UNIVERSIDAD NACIONAL DE LUJAN

EVALUACIN DE LA EFICACIA DE LA

FAGOTIPIA COMO MARCADOR

EPIDEMIOLGICO COMPLEMENTARIO PARA

CEPAS DE SALMONELLA ENTERITIDIS

AISLADAS EN LA CIUDAD DE LUJN

Autor: Ricardo J. Anselmo

Directora: Hebe A. Barrios

2012

2

AGRADECIMIENTOS

A la Doctora Hebe Alicia Barrios por su apoyo, estmulo y direccin

en el trabajo.

A la Doctora Mara Ins Caffer por su colaboracin en el diseo del

plan de esta tesis y por la identificacin antignica de las cepas de

Salmonella.

A la Doctora Mariana Pichel por la caracterizacin molecular de las

cepas.

A las Dras. Graciela A. Ruzo de Maggiotto, Florencia Sparapani y

Susana Ferrarotti por el aporte de cepas de presuntas Salmonella

Enteritidis procedentes de enfermos.

A todos mis compaeros de las asignaturas de Microbiologa

General y Agrcola de la Universidad Nacional de Lujn por los aos de

trabajo compartidos.

Y muy especialmente a Ricardo, que me ha apoyado siempre y por

su ayuda en la toma de muestras.

A todos ellos muchas gracias.

3

I N D I C E

Pgina

INTRODUCCIN 9 1. El microorganismo: Salmonella Enteritidis 11 1.1. La enfermedad: Salmonelosis 11 1.1.1. Historia 11

1.1.2. Ecologa 14 1.1.3. Salmonelosis humana 15 1.2. Epidemiologa de la salmonelosis 16 1.2.1. Distribucin geogrfica 16 1.2.2. Prevalencia 17 1.2.3. Situacin epidemiolgica de la salmonelosis en Argentina 19 1.3. Identificacin y caracterizacin del gnero Salmonella 21 1.3.1. Caractersticas generales 21 1.3.2. Aislamiento 22 1.3.3. Caracterizacin fenotpica 23 1.3.3.1. Perfil bioqumico 23 1.3.3.2. Serotipo 25 1.3.3.3. Fagotipia 26 1.3.3.4. Antibiorresistencia 27 1.3.4. Caracterizacin genotpica 28

4

1.3.4.1. Perfil plasmdico 28 1.3.4.2. Patrones de restriccin cromosmica 29 1.3.4.3. Tcnicas de hibridacin 30 1.3.4.4. Electroforesis en campo pulsado 30 1.3.4.5. Reaccin en cadena de la polimerasa 32 2. Bacterifagos: propiedades generales 33 2.1. Clasificacin de los virus 34 2.2. Estructura de los bacterifagos 35 2.3. Ciclo de vida 37 2.3.1. Ciclo ltico 37 2.3.2. Ciclo lisognico 43 2.4. Bacterifagos de Salmonella Enteritidis 44 2.5. Evolucin fgica 45 2.6. Tipificacin fgica de Salmonella Enteritidis 46 OBJETIVOS 48 MATERIALES Y MTODOS 50 1. Toma de muestras de agua 51 2. Cepas de Salmonella Enteritidis 51 3. Enriquecimiento de bacterifagos salvajes 57 4. Confirmacin 57 5. Criterio de seleccin de bacterifagos 58 6. Purificacin de los bacterifagos 59

5

7. Determinacin del ttulo del bacterifago 60 8. Conservacin de los cultivos 61 9. Tcnica de fagotipia 61 10. Determinacin de grupos de especificidad entre las cepas de Salmonella Enteritidis y los fagos hallados 62 11. Caracterizacin molecular de Salmonella Enteritidis 62 12. Morfologa de los bacterifagos aislados 62 ANEXO: MEDIOS DE CULTIVO E HISOPO DE MOORE 63 RESULTADOS 65 1. Bacterifagos de procedencia salvaje 66 1.1. Aislamiento de bacterifagos salvajes 66 1.1.1. Cepas de Salmonella Enteritidis 66 1.1.2. Muestras de agua 66 1.1.3. Aislamiento de bacterifagos salvajes 66 1.2. Criterio de eleccin de los bacterifagos salvajes

aislados 66 1.2.1. Primera seleccin 66 1.2.2. Segunda seleccin 75 1.2.3. Tercera seleccin 76 1.2.4. Cuarta seleccin 80 1.2.5. Seleccin final de los bacterifagos salvajes 81 2. Determinacin del ttulo del bacterifago 82

6

3. Fagotipificacin 83 4. Grupos de especificidad 83 5. Caracterizacin molecular de Salmonella Enteritidis 94 6. Morfologa de los bacterifagos aislados 95 DISCUSIN 98 CONCLUSIONES 105 BIBLIOGRAFA 107 FOTOGRAFAS 123 NDICE DE FIGURAS Figura 1. Salmonella Enteritidis: aumento porcentual en las infecciones humanas, Europa y EEUU, 1981-2000 (OMS) 17 Figura 2. Serovariedades ms frecuentes de Salmonella spp. de origen humano, Argentina, 2000 2006 20 Figura 3. Serovariedades ms frecuentes de Salmonella spp. de origen animal, Argentina, 2000 2006 20 Figura 4. Flix d`Herelle. Science News 14:44-59, 1949 33 Figura 5. Comparacin de dos tipos bsicos de partculas vricas, virus desnudos y virus con envoltura 36 Figura 6. Estructura caracterstica de los bacterifagos 36 Figura 7. Ciclo replicativo de un virus bacteriano 41 Figura 8. Fijacin de la partcula del bacterifago T4 a la pared celular de E. coli e inyeccin del DNA 42 Figura 9. Reproduccin de un virus (bacterifago) 42 Figura 10. Reproduccin de un virus (bacterifago) 43

7

Figura 11. Distribucin de fago tipos de Salmonella Enteritidis notificados en Suecia , 1997 a 2002 45 Figura 12. Electroforesis en campo pulsado de las cepas de Salmonella Enteritidis seleccionadas 95 NDICE DE TABLAS Tabla 1. Especies y subespecies del gnero Salmonella y subgrupos correspondientes 14 Tabla 2. Algunos ejemplos de serotipos y sus frmulas antignicas 26 Tabla 3. Grupo primero. Datos Epidemiolgicos 53 Tabla 4. Grupo segundo. Datos Epidemiolgicos 54 Tabla 5. Grupo tercero. Datos Epidemiolgicos 54 Tabla 6. Grupo cuarto. Datos Epidemiolgicos 55 Tabla 7. Grupo quinto. Datos Epidemiolgicos 56 Tabla 8. Grupo sexto. Datos Epidemiolgicos 56 Tabla 9. Grupo sptimo. Datos Epidemiolgicos 57 Tabla 10. Primera seleccin de bacterifagos salvajes con estabilidad ltica 69 Tabla 11. Tercera seleccin de bacterifagos salvajes: Grupo A 78 Tabla 12. Tercera seleccin de bacterifagos salvajes. Bacterifagos seleccionados 79 Tabla 13. Seleccin final de bacterifagos salvajes 82 Tabla 14. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Primero 84 Tabla 15. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Segundo 86

8

Tabla 16. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Tercero 87 Tabla 17. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Cuarto 89 Tabla 18. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Quinto 90 Tabla 19. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Sexto 91 Tabla 20. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Sptimo 92 Tabla 21. Contitucin de los grupos de especificidad 93

9

INTRODUCCIN

10

El Ro Lujn nace en la confluencia de los arroyos Durazno y Los Leones en la

localidad de Suipacha, a los 59 0 37 de long. Oeste y a los 34 0 43 54 de lat. Sur,

y luego avanza, encauzado en una cuenca, atravesando las zonas de Mercedes,

Lujn, Pilar y Dique Lujn, desaguando en el Ro de la Plata al norte de la localidad

de Tigre. Segn un informe elevado por la Municipalidad de Mercedes, provincia de

Buenos Aires, de un relevamiento de la cuenca del Ro Lujn realizado en 2005 las

causas ms frecuentes de contaminacin del Ro Lujn se deben a: surgencia de

lquidos cloacales y saturacin de pozos negros, microbasurales no autorizados,

efluentes industriales, inundaciones, efluentes cloacales sin tratamiento, proliferacin

de roedores y perros vagabundos (Municipalidad de Mercedes, Informe 2005).

Este trabajo es la continuacin de ocho estudios realizados desde 1987 a 1993

(Anselmo y col., 1989; 1990; 1991a; 1991b; 1991c; 1993; 1995; 1999), donde en total

se aislaron e identificaron bioqumica y antignicamente 95 cepas de Salmonella

Enteritidis. La serotipificacin se realiz en el Servicio Enterobacterias, Departamento

Bacteriologa, del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (I.N.E.I), de la

Administracin Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (A.N.L.I.S.) Dr. Carlos

G. Malbrn.

En lo que respecta a la determinacin de salmonelas a partir de aguas del ro

Lujn, se pueden resumir en tres estudios realizados desde 1987 a 1990, el primero

se bas en un anlisis comparativo de tcnicas de deteccin de Salmonella en aguas

superficiales donde se determin la presencia de serovariedades de Salmonella en

aguas del Ro Lujn, en la zona urbana de la ciudad homnima, de la provincia de

Buenos Aires. En el mismo se realiz un estudio comparativo de cuatro mtodos de

deteccin a partir de 200 muestras de dicho ro. Las muestras fueron tomadas a

travs de la tcnica de la torunda de Moore en tres sitios de muestreo: uno en la

planta urbana, otro a 2 Km. aguas arriba de la misma y el ltimo a 2 Km. aguas abajo

de la ciudad. Las torundas se sumergieron en el ro hasta 20 cm de la superficie

durante 60 min, 1 da y 7 das. La mejor combinacin de medios de enriquecimiento y

de aislamiento estuvo dada por el caldo Rappaport-Vassiliadis y agar verde brillante

con 0,25% de desoxicolato de sodio, luego de preenriquecer las muestras en agua

peptona fosfato. As mismo, el mayor rendimiento en lo que respecta al nmero de

11

muestras recuperadas y la frecuencia de aislamientos de Salmonella se logr a los 60

min de exposicin de las torundas en el curso de agua (Anselmo y col., 1989).

El segundo consisti en cuantificar esta enterobacteria en aguas del Ro Lujn

a fin de tener una estimacin del grado de contaminacin del ro mencionado donde

se analizaron 36 muestras de agua desde junio 1989 a mayo 1990, el 75 % de las 36

muestras contenan esta enterobacteria mediante la tcnica del Nmero Ms

Probable; la ms alta incidencia de Salmonella se hall en el sitio de muestreo

localizado en el centro de la ciudad, con 460 NMP/L y se encontraron 19

serovariedades, la ms frecuente fue S. Enteritidis, siguiendo en orden decreciente S.

Anatum, S. Bovismorbificans y S. Lindenburg (Anselmo y col., 1991).

En el tercer trabajo publicado, se determinaron las serovariedades de

Salmonella predominantes en el Ro Lujn durante el perodo febrero de 1988 a

diciembre de 1989 donde se analizaron 690 muestras de agua de tres sitios de

muestreo, las mismas se obtuvieron segn la tcnica de Moore y se aislaron

Salmonella spp. en 434 muestras (62,9 %). La serovariedad predominante fue S.

Anatum, siguiendo en orden decreciente S. Montevideo, S. Newport y S. Bredeney.

Se encontr un nmero de serovariedades que se aslan con muy baja frecuencia y

muy espordicamente en el pas: S. Westhampton, S. Poona y S. Saintpaul (Anselmo

y col., 1999).

1. El microorganismo: Salmonella Enteritidis

La exposicin del microorganismo Salmonella serotipo Enteritidis se har, en

este trabajo, de forma global con el resto de los serotipos que constituyen el gnero

Salmonella, ya que este serotipo no presenta ninguna excepcin a las caractersticas

generales del gnero al que pertenece.

1.1. La enfermedad: Salmonelosis

1.1.1. Historia

12

Salmonella spp fue observada inicialmente en el ao 1880 por Karl Joseph

Eberth (1835-1926) en cortes histolgicos de muestras de bazo y ndulos linfticos

mesentricos procedentes de personas fallecidas por fiebre tifoidea. Posteriormente,

fue descrita por Daniel Elmer Salmon (1850-1914) y Theobald Smith (1859-1934), en

el ao 1885, a partir de una cepa aislada de cerdo con Peste Porcina Clsica (Salmon

y col., 1886). El bacterilogo francs Joseph Lon Marcel Lignires (1868-1933)

sugiri en 1900 que estas bacterias se llamaran Salmonella, en honor a Salmon.

La clasificacin y consiguiente nomenclatura del gnero Salmonella es an, hoy

en da, muy controvertida, utilizndose distintos sistemas para referirse a los

miembros de este gnero. La terminologa introducida por White en 1929 y modificada

por Kauffmann en 1966, estableca un tipo especfico para cada cepa de Salmonella

que fuera distinguible antignicamente (equivalente al actual serotipo), teniendo en

cuenta el polimorfismo de los antgenos somticos (O) y flagelares (H), atribuyendo en

un inicio a cada tipo el nombre del lugar donde se aisl por primera vez. La propuesta

de Kauffmann implicaba que cada tipo era en realidad una nueva especie. La primera

lista publicada contena unos 20 nombres, hoy el nmero de serotipos sobrepasa

ampliamente los 2000.

Mediante mtodos de hibridacin ADN-ADN se demostr que las cepas de

Salmonella formaban un solo grupo de hibridacin, con 7 subgrupos o subgneros

(Crosa y col., 1973), distinguibles entre s fenotpicamente. Los subgneros

propuestos pertenecan as a una misma especie, que posteriormente recibi el

nombre de Salmonella choleraesuis (Le Minor y col., 1982, 1986). Esta denominacin

sin embargo se prestaba a confusin, debido a la existencia del serotipo Choleraesuis

que adems mostraba un perfil bioqumico distinto al de la mayora. Le Minor y Popoff

en en ao 1987 propusieron que los 7 subgneros (I, II, IIIa, IIIb, IV, V y VI) definidos

13

anteriormente, fueran considerados subespecies. Recomendaron adems, el cambio

de nombre de la especie Salmonella choleraesuis por el de Salmonella enterica

(publicado por Penner, 1988). La propuesta fue denegada por parte de la Comisin

Judicial del Comit Internacional de Bacteriologa Sistemtica, al considerarse que

Salmonella Typhi podra pasar desapercibida. En 1989, Revees y col. elevaron al

rango de especie a la hasta entonces Salmonella choleraesuis subespecie bongori,

pasando a ser as, la segunda especie del gnero (Tabla 1). Euzby, en el ao 1999,

propuso una enmienda para adoptar la nomenclatura de especie enterica que tuviera

en cuenta la excepcin del serotipo Typhi, pasando a denominarse Salmonella typhi.

Al da de hoy, esta propuesta contina pendiente de resolucin.

Aunque contina sin definirse una frmula concreta para la nomenclatura de

Salmonella, la Organizacin Mundial de la Salud adopt la denominacin de

Salmonella enterica y Salmonella bongori como nicas especies del gnero, y la

subsiguiente divisin en subespecies (o subgrupos fenotpicamente distintos) de S.

enterica como: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV)

e indica (VI). Los serotipos o serovariedades, siguiendo el esquema de Kauffmann-

White, se escriben al final sin cursiva y con la inicial en mayscula, o bien si carecen

de nombre, aadiendo su frmula antignica.

14

Tabla 1. Especies y subespecies del gnero Salmonella y subgrupos correspondientes (Crosa y col., 1973, Popoff y col., 2001)

1. Salmonella enterica

1.1 Salmonella enterica subesp. enterica (subgrupo I) 1.2 Salmonella enterica subesp. salamae (subgrupo II) 1.3 Salmonella enterica subesp. arizonae (subgrupo IIIa) 1.4 Salmonella enterica subesp. diarizonae (subgrupo IIIb) 1.5 Salmonella enterica subesp. houtenae (subgrupo IV) 1.6 Salmonella enterica subesp. indica (subgrupo VI) 2. Salmonella bongori (subgrupo V)

*International Journal of Systematic and Evolutionari Microbiology

1.1.2. Ecologa El principal hbitat de Salmonella es el tracto intestinal de humanos y animales

homeotermos y poiquilotermos (puede formar parte de la flora natural de reptiles y

anfibios). Existen serotipos adaptados al husped como S. Typhi (hombre), S. Abortus

ovis (oveja) o S. Gallinarum (aves), entre otros, aunque la mayora son ubiquitarios.

Los principales reservorios son los animales de abasto (tanto de carne roja como

aves), y en menor medida las aves silvestres, roedores, insectos, peces, moluscos,

tortugas y otros. En general, todo alimento es susceptible de ser contaminado por

efluentes fecales. Salmonella se disemina en el medio natural a travs de excreciones

humanas y animales, sin multiplicarse de forma significativa, aunque puede sobrevivir

durante semanas en agua y durante aos en suelo en condiciones favorables de

temperatura, humedad y pH (Acha y col., 2001, Betancor y col., 2010, Janda y col.,

2006).

El gnero Salmonella es uno de los principales causantes de enfermedades

transmitidas a travs de agua y alimentos. Es comn encontrar Salmonella en aves de

corral, en la cscara de huevos crudos, y en carne roja. En concreto, el problema que

supone la presencia de Salmonella en las aves de corral y en las cscaras de huevo

se atribuye bsicamente a las prcticas utilizadas en este tipo de explotaciones.

Salmonella es adems un posible contaminante en operaciones de transporte de

animales de abasto, y consecuentemente de la carne durante el sacrificio.

15

Uno de los serotipos de Salmonella ms importantes transmitidos a travs del

agua es Salmonella Typhi, aunque con frecuencia son salmonelas no tifoideas,

productoras de procesos patolgicos menos graves, las responsables de los brotes

epidmicos por esta va de transmisin (Madigan y col., 1996). El tratamiento del agua

destinada al consumo pblico ha disminuido la incidencia de Salmonella en todo el

mundo. As, los brotes epidmicos estn a menudo relacionados con fallas en la

depuracin, por contaminacin cruzada entre tuberas de la red y aguas residuales,

inundaciones, efluentes de industrias crnicas o explotaciones ganaderas.

1.1.3. Salmonelosis humana

La salmonelosis puede presentar variedad de cuadros clnicos en funcin del

serotipo implicado en el proceso y de la especificidad de husped (Pier y col., 1998),

entre ellos cuadros de gastroenteritis, fiebre entrica, septicemia, y raramente

encefalitis (Martin y col., 1994). Los nios, ancianos, enfermos y/o personas

inmunodeprimidas son los que presentan las manifestaciones clnicas ms graves. A

ello hay que aadir la existencia de portadores asintomticos. En general, los

serotipos Typhi y Paratyphi A, B y C producen fiebre entrica en humanos (fiebre

tifoidea y paratifoidea, respectivamente); el serotipo Choleraesuis produce septicemia

o infecciones localizadas en cerdo; los serotipos Enteritidis, Typhimurium o Newport

producen gastroenteritis en humanos y animales, frecuentemente agudas pudiendo

variar de leves a fulminantes (Caffer., 2007).

La fiebre entrica o tifoidea, la ms grave de las salmonelosis humanas, cursa

con fiebre, malestar, anorexia, mialgias, cefalea, dolor abdominal y/o diarrea

dependiendo de la magnitud del inculo ingerido. Puede aparecer tambin tos y

epistaxis. Los sntomas se agravan y se presenta fatiga, letargia y desorientacin,

pudiendo aparecer a la semana exantema maculoso o maculopapuloso. Sin

tratamiento la letalidad llega al 10% (Maskalyk, 2003, Parry y col., 2002). En el caso

de las salmonelas no tifoideas, la gastroenteritis, es el ms comn de los cuadros

clnicos. La infeccin sobreviene por la ingestin de alimentos contaminados y es

clnicamente indistinguible de otras gastroenteritis producidas por otros patgenos

gastrointestinales. Aproximadamente 48 h despus de la ingestin se inicia un cuadro

16

de dolor abdominal con vmito y diarrea en cantidad moderada, con sangre, moco y

tenesmo rectal, acompaado de fiebre y/o cefaleas y mialgias. Normalmente se

autolimita al cabo de 4-8 das. Ocasionalmente requiere rehidratacin parental y

hospitalizacin (Abe y col., 2004, Grisaru-Soen y col., 2004).

1.2. Epidemiologa de la salmonelosis

1.2.1. Distribucin geogrfica

La salmonelosis es la toxiinfeccin alimentaria transmitida a travs de

productos y subproductos de origen animal ms importante en los pases

desarrollados. Su seguimiento y control se ha convertido en una cuestin prioritaria de

salud pblica. En Europa se declaran una media de 73 casos por cada 100.000

habitantes, con una variacin de entre 1,8 a 136 casos dependiendo del mtodo

diagnstico, la comunicacin de los datos y los hbitos culinarios de cada pas. Se

estima sin embargo que la cifra real est alrededor de los 450 casos por cada 100.000

habitantes (Berends y col., 1998), causando 3 muertes por cada milln de habitantes.

El CDC en Estados Unidos comunic en 2001 una media de 400 muertes por

salmonelosis al ao (Voetsch y col., 2004).

En el ao 2000, la OMS fund la Global Salm-Surv (WHO-GSS) para reducir el

peso y a la vez, el efecto global que representan las enfermedades de origen

alimentario, mediante la recopilacin de la informacin obtenida en los laboratorios de

referencia de cada pas. Estos datos se analizaron para detallar la distribucin global

de los serotipos de Salmonella en muestras tanto humanas como no humanas.

Cuarenta y siete de los 138 pases pertenecientes a esta organizacin en todo el

mundo enviaron datos del perodo 2000-2002, de un total de casi 300.000 casos de

salmonelosis humanas y poco ms de 65.000 no humanas (Espaa, Francia,

Holanda, Gran Bretaa, e Irlanda fueron algunos de los ausentes a nivel Europeo). En

general, los serotipos ms comunes distribuidos en los 5 continentes son Enteritidis

(63%), Typhimurium (14%) y Newport (2,6%) en muestras de origen humano y

Typhimurium (22,3%), Heidelberg (9,3%) y Enteritidis (8,9%) en las de origen no

humano. Salmonella Typhimurium en muestras humanas es el serotipo ms frecuente

en Oceana, frica y Amrica del Norte, mientras que Enteritidis lo es en Europa,

17

Amrica del Sur y Asia (Galanis y col., 2004). En la Argentina, al igual que en el resto

de Latinoamrica y el Caribe, los serotipos ms frecuentes son Enteritidis (39%) y

Typhimurium (17%) (WHO, 2000-2005).

Figura 1. Salmonella Enteritidis: aumento porcentual en las infecciones humanas

Europa y EEUU, 1981-2000 (OMS)

Tomado de: (Almeida, 2001)

1.2.2. Prevalencia

La infeccin debida a serovariedades no tficas de Salmonella spp. representa

un problema de salud pblica nacional e internacional, que se ha agudizado con la

apertura econmica y la globalizacin, debido a que el consumo de carne de pollo,

huevos y subproductos se ha incrementado en todo el mundo, existe sustancialmente

un mayor riesgo de infeccin (Le Minor, 1992). Casi todas las canales de aves pueden

estar infectadas; el nmero de microorganismos puede ser bajo en un principio y

aumentar como resultado del manejo. Los huevos se pueden contaminar por

transmisin vertical (transovrica), durante la postura o durante la manipulacin o el

almacenamiento. La infeccin en los seres humanos se adquiere por consumo de

18

pollo, huevo crudo o parcialmente cocido, o alimentos preparados con estos (Lax y

col., 1995).

Un dramtico incremento de la salmonelosis en humanos producida

especficamente por S. Enteritidis, ocurri a finales de la dcada de 1980 y principios

de la dcada de 1990 (Rodrigue y col., 1990). En 1995 del total de informes

recopilados por los sistemas de vigilancia de los pases miembros de la OMS se

encontr que 76.1% de los aislamientos correspondieron a la S. serovariedad

Enteritidis, Typhimurium, y Typhi. S. Enteritidis fue ms frecuente en 35 pases

seguido por S. Typhi (12 pases) y S. Typhimurium (8 pases). Las principales

serovariedades aisladas globalmente para 1995 incluyeron Enteritidis, Typhimurium,

Hadar, Infantis, Newport, Typhi, Agona, Virchow y Heidelberg. Los aislamientos de S.

Enteritidis se aumentaron de 25.6% en 1990 a 36.5% para el ao de 1995 (Herikstad

y col., 2002). En Mxico, en un estudio retrospectivo, se identificaron 199

serovariedades, fue la ms frecuente en muestras clnicas S. Enteritidis (20.4%) y, en

segundo lugar, S. Typhimurium (18.3%) (Gutirrez-Cogco y col., 2000).

El incremento de stas y de otras serovariedades es el resultado de una

combinacin de factores que se relacionan con el desarrollo en la industrializacin en

todas las fases de produccin de alimentos en lo que se destacan cambios en las

prcticas de manejo, almacenamiento, distribucin y preparacin. Estas variaciones

han tenido como consecuencia nuevos problemas en la higiene de los alimentos al

originar una fcil diseminacin de Salmonella spp., as como de otros grmenes

patgenos (Acha y Szyfres, 2001).

El aumento del comercio y distribucin de productos de origen avcola

posiblemente han contribuido al incremento de la diseminacin y transmisin de

Salmonella. Los alimentos contaminados con este microorganismo tienen un impacto

directo sobre la salud de las colectividades, no slo debido al patgeno, sino

frecuentemente por la presencia de antimicrobianos que pueden contribuir a la

aparicin de cepas resistentes a estos antimicrobianos (Prat y col., 2001).

En Dinamarca el programa de control de Salmonella en ponedoras comerciales

y pollos parrilleros entre 1996 y 2002 logr reducir la incidencia de Salmonella en

19

humanos y aves. La incidencia de la infeccin en ponedoras comerciales declin de

13.4% en 1998 hasta 2.6% en 2002; para el ao 2003 la incidencia fue 2.3%. Los

estudios de Weneger y col., 2003 estimaron que para el ao 2001 el programa de

control de Salmonella en Dinamarca permiti ahorrar alrededor 25,5 millones de

dlares.

1.2.3. Situacin epidemiolgica de la salmonelosis en Argentina

En la Argentina, segn el Boletn Epidemiolgico Peridico de 2006, las 5

serovariedades prevalentes, en el perodo 2004-2005 fueron: Salmonella Enteritidis

(36.0%), S. Typhimurium (20.5%), S. Infantis (8.7%), S. Newport (5.3%) y S. Agona

(4.9%); siguiendo la misma tendencia que en los aos 2002-2003, donde S. Enteritidis

(30,3 %) ocup tambin el primer lugar, seguida por S. Typhimurium (12.8%) y S.

Infantis (11.5 %), mientras que se invirti el orden de frecuencia con respecto a S.

Agona (11.3%) y S. Newport (6.5%).

Entre todos los aislamientos analizados, se identificaron 43 serovariedades,

entre las cuales S. Enteritidis (36.0%) fue la ms ampliamente distribuida y se

encontr con mayor frecuencia en la mayora de las jurisdicciones. S. Typhimurium

(20.5%) ocup el primer lugar en Crdoba, fue la segunda serovariedad en Buenos

Aires, Ciudad Autnoma de Buenos Aires, Mendoza, Ro Negro y Santa Fe y se

encontr tambin, en menor frecuencia en otras provincias. Tanto S. Newport como S.

Agona estuvieron distribuidas en el pas, en 12 y 11 jurisdicciones respectivamente.

20

Figura 2. Serovariedades ms frecuentes de Salmonella spp. de origen humano, Argentina, 2000 - 2006

Tomado de: Caffer, 2007

Figura 3. Serovariedades mas frecuentes de Salmonella spp. de origen

animal, Argentina, 2000-2006

Tomado de: Caffer, 2007

21

1.3. Identificacin y caracterizacin del gnero Salmonella

1.3.1. Caractersticas generales

El gnero Salmonella se sita dentro de la familia Enterobacteriaceae, Phylum

Proteobacteria. Salmonella es un bacilo acapsular, de 2-4 m de largo por 0,6 m de

ancho, que muestra colonias de entre 2 y 3 mm de dimetro, de color blanco-gris y

textura viscosa, cuando se aslan en placas de agar-sangre durante 24 h a 37C.

Este gnero se caracteriza por tener requerimientos nutricionales muy

sencillos, siguiendo un modelo de fermentacin cido-mixta. La mayora de cepas son

prototrficas, aunque algunas cepas principalmente husped-especficas, necesitan la

adicin en el medio de factores de crecimiento (auxotrficas): uno o ms aminocidos

o vitaminas.

Los miembros del gnero Salmonella, si bien acordes con las caractersticas

que definen la familia a la que pertenecen, se caracterizan por no formar butilenglicol,

producir cido y eventualmente gas a partir de la fermentacin de la glucosa, de

manitol y casi siempre de sorbitol. Tambin por ser ureasa y fenilalanina desaminasa

negativos, aunque positivos para lisina y ornitina descarboxilasas. Son indol negativo

y citrato positivo, y no fermentan ni la sacarosa ni el adonitol. En medio TSI (Triple

Sugar Iron) Salmonella produce normalmente H2S. No crece en medio con cianuro de

potasio y salvo pocas excepciones (S. Gallinarum, S. Pullorum) Salmonella es mvil

por disponer de flagelos pertricos, mostrando la mayora de las cepas variacin

difsica de los antgenos flagelares (Madigan y col., 1996).

La temperatura ptima de crecimiento para Salmonella es de 35 a 37C,

aunque crece dentro de un intervalo de 7 a 54C, y el pH ptimo se sita entre 7-7,5,

pudiendo crecer entre 4,1 y 9. Salmonella crece en alimentos con valores de actividad

de agua del 0,93, aunque el valor ptimo se sita en 0,995. No crece a valores por

debajo de 0,93, aunque el tiempo de supervivencia puede durar meses. Sobrevive a

la refrigeracin, a la congelacin y a ambientes secos. Es sensible a la mayora de

22

desinfectantes y se destruye a altas temperaturas (60C durante 2 3 minutos).

Puede sobrevivir meses fuera de su hospedador.

1.3.2. Aislamiento

El aislamiento de Salmonella se realiza mediante mtodos de cultivo

tradicionales, que consisten en pre-enriquecimiento en medio lquido no selectivo,

enriquecimiento en medios lquidos selectivos y aislamiento sobre medios slidos

selectivos.

Los medios de pre-enriquecimiento, como pueden ser el agua de peptona

tamponada (APT), el caldo universal (UB) o el medio M9 (APS) son necesarios para

muestras con una carga bacteriana presumiblemente baja (portadores tratados,

muestras ambientales, entre otros). La eficacia de estos medios vara dependiendo de

su capacidad tampn (Hoofar y col., 1998). Por otro lado, el uso de estos medios en

muestras fecales no est tan claro, incluso se cree que pueden ser contraproducentes

(Aho, 1992). Hoy, sin embargo el uso de pre-enriquecimiento se propone como

prctica comn en el aislamiento de Salmonella en muestras fecales de cerdo,

aunque su eficacia no est suficientemente probada (Davies y col., 2000, Hoofar y

col., 1998).

El enriquecimiento en medios lquidos selectivos permite, de forma competitiva,

la proliferacin de Salmonella hasta niveles que la hacen detectable en medios

slidos al cabo de aproximadamente 24 h. Ejemplos de caldos enriquecidos son

Rappaprt-Vassiliadis (RV), Caldo selenito o Caldo tetrationato. El caldo RV es

posiblemente el ms utilizado, y hay que tener en cuenta que los caldos selenito y

tetrationato pueden inhibir el crecimiento de algunos serotipos auxotrficos de

Salmonella. La eleccin de uno u otro mtodo en funcin de su mayor eficacia o

sensibilidad, contina siendo hoy tema de estudio (Michael y col., 1999, Nollet y col.,

2001). Tambin se han desarrollado medios semislidos como posible alternativa al

caldo de enriquecimiento, como el medio semislido Rappaport-Vassiliadis modificado

(MSRV), o el medio DIASALM. Ambos medios aprovechan, por un lado, la propiedad

selectiva de RV y, por otro, la motilidad que caracteriza a la mayora de cepas de

23

Salmonella (Davies y col., 2001, Hoofar y col., 2000, Nollet y col., 2001, Voogt y col.,

2001).

Los medios slidos selectivos y/o diferenciales para Salmonella, se basan tanto

en la inhibicin del crecimiento de otras bacterias entricas, como en la discriminacin

visual de las colonias. A menudo se utilizan tanto la produccin de H2S como la no

fermentacin de lactosa como caractersticas diferenciales para dicha discriminacin

visual. Dentro de este grupo, existe una variedad de medios, con mayor o menor

especificidad para aislar cepas de Salmonella. Podemos destacar los siguientes como

los ms comnmente utilizados: agar MacConkey, xilosa-lisina-desoxicolato (XLD),

xilosa-lisina-tergitol 4 (XLT4), Hektoen-Enteric (HE), Rambach (Ra), Salmonella-

Shigella (SS), agar verde brillante novobiocina-glicerol-lactosa (NBGL), identificacin

de Salmonella SM-ID (SM), CHROMagar (CAS), ABC mdium, o COMPASS

Salmonella agar, entre otros.

Existen numerosos estudios que comparan la sensibilidad y especificidad de

unos medios con otros. En cualquier caso los mejores resultados se dan, para

cualquier medio, despus del proceso de enriquecimiento (Dusch y col., 1995, Gaillot

y col., 1999, Maddocks y col., 2002, Ruz y col., 1996,).

1.3.3. Caracterizacin fenotpica

Como ya es sabido, el fenotipo es la expresin del genotipo y ello es lo que lo

convierte en un mtodo til para caracterizar las distintas especies de un mismo grupo

de microorganismos. Aunque el desarrollo de la biologa molecular ha abierto nuevas

y mejores posibilidades para la caracterizacin y el posterior estudio de la taxonoma

y epidemiologa bacteriana, los resultados obtenidos con tcnicas de caracterizacin

fenotpica como pueden ser el perfil bioqumico, el serotipo, el fagotipo, o el perfil de

antibiorresistencia, les confieren un valor como herramientas complementarias tiles

para el marcaje epidemiolgico.

1.3.3.1. Perfil bioqumico

24

El perfil bioqumico confirma la identidad de Salmonella frente a otras

enterobacterias que hayan podido ser aisladas, conjuntamente, en los medios

selectivos. La determinacin del perfil bioqumico se establece como tcnica de

identificacin, ya que se trata de una caracterstica distintiva y estable, capaz de

diferenciar a la mayora de gneros del grupo de las enterobacterias (Farmer y col.,

1985). As pues, la determinacin del perfil bioqumico es el paso siguiente al

aislamiento.

Las pruebas bioqumicas tradicionalmente se han llevado a cabo mediante una

serie de medios especficos como son: agar hierro tres azcares, agar citrato de

Simmons, medio SIM (Sulfhdrico-Indol-Movilidad), pruebas de Ureasa, Oxidasa,

Catalasa, Voges-Proskauer, fenilalanina desaminasa, entre otras, para detectar y

visualizar en ellos una serie de resultados clave en la identificacin de Salmonella.

Las tcnicas sistematizadas de identificacin de microorganismos se basan

principalmente en la realizacin simultnea de determinadas pruebas bioqumicas en

formato miniaturizado. As, tenemos por ejemplo procedimientos manuales como el

sistema API (bioMrieux Inc., Durham, NC), con un perodo de identificacin estimado

de 21 horas, y los sistemas automticos de identificacin, como puede ser Vitek

(bioMrieux), con tiempos de identificacin de entre 4 y 18 horas. Estas tcnicas, que

han evolucionado rpidamente desde su aparicin (Stager y col., 1992), han

aumentado la eficacia de la identificacin de los mtodos tradicionales, introduciendo

un mayor nmero de pruebas bioqumicas especficas. As, en el caso de Vitek se

pueden alcanzar porcentajes de entre el 98 y el 99% de identificacin positiva a las 8

horas (OHara y col., 1993, Visser y col., 1992), frente a identificaciones positivas con

un error estimado de ms del 20% en el caso de mtodos tradicionales.

El perfil bioqumico de Salmonella es estable para la mayora de los serotipos

pertenecientes a los 7 subgrupos identificados. El subgrupo I (subespecie enterica)

que engloba aproximadamente al 60% de los serotipos descritos, los cuales

representan prcticamente la totalidad de los aislamientos de muestras clnicas

(Brenner y col., 2000), se caracteriza bioqumicamente por utilizar el citrato como

nica fuente de carbono, y ser argininadihidrolasa, lisina y ornitina positivo. Este

subgrupo consta de al menos 5 excepciones al perfil tpico: los serotipos Typhi,

25

Choleraesuis, Paratyphi A, Gallinarum y Pullorum. Ninguno de estos 5 serotipos es

capaz de utilizar el citrato, con la excepcin del serotipo Choleraesuis, con un 25 % de

cepas positivas. Con respecto a la presencia de enzimas, el serotipo Paratyphi A es

negativo para lisina decarboxilasa. Todos son prcticamente negativos para arginina

dihidrolasa, exceptuando el serotipo Choleraesuis en el que est presente en un 55 %

de los casos. Los serotipos Typhi y Gallinarum son ambos negativos para ornitina

decarboxilasa (Farmer y col., 1985). Se observan, adems, diferencias en el

porcentaje de fermentacin de algunos azcares entre estos serotipos y los del resto

del subgrupo I de Salmonella.

1.3.3.2. Serotipo

El serotipado permite diferenciar cepas del gnero Salmonella mediante la

determinacin de su composicin antignica: antgenos somticos (O), antgenos

flagelares (H), que mayoritariamente constan de 2 fases (H1 y H2), siendo sta una

caracterstica exclusiva del gnero, y para ciertos serotipos, el antgeno capsular (Vi)

(Tabla 2).

La identificacin de los serotipos se basa en el esquema propuesto por

Kauffman y White (Popoff y col., 1997), incluyendo slo los antgenos de superficie de

importancia diagnstica (Le Minor y col., 1984). As, a cada Salmonella se le asigna

una frmula antignica determinada, habindose identificado un total de 2.541

serotipos hasta el ao 2002 (Centers for Disease Control and Prevention, 2004).

La frmula antignica se representa mediante una combinacin de nmeros y

letras. A modo de ejemplo, la frmula antignica de Salmonella Typhimurium es

1,4,5,12:i:1,2. En primer lugar, aparecen los antgenos O separados por comas. En

ocasiones alguno de estos nmeros figura entre corchetes, lo que significa que no

siempre est presente. A continuacin, para aquellos serotipos que lo presentan,

aparece el antgeno capsular, separado de los anteriores tambin por comas. Y,

finalmente separados de los anteriores mediante dos puntos, los antgenos flagelares,

cuyas fases se separan asimismo por dos puntos. La primera fase (H1) se representa

con letras minsculas, aunque los nuevos antgenos descubiertos tienen asignados

valores del tipo: z6, z10, etc. La segunda fase (H2) se represent inicialmente con

26

nmeros arbigos, aunque hoy los nuevos antgenos se representan con letras

(Popoff y col., 2001). Los antgenos flagelares pueden presentarse de forma

monofsica en algunas cepas, de manera que no expresan la segunda fase flagelar y

se representa con el signo -. Existen cepas monofsicas que pueden presentar

ocasionalmente la segunda fase flagelar, opcionalmente en la frmula figura el signo

- bien el antgeno entre corchetes. Aunque el serotipado no es una tcnica

rutinaria en los laboratorios de diagnstico, es una referencia obligada en los estudios

de salmonelosis.

Tabla 2. Algunos ejemplos de serotipos y sus frmulas antignicas (CDC, 2004,

Espigares y col., 2002)

Serotipos Antgenos Somticos y flagelares Frmula Antignica

O H1 H2

S. Paratyphi A

S. Paratyphi B

S. Typhimurium

S. Virchow

S. Typhi

S. Enteritidis

S. Pullorum(2)

1,2,12

1,4,[5],12

1,4,[5],12

6,7

9,12,[Vi]

1,9,12

1,9,12

a

b

i

r

d

g,m

-

[1,5]

1,2

1,2

1,2

-

[1,7]

-

S. I(1)

1,2,12:a:- 1,2,12:a:[1,5]

S. I 1,4,[5],12:b:1,2

S. I 1,4,[5],12:i:1,2

S. I 6,7:r:1,2

S. I 9,12,[Vi]:d:-

S. I 1,9,12:g,m:- 1,9,12:g,m:[1,7]

S. I 1,9,12:-:-

(1) abreviatura de Salmonella enterica subespecie enterica (o subgrupo I)

(2) serotipo inmvil

1.3.3.3. Fagotipia

Las cepas pertenecientes a un mismo serotipo de Salmonella, pueden

diferenciarse en funcin de sus patrones de sensibilidad, frente a un grupo

seleccionado de bacterifagos. El fagotipo o lisotipo es de gran valor en el estudio

epidemiolgico de Salmonella, ya que existe un alto porcentaje de correlacin entre

fagotipo y origen epidmico. Aunque algunos de los recursos serolgicos pueden

utilizarse para distinguir cepas de serotipos como Typhimurium, las diferencias se

27

evaluarn con mayor precisin mediante el fagotipado (Rabsch y col., 2002),

permitiendo ampliar la informacin necesaria para establecer posibles relaciones

epidemiolgicas.

Los serotipos Typhi, Paratyphi A y B, Typhimurium y Enteritidis han sido los

ms fagotipados desde un inicio. Existen ms de 100 fagotipos distintos de S. Typhi

(Craigie y col., 1938) y se han identificado hasta el momento ms de 300 para S.

Typhimurium (Anderson y col., 1977, Callow, 1959), de los cuales ms de 200 son

fagotipos definitivos (DTs) (Liebana y col., 2002). Se han desarrollado, adems,

esquemas de fagotipado para otros serotipos de importancia clnica: Braenderup

(Sechter y col., 1968), Newport (Petrow y col., 1974), Virchow (Chambers y col., 1987)

o Agona (Tyc, 1990) entre otros.

En general, al igual que el serotipado, la tcnica de fagotipado, no se lleva a

cabo de forma rutinaria en todos los laboratorios, pero se establece como marcador

epidemiolgico complementario al serotipado. De hecho, a raz de la caracterizacin

de la cepa pentarresistente de S. Typhimurium DT104 en el Reino Unido (Low y col.,

1997, Threlfall y col., 1994) y los EEUU (Angulo F, 1997, Glynn y col., 1998), el

fagotipo ha pasado a formar parte de la taxonoma de este serotipo para la mayora

de estudios de caracterizacin de cepas (Briggs y col., 1999, Lan y col., 2003,

Libana y col., 2002, Wray y col., 1998).

1.3.3.4. Antibiorresistencia

La aparicin de antibiorresistencias en Salmonella, y otras bacterias

zoonticas, est ligada al abuso de antibiticos como tratamiento teraputico y

promotor de crecimiento en el ganado (Schroeder y col., 2002, Witte, 1998). Esto ha

producido una inevitable seleccin de cepas resistentes de la flora comensal y

patgena de los animales. Posiblemente por ello, los niveles de antibiorresistencia de

la flora comensal del intestino en humanos se han visto tambin incrementados (van

den Bogaard y col., 2000).

En la adquisicin de resistencias frente a antimicrobianos estn implicados

numerosos mecanismos relacionados con elementos genticos mviles (de

28

transmisin horizontal): plasmidos, transpsones e integrones, jugando estos un papel

importante en la diseminacin (Davies, 1994).

Conocer los niveles de resistencia a antimicrobianos de Salmonella es de

inters tanto sanitario como epidemiolgico. Las tcnicas utilizadas para determinar

antibiorresistencias se clasifican en general, en manuales (mtodos de difusin y

mtodos de dilucin) y semiautomticas/automticas (Ej. MiniAPI, Vitek System o

Walkway System). La mayora de estas tcnicas determinarn si la bacteria es

resistente o sensible frente a la accin de un determinado antimicrobiano, existiendo

adems un valor de sensibilidad intermedio, cuya interpretacin en clnica supondr la

adopcin de distintas actuaciones frente a la infeccin como por ejemplo las dosis a

suministrar. Las pruebas de sensibilidad por mtodos de dilucin adems, permiten

determinar las concentraciones mnimas inhibitorias (CMI), con lo cual se obtiene una

medida in vitro ms precisa de la actividad de un antimicrobiano.

Establecer un perfil de antibiorresistencia es una prctica comn, sencilla,

rpida y accesible para la caracterizacin de cepas de Salmonella en estudios

epidemiolgicos. Un patrn de resistencias similar puede indicar cierta clonalidad,

siempre y cuando las cepas en estudio sean geogrficamente cercanas. Aunque las

resistencias hayan sido transferidas de forma horizontal, se ha demostrado en

Salmonella Typhimurium DT104 la integracin de ciertas antibiorresistencias a nivel

cromosmico (Briggs y col., 1999, Threlfall y col., 1994).

1.3.4. Caracterizacin genotpica

La ingeniera gentica y la biologa molecular nos permiten conocer y estudiar

el genoma de las bacterias para su ordenacin y clasificacin, de acuerdo a un criterio

mucho ms amplio que el obtenido a travs de los mtodos de caracterizacin

fenotpica. Los mtodos de caracterizacin genotpica disponen en general de mayor

poder de discriminacin, reproducibilidad y tipabilidad que los mtodos fenotpicos,

aunque estos ltimos sean de gran inters por su mayor sencillez, rapidez, y en

general, menor costo.

1.3.4.1. Perfil plasmdico

29

Los plsmidos son fragmentos de ADN circular, que pueden replicarse

autnomamente dentro de la bacteria, funcionando como vectores de clonacin y

permitiendo la transmisin horizontal de resistencias o de factores de virulencia, entre

otros.

El perfil plasmdico (nmero y tamao de plsmidos) de un microorganismo

permite su caracterizacin y la deteccin de similitudes y diferencias entre cepas,

pudiendo utilizarse como marcador epidemiolgico.

La mayora de mtodos utilizados para la extraccin de plsmidos son kits

comerciales de purificacin (Gibco BRL, QIAGEN, etc.) basados, mayoritariamente,

en los mtodos descritos por Birnboim y col. en 1979 y Kado y col. en 1981.

Para la caracterizacin, el estudio y la vigilancia epidemiolgica de Salmonella,

la determinacin del perfil plasmdico es casi rutinaria junto a determinados mtodos

fenotpicos y, como mnimo, a algn otro mtodo genotpico de anlisis cromosmico

(Echeita y col., 2001, Gebreyes y col., 2002, Libana y col., 2002, Lindqvist y col.,

2004, Ridley y col., 1998).

1.3.4.2. Patrones de restriccin cromosmica

La tcnica RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) descrita por Kan

y Dozy en 1978, se basa en la deteccin de fragmentos de ADN de distinto peso

molecular, despus de someterlo a un proceso de digestin con una enzima de

restriccin determinada. Dependiendo de si la enzima utilizada es de corte frecuente o

no, obtendremos mayor o menor nmero de fragmentos. Inicialmente se utilizaron

enzimas de restriccin de corte frecuente que proporcionaban patrones de restriccin

electroforticos con un gran nmero de bandas. La tecnologa RFLP se utiliza como

primer paso en los mtodos de hibridacin como el IS200-RFLP (Jeoffreys y col.,

2001) entre otros y se considera variante del mtodo PCR, cuando se aplica a una

secuencia conocida de ADN amplificada, es decir, PCR-RFLP (Allen y col., 2002,

Kisiela y col., 2005, Lauri y col., 2011).

30

1.3.4.3. Tcnicas de hibridacin

En general, para la caracterizacin de cepas de Salmonella las tcnicas de

hibridacin ms utilizadas son el ribotipado y la deteccin de la secuencia de insercin

IS200. El ribotipado se basa en el estudio del polimorfismo de patrones de restriccin

de genes muy conservados de ARN ribosmico y secuencias asociadas. El ADN se

extrae de la bacteria y se corta, mediante enzimas de restriccin, en fragmentos de

distintos tamaos. Posteriormente se transfieren a una membrana y son detectados

con una sonda de la regin del opern del ADNr (sonda universal). El patrn de

bandas obtenido (ribotipo) variar, en funcin de la cepa en estudio y de las enzimas

utilizadas (De Cesare y col., 2001, Esteban y col., 1993), aumentando as el poder de

discriminacin cuando se utilizan un mayor nmero de enzimas. Esta tcnica, se

estableci a principios de los 90, como una de las ms elegidas para la

caracterizacin genotpica de Salmonella (Fontana y col., 2003, Lagatolla y col., 1996,

Pasquali y col., 2004).

Las secuencias de insercin son elementos repetitivos y conservados de ADN

que se encuentran tanto en bacterias como en clulas eucariotas. La secuencia de

insercin IS200 se encuentra en ms del 90% de los aislamientos del gnero

Salmonella, a excepcin de Salmonella enterica serotipo Agona. Tambin se han

detectado en algunas cepas del gnero Shigella. Al igual que el ribotipado, la

deteccin de la secuencia de insercin IS200 especfica de Salmonella (Gibert y col.,

1990), se basa en la tcnica de hibridacin, en la cual los fragmentos de restriccin se

hibridan con un fragmento de dicha secuencia (Echeita y col., 2001, Sanderson y col.,

1993, Threlfall y col., 1994, Lindqvist y col., 2004, Liu y col., 2003).

1.3.4.4. Electroforesis en campo pulsado

En 1982, Schwartz y Cantor introdujeron el concepto de que molculas de ADN

mayores de 50kb hasta ms all de 10 Mb, podan separarse mediante el uso

alternado de dos campos elctricos (Schwartz y col., 1982, 1984). Hasta ese

momento slo fragmentos de ADN de entre 100 a 200 pares de bases hasta 50kb

eran separados rutinariamente a travs de tcnicas convencionales de electroforesis.

La capacidad de separar fragmentos de pesos distintos en un campo elctrico esttico

31

y continuo, se pierde cuando se trata de separar molculas de gran tamao. Si el

ADN se fuerza a cambiar de direccin durante la electroforesis, fragmentos de

distintos pesos empezarn a separarse entre ellos. Con cada reorientacin del campo

elctrico, los fragmentos de ADN ms pequeos se movern hacia la nueva direccin

ms rpidamente que los fragmentos mayores. Estos se quedarn atrs separndose

de los primeros. Se han descrito distintos modelos que explicaran el comportamiento

del ADN durante la PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis). Entre estos se

encuentran el chain model el bag model (Chu y col., 1991).

La manipulacin del ADN intacto se lleva a cabo mediante la fijacin de todo el

material celular dentro de pequeos bloques de agarosa de bajo punto de fusin. Tras

eliminar los restos celulares, el ADN es digerido por enzimas de restriccin

especficas de corte poco frecuente. La PFGE nos permite analizar un nmero

pequeo de grandes fragmentos frente a un nmero elevado de fragmentos pequeos

con la electroforesis convencional.

Los distintos sistemas utilizados para llevar a cabo la electroforesis en campo

pulsado se pueden clasificar en 2 categoras. La ms sencilla est basada en la

inversin peridica de la polaridad de los electrodos durante la electroforesis, as el

ADN se somete a un ngulo de reorientacin de 180 (Field Inversin Gel

Electrophoresis, FIGE) (Carle, 1986), asegurando la linealidad de los resultados y

simplificando as las comparaciones de los patrones obtenidos. La segunda categora

implica instrumental que reorienta los fragmentos de ADN en ngulos oblicuos (96

hasta 165) resultando en un movimiento en zigzag y hacia delante, produciendo una

separacin ms rpida con un rango mayor de fragmentos en un mismo gel (Birren y

col., 1988). Para asegurar la linealidad de los patrones resultantes, se han diseado

sistemas como el de Contour-clamped Homogeneus ElectricField electrophoresis

(CHEF) (Chu et y col., 1986) o el de Rotating Gel Electrophoresis (RGE) (Serwer y

col., 1990, Southern y col., 1987). El primero utiliza varios electrodos dispuestos

hexagonalmente, con un campo elctrico homogneo y con cambios de direccin del

campo llevados a cabo electrnicamente. En el segundo el campo elctrico est fijado

y se hace rotar el gel para cambiar la direccin del ADN.

32

Esta tcnica fue estandarizada por el CDC (Centers for Disease Control and

Prevention) en el ao 1996, para el programa de vigilancia conocido como PulseNet,

The National Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance, por

su capacidad en la obtencin de patrones de restriccin, su alta especificidad y

reproducibilidad entre los distintos laboratorios permitiendo caracterizar prcticamente

la totalidad de cepas patgenas estudiadas con gran poder de discriminacin

(Swaminathan y col., 2001). Actualmente, se establece como el mtodo de eleccin

para los estudios epidemiolgicos de patgenos, y entre ellos, de Salmonella

Baggesen y col., 2000, Eriksson y col., 2005, Garaizar y col., 2000, Gerri y col.,

2004, Kariuki y col., 1999, Lailler y col., 2002, Lawson y col., 2004, Lindstedt y col.,

2000, Liu y col., 2003, Ridley y col., 1998, Threlfall y col., 1996).

1.3.4.5. Reaccin en cadena de la polimerasa

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), descrita por Kary B. Mullis en

1983 (Mullis y col., 1987) y perfeccionada por Saiki y col. en 1985 y White y col. en

1989, se basa en el reconocimiento y la amplificacin de una fraccin de ADN in vitro

mediante la accin de una ADN-polimerasa termoestable.

La PCR se utiliza para obtener la suficiente cantidad de ADN para su anlisis,

siendo su aplicacin principal el diagnstico. Sin embargo, la PCR per se, no es til

como marcador molecular, aunque es la base de un nmero cada vez mayor de

tcnicas que, a partir de pequeas cantidades iniciales de ADN, permiten amplificar

secuencias al azar (Random Amplified Polymorphic DNA RAPD, Arbitrarily Primed-

PCR AP-PCR, Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP), las ms utilizadas

para la caracterizacin de Salmonella especficas (Simple Sequence Repeats SSR,

Cleaved Amplified Pollymorphic Sequence CAPS).

Entre las PCR de secuencias al azar, el RAPD utiliza oligonucletidos cortos

(10 pb) de secuencias arbitrarias y de baja especificidad, que permiten amplificar

fragmentos pequeos de ADN (Welsh y col., 1990, Williams y col., 1990). La AP-PCR

es esencialmente parecida a la anterior, con la salvedad de que el oligonucletido es

mayor (>20pb), y que combina un ciclo de baja especificidad con ciclos de alta

astringencia. En el caso de la AFLP se utilizan dos enzimas, una de corte frecuente y

33

otra de corte poco frecuente. Los fragmentos obtenidos posteriormente se amplifican

utilizando primers de extremos compatibles con el punto de corte enzimtico

(Janssen y col., 1997). En este caso se utilizan geles de poliacrilamida para la

resolucin de los fragmentos obtenidos.

2. Bacterifagos: propiedades generales

Los bacterifagos fueron descubiertos de forma independiente por los

microbilogos Frederick W. Twort (1915) y Flix dHrelle (1917), siendo la ltima

clase principal de virus en ser descubierta. Los virus de plantas fueron descubiertos

en 1892 por Ivanowski y los animales en 1902 por Loeffler y Frsch. Twort y dHrelle

fueron los primeros en reconocer virus especficos para las bacterias, por lo que

dHrelle los denomin bacterifagos (comedores de bacterias).

The next morning, on opening the, I experienced one of those moments of intense emotion which reward the research worker for all his pains: at the first glance I saw that the culture which the night before had been very turbid, was perfectly clear: all the bacteria had vanished, they had dissolved away like sugar in water. As for the agar spread, it was devoid of all growth and what caused my emotion was that in a flash I had understood: what caused my clear spots was in fact an invisible microbe, a filterable virus, but a virus which is parasitic on bacteria.

Figura 4. Flix dHerelle. Science News 14:4459, 1949

34

A partir de la dcada de 1930, virlogos pioneros como Salvador Luria, Max

Delbrck y muchos otros, utilizaron los fagos como modelo para investigar muchos

aspectos de la Virologa; en general como la estructura de los viriones, la

morfognesis, la gentica y la replicacin. Adems los fagos tambin han sido

tomados como modelo para el estudio de la gentica bacteriana y los mecanismos de

control de la expresin gnica, debido a que los huspedes bacterianos son

fcilmente cultivables y manejables en el laboratorio.

En esta poca preantibitica, se prest una notable atencin a su posible uso

como agentes teraputicos, aunque la terapia fgica slo llego a ser usada de forma

habitual en la Unin Sovitica y Europa del Este (Sulakvelidze y col., 2005). En la

actualidad, debido a la aparicin de patgenos multirresistentes a los antibiticos se

estn retomando los estudios sobre fagoterapia clsica iniciados por Flix dHerelle

(Bruttin y Brssow, 2005), aunque tambin se estn desarrollando nuevas

aproximaciones derivadas directamente del estudio de los sistemas virales

(Sulakvelidze y col., 2005).

Se han descrito cerca de 5500 bacterifagos Caudovirales (fagos con cola)

capaces de infectar a una gran diversidad de huspedes bacterianos (Ackermann,

2006). Los bacterifagos constituyen el sistema biolgico ms simple y abundante de

la naturaleza. Desde un punto de vista estrictamente numrico, los fagos son la forma

de vida ms exitosa, se estima que su poblacin global es de aproximadamente 1031

partculas fgicas sobre la Tierra, coexistiendo en relacin 10/1 con las bacterias a las

que infectan. Se han descubierto fagos capaces de infectar a todos los procariotas

descritos hasta el momento y se han adaptado a todos los nichos ecolgicos. Tal

magnitud de fagos ejerce un importante papel ecolgico, regulando, mediante

transferencia gentica, la evolucin de sus hospedadores y afectando, incluso, los

niveles de materia orgnica en la biosfera. (Brssow y Hendrix, 2002, Chibiani-

Chennoufi y col., 2004, Prescott y col., 1996).

2.1. Clasificacin de los virus (Madigan y col., 2009)

Los virus pueden clasificarse en funcin de los hospedadores que

pueden infectar. As, tenemos virus animales, virus vegetales y virus bacterianos o

35

tambin conocidos como bacterifagos, y tambin segn el cido nucleico que

posean y si la cpside presenta o no una envuelta. (Figura 5).

ADN doble cadena, envueltos:

Lipothrixviridae

Rudiviridae

Fuselloviridae

Sulfolobus SNDV

ADN doble cadena, desnudos:

Podoviridae

Tectiviridae

Corticoviridae

Myoviridae

Siphoviridae

ADN monoctenario, desnudos:

Inoviridae

Microviridae

ARN doble cadena, envueltos:

Cystoviridae

ARN monocatenario, desnudos:

Leviviridae

2.2. Estructura de los bacterifagos

El material gentico se encuentra contenido en la cpsida, de morfologa

polidrica en la mayora de los casos, aunque tambin aparecen cpsidas esfricas y

filamentosas. Muchos bacterifagos poseen una morfologa caracterstica, en la que

la cpsida icosadrica se une a una cola filamentosa. La cola de naturaleza proteica,

sirve como orgnulo de anclaje a la superficie de la clula hospedadora (Figura 6).

Durante la infeccin de una clula bacteriana, la partcula vrica no penetra al

interior celular. El bacterifago inyecta el material gentico a travs de las envolturas

externas de la clula bacteriana.

36

Figura 5. Comparacin de dos tipos bsicos de partculas vricas, virus desnudos y

virus con envoltura (Ilustracin de Microsoft)

Figura 6. Estructura caracterstica de los bacterifagos (Ilustracin de Microsoft)

37

2.3. Ciclo de vida (Figura 7)

2.3.1. Ciclo ltico

Una vez que se produce la interaccin entre un bacterifago y su clula

hospedadora, se introduce el material gentico al interior y se induce la sntesis de los

componentes necesarios para fabricar ms partculas vricas. Posteriormente, los

diferentes componentes han de ser ensamblados en una secuencia determinada. Por

ltimo, las partculas vricas saldrn al exterior de la clula hospedadora por lisis de la

misma.

Esta serie de acontecimientos ocurre en varias etapas que conforman el

denominado ciclo ltico o productivo:

1. Adsorcin

2. Penetracin

3. Sntesis de protenas tempranas

4. Replicacin del material gentico

5. Maduracin

6. Liberacin de los viriones maduros

1. Adsorcin

La infeccin de la clula hospedadora comienza cuando interaccionan al azar

una partcula vrica y una clula. Si esta clula tiene receptores especficos para el

fago, se produce la adsorcin irreversible (Figura 8).

.

Los receptores son molculas que suelen estar situadas a nivel de la pared

celular, aunque tambin hay receptores para fagos situados en apndices, como

flagelos y fimbrias.

38

Los receptores fgicos para la adsorcin varan entre los diferentes grupos de

fagos. Las colas suelen ser los rganos de adsorcin (ms concretamente, las fibras

de la cola).

2. Penetracin

Este proceso ha sido muy estudiado en los fagos de la serie Tpar. Una vez que

se produce la adsorcin de las fibras de la cola, se produce la fijacin de las espculas

de la placa basal a la superficie de la clula bacteriana. Se produce la contraccin de

la vaina y el tubo es empujado hacia abajo.

Cuando el tubo penetra la membrana citoplasmtica, el cido nuclico

contenido en la cabeza del fago es inyectado, quedando la cpsida vaca fuera de la

clula.

3. Sntesis de protenas tempranas

Una vez que el ADN fgico ha llegado al citoplasma bacteriano, se ve sometido

a las enzimas de Restriccin-Modificacin de la bacteria. Parte del ADN se transcribe

hasta ARNm gracias a la ARN Polimerasa de la bacteria.

El ARNm es traducido en los ribosomas bacterianos y los productos (protenas

tempranas, por ser los primeros productos fgicos en aparecer), inhiben la sntesis

macromolecular de la clula.

Ms tarde, se transcriben y traducen otros genes del fago, que originan las

protenas de la cpsida, del tubo, de la cola, etc., adems de ciertas enzimas lticas.

4. Replicacin del acido nuclico del fago

La replicacin del fago depende del tipo de cido nuclico que posea (ADN o

ARN, lineal o circular, bicatenario o monocatenario). En la mayora de los casos, los

ADN lineales se circularizan al entrar en la clula. Esto se logra gracias a la existencia

de extremos cohesivos o por repeticin terminal.

39

La replicacin inicial de un cromosoma vrico circular comienza en un sitio

especfico y se lleva a cabo en ambas direcciones segn el modelo que en un

proceso semejante al de replicacin del cromosoma bacteriano, originndose

cromosomas circulares.

Ms tarde, la replicacin ocurre de acuerdo con el modelo o del crculo

rodante. Se origina una molcula de doble cadena que puede ser mucho ms larga

que el cromosoma viral (concatmeros).

Posteriormente una terminasa corta por las secuencias cos y los cromosomas

vricos se empaquetan en las cpsidas.

En el caso de fagos cuyo material gentico est constituido por ARN, una vez

que ste ha penetrado al interior celular, se copia formando una molcula de doble

cadena (forma replicativa).

La cadena de ARN paterna est marcada como + (se comporta como un

ARNm). La ARN replicasa del virus convierte la cadena paterna en un Intermediario

replicativo bicatenario. La replicasa utiliza el Intermediario bicatenario para la sntesis

de ms cadenas de ARN+

La cadena paterna desplazada y las cadenas de la descendencia, o bien son

incorporadas a los nuevos viriones, o bien son utilizadas por la replicasa para formar

nuevos intermediarios replicativos bicatenarios.

5. Maduracin

Ocurre poco despus de iniciada la replicacin del material gentico. Se

acumulan subunidades de la cpsida y del resto de componentes virales. Las

molculas de cido nuclico se condensan y son encapsidadas. Se produce el

autoensamblaje dirigido por los genes del virus.

6. Liberacin de los viriones maduros

40

Al final de la infeccin, aparece en la clula una protena tarda. Esta protena

(enzimtica) se denomina lisozima fgica. La lisozima acta sobre el glucopptido de

la pared celular, rompiendo enlaces glucosdicos y permitiendo la rotura de la misma.

Una vez rota la pared celular bacteriana, se liberan los fagos recin ensamblados.

El ciclo de infeccin puede volver a iniciarse inmediatamente, por interaccin al

azar de un virin con una clula hospedadora susceptible. Los bacterifagos

virulentos solo pueden realizar el Ciclo ltico o productivo.

41

Figura 7. Ciclo replicativo de un virus bacteriano (Ilustracin de Microsoft)

42

Figura 8. Fijacin de la partcula del bacterifago T4 a la pared celular de E. coli e

inyeccin del DNA (a) Interaccin al azar, (b) Accin de receptores y (c) Fijacin

(Ilustracin de Microsoft)

Figura 9. Reproduccin de un virus (bacterifago) (Ilustracin de Microsoft)

43

Figura 10. Reproduccin de un virus (bacterifago) (Ilustracin de Microsoft)

2.3.2. Ciclo lisognico

Los fagos temperados pueden llevar a cabo, adems del ciclo ltico, el

fenmeno de la lisogenia (Figura 9). Estos fagos, una vez inyectado el ADN en el

interior de la clula hospedadora, pueden integrar su material gentico en el

cromosoma de la bacteria, replicndose en sincrona con el hospedador, el cual

sobrevive y se divide normalmente. En este caso los genes vricos integrados en el

cromosoma bacteriano, estn reprimidos y no se expresan. El ADN fgico integrado

en el cromosoma bacteriano recibe el nombre de profago. En circunstancias

adecuadas, se produce la desrepresin de los genes vricos y se produce un ciclo

ltico.

En una clula infectada por un fago temperado ocurren tres procesos muy

ligados en el tiempo:

1. Transcripcin y traduccin del genoma vrico. Esta fase origina la sntesis de

protenas tempranas, entre las cuales hay uno o ms tipos de represores que inhiben

la replicacin y la expresin gnica de los virus, lo que permite el ciclo lisognico.

2. Comienzo de la replicacin del virus.

3. Entrada en estado de profago de uno de los genomas replicados.

El que una clula hospedadora sufra un ciclo ltico o un ciclo lisognico depende del

pulso entre el represor y el proceso de maduracin del fago. Si se producen viriones

44

maduros (y lisozima fgica) antes de que el represor pueda actuar, la clula se lisar.

Si por el contrario, se acumula el represor bloqueando la expresin gnica y la

replicacin del virus, la clula quedar Lisogenizada (Figura 10).

Caractersticas de las clulas lisogenizadas

A partir de una clula lisogenizada, se origina un clon lisognico. En cada una

de las clulas de este clon se encuentra el fago en forma de profago.

Mientras dura el estado de lisogenia, las clulas no eliminan viriones, ni presentan

ninguna protena estructural del virin.

Las clulas infectadas (lisogenizadas) por un fago (Profago) son inmunes a la

infeccin por el mismo fago. Si las clulas lisognicas adsorben partculas vricas de

un fago diferente, se dice que estn superinfectadas.

Bajo determinadas condiciones ambientales el profago se escinde, pasando a

un estado independiente, multiplicndose y originando la lisis celular. A este

fenmeno se le conoce como Induccin y como consecuencia del mismo se origina un

ciclo ltico.

Pueden aparecer fenmenos de conversin fgica debido a que algunos de los

genes virales no quedan reprimidos, y por tanto se expresan, confiriendo a la bacteria

algunas caractersticas fenotpicas que antes no tena. Esto mismo puede ocurrir en el

caso de que la insercin del profago haga que se expresen genes bacterianos que

antes no lo hacan (genes crpticos).

2.4. Bacterifagos de Salmonella Enteritidis

Desde 1997 al 2001 han sido fagotipados 10.049 aislamientos de Salmonella

Enteritidis de origen humano en Europa. Los fagotipos ms comunes en este perodo

fueron PT4 y PT1 (Figura 11), considerando el 35% y 16% de todos los casos,

respectivamente. En los viajeros que vuelven de la mayora de los pases de Europa

Occidental, PT4 era el fagotipo dominante. En Europa Oriental, PT1 era el

dominante, y este fagotipo tambin era comn entre viajeros que vuelven de la

45

Pennsula ibrica. PT8 pareca ser ms comn entre los viajeros que vuelven de los

pases europeos centrales (Nygrd y col., 2004).

Figura 11. Distribucin de fagotipos de Salmonella Enteritidis notificados en Suecia,

1997 a 2002 (Nygrd y col., 2004)

2.5. Evolucin fgica

Los fagos pudieron haber evolucionado de organismos auto-replicativos que

hubieran perdido la maquinaria necesaria para llevar a cabo la traduccin y con ella la

posibilidad de realizar procesos metablicos, obligndolos a convertirse as en

parsitos estrictos. Otra teora alternativa hace referencia a un ancestro comn, que

se hubiera desarrollado como un elemento gentico extracelular proveniente del

hospedador, y que habra adquirido los genes necesarios para proteger su DNA de la

degradacin, primero dentro de la clula y posteriormente fuera de ella. Este origen

bacteriano de algunos fagos, est respaldado por la existencia de secuencias de DNA

en los genomas de las bacterias que parecen tener caractersticas comunes en

cuanto a estructura y organizacin genmica al DNA fgico.

Si bien el origen de los fagos es incierto, el mecanismo por el cual evolucionan

es ms conocido. La forma clsica de evolucin gentica, por medio de mutaciones

46

puntuales en genes que dan como resultado protenas adaptables a distintas

funciones, es la ms aceptada. Pero podra existir adems, otro poderoso mecanismo

de evolucin fgica que se conoce con el trmino de evolucin modular. Esta teora,

propuesta por Botstein (1980), considera que los genomas de los bacterifagos,

incluidos los que nos ocupan, estn organizados en unidades funcionales

multignicas conocidas como mdulos. Estos mdulos codifican funciones biolgicas

concretas, como puede ser la construccin de la cpsida o el establecimiento de la

lisogenia y seran intercambiables, de forma que pueden ser traspasados de unos

fagos a otros potenciando as el proceso evolutivo (Botsein, 1980; Brssow y Desiere,

2001).

2.6. Tipificacin fgica de Salmonella Enteritidis

Los estudios epidemiolgicos de esta infeccin, han determinado la

clasificacin de los diferentes aislamientos de Salmonella Enteritidis en fagotipos (FT),

tomando en consideracin ciertas caractersticas como su virulencia y patogenicidad.

La metodologa de fagotipificacin es la misma en todo el mundo, ya que utiliza los

mismos bacterifagos y es ampliamente utilizada para la clasificacin de aislamientos

de Salmonella que pertenecen a la misma serovariedad. La utilizacin de la

fagotipificacin para propsitos epidemiolgicos, se basa en asumir que los

aislamientos que pertenecen al mismo fagotipo tienen relacin epidemiolgica entre

s, mientras que aislamientos de diferente fagotipo carecen de esa relacin; adems

las serovariedades deben demostrar una alta estabilidad dentro de la poblacin y con

el paso del tiempo (Mancera Martnez y col., 2004).

Actualmente, el mtodo de tipificacin bacteriana de Salmonella Enteritidis ms

utilizado corresponde a la tipificacin fgica, lo que se explica por su estandarizacin,

la facilidad de montaje y porque la mayor parte de los aislados son tipificables y,

adems, los resultados son fcilmente reproducibles. Su limitacin ms importante

radica en su baja capacidad discriminatoria debido a la predominancia de unos pocos

fagotipos en una poblacin bacteriana.

La tipificacin fgica de aislados nacionales de S. Enteritidis es de inters

debido a que esta tcnica de marcacin ha estado restringida a unos pocos pases,

47

en su mayor parte desarrollados. Ello ha impedido conocer cules poblaciones

bacterianas estn involucradas en las nuevas zonas afectadas. Ms an, esta tcnica

de marcacin podra indicar si solo unos pocos fagotipos estn asociados con la

actual epidemia o si, como se sospecha, varios tipos podran estar circulando a partir

de diferentes fuentes infectantes. Adems, la comparacin de aislados clnicos,

alimentarios y avcolas podra mostrar la relacin epidemiolgica de estos. Por ltimo,

la comparacin de los fagotipos que actualmente circulan con los que se han

observado en pocas anteriores podra indicar el posible origen local de la epidemia o

su importacin del exterior (Prat y col., 2001).

Existen, fundamentalmente, dos tipos de bacterifagos: los salvajes o silvestres

que se encuentran en la naturaleza. Dentro de stos existe una variedad que son los

bacterifagos adaptados. Estos ltimos son especficos para un tipo determinado de

Salmonella. Se pens, en un principio, que stos eran mutadores de la clula

husped, pero ms tarde se vio que eran los propios fagos los que sufran

modificaciones al ser enfrentados en varias ocasiones a una misma cepa, de forma

que se hacan activos frente a cepas que en un principio no lisaban (Ward y col.,

1987). Otro tipo son los conocidos como Lisognicos que forman parte de la

estructura gentica de la bacteria. La situacin de lisogenia es una forma especial de

interaccin virus-husped, basada en la asociacin ntima del ADN vrico y bacteriano.

Existe un entrecruzamiento entre el ADN del virus y el ADN bacteriano, empleando el

mismo mecanismo de rotura y recombinacin observado en la recombinacin

gentica. Slo presentan poder ltico frente a su clula husped si sufren algn tipo de

modificacin gentica.

Existen, fundamentalmente, dos tcnicas de fagotipia (ISO, 1995; 2000; 2001):

- Directa: Consistente en el aislamiento de bacterifagos salvajes de la naturaleza y

su posterior aplicacin a un conjunto de cepas que se desean estudiar.

- Indirecta: Consistente en la induccin de bacterifagos de las propias cepas y, una

vez transformados en lticos, formar con ellos un juego de fagotipia para las cepas a

estudiar.

48

OBJETIVOS

49

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la eficacia de la fagotipia como marcador epidemiolgico

complementario para cepas de Salmonella Enteritidis.

OBJETIVOS COMPLEMENTARIOS

1. Aislar y purificar bacterifagos de cepas de Salmonella Enteritidis de aguas del ro

Lujn.

2. Determinar los ttulos de los bacterifagos a travs de Routine Test Dilution (RTD)

3. Establecer los correspondientes grupos de especificidad entre las cepas de S.

Enteritidis y los fagos hallados.

4. Evaluar los perfiles genticos, por PFGE, de S. Enteritidis representativas de los

grupos de especificidad surgidos a fin de evaluar los clones circulantes.

50

MATERIALES

Y

MTODOS

51

1. Toma de muestras de agua

Se tomaron un total de 120 muestras de agua, a razn de 10 mensuales,

durante un ao. Las mismas se obtuvieron segn la tcnica del hisopo de Moore con

60 minutos de exposicin a la corriente de agua (Anselmo y col., 1999; Guinea y col.,

1979). Fueron cultivadas dentro de las 2 h del momento de su extraccin.

Simultneamente se determin la temperatura del agua en cada toma de muestra.

Cuatro puntos de los mrgenes del ro Lujn, confinados en los de mayor

poblacin urbana fueron los sitios de muestreo elegidos. Surgieron de la evaluacin

estadstica de los resultados obtenidos durante investigaciones anteriores realizadas

en el ro Lujn durante los aos 1987 a 1993 donde se obtuvo mayor positividad de

muestras as como mayor cantidad de serovariedades detectadas / muestra.

2. Cepas de Salmonella Enteritidis

Procedencia y origen de las cepas

Las cepas de Salmonella Enteritidis seleccionadas para este trabajo

procedieron de la coleccin de cepas de Salmonella existentes en el Laboratorio de

Microbiologa de la Universidad Nacional de Lujn conservadas en caldo nutritivo con

7 g/L de agar-agar a temperatura ambiente. Las mismas han sido aisladas en trabajos

anteriores desde 1987 a 1993 e identificadas en su oportunidad.

Distribucin de las cepas en grupos

Se seleccionaron un total de 86 cepas de Salmonella Enteritidis, pertenecientes

a siete grupos. Estos son:

- GRUPO PRIMERO: Formado por 23 cepas de Salmonella Enteritidis

seleccionadas entre todas las serovariedades de Salmonella existentes en

el Laboratorio de Microbiologa de la Universidad Nacional de Lujn. Fueron

aisladas de aguas del ro Lujn durante el perodo comprendido de 1987 a

52

1990, de investigaciones anteriores (Anselmo y col., 1989; 1991a; 1999).

Tabla 3.

- GRUPO SEGUNDO: Formado por 6 cepas de Salmonella Enteritidis

procedentes de vescula biliar de uno de cinco terneros fallecidos en el

tambo de la Universidad Nacional de Lujn, con sintomatologa

caracterstica de salmonelosis, de noviembre de 1988 (Anselmo y col.,

1991c). Tabla 4.

- GRUPO TERCERO: Formado por 25 cepas procedentes de la investigacin

de un brote de origen alimentario ocurrido en un comedor escolar de la

ciudad de Lujn, provincia de Buenos Aires, con unas cuarenta personas

afectadas, en marzo de 1990 (Anselmo y col., 1990). Tabla 5.

- GRUPO CUARTO: Formado por 8 cepas provenientes del estudio de otro

brote de origen alimentario acontecido en una panadera y confitera de la

ciudad de Gral. Rodrguez, provincia de Buenos Aires, con unas diecisis

personas afectadas, por ingesta de mayonesa casera utilizada para la

confeccin de sndwiches de miga, en octubre de 1990 (Anselmo y col.,

1991b). Tabla 6.

- GRUPO QUINTO: Integrado por 13 cepas procedentes de una intoxicacin

masiva en una rotisera de la ciudad de Lujn al confeccionarse ensalada

rusa y mayonesa de ave, ambas con mayonesa de elaboracin casera, con

unas 200 personas afectadas, en diciembre de 1991 (Anselmo y col., 1993).

Tabla 7.

- GRUPO SEXTO: 6 cepas provenientes del estudio de un brote familiar en la

ciudad de Lujn, debido a mayonesa casera utilizada para confeccionar

ensalada rusa, con nueve personas afectadas, en setiembre de 1993

(Anselmo y col., 1995, Viora y col., 1994). Tabla 8.

- GRUPO SPTIMO: 5 cepas de Salmonella Enteritidis procedentes de casos

espordicos sucedidos en la ciudad de Lujn desde noviembre de 2009 a

53

diciembre de 2010, provistas por la Dras. Graciela A. Ruzo de Maggiotto,

Florencia Sparapani y Susana Ferrarotti de sus Laboratorios de Anlisis

Clnicos as como del Hospital Nuestra Seora de Lujn y de la Clnica

Gemes de la ciudad de Lujn.

Tabla 3. Grupo Primero. Datos Epidemiolgicos

N cepa Ao aislamiento Sitio de muestreoa

12988

13088

42188

42288

47088

47188

84788

175588

175688

176688

176788

176888

176988

180988

174790

175390

177290

32195

32495

1987

1987

1988

1988

1988

1988

1988

1988

1988

1988

1988

1988

1988

1988

1989

1989

1990

1989

1989

C

C

C

C

A

A

C

B

B

C

C

C

C

B

B

C

A

A

A

54

32595

40995

41195

49195

1989

1989

1989

1989

A

Arroyo El Haras

Arroyo El Haras

A

aA = 2 Km aguas arriba de la zona urbana, B = Planta urbana y C = 2 Km aguas abajo de la zona urbana.

Tabla 4. Grupo Segundo. Datos Epidemiolgicos

N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote

177088

177188

177288

177388

177488

177588

1988

1988

1988

1988

1988

1988

Vescula biliar

Vescula biliar

Vescula biliar

Vescula biliar

Vescula biliar

Vescula biliar

Tambo U.N.Lu.

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Tabla 5. Grupo Tercero. Datos Epidemiolgicos

N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote

60490

60590

60690

60790

60890

60990

61090

61190

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

Heces asintom. 1

Heces asintom. 1

Heces asintom. 2

Heces asintom. 2

Heces enf. 3

Heces enf. 4

Heces enf. 5

Heces enf. 6

Comedor escolar

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

55

61290

61390

61490

61590

61690

61790

61890

61990

62090

62190

62290

62390

62490

62590

62690

62790

62890

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

1990

11990

1990

Heces enf. 7

Canilla bao

Canilla bao

Inodoro

Inodoro

Freezer

Freezer

Mesada cocina

Mesada cocina

Mesa cocina

Mesa cocina

Mesa comedor

Mesa comedor

Helado c/envoltorio

Helado c/envoltorio

Pata pollo cocido

Pata pollo cocido

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Tabla 6. Grupo Cuarto. Datos Epidemiolgicos

N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote

183490

183590

183690

183790

183890

1990

1990

1990

1990

1990

Jamn cocido

Jamn cocido

Mayonesa casera

Mayonesa casera

Paredes int. Heladera

Panaderia

dem

dem

dem

dem

56

183990

184090

184190

1990

1990

1990

Paredes int. Heladera

Estantes cm. Frigor.

Estantes cm. Frigor.

dem

dem

dem

Tabla 7. Grupo Quinto. Datos Epidemiolgicos

N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote

230791

230891

230991

231091

231191

231291

231391

231491

231591

231691

231891

231991

232091

1991

1991

1991

1991

1991

1991

1991

1991

1991

1991

1991

1991

1991

Inodoro

Inodoro

Inodoro

Vaso Licuadora

Vaso Licuadora

Vaso Licuadora

Heces cocinera asintom.

Heces cocinera asintom.

Heces enf. 1

Heces enf. 1

Heces enf. 2

Heces enf. 3

Heces enf. 3

Rotiseria

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Idem

Tabla 8. Grupo Sexto. Datos Epidemiolgicos

N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote

182693

182793

182893

1993

1993

1993

Clara de huevo

Clara de huevo

Heces enf. 1

Familiar

Idem

Idem

57

182993

183093

183193

1993

1993

1993

Heces enf. 1

Heces enf. 2

Heces enf. 2

Idem

Idem

Idem

Tabla 9. Grupo Sptimo. Datos Epidemiolgicos

N cepa Ao aislamiento Origen muestra Casos espordicos

706

756

6182

508091

194110

2009

2009

2010

2010

2010

Heces enf. 1

Heces enf. 2

Heces enf. 3

Heces enf. 4

Heces enf. 5

Lujn

Lujn

Lujn

Lujn

Lujn

3. Enriquecimiento de bacterifagos salvajes

3.1. Se evaluaron 36 cepas de Salmonella Enteritidis (todas las del grupo

primero y un 22% de las cepas representativas de los grupos segundo al sexto), un

pool de 3 mensuales (McLaughlin y col., 2006). A cada uno de los 10 hisopos de

Moore se les adicion 100 mL de Phage Assay Broth (PAB) (Kott, 1966; Oliver Graves

1964) y 1 mL de cultivo en PAB de cada una de las tres S. Enteritidis de 24 h a 35C

y se incub durante 15 horas a 35C (McLaughlin y Brook, 2008).

3.2. Para la descontaminacin se trasvasaron 10 mL de cultivo a un tubo de

15 x 150 mm con tapa a rosca y se aadieron 5 mL de cloroformo. Se agit

enrgicamente 60 segundos y se conservaron a 4C (Daz y col., 1995).

4. Confirmacin (Adams, 1959)

Para comprobar la presencia de bacterifagos, en 5 mL de PAB blando (0,7%

agar) fundido y templado a 50 2C se incorpor 0,5 mL de un cultivo de la cepa

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propagadora en 10 mL de PAB de 24 h a 35C. Se homogeniz en vortex (Fbr by

Decalab S.R.L.) y se verti en placa de 15 cm de dimetro, conteniendo 15 mL de

PAB slido (1,3% agar) desparramando la mezcla uniformemente sobre la superficie

del agar y evitando la presencia de burbujas de aire. Se dej solidificar y se sec la

superficie de la placa a 35C durante 30 minutos, con la tapa sacada y la superficie

del agar hacia abajo e inclinada. A continuacin se colocaron 10 L del cultivo

enriquecido de bacterifago. Se dej la placa sin invertir 30 min a temperatura

ambiente para que se absorba la alcuota. Se incub en la habitual posicin invertida

durante 4 a 15 horas a 35C efectuando lecturas a intervalos frecuentes (McLaughlin y

Brook, 2008). La presencia del bacterifago se visualiza en la aparicin de calvas o

placas de lisis.

5. Criterio de seleccin de bacterifagos

Se realiz de acuerdo a los criterios propuestos por (Anderson y Williams, 1956).

Estos se basan fundamentalmente en tres factores:

a) El tamao de las placas de lisis:

1. Placas grandes l.

2. Placas normales n.

3. Placas pequeas s.

4. Placas diminutas m.

5. Placas micro visibles tan solo con lupa de 10 aumentos.

b) El nmero de placas de lisis:

1. De O a 5 placas, se indica el nmero de las mismas.

2. De O a 20 placas, se pone

3. De 21 a 40 placas, se pone +

4. De 41 a 60 placas, se pone + +

5. De 61 a 80 placas, s