PRACTICA N°: 02

INVESTIGACION DE SALMONELLA

GENERALIDADES

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos gram

negativos, de 0,7-1,5 x 2-5 µm, anaerobios facultativos, no formadores de esporas,

generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. gallinarum). Fermentan glucosa,

maltosa y manitol, pero no fermentan lactosa ni sacarosa. Son generalmente catalasa

positiva, oxidasa negativa y reducen nitratos a nitritos. Son viables en diferentes

condiciones ambientales, sobreviven a la refrigeración y congelación y mueren por

calentamiento (mayor a los 70 °C). El serotipo de Salmonella está determinado por los

siguientes tres tipos de antígenos: el antígeno somático (O), el antígeno flagelar (H) y el

antígeno de virulencia (Vi). Los antígenos somáticos son lipopolisacáridos componentes

de la pared celular y se han identificado 60 antígenos diferentes. Los antígenos flagelares

son proteínas localizadas en el flagelo móvil. El antígeno de virulencia es un polisacárido

termolábil localizado en la cápsula. Antes del 1° de Julio de 1963 se utilizaban 3 espe cies

de Salmonella: S. typhi, S. choleraesuis y S. enteritidis y la mayoría de los serotipos

pertenecían a esta última especie. En la actualidad, todas las especies y subgrupos

anteriores de Salmonella y Arizona se consideran de la misma especie, pero pueden

separarse en 6 subgrupos. La única excepción la constituye S. bongori que por estudios

de hibridación de ADN se constató que es una especie distinta. Por lo tanto, existen 2

especies y 6 subespecies de S. entérica en el esquema actual utilizado por el Centers for

Disease Control and Prevention (CDC).

a. Salmonella entérica:

S. entérica subespecie entérica (I): comprende la mayoría de los serotipos

S. entérica subespecie salamae (II)

S. entérica subespecie arizonae (IIIa)

S. entérica subespecie diarizonae (IIIb)

S. entérica subespecie houtenae (IV)

S. entérica subespecie indica (VI)

b. Salmonella bongori (antes subespecie V)

La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre

caliente pertencen a la subespecie I (entérica) y llevan un nombre relacionado con el lugar

geográfico donde fueron aisladas. Como las serovariedades no tienen nivel taxonómico

de especie, escapan al “Código Internacional de Nomenclatura Bacteriana” y por ello

deben escribirse en letra tipo romano, no itálica, por ejemplo: Salmonella entérica

subespecie entérica serovariedad Typhimurium. Las serovariedades de las subespecies

restantes y S. bongori se designan con el nombre de la subespecie seguido de la fórmula

antigénica, por ejemplo: Salmonella subespecie IV 50: b:- (S. entérica subespecie

houtenae 50: b:-).

La serotipificación es útil para definir, monitorear y controlar brotes y epidemias. Un

segundo método de clasificación que se utiliza con frecuencia es el esquema de

Kaufmann-White. En este esquema, varios serotipos de Salmonella se clasifican dentro

de once serogrupos. Los mismos están basados en un antígeno mayor y uno o varios

antígenos somáticos menores. Recientemente se ha desarrollado un tercer esquema de

clasificación basado en las técnicas de hibridación del ADN.

OBJETIVOS

Describir la metodología llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiología para

realizar la detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. en muestras

de alimentos.

MATERIALES

Muestra de estudio: “QUESO” proveniente de la ciudad de Puno.

Frascos con 100 ml de Agua Peptonada (0.1) mas Tween 80.

Pipetas de 10 ml. Y 1 ml 1/10 esteriles.

Balanza de presicion de 2500 g. de capacidad.

Incubadora regulada a 35-37 °C.

Placas con Agar BPLS (Agar Verde Brillante-Rojo de Fenol-Lactosa-Sacarosa)

Placas con Agar ENDO-S (Agar fuscina-lactosa seg . ENDO , tipo S)

Rotor digital

Cuchillo esteril.

Espatula esteril.

PRINCIPIOS

1. AGAR “BPLS”: Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento

de Salmonella spp., excepto Salmonella typhi y Salmonella paratyphi, a partir de

muestras clínicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria.

Corresponde a las recomendaciones de la Internacional Organization for

Standardization (ISO-1975).

Forma de actuación: Actua según el mismo principio que el Agar BPL. No obstante, su

base nutritiva-mas rica y abundante-permite un crecimiento mejor de Salmonella. El

crecimiento simultaneo , también mas intenso , de gérmenes acompañantes , se

impide notablemente por el contenido mas elevado de verde brillante. Puesto que las

Salmonellas no pueden degradar la Lactosa ni la Sacarosa, el contenido en sacarosa

permite además el reconocimiento de la flora acompañante Lactosa-Positiva débil o

Lactosa-Negativa pero Sacarosa-Positiva.

Composicion (g/litro)

Peptona de carne 5,0

Peptona de caseína 5,0

Extracto de carne 5,0

Sodio cloruro 3,0

Di-Sodio hidrogenofosfato 2,0

Lactosa 10,0

Sacarosa 10,0

Rojo de fenol 0.08

Verde brillante 0.0125

Agar-agar 12,0

Empleo e interpretación

Sembrar directamente con el material objeto de investigación, o a partir de un

cultivo previo de enriquecimiento. Deben utilizarse en paralelo medios de cultivo

menos inhibidores.

Incubación: 18 a 24 horas, a 37°C.

Colonias Microorganismos

Rojo-rosadas con halo rojo. Lactosa-negativos y sacarosa-

negativos: Salmonella y otros.

Verde-anarillentas con halo verde-

amarillento

Lactosa-positivos o sacarosa-positivos:

E. coli, Citrobacter, Proteus vulgaris,

Klebsiella y otros. No obstante, a

veces, inhibición completa.

2. AGAR “ENDO –S ” Agar selectivo para demostración de bacterias instestinales

patógenas de los grupos salmonella y shigella según ENDO (1903).

Forma de actuación: Las bacterias Gram Positivas son predominantemente inhibidas

por el sulfito y la fuscina. E.coli y coliformes degradadores de la lactosa producen

aldehído y acido. El aldehído libera a la fucsina de la combinación fucsina- sulfito la

cual tiñe entonces fuertemente de rojo a las colonias. Las colonias de gérmenes

lactosa negativo permanecen palidas.

Composicion (g/litro)

Peptona de caseína 5,0

Extracto de carne 3,0

Sodio cloruro 3,0

Di-Potasio hidrogenofosfato 2,0

Lactosa 10,0

Fucsina 0,25

Sodio Sulfito 1.5

Agar-agar 12,0

Empleo e interpretación

Sembrar las placas en estria, por agotamiento.

Incubación: 24 horas, a 37°C.

Colonias Microorganismos

Incoloras , claras Lactosa-negativos:Salmonella,

Shigellas y otros.

Rojas:

Rojas, ocasionalmente con brillo

metalico.

Rojas hasta rosadas.

Lactosa-positivos :

Escherichia coli.

Enterobacter , Klebsiella , algunos

Citrobacter y otros.

PROCEDIMIENTO

Pesar 10 g. de la muestra (“Queso”).

Dilución 10-1: Desmenuzar la muestra y verterlo con mucho cuidado en un frasco

con agua peptonada (100 ml) y homogenizar en el rotor digital.

Metodología en AGAR “BPLS”:

Verter 0.1 ml de la dilución 10-1 a la placa con Agar BPLS

Dilucion 10-2: Separar 1ml de la primera dilución a un tubo de ensayo de 10 ml. De

agua peptonada y verter 0.1 ml de esta a una placa con agar BPLS.

Dilucion 10-3: Separar 1ml de la segunda dilución a un tubo de ensayo de 10 ml.

De agua peptonada y verter 0.1 ml de esta a una placa con agar BPLS.

Incubar las placas a 37 °C por 24 horas.

RESULTADOS

No se encontró colonias rojas-rosadas con halo rojos en ninguna de las 3 diluciones

siendo nuestros resultados NEGATIVOS para Salmonella.

CONCLUSIONES

Según la metodología empleada no se detecto, aislo ni se identifico Salmonella sp. En la

muestra de estudio (Queso).

Metodología en AGAR “ENDO –S

Verter 0.1 ml de la dilución 10-1 a la placa con Agar ENDO.

Dilucion 10-2: Separar 1ml de la primera dilución a un tubo de ensayo de 10 ml. De

agua peptonada y verter 0.1 ml de esta a una placa con agar ENDO.

Dilucion 10-3: Separar 1ml de la segunda dilución a un tubo de ensayo de 10 ml.

De agua peptonada y verter 0.1 ml de esta a una placa con agar ENDO.

Incubar las placas a 37 °C por 24 horas.

RESULTADOS

Ausencia de UFC de Salmonella en 10 gr de muestra ,(Queso) en las 3 diluciones siendo

nuestros resultados NEGATIVOS para Salmonella.

CONCLUSIONES

Según la metodología empleada no se aislo UFC de Salmonella sp.de la muestra en

estudio (Queso). En el medio Agar ENDO.