Tecnología Del DNA Recombinante

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  • 7/24/2019 Tecnologa Del DNA Recombinante

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    Universidad Central de VenezuelaFacultad de MedicinaEscuela de Medicina Jos Mara VargasCtedra de Bioqumica

    Br. Fabin odrguez

    Caracas! "e#tiembre $%&%

    'ecnologa del()* ecombinante

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    Contenido

    &. ecombinaci+n ,entica$. 'rans-erencia del ()*. Clonaci+n del ()*

    .

    Endonucleasas de estricci+n. Vectores de Clonaci+n. Bibliotecas de ()* ecombinante

    /. eacci+n en Cadena de la 0olimerasa1. "out2ern blot

    3. *#licaciones de la 'ecnologa del ()*ecombinante

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    EC4MB5)*C56) ,7)E'5C*

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    ecombinaci+n

    eordenamiento de la 5n-ormaci+ngentica dentro 8 entre molculas

    de ()*

    ecombinaci+n ,entica

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    ecombinaci+n

    ecombinaci+n gentica 2om+loga9 entresegmentos homlogos de 2 molculas de DNA.Sitios inespecfcos.

    ecombinaci+n es#ec:ca de sitio9recombinacin entre sitios precisos de DNA.

    'rans#osici+n9 Segmentos cortos de DNA queson capaces de trasladarse de un segmento delDNA a otro.

    Clases de ecombinaci+n

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    '*)"FEE)C5* (E ()*

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    'rans-erencia

    *lgunas bacterias #ueden trans-erirsegmentos de ()* entre ellas #ara#osteriormente recombinarlos con

    su #ro#io ()*.

    'rans-erencia de ()*

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    ecombinaci+n

    0roceso en el cual una bacteria incor#ora un -ragmentode ()* que se encuentra en el medio e;terno

    sedenominan Com#etentes?Com#onentes@

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    ecombinaci+n

    0roceso de trans-erencia de()* entre dos bacteriasdurante el cual un 0lasmido es

    incor#orado a travs de un =#ilise;ual>

    8 #osee un -actor de-ertilidad ?F@ 8 el #ili se;ualmientras que la clula rece#torase denomina =2embra> 8 no#osee -actor de -ertilidad ?FD@

    0or este #roceso se trans:eren

    'i#os de 'rans-erencia

    Conugaci+n

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    ecombinaci+n

    El #roceso de trans-erencia esllevado a cabo #or un virusbacteriano! un Bacterio-ago! elcual in8ecta su ()* al

    cito#lasma bacteriano

    ! sin destruir la clula.#uede #asar a -ase ltica.

    'i#os de 'rans-erencia

    'ransducci+n

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    ecombinaci+n

    0roceso en el que se trans:ere un segmento de ()* deun lugar a otro dentro de un mismo cromosoma o entreel cromosoma! #lasmidos o bacteri+-ago #resentes en la

    clula.

    E;isten clases de elementos trans#onibles9 secuenciasde inserci+n ?5"@! trans#osones 8 -agos Mu

    'i#os de 'rans-erencia

    'rans#osici+n

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    C

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    Clonaci+n

    Consiste en #ro#agar un-ragmento de ()* en otra clula

    Un clon es una #rogenie de

    clulas que se derivan de unasola clula! cada una de lascuales contiene la mismain-ormaci+n gentica

    El -ragmento a clonar #uedeinsertarse in vitro en un #lsmido#ara luego reinsertarlo en labacteria o introducirse en unbacteri+-ago que luego in-ectar

    la clula bacteriana?'rans-ecci+n@

    Clonaci+n del ()*

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    Clonaci+n

    "elecci+n del-ragmento a clonar.

    Corte del -ragmentodel ()* original.

    5nserci+n del-ragmento en unvctor ?ve2culo@.

    ecombinaci+nentre el -ragmentoa clonar 8 el vector.

    5ntroducci+n en la

    clula del vectorrecombinante.

    e#licaci+n delgenoma de laclula.

    *islamiento del-ragmento de ()*

    Clonaci+n del ()*

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    E)(4)UC

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    Clonaci+n

    Enzimas bacterianas que cortan es#ec:camente el enlace

    -os-odiester de secuencias en las dobles cadenas de ()*.

    )o #ueden actuar sobre ()* metilado 8 sirven como de-ensa #ara laclula bacteriana.

    ,eneralmente reconocen sitios #alindr+micos ?sitios de restricci+n@

    "e denominan de acuerdo al organismo que les dio origen9

    Eco5 Escherichia coli

    Endonucleasas de estricci+n

    Cl i+

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    Clonaci+n

    E;isten dos clases deEndonucleasas de estricci+n9

    'i#o 59 com#leos multienzimticos

    con doble actividad metilasa 8endonucleasa! requieren *'0 8 "Dadenosilmetionina 8 cortan adistancia del sitio dereconocimiento.

    'i#o 559 dmeros s+lo con actividadendonucleasa sobre un sitio dereconocimiento es#ec:co.

    Endonucleasas de estricci+n

    Eco5 reconoce la secuencia derestricci+n ,**''C 8 corta entre, 8 *

    Cl i+

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    Clonaci+n

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    VEC'4E" (E C

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    Clonaci+n

    Molcula de ()* a la cual se une el -ragmentode ()* que se desea clonar.

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    Clonaci+n

    Molculas de ()*e;tracromosomales! #equeGas8 circulares

    "u re#licaci+n #uede serinde#endiente de la delcromosoma bacteriano

    0ueden e;istir varias co#ias#or clula.

    Uno de los ms utilizados 2a

    sido #B$$

    Vectores de Clonaci+n

    0lsmidos

    Cl i+

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    Clonaci+n

    El vector a utilizar debe ser clivadocon la misma endonucleasa derestricci+n utilizada #ara usado#ara generar los -ragmentos a

    recombinar.

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    Clonaci+n

    Molcula de ()* viral de 1%.%%% #b.

    * este ()* se le quita un segmento de

    $/.%%% #b con Eco 5! #ara que #ueda#ortar el ()* de inters ?se liga con()* ligasa@.

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    Clonaci+n

    Vectores 2bridos entre #lsmidos 8-agos! creados #or el 2ombre! #araclonar -ragmentos muc2o msgrandes! de 2asta /1.%%% #b

    Vectores de Clonaci+n

    C+smidos

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    B5B

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    Clonaci+n

    ,ru#o de clones! cada uno con un-ragmento distinto de ()*! entre loscuales se encuentra el de inters.

    ,enoteca gen+mica9 #roducida a #artirdel ()* gen+mico! inclu8e al genoma

    com#leto! #ero no como se e;#resa.Utiliza C+smidos.

    ,enoteca de e;#resi+n o Biblioteca dec()*9 #roducida a #artir del m)*.5nclu8e s+lo los m)* que se e;#resan

    en el ti#o celular del cual se e;trao. )oinclu8e #romotores! ni intrones! niotras regiones no codi:cantes.equieren realizar 'ranscri#ci+nreversa. Utiliza 0lsmidos

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    Clonaci+n

    0uede utilizarseuna sonda de

    2ibridaci+nmarcadaradioactivamente.

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    Clonaci+n

    0uede utilizarse una sonda de2ibridaci+n marcadaradioactivamente.

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    Clonaci+n

    Una vez reconocidos!#ueden aislarse los clones!mediante el reconocimientode las #rotenassintetizadas a #artir deellos #ara esto #uede

    usarse el Hestern blot

    ,enotecas

    econocimiento de los clones.

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    E*CC56) E) C*(E)* (E

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    0C

    'cnica de *M0

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    0C

    El #roceso requiere9 conocer lasecuencia del -ragmento a am#li:car!dos #rimers! d)'0 8 un ()* #olimerasatermoestable ?()* #olimerasa deThermophilus aquaticuso 'aq #oli@

    (esnaturalizaci+n9 el *() es calentado aI/DI1C ; &K #ara se#arar la doblebanda.

    *lineamiento9 desciende la tem#eratura

    #ara que cebadores ?#rimers@ diseGadoses#ec:camente se unan al ()*monobanda. 1$C

    Elongaci+n9 sube la tem#eratura 2astala +#tima de la ()* 0olimerasa usada.

    L$C

    eacci+n en Cadena de la0olimerasa

    0C

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    0C

    eacci+n en Cadena de la0olimerasa

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    "4U'E) B

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    "out2ern blot

    'cnica que #ermite localizar un gen en #articular.

    "e digiere el ()* con endonucleasas de restricci+n se realizaelectro-oresis en agarosa! se desnaturalizan los -ragmentos! setrans:eren a un #a#el de nitrogelulosa se incuban con sondas de ()*marcado se realiza autoradiogra-a.

    "out2ern blot

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    *0

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    *#licaciones del ()* ecombinante

    *#licaciones del ()* ecombinante

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    *#licaciones del ()* ecombinante

    En la bD" 2a8 una sustituci+n del ,lu ?,*,@ en #osici+n 3 de la OD

    globina #or una Valina ?,',@

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    # cac o es de eco b a e

    uella (actilar del ()*

    En todos los individuos e;istensecuencias re#etidas en =tandem>?V)'@ que se re#iten de $ a ms de&%% veces #or locus. El #atr+n dere#eticiones es #ro#io de cadaindividuo.

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    Siempre he defendido ferozmente la posicinde que debemos basar nuestra visin del

    mundo en el estado de nuestroconocimiento, en los hechos, y no en lo que

    nos gustara que ocurriera. or eso lagen!tica es tan importante. orque nosllevar" a respuestas para muchas de las

    mayores y m"s complicadas cuestiones quehan preocupado a la gente durante cientos

    #...$ de a%os. ero muchas de esasrespuestas no son f"ciles, puesto que #...$ la

    gen!tica puede ser cruel.

    James Hatson

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    &unque circunstancialmente no obtengan

    una cali'cacin alta, nuestra profesin esde largo aliento y se construye paso apaso.

    (r. *le;is C2irinos

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    ,racias

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    "E *C*B6 ,E)7'5C*8 8a casi se acaba el

    cursoP