UNIVERSIDAD NACIONAL DE LUJAN
EVALUACIN DE LA EFICACIA DE LA
FAGOTIPIA COMO MARCADOR
EPIDEMIOLGICO COMPLEMENTARIO PARA
CEPAS DE SALMONELLA ENTERITIDIS
AISLADAS EN LA CIUDAD DE LUJN
Autor: Ricardo J. Anselmo
Directora: Hebe A. Barrios
2012
2
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Hebe Alicia Barrios por su apoyo, estmulo y direccin
en el trabajo.
A la Doctora Mara Ins Caffer por su colaboracin en el diseo del
plan de esta tesis y por la identificacin antignica de las cepas de
Salmonella.
A la Doctora Mariana Pichel por la caracterizacin molecular de las
cepas.
A las Dras. Graciela A. Ruzo de Maggiotto, Florencia Sparapani y
Susana Ferrarotti por el aporte de cepas de presuntas Salmonella
Enteritidis procedentes de enfermos.
A todos mis compaeros de las asignaturas de Microbiologa
General y Agrcola de la Universidad Nacional de Lujn por los aos de
trabajo compartidos.
Y muy especialmente a Ricardo, que me ha apoyado siempre y por
su ayuda en la toma de muestras.
A todos ellos muchas gracias.
3
I N D I C E
Pgina
INTRODUCCIN 9 1. El microorganismo: Salmonella Enteritidis 11 1.1. La enfermedad: Salmonelosis 11 1.1.1. Historia 11
1.1.2. Ecologa 14 1.1.3. Salmonelosis humana 15 1.2. Epidemiologa de la salmonelosis 16 1.2.1. Distribucin geogrfica 16 1.2.2. Prevalencia 17 1.2.3. Situacin epidemiolgica de la salmonelosis en Argentina 19 1.3. Identificacin y caracterizacin del gnero Salmonella 21 1.3.1. Caractersticas generales 21 1.3.2. Aislamiento 22 1.3.3. Caracterizacin fenotpica 23 1.3.3.1. Perfil bioqumico 23 1.3.3.2. Serotipo 25 1.3.3.3. Fagotipia 26 1.3.3.4. Antibiorresistencia 27 1.3.4. Caracterizacin genotpica 28
4
1.3.4.1. Perfil plasmdico 28 1.3.4.2. Patrones de restriccin cromosmica 29 1.3.4.3. Tcnicas de hibridacin 30 1.3.4.4. Electroforesis en campo pulsado 30 1.3.4.5. Reaccin en cadena de la polimerasa 32 2. Bacterifagos: propiedades generales 33 2.1. Clasificacin de los virus 34 2.2. Estructura de los bacterifagos 35 2.3. Ciclo de vida 37 2.3.1. Ciclo ltico 37 2.3.2. Ciclo lisognico 43 2.4. Bacterifagos de Salmonella Enteritidis 44 2.5. Evolucin fgica 45 2.6. Tipificacin fgica de Salmonella Enteritidis 46 OBJETIVOS 48 MATERIALES Y MTODOS 50 1. Toma de muestras de agua 51 2. Cepas de Salmonella Enteritidis 51 3. Enriquecimiento de bacterifagos salvajes 57 4. Confirmacin 57 5. Criterio de seleccin de bacterifagos 58 6. Purificacin de los bacterifagos 59
5
7. Determinacin del ttulo del bacterifago 60 8. Conservacin de los cultivos 61 9. Tcnica de fagotipia 61 10. Determinacin de grupos de especificidad entre las cepas de Salmonella Enteritidis y los fagos hallados 62 11. Caracterizacin molecular de Salmonella Enteritidis 62 12. Morfologa de los bacterifagos aislados 62 ANEXO: MEDIOS DE CULTIVO E HISOPO DE MOORE 63 RESULTADOS 65 1. Bacterifagos de procedencia salvaje 66 1.1. Aislamiento de bacterifagos salvajes 66 1.1.1. Cepas de Salmonella Enteritidis 66 1.1.2. Muestras de agua 66 1.1.3. Aislamiento de bacterifagos salvajes 66 1.2. Criterio de eleccin de los bacterifagos salvajes
aislados 66 1.2.1. Primera seleccin 66 1.2.2. Segunda seleccin 75 1.2.3. Tercera seleccin 76 1.2.4. Cuarta seleccin 80 1.2.5. Seleccin final de los bacterifagos salvajes 81 2. Determinacin del ttulo del bacterifago 82
6
3. Fagotipificacin 83 4. Grupos de especificidad 83 5. Caracterizacin molecular de Salmonella Enteritidis 94 6. Morfologa de los bacterifagos aislados 95 DISCUSIN 98 CONCLUSIONES 105 BIBLIOGRAFA 107 FOTOGRAFAS 123 NDICE DE FIGURAS Figura 1. Salmonella Enteritidis: aumento porcentual en las infecciones humanas, Europa y EEUU, 1981-2000 (OMS) 17 Figura 2. Serovariedades ms frecuentes de Salmonella spp. de origen humano, Argentina, 2000 2006 20 Figura 3. Serovariedades ms frecuentes de Salmonella spp. de origen animal, Argentina, 2000 2006 20 Figura 4. Flix d`Herelle. Science News 14:44-59, 1949 33 Figura 5. Comparacin de dos tipos bsicos de partculas vricas, virus desnudos y virus con envoltura 36 Figura 6. Estructura caracterstica de los bacterifagos 36 Figura 7. Ciclo replicativo de un virus bacteriano 41 Figura 8. Fijacin de la partcula del bacterifago T4 a la pared celular de E. coli e inyeccin del DNA 42 Figura 9. Reproduccin de un virus (bacterifago) 42 Figura 10. Reproduccin de un virus (bacterifago) 43
7
Figura 11. Distribucin de fago tipos de Salmonella Enteritidis notificados en Suecia , 1997 a 2002 45 Figura 12. Electroforesis en campo pulsado de las cepas de Salmonella Enteritidis seleccionadas 95 NDICE DE TABLAS Tabla 1. Especies y subespecies del gnero Salmonella y subgrupos correspondientes 14 Tabla 2. Algunos ejemplos de serotipos y sus frmulas antignicas 26 Tabla 3. Grupo primero. Datos Epidemiolgicos 53 Tabla 4. Grupo segundo. Datos Epidemiolgicos 54 Tabla 5. Grupo tercero. Datos Epidemiolgicos 54 Tabla 6. Grupo cuarto. Datos Epidemiolgicos 55 Tabla 7. Grupo quinto. Datos Epidemiolgicos 56 Tabla 8. Grupo sexto. Datos Epidemiolgicos 56 Tabla 9. Grupo sptimo. Datos Epidemiolgicos 57 Tabla 10. Primera seleccin de bacterifagos salvajes con estabilidad ltica 69 Tabla 11. Tercera seleccin de bacterifagos salvajes: Grupo A 78 Tabla 12. Tercera seleccin de bacterifagos salvajes. Bacterifagos seleccionados 79 Tabla 13. Seleccin final de bacterifagos salvajes 82 Tabla 14. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Primero 84 Tabla 15. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Segundo 86
8
Tabla 16. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Tercero 87 Tabla 17. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Cuarto 89 Tabla 18. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Quinto 90 Tabla 19. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Sexto 91 Tabla 20. Fagotipia de S. Enteritidis del Grupo Sptimo 92 Tabla 21. Contitucin de los grupos de especificidad 93
9
INTRODUCCIN
10
El Ro Lujn nace en la confluencia de los arroyos Durazno y Los Leones en la
localidad de Suipacha, a los 59 0 37 de long. Oeste y a los 34 0 43 54 de lat. Sur,
y luego avanza, encauzado en una cuenca, atravesando las zonas de Mercedes,
Lujn, Pilar y Dique Lujn, desaguando en el Ro de la Plata al norte de la localidad
de Tigre. Segn un informe elevado por la Municipalidad de Mercedes, provincia de
Buenos Aires, de un relevamiento de la cuenca del Ro Lujn realizado en 2005 las
causas ms frecuentes de contaminacin del Ro Lujn se deben a: surgencia de
lquidos cloacales y saturacin de pozos negros, microbasurales no autorizados,
efluentes industriales, inundaciones, efluentes cloacales sin tratamiento, proliferacin
de roedores y perros vagabundos (Municipalidad de Mercedes, Informe 2005).
Este trabajo es la continuacin de ocho estudios realizados desde 1987 a 1993
(Anselmo y col., 1989; 1990; 1991a; 1991b; 1991c; 1993; 1995; 1999), donde en total
se aislaron e identificaron bioqumica y antignicamente 95 cepas de Salmonella
Enteritidis. La serotipificacin se realiz en el Servicio Enterobacterias, Departamento
Bacteriologa, del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (I.N.E.I), de la
Administracin Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (A.N.L.I.S.) Dr. Carlos
G. Malbrn.
En lo que respecta a la determinacin de salmonelas a partir de aguas del ro
Lujn, se pueden resumir en tres estudios realizados desde 1987 a 1990, el primero
se bas en un anlisis comparativo de tcnicas de deteccin de Salmonella en aguas
superficiales donde se determin la presencia de serovariedades de Salmonella en
aguas del Ro Lujn, en la zona urbana de la ciudad homnima, de la provincia de
Buenos Aires. En el mismo se realiz un estudio comparativo de cuatro mtodos de
deteccin a partir de 200 muestras de dicho ro. Las muestras fueron tomadas a
travs de la tcnica de la torunda de Moore en tres sitios de muestreo: uno en la
planta urbana, otro a 2 Km. aguas arriba de la misma y el ltimo a 2 Km. aguas abajo
de la ciudad. Las torundas se sumergieron en el ro hasta 20 cm de la superficie
durante 60 min, 1 da y 7 das. La mejor combinacin de medios de enriquecimiento y
de aislamiento estuvo dada por el caldo Rappaport-Vassiliadis y agar verde brillante
con 0,25% de desoxicolato de sodio, luego de preenriquecer las muestras en agua
peptona fosfato. As mismo, el mayor rendimiento en lo que respecta al nmero de
11
muestras recuperadas y la frecuencia de aislamientos de Salmonella se logr a los 60
min de exposicin de las torundas en el curso de agua (Anselmo y col., 1989).
El segundo consisti en cuantificar esta enterobacteria en aguas del Ro Lujn
a fin de tener una estimacin del grado de contaminacin del ro mencionado donde
se analizaron 36 muestras de agua desde junio 1989 a mayo 1990, el 75 % de las 36
muestras contenan esta enterobacteria mediante la tcnica del Nmero Ms
Probable; la ms alta incidencia de Salmonella se hall en el sitio de muestreo
localizado en el centro de la ciudad, con 460 NMP/L y se encontraron 19
serovariedades, la ms frecuente fue S. Enteritidis, siguiendo en orden decreciente S.
Anatum, S. Bovismorbificans y S. Lindenburg (Anselmo y col., 1991).
En el tercer trabajo publicado, se determinaron las serovariedades de
Salmonella predominantes en el Ro Lujn durante el perodo febrero de 1988 a
diciembre de 1989 donde se analizaron 690 muestras de agua de tres sitios de
muestreo, las mismas se obtuvieron segn la tcnica de Moore y se aislaron
Salmonella spp. en 434 muestras (62,9 %). La serovariedad predominante fue S.
Anatum, siguiendo en orden decreciente S. Montevideo, S. Newport y S. Bredeney.
Se encontr un nmero de serovariedades que se aslan con muy baja frecuencia y
muy espordicamente en el pas: S. Westhampton, S. Poona y S. Saintpaul (Anselmo
y col., 1999).
1. El microorganismo: Salmonella Enteritidis
La exposicin del microorganismo Salmonella serotipo Enteritidis se har, en
este trabajo, de forma global con el resto de los serotipos que constituyen el gnero
Salmonella, ya que este serotipo no presenta ninguna excepcin a las caractersticas
generales del gnero al que pertenece.
1.1. La enfermedad: Salmonelosis
1.1.1. Historia
12
Salmonella spp fue observada inicialmente en el ao 1880 por Karl Joseph
Eberth (1835-1926) en cortes histolgicos de muestras de bazo y ndulos linfticos
mesentricos procedentes de personas fallecidas por fiebre tifoidea. Posteriormente,
fue descrita por Daniel Elmer Salmon (1850-1914) y Theobald Smith (1859-1934), en
el ao 1885, a partir de una cepa aislada de cerdo con Peste Porcina Clsica (Salmon
y col., 1886). El bacterilogo francs Joseph Lon Marcel Lignires (1868-1933)
sugiri en 1900 que estas bacterias se llamaran Salmonella, en honor a Salmon.
La clasificacin y consiguiente nomenclatura del gnero Salmonella es an, hoy
en da, muy controvertida, utilizndose distintos sistemas para referirse a los
miembros de este gnero. La terminologa introducida por White en 1929 y modificada
por Kauffmann en 1966, estableca un tipo especfico para cada cepa de Salmonella
que fuera distinguible antignicamente (equivalente al actual serotipo), teniendo en
cuenta el polimorfismo de los antgenos somticos (O) y flagelares (H), atribuyendo en
un inicio a cada tipo el nombre del lugar donde se aisl por primera vez. La propuesta
de Kauffmann implicaba que cada tipo era en realidad una nueva especie. La primera
lista publicada contena unos 20 nombres, hoy el nmero de serotipos sobrepasa
ampliamente los 2000.
Mediante mtodos de hibridacin ADN-ADN se demostr que las cepas de
Salmonella formaban un solo grupo de hibridacin, con 7 subgrupos o subgneros
(Crosa y col., 1973), distinguibles entre s fenotpicamente. Los subgneros
propuestos pertenecan as a una misma especie, que posteriormente recibi el
nombre de Salmonella choleraesuis (Le Minor y col., 1982, 1986). Esta denominacin
sin embargo se prestaba a confusin, debido a la existencia del serotipo Choleraesuis
que adems mostraba un perfil bioqumico distinto al de la mayora. Le Minor y Popoff
en en ao 1987 propusieron que los 7 subgneros (I, II, IIIa, IIIb, IV, V y VI) definidos
13
anteriormente, fueran considerados subespecies. Recomendaron adems, el cambio
de nombre de la especie Salmonella choleraesuis por el de Salmonella enterica
(publicado por Penner, 1988). La propuesta fue denegada por parte de la Comisin
Judicial del Comit Internacional de Bacteriologa Sistemtica, al considerarse que
Salmonella Typhi podra pasar desapercibida. En 1989, Revees y col. elevaron al
rango de especie a la hasta entonces Salmonella choleraesuis subespecie bongori,
pasando a ser as, la segunda especie del gnero (Tabla 1). Euzby, en el ao 1999,
propuso una enmienda para adoptar la nomenclatura de especie enterica que tuviera
en cuenta la excepcin del serotipo Typhi, pasando a denominarse Salmonella typhi.
Al da de hoy, esta propuesta contina pendiente de resolucin.
Aunque contina sin definirse una frmula concreta para la nomenclatura de
Salmonella, la Organizacin Mundial de la Salud adopt la denominacin de
Salmonella enterica y Salmonella bongori como nicas especies del gnero, y la
subsiguiente divisin en subespecies (o subgrupos fenotpicamente distintos) de S.
enterica como: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV)
e indica (VI). Los serotipos o serovariedades, siguiendo el esquema de Kauffmann-
White, se escriben al final sin cursiva y con la inicial en mayscula, o bien si carecen
de nombre, aadiendo su frmula antignica.
14
Tabla 1. Especies y subespecies del gnero Salmonella y subgrupos correspondientes (Crosa y col., 1973, Popoff y col., 2001)
1. Salmonella enterica
1.1 Salmonella enterica subesp. enterica (subgrupo I) 1.2 Salmonella enterica subesp. salamae (subgrupo II) 1.3 Salmonella enterica subesp. arizonae (subgrupo IIIa) 1.4 Salmonella enterica subesp. diarizonae (subgrupo IIIb) 1.5 Salmonella enterica subesp. houtenae (subgrupo IV) 1.6 Salmonella enterica subesp. indica (subgrupo VI) 2. Salmonella bongori (subgrupo V)
*International Journal of Systematic and Evolutionari Microbiology
1.1.2. Ecologa El principal hbitat de Salmonella es el tracto intestinal de humanos y animales
homeotermos y poiquilotermos (puede formar parte de la flora natural de reptiles y
anfibios). Existen serotipos adaptados al husped como S. Typhi (hombre), S. Abortus
ovis (oveja) o S. Gallinarum (aves), entre otros, aunque la mayora son ubiquitarios.
Los principales reservorios son los animales de abasto (tanto de carne roja como
aves), y en menor medida las aves silvestres, roedores, insectos, peces, moluscos,
tortugas y otros. En general, todo alimento es susceptible de ser contaminado por
efluentes fecales. Salmonella se disemina en el medio natural a travs de excreciones
humanas y animales, sin multiplicarse de forma significativa, aunque puede sobrevivir
durante semanas en agua y durante aos en suelo en condiciones favorables de
temperatura, humedad y pH (Acha y col., 2001, Betancor y col., 2010, Janda y col.,
2006).
El gnero Salmonella es uno de los principales causantes de enfermedades
transmitidas a travs de agua y alimentos. Es comn encontrar Salmonella en aves de
corral, en la cscara de huevos crudos, y en carne roja. En concreto, el problema que
supone la presencia de Salmonella en las aves de corral y en las cscaras de huevo
se atribuye bsicamente a las prcticas utilizadas en este tipo de explotaciones.
Salmonella es adems un posible contaminante en operaciones de transporte de
animales de abasto, y consecuentemente de la carne durante el sacrificio.
15
Uno de los serotipos de Salmonella ms importantes transmitidos a travs del
agua es Salmonella Typhi, aunque con frecuencia son salmonelas no tifoideas,
productoras de procesos patolgicos menos graves, las responsables de los brotes
epidmicos por esta va de transmisin (Madigan y col., 1996). El tratamiento del agua
destinada al consumo pblico ha disminuido la incidencia de Salmonella en todo el
mundo. As, los brotes epidmicos estn a menudo relacionados con fallas en la
depuracin, por contaminacin cruzada entre tuberas de la red y aguas residuales,
inundaciones, efluentes de industrias crnicas o explotaciones ganaderas.
1.1.3. Salmonelosis humana
La salmonelosis puede presentar variedad de cuadros clnicos en funcin del
serotipo implicado en el proceso y de la especificidad de husped (Pier y col., 1998),
entre ellos cuadros de gastroenteritis, fiebre entrica, septicemia, y raramente
encefalitis (Martin y col., 1994). Los nios, ancianos, enfermos y/o personas
inmunodeprimidas son los que presentan las manifestaciones clnicas ms graves. A
ello hay que aadir la existencia de portadores asintomticos. En general, los
serotipos Typhi y Paratyphi A, B y C producen fiebre entrica en humanos (fiebre
tifoidea y paratifoidea, respectivamente); el serotipo Choleraesuis produce septicemia
o infecciones localizadas en cerdo; los serotipos Enteritidis, Typhimurium o Newport
producen gastroenteritis en humanos y animales, frecuentemente agudas pudiendo
variar de leves a fulminantes (Caffer., 2007).
La fiebre entrica o tifoidea, la ms grave de las salmonelosis humanas, cursa
con fiebre, malestar, anorexia, mialgias, cefalea, dolor abdominal y/o diarrea
dependiendo de la magnitud del inculo ingerido. Puede aparecer tambin tos y
epistaxis. Los sntomas se agravan y se presenta fatiga, letargia y desorientacin,
pudiendo aparecer a la semana exantema maculoso o maculopapuloso. Sin
tratamiento la letalidad llega al 10% (Maskalyk, 2003, Parry y col., 2002). En el caso
de las salmonelas no tifoideas, la gastroenteritis, es el ms comn de los cuadros
clnicos. La infeccin sobreviene por la ingestin de alimentos contaminados y es
clnicamente indistinguible de otras gastroenteritis producidas por otros patgenos
gastrointestinales. Aproximadamente 48 h despus de la ingestin se inicia un cuadro
16
de dolor abdominal con vmito y diarrea en cantidad moderada, con sangre, moco y
tenesmo rectal, acompaado de fiebre y/o cefaleas y mialgias. Normalmente se
autolimita al cabo de 4-8 das. Ocasionalmente requiere rehidratacin parental y
hospitalizacin (Abe y col., 2004, Grisaru-Soen y col., 2004).
1.2. Epidemiologa de la salmonelosis
1.2.1. Distribucin geogrfica
La salmonelosis es la toxiinfeccin alimentaria transmitida a travs de
productos y subproductos de origen animal ms importante en los pases
desarrollados. Su seguimiento y control se ha convertido en una cuestin prioritaria de
salud pblica. En Europa se declaran una media de 73 casos por cada 100.000
habitantes, con una variacin de entre 1,8 a 136 casos dependiendo del mtodo
diagnstico, la comunicacin de los datos y los hbitos culinarios de cada pas. Se
estima sin embargo que la cifra real est alrededor de los 450 casos por cada 100.000
habitantes (Berends y col., 1998), causando 3 muertes por cada milln de habitantes.
El CDC en Estados Unidos comunic en 2001 una media de 400 muertes por
salmonelosis al ao (Voetsch y col., 2004).
En el ao 2000, la OMS fund la Global Salm-Surv (WHO-GSS) para reducir el
peso y a la vez, el efecto global que representan las enfermedades de origen
alimentario, mediante la recopilacin de la informacin obtenida en los laboratorios de
referencia de cada pas. Estos datos se analizaron para detallar la distribucin global
de los serotipos de Salmonella en muestras tanto humanas como no humanas.
Cuarenta y siete de los 138 pases pertenecientes a esta organizacin en todo el
mundo enviaron datos del perodo 2000-2002, de un total de casi 300.000 casos de
salmonelosis humanas y poco ms de 65.000 no humanas (Espaa, Francia,
Holanda, Gran Bretaa, e Irlanda fueron algunos de los ausentes a nivel Europeo). En
general, los serotipos ms comunes distribuidos en los 5 continentes son Enteritidis
(63%), Typhimurium (14%) y Newport (2,6%) en muestras de origen humano y
Typhimurium (22,3%), Heidelberg (9,3%) y Enteritidis (8,9%) en las de origen no
humano. Salmonella Typhimurium en muestras humanas es el serotipo ms frecuente
en Oceana, frica y Amrica del Norte, mientras que Enteritidis lo es en Europa,
17
Amrica del Sur y Asia (Galanis y col., 2004). En la Argentina, al igual que en el resto
de Latinoamrica y el Caribe, los serotipos ms frecuentes son Enteritidis (39%) y
Typhimurium (17%) (WHO, 2000-2005).
Figura 1. Salmonella Enteritidis: aumento porcentual en las infecciones humanas
Europa y EEUU, 1981-2000 (OMS)
Tomado de: (Almeida, 2001)
1.2.2. Prevalencia
La infeccin debida a serovariedades no tficas de Salmonella spp. representa
un problema de salud pblica nacional e internacional, que se ha agudizado con la
apertura econmica y la globalizacin, debido a que el consumo de carne de pollo,
huevos y subproductos se ha incrementado en todo el mundo, existe sustancialmente
un mayor riesgo de infeccin (Le Minor, 1992). Casi todas las canales de aves pueden
estar infectadas; el nmero de microorganismos puede ser bajo en un principio y
aumentar como resultado del manejo. Los huevos se pueden contaminar por
transmisin vertical (transovrica), durante la postura o durante la manipulacin o el
almacenamiento. La infeccin en los seres humanos se adquiere por consumo de
18
pollo, huevo crudo o parcialmente cocido, o alimentos preparados con estos (Lax y
col., 1995).
Un dramtico incremento de la salmonelosis en humanos producida
especficamente por S. Enteritidis, ocurri a finales de la dcada de 1980 y principios
de la dcada de 1990 (Rodrigue y col., 1990). En 1995 del total de informes
recopilados por los sistemas de vigilancia de los pases miembros de la OMS se
encontr que 76.1% de los aislamientos correspondieron a la S. serovariedad
Enteritidis, Typhimurium, y Typhi. S. Enteritidis fue ms frecuente en 35 pases
seguido por S. Typhi (12 pases) y S. Typhimurium (8 pases). Las principales
serovariedades aisladas globalmente para 1995 incluyeron Enteritidis, Typhimurium,
Hadar, Infantis, Newport, Typhi, Agona, Virchow y Heidelberg. Los aislamientos de S.
Enteritidis se aumentaron de 25.6% en 1990 a 36.5% para el ao de 1995 (Herikstad
y col., 2002). En Mxico, en un estudio retrospectivo, se identificaron 199
serovariedades, fue la ms frecuente en muestras clnicas S. Enteritidis (20.4%) y, en
segundo lugar, S. Typhimurium (18.3%) (Gutirrez-Cogco y col., 2000).
El incremento de stas y de otras serovariedades es el resultado de una
combinacin de factores que se relacionan con el desarrollo en la industrializacin en
todas las fases de produccin de alimentos en lo que se destacan cambios en las
prcticas de manejo, almacenamiento, distribucin y preparacin. Estas variaciones
han tenido como consecuencia nuevos problemas en la higiene de los alimentos al
originar una fcil diseminacin de Salmonella spp., as como de otros grmenes
patgenos (Acha y Szyfres, 2001).
El aumento del comercio y distribucin de productos de origen avcola
posiblemente han contribuido al incremento de la diseminacin y transmisin de
Salmonella. Los alimentos contaminados con este microorganismo tienen un impacto
directo sobre la salud de las colectividades, no slo debido al patgeno, sino
frecuentemente por la presencia de antimicrobianos que pueden contribuir a la
aparicin de cepas resistentes a estos antimicrobianos (Prat y col., 2001).
En Dinamarca el programa de control de Salmonella en ponedoras comerciales
y pollos parrilleros entre 1996 y 2002 logr reducir la incidencia de Salmonella en
19
humanos y aves. La incidencia de la infeccin en ponedoras comerciales declin de
13.4% en 1998 hasta 2.6% en 2002; para el ao 2003 la incidencia fue 2.3%. Los
estudios de Weneger y col., 2003 estimaron que para el ao 2001 el programa de
control de Salmonella en Dinamarca permiti ahorrar alrededor 25,5 millones de
dlares.
1.2.3. Situacin epidemiolgica de la salmonelosis en Argentina
En la Argentina, segn el Boletn Epidemiolgico Peridico de 2006, las 5
serovariedades prevalentes, en el perodo 2004-2005 fueron: Salmonella Enteritidis
(36.0%), S. Typhimurium (20.5%), S. Infantis (8.7%), S. Newport (5.3%) y S. Agona
(4.9%); siguiendo la misma tendencia que en los aos 2002-2003, donde S. Enteritidis
(30,3 %) ocup tambin el primer lugar, seguida por S. Typhimurium (12.8%) y S.
Infantis (11.5 %), mientras que se invirti el orden de frecuencia con respecto a S.
Agona (11.3%) y S. Newport (6.5%).
Entre todos los aislamientos analizados, se identificaron 43 serovariedades,
entre las cuales S. Enteritidis (36.0%) fue la ms ampliamente distribuida y se
encontr con mayor frecuencia en la mayora de las jurisdicciones. S. Typhimurium
(20.5%) ocup el primer lugar en Crdoba, fue la segunda serovariedad en Buenos
Aires, Ciudad Autnoma de Buenos Aires, Mendoza, Ro Negro y Santa Fe y se
encontr tambin, en menor frecuencia en otras provincias. Tanto S. Newport como S.
Agona estuvieron distribuidas en el pas, en 12 y 11 jurisdicciones respectivamente.
20
Figura 2. Serovariedades ms frecuentes de Salmonella spp. de origen humano, Argentina, 2000 - 2006
Tomado de: Caffer, 2007
Figura 3. Serovariedades mas frecuentes de Salmonella spp. de origen
animal, Argentina, 2000-2006
Tomado de: Caffer, 2007
21
1.3. Identificacin y caracterizacin del gnero Salmonella
1.3.1. Caractersticas generales
El gnero Salmonella se sita dentro de la familia Enterobacteriaceae, Phylum
Proteobacteria. Salmonella es un bacilo acapsular, de 2-4 m de largo por 0,6 m de
ancho, que muestra colonias de entre 2 y 3 mm de dimetro, de color blanco-gris y
textura viscosa, cuando se aslan en placas de agar-sangre durante 24 h a 37C.
Este gnero se caracteriza por tener requerimientos nutricionales muy
sencillos, siguiendo un modelo de fermentacin cido-mixta. La mayora de cepas son
prototrficas, aunque algunas cepas principalmente husped-especficas, necesitan la
adicin en el medio de factores de crecimiento (auxotrficas): uno o ms aminocidos
o vitaminas.
Los miembros del gnero Salmonella, si bien acordes con las caractersticas
que definen la familia a la que pertenecen, se caracterizan por no formar butilenglicol,
producir cido y eventualmente gas a partir de la fermentacin de la glucosa, de
manitol y casi siempre de sorbitol. Tambin por ser ureasa y fenilalanina desaminasa
negativos, aunque positivos para lisina y ornitina descarboxilasas. Son indol negativo
y citrato positivo, y no fermentan ni la sacarosa ni el adonitol. En medio TSI (Triple
Sugar Iron) Salmonella produce normalmente H2S. No crece en medio con cianuro de
potasio y salvo pocas excepciones (S. Gallinarum, S. Pullorum) Salmonella es mvil
por disponer de flagelos pertricos, mostrando la mayora de las cepas variacin
difsica de los antgenos flagelares (Madigan y col., 1996).
La temperatura ptima de crecimiento para Salmonella es de 35 a 37C,
aunque crece dentro de un intervalo de 7 a 54C, y el pH ptimo se sita entre 7-7,5,
pudiendo crecer entre 4,1 y 9. Salmonella crece en alimentos con valores de actividad
de agua del 0,93, aunque el valor ptimo se sita en 0,995. No crece a valores por
debajo de 0,93, aunque el tiempo de supervivencia puede durar meses. Sobrevive a
la refrigeracin, a la congelacin y a ambientes secos. Es sensible a la mayora de
22
desinfectantes y se destruye a altas temperaturas (60C durante 2 3 minutos).
Puede sobrevivir meses fuera de su hospedador.
1.3.2. Aislamiento
El aislamiento de Salmonella se realiza mediante mtodos de cultivo
tradicionales, que consisten en pre-enriquecimiento en medio lquido no selectivo,
enriquecimiento en medios lquidos selectivos y aislamiento sobre medios slidos
selectivos.
Los medios de pre-enriquecimiento, como pueden ser el agua de peptona
tamponada (APT), el caldo universal (UB) o el medio M9 (APS) son necesarios para
muestras con una carga bacteriana presumiblemente baja (portadores tratados,
muestras ambientales, entre otros). La eficacia de estos medios vara dependiendo de
su capacidad tampn (Hoofar y col., 1998). Por otro lado, el uso de estos medios en
muestras fecales no est tan claro, incluso se cree que pueden ser contraproducentes
(Aho, 1992). Hoy, sin embargo el uso de pre-enriquecimiento se propone como
prctica comn en el aislamiento de Salmonella en muestras fecales de cerdo,
aunque su eficacia no est suficientemente probada (Davies y col., 2000, Hoofar y
col., 1998).
El enriquecimiento en medios lquidos selectivos permite, de forma competitiva,
la proliferacin de Salmonella hasta niveles que la hacen detectable en medios
slidos al cabo de aproximadamente 24 h. Ejemplos de caldos enriquecidos son
Rappaprt-Vassiliadis (RV), Caldo selenito o Caldo tetrationato. El caldo RV es
posiblemente el ms utilizado, y hay que tener en cuenta que los caldos selenito y
tetrationato pueden inhibir el crecimiento de algunos serotipos auxotrficos de
Salmonella. La eleccin de uno u otro mtodo en funcin de su mayor eficacia o
sensibilidad, contina siendo hoy tema de estudio (Michael y col., 1999, Nollet y col.,
2001). Tambin se han desarrollado medios semislidos como posible alternativa al
caldo de enriquecimiento, como el medio semislido Rappaport-Vassiliadis modificado
(MSRV), o el medio DIASALM. Ambos medios aprovechan, por un lado, la propiedad
selectiva de RV y, por otro, la motilidad que caracteriza a la mayora de cepas de
23
Salmonella (Davies y col., 2001, Hoofar y col., 2000, Nollet y col., 2001, Voogt y col.,
2001).
Los medios slidos selectivos y/o diferenciales para Salmonella, se basan tanto
en la inhibicin del crecimiento de otras bacterias entricas, como en la discriminacin
visual de las colonias. A menudo se utilizan tanto la produccin de H2S como la no
fermentacin de lactosa como caractersticas diferenciales para dicha discriminacin
visual. Dentro de este grupo, existe una variedad de medios, con mayor o menor
especificidad para aislar cepas de Salmonella. Podemos destacar los siguientes como
los ms comnmente utilizados: agar MacConkey, xilosa-lisina-desoxicolato (XLD),
xilosa-lisina-tergitol 4 (XLT4), Hektoen-Enteric (HE), Rambach (Ra), Salmonella-
Shigella (SS), agar verde brillante novobiocina-glicerol-lactosa (NBGL), identificacin
de Salmonella SM-ID (SM), CHROMagar (CAS), ABC mdium, o COMPASS
Salmonella agar, entre otros.
Existen numerosos estudios que comparan la sensibilidad y especificidad de
unos medios con otros. En cualquier caso los mejores resultados se dan, para
cualquier medio, despus del proceso de enriquecimiento (Dusch y col., 1995, Gaillot
y col., 1999, Maddocks y col., 2002, Ruz y col., 1996,).
1.3.3. Caracterizacin fenotpica
Como ya es sabido, el fenotipo es la expresin del genotipo y ello es lo que lo
convierte en un mtodo til para caracterizar las distintas especies de un mismo grupo
de microorganismos. Aunque el desarrollo de la biologa molecular ha abierto nuevas
y mejores posibilidades para la caracterizacin y el posterior estudio de la taxonoma
y epidemiologa bacteriana, los resultados obtenidos con tcnicas de caracterizacin
fenotpica como pueden ser el perfil bioqumico, el serotipo, el fagotipo, o el perfil de
antibiorresistencia, les confieren un valor como herramientas complementarias tiles
para el marcaje epidemiolgico.
1.3.3.1. Perfil bioqumico
24
El perfil bioqumico confirma la identidad de Salmonella frente a otras
enterobacterias que hayan podido ser aisladas, conjuntamente, en los medios
selectivos. La determinacin del perfil bioqumico se establece como tcnica de
identificacin, ya que se trata de una caracterstica distintiva y estable, capaz de
diferenciar a la mayora de gneros del grupo de las enterobacterias (Farmer y col.,
1985). As pues, la determinacin del perfil bioqumico es el paso siguiente al
aislamiento.
Las pruebas bioqumicas tradicionalmente se han llevado a cabo mediante una
serie de medios especficos como son: agar hierro tres azcares, agar citrato de
Simmons, medio SIM (Sulfhdrico-Indol-Movilidad), pruebas de Ureasa, Oxidasa,
Catalasa, Voges-Proskauer, fenilalanina desaminasa, entre otras, para detectar y
visualizar en ellos una serie de resultados clave en la identificacin de Salmonella.
Las tcnicas sistematizadas de identificacin de microorganismos se basan
principalmente en la realizacin simultnea de determinadas pruebas bioqumicas en
formato miniaturizado. As, tenemos por ejemplo procedimientos manuales como el
sistema API (bioMrieux Inc., Durham, NC), con un perodo de identificacin estimado
de 21 horas, y los sistemas automticos de identificacin, como puede ser Vitek
(bioMrieux), con tiempos de identificacin de entre 4 y 18 horas. Estas tcnicas, que
han evolucionado rpidamente desde su aparicin (Stager y col., 1992), han
aumentado la eficacia de la identificacin de los mtodos tradicionales, introduciendo
un mayor nmero de pruebas bioqumicas especficas. As, en el caso de Vitek se
pueden alcanzar porcentajes de entre el 98 y el 99% de identificacin positiva a las 8
horas (OHara y col., 1993, Visser y col., 1992), frente a identificaciones positivas con
un error estimado de ms del 20% en el caso de mtodos tradicionales.
El perfil bioqumico de Salmonella es estable para la mayora de los serotipos
pertenecientes a los 7 subgrupos identificados. El subgrupo I (subespecie enterica)
que engloba aproximadamente al 60% de los serotipos descritos, los cuales
representan prcticamente la totalidad de los aislamientos de muestras clnicas
(Brenner y col., 2000), se caracteriza bioqumicamente por utilizar el citrato como
nica fuente de carbono, y ser argininadihidrolasa, lisina y ornitina positivo. Este
subgrupo consta de al menos 5 excepciones al perfil tpico: los serotipos Typhi,
25
Choleraesuis, Paratyphi A, Gallinarum y Pullorum. Ninguno de estos 5 serotipos es
capaz de utilizar el citrato, con la excepcin del serotipo Choleraesuis, con un 25 % de
cepas positivas. Con respecto a la presencia de enzimas, el serotipo Paratyphi A es
negativo para lisina decarboxilasa. Todos son prcticamente negativos para arginina
dihidrolasa, exceptuando el serotipo Choleraesuis en el que est presente en un 55 %
de los casos. Los serotipos Typhi y Gallinarum son ambos negativos para ornitina
decarboxilasa (Farmer y col., 1985). Se observan, adems, diferencias en el
porcentaje de fermentacin de algunos azcares entre estos serotipos y los del resto
del subgrupo I de Salmonella.
1.3.3.2. Serotipo
El serotipado permite diferenciar cepas del gnero Salmonella mediante la
determinacin de su composicin antignica: antgenos somticos (O), antgenos
flagelares (H), que mayoritariamente constan de 2 fases (H1 y H2), siendo sta una
caracterstica exclusiva del gnero, y para ciertos serotipos, el antgeno capsular (Vi)
(Tabla 2).
La identificacin de los serotipos se basa en el esquema propuesto por
Kauffman y White (Popoff y col., 1997), incluyendo slo los antgenos de superficie de
importancia diagnstica (Le Minor y col., 1984). As, a cada Salmonella se le asigna
una frmula antignica determinada, habindose identificado un total de 2.541
serotipos hasta el ao 2002 (Centers for Disease Control and Prevention, 2004).
La frmula antignica se representa mediante una combinacin de nmeros y
letras. A modo de ejemplo, la frmula antignica de Salmonella Typhimurium es
1,4,5,12:i:1,2. En primer lugar, aparecen los antgenos O separados por comas. En
ocasiones alguno de estos nmeros figura entre corchetes, lo que significa que no
siempre est presente. A continuacin, para aquellos serotipos que lo presentan,
aparece el antgeno capsular, separado de los anteriores tambin por comas. Y,
finalmente separados de los anteriores mediante dos puntos, los antgenos flagelares,
cuyas fases se separan asimismo por dos puntos. La primera fase (H1) se representa
con letras minsculas, aunque los nuevos antgenos descubiertos tienen asignados
valores del tipo: z6, z10, etc. La segunda fase (H2) se represent inicialmente con
26
nmeros arbigos, aunque hoy los nuevos antgenos se representan con letras
(Popoff y col., 2001). Los antgenos flagelares pueden presentarse de forma
monofsica en algunas cepas, de manera que no expresan la segunda fase flagelar y
se representa con el signo -. Existen cepas monofsicas que pueden presentar
ocasionalmente la segunda fase flagelar, opcionalmente en la frmula figura el signo
- bien el antgeno entre corchetes. Aunque el serotipado no es una tcnica
rutinaria en los laboratorios de diagnstico, es una referencia obligada en los estudios
de salmonelosis.
Tabla 2. Algunos ejemplos de serotipos y sus frmulas antignicas (CDC, 2004,
Espigares y col., 2002)
Serotipos Antgenos Somticos y flagelares Frmula Antignica
O H1 H2
S. Paratyphi A
S. Paratyphi B
S. Typhimurium
S. Virchow
S. Typhi
S. Enteritidis
S. Pullorum(2)
1,2,12
1,4,[5],12
1,4,[5],12
6,7
9,12,[Vi]
1,9,12
1,9,12
a
b
i
r
d
g,m
-
[1,5]
1,2
1,2
1,2
-
[1,7]
-
S. I(1)
1,2,12:a:- 1,2,12:a:[1,5]
S. I 1,4,[5],12:b:1,2
S. I 1,4,[5],12:i:1,2
S. I 6,7:r:1,2
S. I 9,12,[Vi]:d:-
S. I 1,9,12:g,m:- 1,9,12:g,m:[1,7]
S. I 1,9,12:-:-
(1) abreviatura de Salmonella enterica subespecie enterica (o subgrupo I)
(2) serotipo inmvil
1.3.3.3. Fagotipia
Las cepas pertenecientes a un mismo serotipo de Salmonella, pueden
diferenciarse en funcin de sus patrones de sensibilidad, frente a un grupo
seleccionado de bacterifagos. El fagotipo o lisotipo es de gran valor en el estudio
epidemiolgico de Salmonella, ya que existe un alto porcentaje de correlacin entre
fagotipo y origen epidmico. Aunque algunos de los recursos serolgicos pueden
utilizarse para distinguir cepas de serotipos como Typhimurium, las diferencias se
27
evaluarn con mayor precisin mediante el fagotipado (Rabsch y col., 2002),
permitiendo ampliar la informacin necesaria para establecer posibles relaciones
epidemiolgicas.
Los serotipos Typhi, Paratyphi A y B, Typhimurium y Enteritidis han sido los
ms fagotipados desde un inicio. Existen ms de 100 fagotipos distintos de S. Typhi
(Craigie y col., 1938) y se han identificado hasta el momento ms de 300 para S.
Typhimurium (Anderson y col., 1977, Callow, 1959), de los cuales ms de 200 son
fagotipos definitivos (DTs) (Liebana y col., 2002). Se han desarrollado, adems,
esquemas de fagotipado para otros serotipos de importancia clnica: Braenderup
(Sechter y col., 1968), Newport (Petrow y col., 1974), Virchow (Chambers y col., 1987)
o Agona (Tyc, 1990) entre otros.
En general, al igual que el serotipado, la tcnica de fagotipado, no se lleva a
cabo de forma rutinaria en todos los laboratorios, pero se establece como marcador
epidemiolgico complementario al serotipado. De hecho, a raz de la caracterizacin
de la cepa pentarresistente de S. Typhimurium DT104 en el Reino Unido (Low y col.,
1997, Threlfall y col., 1994) y los EEUU (Angulo F, 1997, Glynn y col., 1998), el
fagotipo ha pasado a formar parte de la taxonoma de este serotipo para la mayora
de estudios de caracterizacin de cepas (Briggs y col., 1999, Lan y col., 2003,
Libana y col., 2002, Wray y col., 1998).
1.3.3.4. Antibiorresistencia
La aparicin de antibiorresistencias en Salmonella, y otras bacterias
zoonticas, est ligada al abuso de antibiticos como tratamiento teraputico y
promotor de crecimiento en el ganado (Schroeder y col., 2002, Witte, 1998). Esto ha
producido una inevitable seleccin de cepas resistentes de la flora comensal y
patgena de los animales. Posiblemente por ello, los niveles de antibiorresistencia de
la flora comensal del intestino en humanos se han visto tambin incrementados (van
den Bogaard y col., 2000).
En la adquisicin de resistencias frente a antimicrobianos estn implicados
numerosos mecanismos relacionados con elementos genticos mviles (de
28
transmisin horizontal): plasmidos, transpsones e integrones, jugando estos un papel
importante en la diseminacin (Davies, 1994).
Conocer los niveles de resistencia a antimicrobianos de Salmonella es de
inters tanto sanitario como epidemiolgico. Las tcnicas utilizadas para determinar
antibiorresistencias se clasifican en general, en manuales (mtodos de difusin y
mtodos de dilucin) y semiautomticas/automticas (Ej. MiniAPI, Vitek System o
Walkway System). La mayora de estas tcnicas determinarn si la bacteria es
resistente o sensible frente a la accin de un determinado antimicrobiano, existiendo
adems un valor de sensibilidad intermedio, cuya interpretacin en clnica supondr la
adopcin de distintas actuaciones frente a la infeccin como por ejemplo las dosis a
suministrar. Las pruebas de sensibilidad por mtodos de dilucin adems, permiten
determinar las concentraciones mnimas inhibitorias (CMI), con lo cual se obtiene una
medida in vitro ms precisa de la actividad de un antimicrobiano.
Establecer un perfil de antibiorresistencia es una prctica comn, sencilla,
rpida y accesible para la caracterizacin de cepas de Salmonella en estudios
epidemiolgicos. Un patrn de resistencias similar puede indicar cierta clonalidad,
siempre y cuando las cepas en estudio sean geogrficamente cercanas. Aunque las
resistencias hayan sido transferidas de forma horizontal, se ha demostrado en
Salmonella Typhimurium DT104 la integracin de ciertas antibiorresistencias a nivel
cromosmico (Briggs y col., 1999, Threlfall y col., 1994).
1.3.4. Caracterizacin genotpica
La ingeniera gentica y la biologa molecular nos permiten conocer y estudiar
el genoma de las bacterias para su ordenacin y clasificacin, de acuerdo a un criterio
mucho ms amplio que el obtenido a travs de los mtodos de caracterizacin
fenotpica. Los mtodos de caracterizacin genotpica disponen en general de mayor
poder de discriminacin, reproducibilidad y tipabilidad que los mtodos fenotpicos,
aunque estos ltimos sean de gran inters por su mayor sencillez, rapidez, y en
general, menor costo.
1.3.4.1. Perfil plasmdico
29
Los plsmidos son fragmentos de ADN circular, que pueden replicarse
autnomamente dentro de la bacteria, funcionando como vectores de clonacin y
permitiendo la transmisin horizontal de resistencias o de factores de virulencia, entre
otros.
El perfil plasmdico (nmero y tamao de plsmidos) de un microorganismo
permite su caracterizacin y la deteccin de similitudes y diferencias entre cepas,
pudiendo utilizarse como marcador epidemiolgico.
La mayora de mtodos utilizados para la extraccin de plsmidos son kits
comerciales de purificacin (Gibco BRL, QIAGEN, etc.) basados, mayoritariamente,
en los mtodos descritos por Birnboim y col. en 1979 y Kado y col. en 1981.
Para la caracterizacin, el estudio y la vigilancia epidemiolgica de Salmonella,
la determinacin del perfil plasmdico es casi rutinaria junto a determinados mtodos
fenotpicos y, como mnimo, a algn otro mtodo genotpico de anlisis cromosmico
(Echeita y col., 2001, Gebreyes y col., 2002, Libana y col., 2002, Lindqvist y col.,
2004, Ridley y col., 1998).
1.3.4.2. Patrones de restriccin cromosmica
La tcnica RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) descrita por Kan
y Dozy en 1978, se basa en la deteccin de fragmentos de ADN de distinto peso
molecular, despus de someterlo a un proceso de digestin con una enzima de
restriccin determinada. Dependiendo de si la enzima utilizada es de corte frecuente o
no, obtendremos mayor o menor nmero de fragmentos. Inicialmente se utilizaron
enzimas de restriccin de corte frecuente que proporcionaban patrones de restriccin
electroforticos con un gran nmero de bandas. La tecnologa RFLP se utiliza como
primer paso en los mtodos de hibridacin como el IS200-RFLP (Jeoffreys y col.,
2001) entre otros y se considera variante del mtodo PCR, cuando se aplica a una
secuencia conocida de ADN amplificada, es decir, PCR-RFLP (Allen y col., 2002,
Kisiela y col., 2005, Lauri y col., 2011).
30
1.3.4.3. Tcnicas de hibridacin
En general, para la caracterizacin de cepas de Salmonella las tcnicas de
hibridacin ms utilizadas son el ribotipado y la deteccin de la secuencia de insercin
IS200. El ribotipado se basa en el estudio del polimorfismo de patrones de restriccin
de genes muy conservados de ARN ribosmico y secuencias asociadas. El ADN se
extrae de la bacteria y se corta, mediante enzimas de restriccin, en fragmentos de
distintos tamaos. Posteriormente se transfieren a una membrana y son detectados
con una sonda de la regin del opern del ADNr (sonda universal). El patrn de
bandas obtenido (ribotipo) variar, en funcin de la cepa en estudio y de las enzimas
utilizadas (De Cesare y col., 2001, Esteban y col., 1993), aumentando as el poder de
discriminacin cuando se utilizan un mayor nmero de enzimas. Esta tcnica, se
estableci a principios de los 90, como una de las ms elegidas para la
caracterizacin genotpica de Salmonella (Fontana y col., 2003, Lagatolla y col., 1996,
Pasquali y col., 2004).
Las secuencias de insercin son elementos repetitivos y conservados de ADN
que se encuentran tanto en bacterias como en clulas eucariotas. La secuencia de
insercin IS200 se encuentra en ms del 90% de los aislamientos del gnero
Salmonella, a excepcin de Salmonella enterica serotipo Agona. Tambin se han
detectado en algunas cepas del gnero Shigella. Al igual que el ribotipado, la
deteccin de la secuencia de insercin IS200 especfica de Salmonella (Gibert y col.,
1990), se basa en la tcnica de hibridacin, en la cual los fragmentos de restriccin se
hibridan con un fragmento de dicha secuencia (Echeita y col., 2001, Sanderson y col.,
1993, Threlfall y col., 1994, Lindqvist y col., 2004, Liu y col., 2003).
1.3.4.4. Electroforesis en campo pulsado
En 1982, Schwartz y Cantor introdujeron el concepto de que molculas de ADN
mayores de 50kb hasta ms all de 10 Mb, podan separarse mediante el uso
alternado de dos campos elctricos (Schwartz y col., 1982, 1984). Hasta ese
momento slo fragmentos de ADN de entre 100 a 200 pares de bases hasta 50kb
eran separados rutinariamente a travs de tcnicas convencionales de electroforesis.
La capacidad de separar fragmentos de pesos distintos en un campo elctrico esttico
31
y continuo, se pierde cuando se trata de separar molculas de gran tamao. Si el
ADN se fuerza a cambiar de direccin durante la electroforesis, fragmentos de
distintos pesos empezarn a separarse entre ellos. Con cada reorientacin del campo
elctrico, los fragmentos de ADN ms pequeos se movern hacia la nueva direccin
ms rpidamente que los fragmentos mayores. Estos se quedarn atrs separndose
de los primeros. Se han descrito distintos modelos que explicaran el comportamiento
del ADN durante la PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis). Entre estos se
encuentran el chain model el bag model (Chu y col., 1991).
La manipulacin del ADN intacto se lleva a cabo mediante la fijacin de todo el
material celular dentro de pequeos bloques de agarosa de bajo punto de fusin. Tras
eliminar los restos celulares, el ADN es digerido por enzimas de restriccin
especficas de corte poco frecuente. La PFGE nos permite analizar un nmero
pequeo de grandes fragmentos frente a un nmero elevado de fragmentos pequeos
con la electroforesis convencional.
Los distintos sistemas utilizados para llevar a cabo la electroforesis en campo
pulsado se pueden clasificar en 2 categoras. La ms sencilla est basada en la
inversin peridica de la polaridad de los electrodos durante la electroforesis, as el
ADN se somete a un ngulo de reorientacin de 180 (Field Inversin Gel
Electrophoresis, FIGE) (Carle, 1986), asegurando la linealidad de los resultados y
simplificando as las comparaciones de los patrones obtenidos. La segunda categora
implica instrumental que reorienta los fragmentos de ADN en ngulos oblicuos (96
hasta 165) resultando en un movimiento en zigzag y hacia delante, produciendo una
separacin ms rpida con un rango mayor de fragmentos en un mismo gel (Birren y
col., 1988). Para asegurar la linealidad de los patrones resultantes, se han diseado
sistemas como el de Contour-clamped Homogeneus ElectricField electrophoresis
(CHEF) (Chu et y col., 1986) o el de Rotating Gel Electrophoresis (RGE) (Serwer y
col., 1990, Southern y col., 1987). El primero utiliza varios electrodos dispuestos
hexagonalmente, con un campo elctrico homogneo y con cambios de direccin del
campo llevados a cabo electrnicamente. En el segundo el campo elctrico est fijado
y se hace rotar el gel para cambiar la direccin del ADN.
32
Esta tcnica fue estandarizada por el CDC (Centers for Disease Control and
Prevention) en el ao 1996, para el programa de vigilancia conocido como PulseNet,
The National Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance, por
su capacidad en la obtencin de patrones de restriccin, su alta especificidad y
reproducibilidad entre los distintos laboratorios permitiendo caracterizar prcticamente
la totalidad de cepas patgenas estudiadas con gran poder de discriminacin
(Swaminathan y col., 2001). Actualmente, se establece como el mtodo de eleccin
para los estudios epidemiolgicos de patgenos, y entre ellos, de Salmonella
Baggesen y col., 2000, Eriksson y col., 2005, Garaizar y col., 2000, Gerri y col.,
2004, Kariuki y col., 1999, Lailler y col., 2002, Lawson y col., 2004, Lindstedt y col.,
2000, Liu y col., 2003, Ridley y col., 1998, Threlfall y col., 1996).
1.3.4.5. Reaccin en cadena de la polimerasa
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), descrita por Kary B. Mullis en
1983 (Mullis y col., 1987) y perfeccionada por Saiki y col. en 1985 y White y col. en
1989, se basa en el reconocimiento y la amplificacin de una fraccin de ADN in vitro
mediante la accin de una ADN-polimerasa termoestable.
La PCR se utiliza para obtener la suficiente cantidad de ADN para su anlisis,
siendo su aplicacin principal el diagnstico. Sin embargo, la PCR per se, no es til
como marcador molecular, aunque es la base de un nmero cada vez mayor de
tcnicas que, a partir de pequeas cantidades iniciales de ADN, permiten amplificar
secuencias al azar (Random Amplified Polymorphic DNA RAPD, Arbitrarily Primed-
PCR AP-PCR, Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP), las ms utilizadas
para la caracterizacin de Salmonella especficas (Simple Sequence Repeats SSR,
Cleaved Amplified Pollymorphic Sequence CAPS).
Entre las PCR de secuencias al azar, el RAPD utiliza oligonucletidos cortos
(10 pb) de secuencias arbitrarias y de baja especificidad, que permiten amplificar
fragmentos pequeos de ADN (Welsh y col., 1990, Williams y col., 1990). La AP-PCR
es esencialmente parecida a la anterior, con la salvedad de que el oligonucletido es
mayor (>20pb), y que combina un ciclo de baja especificidad con ciclos de alta
astringencia. En el caso de la AFLP se utilizan dos enzimas, una de corte frecuente y
33
otra de corte poco frecuente. Los fragmentos obtenidos posteriormente se amplifican
utilizando primers de extremos compatibles con el punto de corte enzimtico
(Janssen y col., 1997). En este caso se utilizan geles de poliacrilamida para la
resolucin de los fragmentos obtenidos.
2. Bacterifagos: propiedades generales
Los bacterifagos fueron descubiertos de forma independiente por los
microbilogos Frederick W. Twort (1915) y Flix dHrelle (1917), siendo la ltima
clase principal de virus en ser descubierta. Los virus de plantas fueron descubiertos
en 1892 por Ivanowski y los animales en 1902 por Loeffler y Frsch. Twort y dHrelle
fueron los primeros en reconocer virus especficos para las bacterias, por lo que
dHrelle los denomin bacterifagos (comedores de bacterias).
The next morning, on opening the, I experienced one of those moments of intense emotion which reward the research worker for all his pains: at the first glance I saw that the culture which the night before had been very turbid, was perfectly clear: all the bacteria had vanished, they had dissolved away like sugar in water. As for the agar spread, it was devoid of all growth and what caused my emotion was that in a flash I had understood: what caused my clear spots was in fact an invisible microbe, a filterable virus, but a virus which is parasitic on bacteria.
Figura 4. Flix dHerelle. Science News 14:4459, 1949
34
A partir de la dcada de 1930, virlogos pioneros como Salvador Luria, Max
Delbrck y muchos otros, utilizaron los fagos como modelo para investigar muchos
aspectos de la Virologa; en general como la estructura de los viriones, la
morfognesis, la gentica y la replicacin. Adems los fagos tambin han sido
tomados como modelo para el estudio de la gentica bacteriana y los mecanismos de
control de la expresin gnica, debido a que los huspedes bacterianos son
fcilmente cultivables y manejables en el laboratorio.
En esta poca preantibitica, se prest una notable atencin a su posible uso
como agentes teraputicos, aunque la terapia fgica slo llego a ser usada de forma
habitual en la Unin Sovitica y Europa del Este (Sulakvelidze y col., 2005). En la
actualidad, debido a la aparicin de patgenos multirresistentes a los antibiticos se
estn retomando los estudios sobre fagoterapia clsica iniciados por Flix dHerelle
(Bruttin y Brssow, 2005), aunque tambin se estn desarrollando nuevas
aproximaciones derivadas directamente del estudio de los sistemas virales
(Sulakvelidze y col., 2005).
Se han descrito cerca de 5500 bacterifagos Caudovirales (fagos con cola)
capaces de infectar a una gran diversidad de huspedes bacterianos (Ackermann,
2006). Los bacterifagos constituyen el sistema biolgico ms simple y abundante de
la naturaleza. Desde un punto de vista estrictamente numrico, los fagos son la forma
de vida ms exitosa, se estima que su poblacin global es de aproximadamente 1031
partculas fgicas sobre la Tierra, coexistiendo en relacin 10/1 con las bacterias a las
que infectan. Se han descubierto fagos capaces de infectar a todos los procariotas
descritos hasta el momento y se han adaptado a todos los nichos ecolgicos. Tal
magnitud de fagos ejerce un importante papel ecolgico, regulando, mediante
transferencia gentica, la evolucin de sus hospedadores y afectando, incluso, los
niveles de materia orgnica en la biosfera. (Brssow y Hendrix, 2002, Chibiani-
Chennoufi y col., 2004, Prescott y col., 1996).
2.1. Clasificacin de los virus (Madigan y col., 2009)
Los virus pueden clasificarse en funcin de los hospedadores que
pueden infectar. As, tenemos virus animales, virus vegetales y virus bacterianos o
35
tambin conocidos como bacterifagos, y tambin segn el cido nucleico que
posean y si la cpside presenta o no una envuelta. (Figura 5).
ADN doble cadena, envueltos:
Lipothrixviridae
Rudiviridae
Fuselloviridae
Sulfolobus SNDV
ADN doble cadena, desnudos:
Podoviridae
Tectiviridae
Corticoviridae
Myoviridae
Siphoviridae
ADN monoctenario, desnudos:
Inoviridae
Microviridae
ARN doble cadena, envueltos:
Cystoviridae
ARN monocatenario, desnudos:
Leviviridae
2.2. Estructura de los bacterifagos
El material gentico se encuentra contenido en la cpsida, de morfologa
polidrica en la mayora de los casos, aunque tambin aparecen cpsidas esfricas y
filamentosas. Muchos bacterifagos poseen una morfologa caracterstica, en la que
la cpsida icosadrica se une a una cola filamentosa. La cola de naturaleza proteica,
sirve como orgnulo de anclaje a la superficie de la clula hospedadora (Figura 6).
Durante la infeccin de una clula bacteriana, la partcula vrica no penetra al
interior celular. El bacterifago inyecta el material gentico a travs de las envolturas
externas de la clula bacteriana.
36
Figura 5. Comparacin de dos tipos bsicos de partculas vricas, virus desnudos y
virus con envoltura (Ilustracin de Microsoft)
Figura 6. Estructura caracterstica de los bacterifagos (Ilustracin de Microsoft)
37
2.3. Ciclo de vida (Figura 7)
2.3.1. Ciclo ltico
Una vez que se produce la interaccin entre un bacterifago y su clula
hospedadora, se introduce el material gentico al interior y se induce la sntesis de los
componentes necesarios para fabricar ms partculas vricas. Posteriormente, los
diferentes componentes han de ser ensamblados en una secuencia determinada. Por
ltimo, las partculas vricas saldrn al exterior de la clula hospedadora por lisis de la
misma.
Esta serie de acontecimientos ocurre en varias etapas que conforman el
denominado ciclo ltico o productivo:
1. Adsorcin
2. Penetracin
3. Sntesis de protenas tempranas
4. Replicacin del material gentico
5. Maduracin
6. Liberacin de los viriones maduros
1. Adsorcin
La infeccin de la clula hospedadora comienza cuando interaccionan al azar
una partcula vrica y una clula. Si esta clula tiene receptores especficos para el
fago, se produce la adsorcin irreversible (Figura 8).
.
Los receptores son molculas que suelen estar situadas a nivel de la pared
celular, aunque tambin hay receptores para fagos situados en apndices, como
flagelos y fimbrias.
38
Los receptores fgicos para la adsorcin varan entre los diferentes grupos de
fagos. Las colas suelen ser los rganos de adsorcin (ms concretamente, las fibras
de la cola).
2. Penetracin
Este proceso ha sido muy estudiado en los fagos de la serie Tpar. Una vez que
se produce la adsorcin de las fibras de la cola, se produce la fijacin de las espculas
de la placa basal a la superficie de la clula bacteriana. Se produce la contraccin de
la vaina y el tubo es empujado hacia abajo.
Cuando el tubo penetra la membrana citoplasmtica, el cido nuclico
contenido en la cabeza del fago es inyectado, quedando la cpsida vaca fuera de la
clula.
3. Sntesis de protenas tempranas
Una vez que el ADN fgico ha llegado al citoplasma bacteriano, se ve sometido
a las enzimas de Restriccin-Modificacin de la bacteria. Parte del ADN se transcribe
hasta ARNm gracias a la ARN Polimerasa de la bacteria.
El ARNm es traducido en los ribosomas bacterianos y los productos (protenas
tempranas, por ser los primeros productos fgicos en aparecer), inhiben la sntesis
macromolecular de la clula.
Ms tarde, se transcriben y traducen otros genes del fago, que originan las
protenas de la cpsida, del tubo, de la cola, etc., adems de ciertas enzimas lticas.
4. Replicacin del acido nuclico del fago
La replicacin del fago depende del tipo de cido nuclico que posea (ADN o
ARN, lineal o circular, bicatenario o monocatenario). En la mayora de los casos, los
ADN lineales se circularizan al entrar en la clula. Esto se logra gracias a la existencia
de extremos cohesivos o por repeticin terminal.
39
La replicacin inicial de un cromosoma vrico circular comienza en un sitio
especfico y se lleva a cabo en ambas direcciones segn el modelo que en un
proceso semejante al de replicacin del cromosoma bacteriano, originndose
cromosomas circulares.
Ms tarde, la replicacin ocurre de acuerdo con el modelo o del crculo
rodante. Se origina una molcula de doble cadena que puede ser mucho ms larga
que el cromosoma viral (concatmeros).
Posteriormente una terminasa corta por las secuencias cos y los cromosomas
vricos se empaquetan en las cpsidas.
En el caso de fagos cuyo material gentico est constituido por ARN, una vez
que ste ha penetrado al interior celular, se copia formando una molcula de doble
cadena (forma replicativa).
La cadena de ARN paterna est marcada como + (se comporta como un
ARNm). La ARN replicasa del virus convierte la cadena paterna en un Intermediario
replicativo bicatenario. La replicasa utiliza el Intermediario bicatenario para la sntesis
de ms cadenas de ARN+
La cadena paterna desplazada y las cadenas de la descendencia, o bien son
incorporadas a los nuevos viriones, o bien son utilizadas por la replicasa para formar
nuevos intermediarios replicativos bicatenarios.
5. Maduracin
Ocurre poco despus de iniciada la replicacin del material gentico. Se
acumulan subunidades de la cpsida y del resto de componentes virales. Las
molculas de cido nuclico se condensan y son encapsidadas. Se produce el
autoensamblaje dirigido por los genes del virus.
6. Liberacin de los viriones maduros
40
Al final de la infeccin, aparece en la clula una protena tarda. Esta protena
(enzimtica) se denomina lisozima fgica. La lisozima acta sobre el glucopptido de
la pared celular, rompiendo enlaces glucosdicos y permitiendo la rotura de la misma.
Una vez rota la pared celular bacteriana, se liberan los fagos recin ensamblados.
El ciclo de infeccin puede volver a iniciarse inmediatamente, por interaccin al
azar de un virin con una clula hospedadora susceptible. Los bacterifagos
virulentos solo pueden realizar el Ciclo ltico o productivo.
41
Figura 7. Ciclo replicativo de un virus bacteriano (Ilustracin de Microsoft)
42
Figura 8. Fijacin de la partcula del bacterifago T4 a la pared celular de E. coli e
inyeccin del DNA (a) Interaccin al azar, (b) Accin de receptores y (c) Fijacin
(Ilustracin de Microsoft)
Figura 9. Reproduccin de un virus (bacterifago) (Ilustracin de Microsoft)
43
Figura 10. Reproduccin de un virus (bacterifago) (Ilustracin de Microsoft)
2.3.2. Ciclo lisognico
Los fagos temperados pueden llevar a cabo, adems del ciclo ltico, el
fenmeno de la lisogenia (Figura 9). Estos fagos, una vez inyectado el ADN en el
interior de la clula hospedadora, pueden integrar su material gentico en el
cromosoma de la bacteria, replicndose en sincrona con el hospedador, el cual
sobrevive y se divide normalmente. En este caso los genes vricos integrados en el
cromosoma bacteriano, estn reprimidos y no se expresan. El ADN fgico integrado
en el cromosoma bacteriano recibe el nombre de profago. En circunstancias
adecuadas, se produce la desrepresin de los genes vricos y se produce un ciclo
ltico.
En una clula infectada por un fago temperado ocurren tres procesos muy
ligados en el tiempo:
1. Transcripcin y traduccin del genoma vrico. Esta fase origina la sntesis de
protenas tempranas, entre las cuales hay uno o ms tipos de represores que inhiben
la replicacin y la expresin gnica de los virus, lo que permite el ciclo lisognico.
2. Comienzo de la replicacin del virus.
3. Entrada en estado de profago de uno de los genomas replicados.
El que una clula hospedadora sufra un ciclo ltico o un ciclo lisognico depende del
pulso entre el represor y el proceso de maduracin del fago. Si se producen viriones
44
maduros (y lisozima fgica) antes de que el represor pueda actuar, la clula se lisar.
Si por el contrario, se acumula el represor bloqueando la expresin gnica y la
replicacin del virus, la clula quedar Lisogenizada (Figura 10).
Caractersticas de las clulas lisogenizadas
A partir de una clula lisogenizada, se origina un clon lisognico. En cada una
de las clulas de este clon se encuentra el fago en forma de profago.
Mientras dura el estado de lisogenia, las clulas no eliminan viriones, ni presentan
ninguna protena estructural del virin.
Las clulas infectadas (lisogenizadas) por un fago (Profago) son inmunes a la
infeccin por el mismo fago. Si las clulas lisognicas adsorben partculas vricas de
un fago diferente, se dice que estn superinfectadas.
Bajo determinadas condiciones ambientales el profago se escinde, pasando a
un estado independiente, multiplicndose y originando la lisis celular. A este
fenmeno se le conoce como Induccin y como consecuencia del mismo se origina un
ciclo ltico.
Pueden aparecer fenmenos de conversin fgica debido a que algunos de los
genes virales no quedan reprimidos, y por tanto se expresan, confiriendo a la bacteria
algunas caractersticas fenotpicas que antes no tena. Esto mismo puede ocurrir en el
caso de que la insercin del profago haga que se expresen genes bacterianos que
antes no lo hacan (genes crpticos).
2.4. Bacterifagos de Salmonella Enteritidis
Desde 1997 al 2001 han sido fagotipados 10.049 aislamientos de Salmonella
Enteritidis de origen humano en Europa. Los fagotipos ms comunes en este perodo
fueron PT4 y PT1 (Figura 11), considerando el 35% y 16% de todos los casos,
respectivamente. En los viajeros que vuelven de la mayora de los pases de Europa
Occidental, PT4 era el fagotipo dominante. En Europa Oriental, PT1 era el
dominante, y este fagotipo tambin era comn entre viajeros que vuelven de la
45
Pennsula ibrica. PT8 pareca ser ms comn entre los viajeros que vuelven de los
pases europeos centrales (Nygrd y col., 2004).
Figura 11. Distribucin de fagotipos de Salmonella Enteritidis notificados en Suecia,
1997 a 2002 (Nygrd y col., 2004)
2.5. Evolucin fgica
Los fagos pudieron haber evolucionado de organismos auto-replicativos que
hubieran perdido la maquinaria necesaria para llevar a cabo la traduccin y con ella la
posibilidad de realizar procesos metablicos, obligndolos a convertirse as en
parsitos estrictos. Otra teora alternativa hace referencia a un ancestro comn, que
se hubiera desarrollado como un elemento gentico extracelular proveniente del
hospedador, y que habra adquirido los genes necesarios para proteger su DNA de la
degradacin, primero dentro de la clula y posteriormente fuera de ella. Este origen
bacteriano de algunos fagos, est respaldado por la existencia de secuencias de DNA
en los genomas de las bacterias que parecen tener caractersticas comunes en
cuanto a estructura y organizacin genmica al DNA fgico.
Si bien el origen de los fagos es incierto, el mecanismo por el cual evolucionan
es ms conocido. La forma clsica de evolucin gentica, por medio de mutaciones
46
puntuales en genes que dan como resultado protenas adaptables a distintas
funciones, es la ms aceptada. Pero podra existir adems, otro poderoso mecanismo
de evolucin fgica que se conoce con el trmino de evolucin modular. Esta teora,
propuesta por Botstein (1980), considera que los genomas de los bacterifagos,
incluidos los que nos ocupan, estn organizados en unidades funcionales
multignicas conocidas como mdulos. Estos mdulos codifican funciones biolgicas
concretas, como puede ser la construccin de la cpsida o el establecimiento de la
lisogenia y seran intercambiables, de forma que pueden ser traspasados de unos
fagos a otros potenciando as el proceso evolutivo (Botsein, 1980; Brssow y Desiere,
2001).
2.6. Tipificacin fgica de Salmonella Enteritidis
Los estudios epidemiolgicos de esta infeccin, han determinado la
clasificacin de los diferentes aislamientos de Salmonella Enteritidis en fagotipos (FT),
tomando en consideracin ciertas caractersticas como su virulencia y patogenicidad.
La metodologa de fagotipificacin es la misma en todo el mundo, ya que utiliza los
mismos bacterifagos y es ampliamente utilizada para la clasificacin de aislamientos
de Salmonella que pertenecen a la misma serovariedad. La utilizacin de la
fagotipificacin para propsitos epidemiolgicos, se basa en asumir que los
aislamientos que pertenecen al mismo fagotipo tienen relacin epidemiolgica entre
s, mientras que aislamientos de diferente fagotipo carecen de esa relacin; adems
las serovariedades deben demostrar una alta estabilidad dentro de la poblacin y con
el paso del tiempo (Mancera Martnez y col., 2004).
Actualmente, el mtodo de tipificacin bacteriana de Salmonella Enteritidis ms
utilizado corresponde a la tipificacin fgica, lo que se explica por su estandarizacin,
la facilidad de montaje y porque la mayor parte de los aislados son tipificables y,
adems, los resultados son fcilmente reproducibles. Su limitacin ms importante
radica en su baja capacidad discriminatoria debido a la predominancia de unos pocos
fagotipos en una poblacin bacteriana.
La tipificacin fgica de aislados nacionales de S. Enteritidis es de inters
debido a que esta tcnica de marcacin ha estado restringida a unos pocos pases,
47
en su mayor parte desarrollados. Ello ha impedido conocer cules poblaciones
bacterianas estn involucradas en las nuevas zonas afectadas. Ms an, esta tcnica
de marcacin podra indicar si solo unos pocos fagotipos estn asociados con la
actual epidemia o si, como se sospecha, varios tipos podran estar circulando a partir
de diferentes fuentes infectantes. Adems, la comparacin de aislados clnicos,
alimentarios y avcolas podra mostrar la relacin epidemiolgica de estos. Por ltimo,
la comparacin de los fagotipos que actualmente circulan con los que se han
observado en pocas anteriores podra indicar el posible origen local de la epidemia o
su importacin del exterior (Prat y col., 2001).
Existen, fundamentalmente, dos tipos de bacterifagos: los salvajes o silvestres
que se encuentran en la naturaleza. Dentro de stos existe una variedad que son los
bacterifagos adaptados. Estos ltimos son especficos para un tipo determinado de
Salmonella. Se pens, en un principio, que stos eran mutadores de la clula
husped, pero ms tarde se vio que eran los propios fagos los que sufran
modificaciones al ser enfrentados en varias ocasiones a una misma cepa, de forma
que se hacan activos frente a cepas que en un principio no lisaban (Ward y col.,
1987). Otro tipo son los conocidos como Lisognicos que forman parte de la
estructura gentica de la bacteria. La situacin de lisogenia es una forma especial de
interaccin virus-husped, basada en la asociacin ntima del ADN vrico y bacteriano.
Existe un entrecruzamiento entre el ADN del virus y el ADN bacteriano, empleando el
mismo mecanismo de rotura y recombinacin observado en la recombinacin
gentica. Slo presentan poder ltico frente a su clula husped si sufren algn tipo de
modificacin gentica.
Existen, fundamentalmente, dos tcnicas de fagotipia (ISO, 1995; 2000; 2001):
- Directa: Consistente en el aislamiento de bacterifagos salvajes de la naturaleza y
su posterior aplicacin a un conjunto de cepas que se desean estudiar.
- Indirecta: Consistente en la induccin de bacterifagos de las propias cepas y, una
vez transformados en lticos, formar con ellos un juego de fagotipia para las cepas a
estudiar.
48
OBJETIVOS
49
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la eficacia de la fagotipia como marcador epidemiolgico
complementario para cepas de Salmonella Enteritidis.
OBJETIVOS COMPLEMENTARIOS
1. Aislar y purificar bacterifagos de cepas de Salmonella Enteritidis de aguas del ro
Lujn.
2. Determinar los ttulos de los bacterifagos a travs de Routine Test Dilution (RTD)
3. Establecer los correspondientes grupos de especificidad entre las cepas de S.
Enteritidis y los fagos hallados.
4. Evaluar los perfiles genticos, por PFGE, de S. Enteritidis representativas de los
grupos de especificidad surgidos a fin de evaluar los clones circulantes.
50
MATERIALES
Y
MTODOS
51
1. Toma de muestras de agua
Se tomaron un total de 120 muestras de agua, a razn de 10 mensuales,
durante un ao. Las mismas se obtuvieron segn la tcnica del hisopo de Moore con
60 minutos de exposicin a la corriente de agua (Anselmo y col., 1999; Guinea y col.,
1979). Fueron cultivadas dentro de las 2 h del momento de su extraccin.
Simultneamente se determin la temperatura del agua en cada toma de muestra.
Cuatro puntos de los mrgenes del ro Lujn, confinados en los de mayor
poblacin urbana fueron los sitios de muestreo elegidos. Surgieron de la evaluacin
estadstica de los resultados obtenidos durante investigaciones anteriores realizadas
en el ro Lujn durante los aos 1987 a 1993 donde se obtuvo mayor positividad de
muestras as como mayor cantidad de serovariedades detectadas / muestra.
2. Cepas de Salmonella Enteritidis
Procedencia y origen de las cepas
Las cepas de Salmonella Enteritidis seleccionadas para este trabajo
procedieron de la coleccin de cepas de Salmonella existentes en el Laboratorio de
Microbiologa de la Universidad Nacional de Lujn conservadas en caldo nutritivo con
7 g/L de agar-agar a temperatura ambiente. Las mismas han sido aisladas en trabajos
anteriores desde 1987 a 1993 e identificadas en su oportunidad.
Distribucin de las cepas en grupos
Se seleccionaron un total de 86 cepas de Salmonella Enteritidis, pertenecientes
a siete grupos. Estos son:
- GRUPO PRIMERO: Formado por 23 cepas de Salmonella Enteritidis
seleccionadas entre todas las serovariedades de Salmonella existentes en
el Laboratorio de Microbiologa de la Universidad Nacional de Lujn. Fueron
aisladas de aguas del ro Lujn durante el perodo comprendido de 1987 a
52
1990, de investigaciones anteriores (Anselmo y col., 1989; 1991a; 1999).
Tabla 3.
- GRUPO SEGUNDO: Formado por 6 cepas de Salmonella Enteritidis
procedentes de vescula biliar de uno de cinco terneros fallecidos en el
tambo de la Universidad Nacional de Lujn, con sintomatologa
caracterstica de salmonelosis, de noviembre de 1988 (Anselmo y col.,
1991c). Tabla 4.
- GRUPO TERCERO: Formado por 25 cepas procedentes de la investigacin
de un brote de origen alimentario ocurrido en un comedor escolar de la
ciudad de Lujn, provincia de Buenos Aires, con unas cuarenta personas
afectadas, en marzo de 1990 (Anselmo y col., 1990). Tabla 5.
- GRUPO CUARTO: Formado por 8 cepas provenientes del estudio de otro
brote de origen alimentario acontecido en una panadera y confitera de la
ciudad de Gral. Rodrguez, provincia de Buenos Aires, con unas diecisis
personas afectadas, por ingesta de mayonesa casera utilizada para la
confeccin de sndwiches de miga, en octubre de 1990 (Anselmo y col.,
1991b). Tabla 6.
- GRUPO QUINTO: Integrado por 13 cepas procedentes de una intoxicacin
masiva en una rotisera de la ciudad de Lujn al confeccionarse ensalada
rusa y mayonesa de ave, ambas con mayonesa de elaboracin casera, con
unas 200 personas afectadas, en diciembre de 1991 (Anselmo y col., 1993).
Tabla 7.
- GRUPO SEXTO: 6 cepas provenientes del estudio de un brote familiar en la
ciudad de Lujn, debido a mayonesa casera utilizada para confeccionar
ensalada rusa, con nueve personas afectadas, en setiembre de 1993
(Anselmo y col., 1995, Viora y col., 1994). Tabla 8.
- GRUPO SPTIMO: 5 cepas de Salmonella Enteritidis procedentes de casos
espordicos sucedidos en la ciudad de Lujn desde noviembre de 2009 a
53
diciembre de 2010, provistas por la Dras. Graciela A. Ruzo de Maggiotto,
Florencia Sparapani y Susana Ferrarotti de sus Laboratorios de Anlisis
Clnicos as como del Hospital Nuestra Seora de Lujn y de la Clnica
Gemes de la ciudad de Lujn.
Tabla 3. Grupo Primero. Datos Epidemiolgicos
N cepa Ao aislamiento Sitio de muestreoa
12988
13088
42188
42288
47088
47188
84788
175588
175688
176688
176788
176888
176988
180988
174790
175390
177290
32195
32495
1987
1987
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1988
1989
1989
1990
1989
1989
C
C
C
C
A
A
C
B
B
C
C
C
C
B
B
C
A
A
A
54
32595
40995
41195
49195
1989
1989
1989
1989
A
Arroyo El Haras
Arroyo El Haras
A
aA = 2 Km aguas arriba de la zona urbana, B = Planta urbana y C = 2 Km aguas abajo de la zona urbana.
Tabla 4. Grupo Segundo. Datos Epidemiolgicos
N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote
177088
177188
177288
177388
177488
177588
1988
1988
1988
1988
1988
1988
Vescula biliar
Vescula biliar
Vescula biliar
Vescula biliar
Vescula biliar
Vescula biliar
Tambo U.N.Lu.
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Tabla 5. Grupo Tercero. Datos Epidemiolgicos
N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote
60490
60590
60690
60790
60890
60990
61090
61190
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
Heces asintom. 1
Heces asintom. 1
Heces asintom. 2
Heces asintom. 2
Heces enf. 3
Heces enf. 4
Heces enf. 5
Heces enf. 6
Comedor escolar
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
55
61290
61390
61490
61590
61690
61790
61890
61990
62090
62190
62290
62390
62490
62590
62690
62790
62890
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
1990
11990
1990
Heces enf. 7
Canilla bao
Canilla bao
Inodoro
Inodoro
Freezer
Freezer
Mesada cocina
Mesada cocina
Mesa cocina
Mesa cocina
Mesa comedor
Mesa comedor
Helado c/envoltorio
Helado c/envoltorio
Pata pollo cocido
Pata pollo cocido
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Tabla 6. Grupo Cuarto. Datos Epidemiolgicos
N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote
183490
183590
183690
183790
183890
1990
1990
1990
1990
1990
Jamn cocido
Jamn cocido
Mayonesa casera
Mayonesa casera
Paredes int. Heladera
Panaderia
dem
dem
dem
dem
56
183990
184090
184190
1990
1990
1990
Paredes int. Heladera
Estantes cm. Frigor.
Estantes cm. Frigor.
dem
dem
dem
Tabla 7. Grupo Quinto. Datos Epidemiolgicos
N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote
230791
230891
230991
231091
231191
231291
231391
231491
231591
231691
231891
231991
232091
1991
1991
1991
1991
1991
1991
1991
1991
1991
1991
1991
1991
1991
Inodoro
Inodoro
Inodoro
Vaso Licuadora
Vaso Licuadora
Vaso Licuadora
Heces cocinera asintom.
Heces cocinera asintom.
Heces enf. 1
Heces enf. 1
Heces enf. 2
Heces enf. 3
Heces enf. 3
Rotiseria
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Idem
Tabla 8. Grupo Sexto. Datos Epidemiolgicos
N cepa Ao aislamiento Origen muestra Brote
182693
182793
182893
1993
1993
1993
Clara de huevo
Clara de huevo
Heces enf. 1
Familiar
Idem
Idem
57
182993
183093
183193
1993
1993
1993
Heces enf. 1
Heces enf. 2
Heces enf. 2
Idem
Idem
Idem
Tabla 9. Grupo Sptimo. Datos Epidemiolgicos
N cepa Ao aislamiento Origen muestra Casos espordicos
706
756
6182
508091
194110
2009
2009
2010
2010
2010
Heces enf. 1
Heces enf. 2
Heces enf. 3
Heces enf. 4
Heces enf. 5
Lujn
Lujn
Lujn
Lujn
Lujn
3. Enriquecimiento de bacterifagos salvajes
3.1. Se evaluaron 36 cepas de Salmonella Enteritidis (todas las del grupo
primero y un 22% de las cepas representativas de los grupos segundo al sexto), un
pool de 3 mensuales (McLaughlin y col., 2006). A cada uno de los 10 hisopos de
Moore se les adicion 100 mL de Phage Assay Broth (PAB) (Kott, 1966; Oliver Graves
1964) y 1 mL de cultivo en PAB de cada una de las tres S. Enteritidis de 24 h a 35C
y se incub durante 15 horas a 35C (McLaughlin y Brook, 2008).
3.2. Para la descontaminacin se trasvasaron 10 mL de cultivo a un tubo de
15 x 150 mm con tapa a rosca y se aadieron 5 mL de cloroformo. Se agit
enrgicamente 60 segundos y se conservaron a 4C (Daz y col., 1995).
4. Confirmacin (Adams, 1959)
Para comprobar la presencia de bacterifagos, en 5 mL de PAB blando (0,7%
agar) fundido y templado a 50 2C se incorpor 0,5 mL de un cultivo de la cepa
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propagadora en 10 mL de PAB de 24 h a 35C. Se homogeniz en vortex (Fbr by
Decalab S.R.L.) y se verti en placa de 15 cm de dimetro, conteniendo 15 mL de
PAB slido (1,3% agar) desparramando la mezcla uniformemente sobre la superficie
del agar y evitando la presencia de burbujas de aire. Se dej solidificar y se sec la
superficie de la placa a 35C durante 30 minutos, con la tapa sacada y la superficie
del agar hacia abajo e inclinada. A continuacin se colocaron 10 L del cultivo
enriquecido de bacterifago. Se dej la placa sin invertir 30 min a temperatura
ambiente para que se absorba la alcuota. Se incub en la habitual posicin invertida
durante 4 a 15 horas a 35C efectuando lecturas a intervalos frecuentes (McLaughlin y
Brook, 2008). La presencia del bacterifago se visualiza en la aparicin de calvas o
placas de lisis.
5. Criterio de seleccin de bacterifagos
Se realiz de acuerdo a los criterios propuestos por (Anderson y Williams, 1956).
Estos se basan fundamentalmente en tres factores:
a) El tamao de las placas de lisis:
1. Placas grandes l.
2. Placas normales n.
3. Placas pequeas s.
4. Placas diminutas m.
5. Placas micro visibles tan solo con lupa de 10 aumentos.
b) El nmero de placas de lisis:
1. De O a 5 placas, se indica el nmero de las mismas.
2. De O a 20 placas, se pone
3. De 21 a 40 placas, se pone +
4. De 41 a 60 placas, se pone + +
5. De 61 a 80 placas, s
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