ARN. •  Se basa en cambios de temperatura para desnaturalizar el ADN y separar las cadenas. •  Si baja la temperatura se vuelven a aparear las

cadenas complementarias. Algunas se aparean con ARN (hibridación).

HIBRIDACION MOLECULAR

Técnica que permite la formación de cadenas complementarias de ADN-ARN Utiliza altas temperaturas para desnaturalizar el ADN y separar las cadenas.

Si baja la temperatura se vuelven a a p a r e a r l a s c a d e n a s complementarias. Algunas se aparean con ARN y se produce la hibridación.

ADN

ARN

Hibrido ADN-ARN

Utilizando técnicas inmunohistoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas.

Hibridación in situ

En esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ, donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma.

En biotecnología la hibridación somática es el proceso por el cual se obtienen plantas híbridas a partir de la f u s i ó n d e c é l u l a s o d e protoplastos derivados de células somáticas . Esta técnica surgió hace unos 30 años como una herramienta muy promisoria para sortear problemas de incompatibilidad precigótica

Hibridación celular

Esta técnica demostró ser útil en la mejora genética de plantas, principalmente por permitir la introducción limitada de genes de especies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o tolerancia a estreses.

ADN complementario (ADNc)

Transcriptasas inversas son utilizadas para obtener ADNc a partir de ARNm

Segmentos de oligonucleótidos contienen endonucleasas de restrición

El ADNc es incorporado a un vector adecuado ADN c clonado

Reacción en cadena de la polimerasa

El ADN complementario o ADNc es un ADN de doble cadena. Se sintetiza a partir de una hebra simple de ARNm maduro. Se suele utilizar para la clonación de genes propios d e c é l u l a s e u c a r i o t a s e n células procariotas, debido a que, dada la naturaleza de su síntesis, carece de intrones

Terminología •  Acidos nucleicos : b iomoléculas formadas por macropol ímeros de

desoxiribonucleótidos, o ribonucleótidos. •  ADN desnudo: ADN desprovisto de cubierta proteínica o lipídica para transcripción, replicación o transferencia de genes. •  ADNr  = ADN recombinante: molécula de ADN formado por recombinación de

fragmentos de ADN de orígenes diferentes.  •  ARNHn = ARN heterogéneo nuclear = ARNm primario: localizado en el núcleo que

presenta intrones y exones. •  Biología Molecular: parte de la biología que trata de los fenómenos biológicos a

nivel molecular.  •  Biotecnología: toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y

organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos en usos específicos.

•  Células sexuales: células que al unirse forman el huevo fertilizado, en la especie humana los gametos.

•  Clones: grupo de células o de organismos de idéntica constitución genética entre sí de ancestro común del que proceden por división binaria o por reproducción asexual.

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Acidos nucle icos : b iomo lécu las fo rmadas por macropo l ímeros de desoxiribonucleótidos, o ribonucleótidos. ADN desnudo: ADN desprovisto de cubierta proteínica o lipídica para transcripción, replicación o transferencia de genes. ADNr = ADN recombinante: molécula de ADN formado por recombinación de fragmentos de ADN de orígenes diferentes. ARNHn = ARN heterogéneo nuclear = ARNm primario: localizado en el núcleo que presenta intrones y exones. Biología Molecular: parte de la biología que trata de los fenómenos biológicos a nivel molecular. Biotecnología: toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos en usos específicos. Células sexuales: células que al unirse forman el huevo fertilizado, en la especie humana los gametos. Clones: grupo de células o de organismos de idéntica constitución genética entre sí de ancestro común del que proceden por división binaria o por reproducción asexual.

q Hibridación: proceso de generación de una molécula, célula u organismo combinado con material genético procedente de organismos diferentes. q Ingeniería genética: conjunto de técnicas utilizadas para introducir un gen extraño en un organismo con el fin de modificar su material genético y los productos de expresión. q Locus (loci): en genética, punto de un cromosoma ocupado por un gen. q Manipulación genética: formación de nuevas combinaciones de material hereditario por inserción de moléculas de ácido nucleico, en el interior de virus, plásmido bacteriano u otro sistema vector fuera de la célula. q Mapa genético: diagrama descriptivo de los genes en cada cromosoma q Mosaico: individuo que presenta dos o mas líneas celulares genéticamente diferentes como consecuencia de una anomalía en las primeras mitosis del cigoto. q Mutación: cambio del material genético, en un par de bases del ADN, en un gen específico o en la estructura cromosómica. En células somáticas la mutación constituye el origen de algunos cánceres y de ciertos aspectos del envejecimiento. q Palindromos: segmentos capicúas que resultan iguales vistos en uno u otro sentido, como el capicúa alfabético anilina, anita lava la tina (Se leen igual en ambos sentidos ) q Plásmido: forma acelular de vida, fragmento circular de ADN bicatenario que contienen unos cuantos genes y se encuentran en el interior de ciertas bacterias, se replican de forma in fundamental para la secuenciación del Proyecto Genoma Humano dependiente al ADN bacteriano y pueden pasar de unas bacterias a otras. Se utilizan como vectores en manipulación genética. q RCP = Reacción en cadena de polimerasa: técnica de análisis del genoma mediante la amplificación ilimitada de porciones específicas del ADN, fundamental para la secuenciación del Proyecto Genoma Humano q Sonda de ADN: fragmento de ADN conocido que se utiliza para averiguar si los cromosomas investigados contienen la secuencia complementaria q Transcripción inversa: proceso de síntesis de ADN complementario a partir del ARN genómico de los retrovirus efectuado por la enzima transcriptasa inversa.

ADNc (complementario) • Copia de DNA a partir de RNA • Obtenido con Transcriptasa inversa (enzima de

retrovirus) •  Este DNA es complementario al RNA •  Este DNA se clona • Útil para entender la estructura y función de los genes

Vector: portador, que transfiere material genético de un huésped a otro. Ø Southern blot: método desarrollado para la detección de genes específicos en el ADN celular. Ø  Northern blot: se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método Northern sirve para identificar ARN. Ø PCR: (reacción en Cadena de la Polimerasa), utiliza un paso de hibridación de oligonuclotidos para la secuenciación de ADN de un organismo.