Evaluación de fructanos en tres especies de agave (A. angustifolia Haw., A.potatorum Zucc. y A. cantala Roxb) del Estado de Oaxaca.

Santiago García Patricia1, Vera Guzmán Araceli1 y López G. Mercedes2.

1 Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional CIIDIR-IPN-U. Oaxaca.Apartado Postal 96B, Oaxaca, Oax.,68030

2 Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN,Unidad Irapuato. Apartado postal 629, Irapuato Gto., 36500 México.

1email:psanti_02@yahoo.com

RESUMEN

Se evaluaron plantas de A. angustifolia Haw. de Santiago Matatlán de 9 años de edad, A.

potatorum Zucc. y A. cantala Roxb. de 7 y 5 años respectivamente, provenientes de Sola de Vega,

Oaxaca. El objetivo del presente trabajo fue identificar y determinar el contenido de fructololigosacaridos

de A. angustifolia Haw., A. potatorum Zucc. y A. cantala Roxb. Así como determinar el grado de hidrólisis

de la inulina durante el horneado y en condiciones controladas de A. angustifolia y A. potatorum. por ser

estos lo de mayor utilización en la elaboración del mezcal. El contenido de carbohidratos fue evaluado por

métodos espectrofotometricos y la identificación de fructooligosacáridos por cromatografía de capa fina

según el método descrito por Mancilla-Margalli y López, (2002). La hidrólisis térmica se llevó a cabo

siguiendo la cinética de hidrólisis de la inulina de las piñas en el horno tradicional y en condiciones

controladas a tres temperatura evaluando cada 12 horas azucares reductores directos y el grado de

hidrólisis de inulina por medio de cromatografía en capa fina.

De los resultados se encontró que el contenido de azúcares totales y fructosa fue mayor

en la especie de A. angustifolia. En A. potatorum los azucares reductores fueron ligeramente mayores y

los azucares totales y fructosa fueron similares a las otras especies. Valores ligeramente menores (22%)

se encontraron para A. cantala. El rendimiento de la extracción fue variable obteniéndose de 1.3-6% de

fructanos de bajo DP y un valor de 12-30% de fructanos de alto DP dependiendo de la especie y edad. La

identificación de los fructooligosacáridos por cromatografía en capa fina, revela que las tres especies

contienen glucosa y fructooligosacáridos de bajo y alto DP y dependiendo de la especie se encuentran en

mayor o menor proporción. De los resultados de la etapa de cocimiento en la elaboración del mezcal seencontró que para A. angustifolia son necesarias 48 horas de cocimiento, ya que a este tiempo se obtiene

la mayor concentración de fructosa lo cual se ve reflejado en la hidrólisis a pH 5.5. Así mismo se encontró

que para A. Potatorum el tiempo de hidrólisis es menor casi 8 horas a temperatura de 85ºC y pH de 4.5.

Palabras clave: Agave, fructanos, inulina

INTRODUCCION

Entre los recursos productivos de importancia para la economía de México se encuentra el Agave. Planta

utilizada tradicionalmente para la producción de bebidas alcohólicas, (tequila, mezcal, sotol) y de gran interés por su

alto contenido de fructanos como material de reserva. Los fructanos o fructooligosacaridos (FOS), son polímeros de

la fructosa en el cual los enlaces fructosil-fructosa constituyen la mayoría de los enlaces glicosídicos. Estos

compuestos son carbohidratos no reductores lineales o ramificados formados por fructosa con enlaces (2-1) que

generalmente contienen una molécula de glucosa en un extremo. Las diferentes estructuras moleculares de los

fructanos pueden conferirles propiedades particulares a la especie que los contiene. Los fructanos tipo inulina son

oligosacaridos no digeribles clasificados como fibra dietaria y/o prebióticos. Sus propiedades nutricionales no

dependen tanto como las propiedades tecnológicas de su estructura molecular especialmente de su grado de

polimerización, las cuales determinan su solubilidad en el agua, su viscosidad, su capacidad de retención de agua y

su capacidad para dar textura a los alimentos. Se ha encontrado que las dietas ricas en fructanos pueden tener efectos

promotores de la salud (Roberfroid, 2002) ya que son carbohidratos que no son hidrolizados por las enzimas

digestivas, y pueden ser metabolizados en el intestino grueso por enzimas producidas por bacterias (Cummings and

Englisyst, 1995). En diversas especies de la familia Agavaceae se han encontrado que almacenan fructanos

principalmente en sus tallos Mancilla-Margalli y López, 2002 encontraron que en A. tequilana Weber var. Azul., los

fructooligosacáridos e inulina son los principales carbohidratos de reserva. Recientemente la estructura de los

fructanos de A. tequilana Weber var. Azul., fue identificada (López y col, 2003) abriendo nuevos usos como

prebioticos, agentes anticancerígenos y antidiabéticos entre otros. Considerando las demandas actuales en cuanto a la

necesidad de ofrecer productos nutracéuticos el presente trabajo pretendió generar información sobre el contenido y

tipo de fructanos en Agave angustifolia Haw, Agave potatorum Zucc. y A. cantala Roxb. del Estado de Oaxaca y. la

cinética de hidrólisis de la inulina durante el horneado y en condiciones controladas de A. angustifolia y A.

potatorum por ser estos lo de mayor utilización en la elaboración del mezcal.

METODOS EXPERIMENTALES

Materiales

Se utilizaron plantas de A. angustifolia Haw., de 9 años de edad de Santiago Matatlán, A. potatorum

Zucc., de 7 años y A. cantala Roxb., de 5 años de edad de Sola de Vega Oaxaca, con un peso promedio de 79.6, 46.5

y 85.6 Kg., respectivamente las cuales fueron recolectadas y transportadas al laboratorio del CIIDIR-OAXACA. Para

la realización de los análisis, las plantas de agave fueron divididas de la siguiente forma: Las muestras fueron

cortadas en trozos y se molieron en un molino Grindomix (GM 200) por 30 segundos a 10 000 r.p.m. además las

muestras fueron homogeneizadas y utilizadas para la extracción de azúcares e inulina. La extracción de inulina se

realizó de acuerdo al método propuesto por Livingston (1990) con algunas modificaciones.

Hojas jóvenes (HJb, HJm, HJa) ubicadas en la parte superior de la piña. Hojas medias (HMb, HMm, HMa).

Hojas viejas (HVb, HVm, HVa) ubicadas en la parte inferior de la planta. (b, m y a) corresponden a la parte basal,

media y apical de cada una de las hojas. Las piñas fueron divididas en pencas jóvenes, medias, viejas (PJ, PM, PV) y

mezontle.

Caracterización fisicoquímica.- Parámetros como humedad proteína, fibra cruda, sólidos totales, grados Brix y pH

se realizaron siguiendo las técnicas de la A.O.A.C (1994).

Extracción de azúcares solubles.

Se pesaron 10 g de cada muestra de agave y los carbohidratos solubles fueron extraídos con 50 ml de una

solución alcohólica al 80 % durante 30 min. y en agitación constante manteniendo una temperatura de 75 ºC. La

mezcla se filtró y el remanente sólido se sometió dos veces más a extracción en medio acuoso por 10 min., en

agitación constante y a una temperatura de 75 ºC. Se juntaron los tres sobrenadantes y se concentraron casi hasta

sequedad mediante el uso de un rotavapor a una temperatura de 75 ºC y presión reducida. Las muestras concentradas

se aforaron a un volumen de 10 ml con agua desionizada, posteriormente se tomó una alícuota para la de terminación

de carbohidratos.

Del extracto concentrado de cada muestra se tomó una alícuota de 200 l y se aforó a un volumen de 100

ml con agua desionizada. Para cada determinación se tomaron 100 l de esta solución y se llevaron a un volumen de

1 ml con la adición de agua desionizada. Cada determinación se realizó por triplicado.

Azúcares reductores directos.

En un tubo de ensaye se colocaron 100 l de muestra y se llevaron a un volumen de 1 ml con H2O

desionizada. Se le agregaron 1 ml del reactivo C y la mezcla se calentó 100 ºC durante 15 min. Después de este

tiempo la solución se enfrió rápidamente a temperatura ambiente y se le adicionó 1 ml de reactivo D, agitar y diluir

con 3 ml de agua. Agitar nuevamente y determinar la absorbancia en una de 520 nm. El color azul-verde de la

solución es inestable por lo que se debe leer casi inmediatamente para obtener reproducibilidad.

Reactivo A Se disolvieron 15 g de tartrato de sodio y potasio, mas 30 g de carbonato de calcio (Na2CO3) en 300 ml

de agua desionizada. Se agregaron 20 g de bicarbonato de calcio (NaHCO3). Por otra parte se disolvieron 180 g de

sulfato de sodio anhidro en 500 ml de agua previamente hervida y fría. Las dos soluciones se mezclaron y se

aforaron a un litro.

Reactivo B: Se disolvieron 5 g de sulfato de cobre pentahidratado y 45 g de sulfato de sodio anhidro en H2O y se

afora ron a un volumen de 250 ml.

Reactivo C: Mezclar A Y B en una proporción 4:1 (v/v) antes de usarse.

Reactivo D: Se disolvieron 25 g de molibdato de amonio en 450 ml de H2O. Se adicionaron cuidadosamente 21 ml

de H2SO4 concentrado en agitación constante. Disolver 3 g de arsenato de sodio en 25 ml de H2O y adicionar a la

solución de molibdato. Esta solución se incuba a 37 ºC por un periodo de 24-28 horas y se almacenan en un frasco

ámbar, antes de utilizar este reactivo se diluyeron con 2 volúmenes de H2SO4 0.75 M.

Para esta determinación se realizó una curva de calibración con soluciones de glucosa en una

concentración de 2 a 100 g/ml.

Azúcares totales.

A 1 ml de la muestra contenida en un tubo de ensaye se le adicionó 1 ml de solución de fenol al 5 %

posteriormente se le agregaron 5 ml de H2SO4 de manera rápida y directa sobre la superficie del líquido y no sobre

las paredes del tubo.Los tubos se dejaron reposar a temperatura ambiente por 10 mín. y posteriormente se agitaron y

se colocaron por 20 mín. más en un baño María a 25 ó 30 ºC. La lectura de las absorbancias se realizó en un

espectrofotómetro a una longitud de onda de 490 nm. El color amarillo de la solución es estable por algunas horas.

La curva de calibración se realizó determinando la absorbancia de soluciones de glucosa en un rango de

concentraciones de 2-100 g/ml.

Fructosa.

Preparación del reactivo.Se disolvieron 10 mg de antrona y 10 mg de L-triptofano en 100 ml de H2SO4 al

75 %. Esta solución se almacenó en un frasco ámbar a 4 ºC por un tiempo no mayor de 7 días.La curva de

calibración se realizó determinando la absorbancia de las soluciones que contienen concentraciones de fructosa en un

rango de 1 a 200 g/ml.

A 100 l de muestra se le adicionaron 900 l de H2O desionizada y 2 ml de reactivo ATS. La mezcla se

agitó y se mantiene en un baño María a 55 ºC durante 90 mín. El color es estable aproximadamente 2 a 3 horas.

Después de este tiempo se enfrió a chorro de agua y se determinó la absorbancia de las muestras a 520 nm.

Extracción de la inulina.

Para la extracción de la inulina se tomaron muestra de 3 diferentes piñas con una edad promedio de 9

años, se pesaron 30 g de muestra de agave crudo y molido, se sometió a un proceso de extracción con una solución

de etanol al 80 %. El pH se ajustó a 8 con hidróxido de calcio Ca (OH)2. La mezcla se agitó constantemente durante

1 hora manteniendo la temperatura a 75 ºC. La muestra se filtró y el remanente sólido se extrajo nuevamente con 50

ml de agua desionizada en agitación constante por 30 mín. y a 75 ºC. Este paso se repitió una vez más.

Los filtrados se juntaron y se agregaron 10 ml de resina Bio Rad grado analítico (AG 50W-X4, en forma

H+ con un tamaño de 200 a 400 mesh), previamente activada. (Se tomaron dos gramos de resina húmeda y se lavó

con 10 ml de HCl 0.1 N, 40 ml de NaOH y nuevamente con 10 ml de HCl 0.1 N). Después de este tiempo se retiró la

resina por filtración y el pH, que se acidificó se ajusta a 7 con hidróxido de calcio, a la solución se le agregó carbón

activado para retirar pigmentos y algunos contaminantes, para retirar el carbón activado de la solución se filtró. El

filtrado se lleva casi hasta sequedad mediante el uso de un rotavapor, a una temperatura de 70 ºC y presión reducida.

A la muestra concentrada se le agregó etanol absoluto y el precipitado blanco que se forma se le dejó

reposar por 12 horas a 4 ºC. Después de este tiempo el sobrenadante se retiró por decantación y al precipitado se dejo

secar en ácido sulfúrico concentrado.

Hidrólisis térmica de la inulina.

Se preparó una solución de inulina de agave al 10 % en solución de acetato de sodio 0.2 M, para el pH de

5.0, se disolvió en buffer de fosfato 0.1 M para el valor de pH de 7.8 y se disolvió en agua desionizada para el pH

5.5. La muestra disuelta se sometió a una temperatura constante de 95 ºC y se tomaron muestras cada 8 horas,

mediante un capilar para su posterior aplicación en una placa de TLC para correrla y revelarla según condiciones

descritas.

Por otro lado se tomaron 10 l de la muestra (cada 8 horas) y se disolvieron con 5 ml de agua desionizada.

Finalmente se tomó 1 ml de esta dilución para la determinación de azucares reductores directos.

Identificación de inulina por cromatografía en capa fina (TLC).

Para el monitoreo de la extracción de la inulina, así como la identificación de sus oligos generados, se

utilizaron placas de gel de sílice para cromatografía en capa fina, para visualizar la separación de compuestos se

utilizó un revelador especifico para azúcares.

En la placa de gel de sílice se aplica 1 l de cada muestra. El corrimiento de la cromatografía se realizó en

una cámara de vidrio herméticamente sellada y saturada con un sistema de solvente de 1 propanol: acetato de etilo:

agua (40:40.20 v/v), para la identificación de carbohidratos presentes en le agave se utilizaron diferentes estándares

(mencionados anteriormente), la placa se asperja con el revelador constituido por 3 soluciones, difenilamina al 4 %,

anilina al 4 % y ácido fosfórico al 85 %, las cuales se mezcal antes de usarse. Este revelador produce una coloración

azul grisáceo para las aldosas, mientras que la presencia de cetosas se evidencia por la generación de manchas de

color rojo. La sensibilidad del revelador es de 1 g.

D I A G R A M A D E ACTIVIDADES.

PIÑAS CRUDAS

DETERMINACIÓN DEAZÚCARES

IDENTIFICACIÓN DEINULINA POR TLC

MOLIENDA

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

PIÑAS COCIDAS

ºBx

pH

EXTRACCIÓN Y PURIFICACCIONDE FRUCTANOS

ºBx

pH

HIDRÓLISIS

TERMINADETERMINACION DE

IDENTIFICACION AZÚCARES TOTALES

AZÚCARESREDUCTORES TOTALES

FRUCTOSA

CAMBIO DECOLOR

Extracción e identificación de oligosacaridos.

La extracción de azúcares se realizó con etanol la cual tienen como finalidad solubilizar los azúcares

que se encuentren presentes en la materia prima, siguiendo el método de Nelson y Somogy (1944). Los azúcares

totales se determinaron por los métodos espectrofotometricos por Dubois y colaboradores (1953) y la determinación

de fructosa se realizó mediante el método de la antrona–triptofano–ácido sulfúrico (ATS) propuesto por Somani y

col (1987). Para identificar los fructanos presentes en los agaves se utilizaron placas de sílica gel, estándares de

glucosa, fructosa, sacarosa, kestosas e inulina de achicoria (Cichorium intybus L.), la identificación de los

oligosacáridos por cromatografía de capa fina según el método descrito por Mancilla-Margalli y López, (2002). Los

datos obtenidos fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA) empleando el programa SAS

(Statiscal Análysis System, 1999). Se realizó una comparación de medias utilizando la prueba de Tuckey (P=0.05).

Para la hidrólisis las soluciones fueron preparadas al 10 % de inulina disolviendo la cantidad requerida del polvo,

posteriormente se sometieron a condiciones controladas, estas soluciones fueron retirados cada doce horas y

congelados para su posterior análisis.

Diseño experimental hidrólisis térmica

El diseño experimental que se utilizó para la evaluación fue un diseño completamente aleatorizado con arreglo

factorial 3 x 2. Los factores de estudio fueron: 1) r temperatura de la hidrólisis térmica del agave, niveles de (85, 95 y

105 °C) y 2) pH en dos niveles (4.5 y 5.5).

Cuadro1. Factores de estudio.

Temperatura pH

4.585

5.5

4.595

5.5

4.5105

5.5

La unidad experimental será una muestra de -100 g y se tendrán tres repeticiones por tratamiento. Los carbohidratos

del Agave potatorum se sometieron a hidrólisis térmica en una estufa, durante 84 horas, en los diferentes

tratamientos. Las muestras se tomaron cada 12 horas y se colocaron en refrigeración para su posterior análisis.

Técnica

Se preparó una solución de inulina de agave al 10% en solución de acetato de sodio 0.2 M, para el pH de 4.5 y se

disolvió en agua desionizada para el pH de 5.5 la muestra disuelta se somete a calentamiento a una temperatura

constante de 85, 96 y 105 ºC, y se tomaron muestras cada ocho horas, mediante un capilar para su posterior

aplicación en una placa de cromatografía en capa fina (TLC) para correrla y revelarla según las condiciones

descritas.

Asi mismo se tomaron una muestra de 10 l (cada ocho horas) y se disolvieron con 5 ml de agua desionizada.

Finalmente se tomó 1 ml de esta dilución para la determinación de azúcares reductores.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Meta 1 Caracterización físico-química de tres especies de Agave del Estado de Oaxaca

Contenido de Sólidos Solubles y pH en las piñas

El contenido de sólidos solubles varió dependiendo de la especie. El Cuadro 2 muestra los resultados para el Agave

angustifolia, observándose mayor contenido de sólidos solubles para esta especie. Valores ligeramente menores se

obtuvieron para Agave cantala. No se presentaron diferencias significativas en el contenido de sólidos solubles

(ºBrix) en las pencas de la piña y su contenido en el mezontle fue ligeramente mayor. Estos valores fueron similares

al reportado para Agave tequilana Weber. var. Azul, por Mancilla, (2000). Por su parte el Agave potatorum, tuvo los

valores de sólidos solubles mas bajos en las pencas y en el mezontle, de 21.73 ± 5.24

Cuadro 2. Contenido de sólidos solubles y pH en piñas

*Los datos con la misma letra en cada muestra y para cada especie, son estadísticamente iguales(Tukey,0.05).

Análisis proximal

El Cuadro 3 muestra el contenido de proteínas, fibra insoluble y minerales en agave, se observa que el contenido

de proteínas estuvo entre valores de 0.88 a 2.10% no existiendo diferencias significativa entre especies. El contenido

de fibra insoluble varió dependiendo de la especie, los valores en Agave angustifolia fueron similares a los

encontrados para A. potatorum, mientras que para A. cantala se encontró que contiene 19.75% más de fibra. En todos

los casos el contenido de carbohidratos fue en promedio 75.8%, excepto para A. potatorum, quien presentó un valor

ligeramente menor (74.3%). Estos resultados concuerdan con lo reportado por Purseglove, (1972).

A. angustifolia Haw. A. potatorum Zucc. A. cantala Roxb.

Muestra pH Brix pH Brix pH Brix

Penca Joven 4.6± 0.08 24.4± 2.3ab 5.0 ± 0.08 14.1 ± 1.9de 4.4 ± 0.04 20.0 ± 4.1cdPencaMedia

4.6± 0.08 24.9± 0.5 ab 4.9 ± 0.09 17.3 ± 5.6cd 4.5 ± 0.06 24.3 ± 2.3ab

Penca Vieja 4.3± 0.08 25.4± 0.5 ab 5.1 ± 0.43 10.9 ± 3.7e 4.5 ± 0.08 20.5 ± 0.5bcMezontle 4.5± 0.08 26.8± 4.1 a 5.4 ± 0.09 21.7 ± 5.2abc 4.7 ± 0.03 25.6 ± 4.4ab

Cuadro 3. Contenido nutricional de las tres especies de agave

Contenido de carbohidratos en piñas de Agave.

El contenido de azúcares reductores en piñas de A. angustifolia, fué menor que en A. cantala (Cuadro 4)

siendo esta diferencia mayor en pencas. Con respecto a los azúcares totales, en el mezontle de Agave angustifolia se

encontró un valor de 233.14 ± 15.7 mg g-1, valor mayor al encontrado en pencas del mismo agave. Datos similares

fueron reportados por Mancilla-Margalli (2000) para A. tequilana var. Azul. Se observó una correlación de ºBx

conazúcares totales con valor r =0.897. La cantidad de fructosa en pencas fue de 306.4 ± 24.4 mg g-1 de muestra

fresca .

Para Agave cantala, los reductores en pencas jóvenes alcanzaron valores de 56.06 ± 7.44 mg g-1 de muestra,

disminuyendo su concentración hacia el mezontle. La cantidad de azúcares reductores totales encontrados en el

Muestra Sólido seco(%)

ºBrix Proteína(%)Cenizas

(%)Fibra insoluble

(%)

Agave potatorum Zucc.

Penca joven 25.64bc 14.10fg 0.88 a 1.13 a 13.5dPenca media 25.80 bc 17.30ef 0.72 a 1.26 a 17.0bcdPenca vieja 19.91c 10.90g 1.05 a 1.36 a 19.0abMezontle 27.59ab 21.70bcd 2.72 a 1.46 a 13.2d

Agave angustifolia Haw.

Penca joven 25.00bcd 24.42 bcd 1.00 a 1.3 a 14.0cdPenca media 25.80 bc 24.98ab 0.88 a 1.2 a 16.0bcPenca vieja 30.24a 25.40 ab 0.88 a 1.2 a 18.0bcMezontle 31.00 a 26.86 a 2.10 a 1.4 a 17.0cd

Agave catala Roxb.

Penca joven 21.48de 20.00def 1.01 a 1.32 a 16.7aPenca media 30.48 a 24.33ab 0.83 a 1.49 a 22.8 aPenca vieja 23.02cde 20.53cde 1.03 a 1.62 a 22.2abMezontle 25.90bc 25.60ab 2.60 a 1.42 a 19.2ab

mezontle fueron de 169.41 ± 25.8 mg g-1, similares a los encontrados en la penca vieja, y valores ligeramente

menores en la parte que corresponde a la penca media y joven (Cuadro 8), lo cual representa un 27% menos a lo

encontrado para A. angustifolia. El contenido de fructosa en las pencas y el mezontle en A. cantala fueron en

promedio de 244 ± 67.65 mg g-1, es decir un 22% menor que para A. angustifolia.

Cuadro 4.Contenido de carbohidratos de las piñas de A. angustifolia Haw. y A. cantala Roxb.

Muestra Reductoresmg g-1

Reductores totales mg g-1 Fructosa mg g-1

A. angustifolia Haw.

Penca joven 1.4 ± 1.0 200.76 ± 6.8 292.26 ± 20.5

Penca media 1.3 ± 0.7 207.02 ± 3.0 300.10 ± 12.0

Penca vieja 1.22 ± 0.3 238.46 ± 17.8 320.54 ± 28.2

Mezontle 0.90 ± 0.2 233.10 ± 15.7 334.86 ± 26.9

A. cantala Roxb.

Penca joven 56.06 ± 6.2 148.28 ± 16.8 211.51 ± 22.5

Penca media 21.6 ± 8.76 157.33 ± 13.0 286.09 ± 15.-0

Penca vieja 18.72 ± 4.29 166.08 ± 17.8 243.02 ± 28.2

Mezontle 9.15 ± 2.22 169.41 ± 15.7 236.6 ± 26.9

Contenido de azúcares en piñas de A. potatorum

Esta especie es de gran demanda en la región de Sola de Vega, Oaxaca, donde el maguey se cultiva pero se

aprovechan magueyes silvestres para la elaboración del mezcal denominado "tobalá". Se encontró que en agave

cultivado con 7 años de edad (fecha en que lo cosechan), el contenido de azúcares reductores promedio fue del orden

de 13.31 ± 1.4 mg g-1, valor relativamente alto comparado con otros agaves al momento del corte. El contenido de

azúcares totales fue de 206.30 ± 41.11 mg g-1, y valores menores fueron encontrados en las pencas.

En pencas de agave silvestre se encontró un 28.5% más de azúcares totales (Cuadro5) y el contenido de

fructosa en la base de las pencas fue similar al mezontle. Se observó también un contenido bajo de azúcares

reductores, con aumento de azúcares totales en la penca joven y vieja. Sobresale en A. Potatorum silvestre el

contenido de fructosa, el cual registra un promedio de 443.67 ± 48.43 mg g-1 equivalente a un 52.5% más que en

Agave potatorum cultivado. Estos resultados indican que el agave que crece de manera silvestre contiene alto

contenido de azúcares reductores totales y fructosa debido probablemente a la edad, al tipo de suelo, y al stress

hídrico al que se ve sometida durante su desarrollo.

Cuadro 5 Contenido de carbohidratos en Agavepotatorum Zucc., cultivado y silvestre.

Contenido de fructooligosacáridos en hojas de A. angustifolia Haw.

El contenido de azúcares reductores en hojas de Agave angustifolia (HV,HMb y HJb) fue muy similar en

las tres partes de la hoja con la misma ubicación, las cuales tuvieron un promedio de 5.4 ± 1.8 mg g-1. El contenido

de azúcares totales fue mayor en la parte basal de las hojas medias y viejas y valores ligeramente menores se

encontraron en hojas jóvenes, observándose un gradiente de concentración de la parte apical de las hojas hacia la

parte basal de las misma1muestra el contenido de azúcares en hojas de Agave angustifolia, en ella se observa que la

mayor concentración de fructosa se encontró en la parte basal de las hojas medias y viejas (HMb) (HVb) las cuales

tuvieron un valor promedio de 223± 7.5 mg g-1.

Jb Jm Mb Mv Vb Vm Jb Jm Mb Mv Vb Vm Jb Jm Mb Mv Vb Vm

Hojas de agave

0

50

100

150

200

250

Con

cent

raci

on d

e az

ucar

es m

g g-

1

Desviac ion/estandartReductoresT otalesFruc tosa

Figura 1. Contenido de azúcares reductores, totales y fructosa en hojas de Agave angustifolia Haw.

Reductoresmg g-1

Azúcares totalesmg g-1

Fructosamg g-1Muestra

Cultivado Silvestre Cultivado Silvestre Cultivado Silvestre

Penca joven 11.70 7.52 170.09 285.58 270.55 423.42

Penca media 14.51 5.17 138.20 287.90 206.61 418.61

Mezontle 13.72 3.02 206.30 288.12 264.97 490.48

Contenido de oligosacaridos en hojas de Agave potatorum Zucc.

La Figura 2 muestra el contenido de azúcares reductores, totales y fructosa, en hojas de Agave potatorum, en ella

se observa que el contenido de azúcares reductores varía entre valores de 5.85 ± 3.68 a 11.96 ± 4.26 mg g-1. Se

observó también que la mayor concentración de los azúcares totales se encuentran en la parte basal de las hojas

medias, valor dos veces menor al reportado por Cruz, (2001) en hojas fertilizadas de Agave angustifolia.

Jb Jm Vb Vm Mb Mm Jb Jm Vb Vm Mb Mm Jb Jm Vb Vm Mb Mm

Hojas de agave

0

20

40

60

80

Con

cent

raci

on e

n m

g.gr

-1 d

e m

uest

ra

Desviac ion /Es tandarReductoresT otalesFructosa

Figura 2. Contenido de oligosacaridos en hojas deAgave potatorum Zucc.

Contenido de azúcares en hojas de Agave cantala Roxb.

La Figura 3 muestra el contenido de carbohidratos de las hojas de Agave cantala, en los cuales los azúcares

reductores fueron del orden de 9.73 ± 1.38 a 23.89 ± 1.17 mg g-1. La cantidad de azúcares totales, en las hojas joven,

media y vieja en su parte basal presentan valores de 68.73 ± 5.07, 83.08 ± 4.35 mg g-1 y 49.26 ± 1.9 respectivamente,

valores menores fueron encontrados en la parte media. La cantidad de fructosa en las hojas joven, media y vieja en

su parte basal fue de 57.8 ± 6.53, 41.06 ± 8.98 y 10.95 ± 1.14 mg g-1, valores menores a los encontrados en las hojas

de Agave angustifolia. Los resultados nos indican que la mayor cantidad de fructosa se encuentra en la parte basal de

las hojas joven y medias.

Jb Jm Vb Vm Mb Mm Jb Jm Vb Vm Mb Mm Jb Jm Vb Vm Mb Mm

Hojas de Agave

0

20

40

60

80

100C

once

ntra

cion

en

mg.

g-1

de m

uest

raDesviac ion/es tandarReductoresTotalesFructosa

Figura 3. Contenido de azúcares en hojas deAgave cantala Roxb.

Identificación de Fructanos por TLC

La identificación de los fructanos de las tres especies fue realizada para establecer diferencias y

similaridades entre ellas. Los perfiles cromatograficos se muestran en la Figura 4. La línea 1-8 corresponde a

fructanos de alto y bajo DP de las tres especies en estudio.

A. angustifolia

En el primer carril se encuentra el estándar de achicoria (Cichorium intybus L.) en el carril 2 y 3 se

aplicaron muestras del mezontle de A. angustifolia de alto y bajo DP respectivamente, en el carril 2 se observa que la

mayor parte de la muestra permanece en la parte basal del cromatograma el cual coincide con el estándar de inulina

de achicoria y en el carril 3 se observan Glucosa y fructanos de bajo DP que coincidieron con los estándares de F-G,

1-kestosa, nystosa, y 1,1,1-kestopentaosa. En los fructanos extraídos del mezontle de esta especie, como se observa

en la figura 9 prevalece la presencia de (DP) 20, lo cual coincide con el porcentaje de fructanos de alto DP

obtenidos durante la separación de la muestra y con lo reportado por Leach y López, 2005. En este cromatograma se

observa la presencia de una inulina neoserie ubicada entre la F-G y la 1-kestosa llamada neo-kestosa, coincidiendo

estos resultados con lo reportado para A. tequilana por López M.G. y col., 2003.

A. potatorum.

En el carril 4 y 5 se aplicaron fructanos del mezontle de A. potatorum encontrando en la TLC que esta

especie contiene fructanos de alto DP (carril 4), así como fructanos de bajo DP (carril 5), se observa también una

mayor proporción de glucosa que cualquiera de las otras muestras de agaves a la misma concentración. En el carril 4

los fructooligosacáridos coinciden con los estándares de fructosa-sacarosa (DP2), nystosa (DP4) y casi no se observa

la 1-kestosa ni la 1,1,1-kestopentaosa (DP5) y de una manera similar a A. angustifolia se encontró también la neo-

kestosa descrita por Shiomi, 1989 y reportada para agaves por López M. G. y col., 2003.

A. cantala

En el carril 6 de la figura 9se observa el perfil cromatográfico del mezontle de A. cantala y en donde se

observa la presencia de fructooligosacaridos con un DP≥20 que coincide con el estándar de achicoria (Cichorium

intybus L.). En el carril 7 se observa principalmente glucosa aunque comparativamente en menor proporción que

para A. potatorum. Al realizar la separación por grado de polimerización, se encontró en el sobrenadante o de bajo

DP una mayor proporción glucosa, y en menor proporción F-S, 1-kestosa,. nystosa y 1,1,1, kestopentaosa

ligeramente menor a lo encontrado para A. angustifolia.. Cabe mencionar que en las tres especies se encontró el

isómero de la kestosa (neokestosa) similar al encontrado para otros Agaves (Leach y López, 2005).

Figura 4. Cromatografía en capa fina de los fructanos de Agave de tresespecies.

GLUC

F- S

DP=3 (neokestosa)

DP=3

DP= 4

DP=5

1 2 3 4 5 6 7

Meta 3. Hidrólisis térmica de la inulina

.Determinación de Azúcares reductores directos durante la hidrólisis a 3 pHs.

La figura 5 muestran los resultados de azúcares reductores directos de A. angustifolia Haw y Cichorium

intibus a diferentes pHs respectivamente. En la hidrólisis a pH 5.5 de A. angustifolia Haw se observa un incremento

drástico de la concentración de un valor inicial de 0.154 mg/g a un valor máximo de 153.34 mg/g a las 72 horas

dicha concentración coincide con el cromatógrama de la figura 12 en el que se observa que a este tiempo se ha

hidrolizado toda la inulina. Así mismo a pH 5.0 presenta el mismo comportamiento, pero las concentraciones son

menores alcanzando la mayor concentración a las 64 horas con un valor de 121.99 mg/g, manteniéndose casi

constante hasta el final de la hidrólisis. Sin embargo a pH 7.8 no se observa ningún incremento.

A pH 5.0 y 5.5 el estándar de achicoria muestra el mismo comportamiento que el de agave, con valores

ligeramente menores.Como se observa en los resultados el pH 5.5 es el pH óptimo para la hidrólisis de inulina,

resultados similares encontró Roover (1999) en Achicoria.

0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88

0

20

40

60

80

100

120

140

160

ARDpH 5.0pH 5.5pH 7.8

Figura5. - Azucares reductores directos de A. angustifolia Haw generados durante la hidrólisis térmica (95ºC) a diferentes pHs.

Contenido de azucares de A. potatorum Zucc durante el cocimiento.

La determinación de azucares reductores, fructosa y azucares totales del Agave potatorum durante el

cocimiento en un horno tradicional se muestran en la figura 6. El contenido de azucares reductores muestra una

concentración inicial de 49.32 mg/g, esta concentración aumenta conforme el tiempo del cocimiento alcanzando una

concentración máxima de 133.5 mg/g, conforme el tiempo del cocimiento la inulina es hidrolizada y la concentración

de azucares reductores aumenta, estos valores son importantes para llevar el control del proceso de cocción del

agave.

El contenido de azucares totales presenta una concentración inicial de 124.72 mg/g, conforme el tiempo del

cocimiento avanza alcanza un valor máximo de 172.88 mg/g. Mientras que el contenido de fructosa presenta un valor

inicial de 77.55 y durante el tiempo del cocimiento alcanza una concentración máxima de 136.7 mg/g.

En la figura también se observa que valores de azucares totales y fructosa, además de azucares reductores

pueden tomarse en cuenta para llevar el control durante el cocimiento del agave, tomando en cuenta estos análisis de

los azúcares nos ayudaría para evitar la formación de compuestos no deseables en el proceso.

Según Cedeño (1995) que el tiempo de cocimiento, así como el pH y la temperatura son de gran

importancia para la hidrólisis de inulina, para obtener los azucares reductores disponibles para la fermentación,

mientras Tellez (1998) menciona que cuando el agave se somete a altas temperaturas puede degradar los azúcares

por reacciones de Maillard y producir otros compuestos que pueden ser deseables o no para la fermentación.

0 12 24 36 48 0 12 24 36 48 0 12 24 36 480

50

100

150

200

250

Figura 6 Contenido de azucares reductores, azucares totales y fructosadurante el cocimiento en un horno tradicional.

Identificación de azucares en cromatografía en capa fina durante el cocimiento en un horno tradicional.

Además de otras especies de agave el A. potatorum Zucc se utiliza para la elaboración del mezcal, el cocimiento es

una de las etapas importantes para la elaboración de la bebida, debido a que el agave presenta un polímero de

fructosa o carbohidrato no reductor que tiene que hidrolizarse para obtener azucares reductores que permitan su

fermentación.

En la figura 7 se observa la hidrólisis de inulina del agave durante el cocimiento en un horno tradicional, la hidrólisis

se efectuó durante 48 horas, en la figura se observa en tiempo cero la presencia de inulina, mientras que a las 12 y

24 horas se observa manchas tenues correspondientes a 1-kestosa (DP3), 1,1 kestotetraose (DP4), 1,1,1

kestopentaose (DP5)…. Además de hexosas, a partir de las 36 horas ya no se observa la presencia de inulina, a esta

hora solo se observa manchas con una coloración entre roja y gris esto indica la presencia de glucosa y fructosa,

como se puede observar todavía hay presencia de inulina por lo que el tiempo de cocción que dan los productores en

esta especie no es suficiente para hidrolizar toda la inulina y como losmicroorganismos solo utilizan los azucares

reductores lsu rendimiento disminuye.

Figura 7. Cromatografía en capa fina de la inulina del A. potatorumZucc, durante el cocimiento en un horno tradicional.

Identificación de azucares de la hidrólisis térmica de inulina del Agave potatorum Zucc.

En la figura 8 se observa la hidrólisis del Agave potatorum sometida a condiciones controladas de pH y

temperatura ( pH 4.5 y a 85 ºC) , en el tiempo cero se observa la presencia de inulina en esta especie, además se

observa la presencia de azucares que se forman durante la hidrólisis térmica, a las 24 horas se observan manchas

tenues correspondientes a 1-kestosa (DP3), 1,1 kestotetraose (DP4), 1,1,1 kestopentaose (DP5) y así como la

presencia de hexosas, la presencia de estos compuestos se observa hasta las 48 horas, sin embargo la inulina ya no se

observa desde las 36 horas por lo que a este tiempo se puede detener la hidrólisis de inulina del agave a estas

condiciones.

Estudios realizados por López y col. (2002) en la identificación de carbohidratos en cromatografía en capa

fina de la hidrólisis de inulina del Agave angustifolia Haw a 95 ºC y a pH de 5.0 encontraron que la inulina en esta

especie es hidrolizado completamente a las 48 horas. Mientras French (1993) menciona que la hidrólisis ocurre bajo

condiciones deseables de pH y temperatura, que el efecto principal es acortar la molécula de inulina y producir los

azucares libres.

G F

DP3

DP4

DP5

0 12 24 36 48Horas

Se concluye que cada especie presenta diferente longitud de cadena de inulina, por el tiempo de la hidrólisis del

Agave potatorum, en comparación de los estudios realizados por López y col. (2002), por lo tanto es necesario tomar

en cuenta los factores como el pH y la temperatura.

Figura 8 Cromatografía en capa fina de la hidrólisis de inulina deA. potatorum Zucc a 85 ºC y a pH 4.5

La hidrólisis de inulina del Agave potatorum sometida a condiciones controladas de pH y temperatura (pH de 5.5 y a

85 ºC), muestra que a las 24 horas se observa manchas tenues, estos corresponden a DP3, DP4, DP5, además de

glucosa y fructosa, además de inulina, mientras que a las 36 horas solo se observa manchas de coloración rojo y

grisácea estos corresponden a moléculas de glucosa y fructosa, a este tiempo la inulina esta completamente

hidrolizada.

Estudios realizados por López y col. (2002) identificaron carbohidratos de la hidrólisis de inulina del Agave

angustifolia Haw a pH de 5.0 y a 95 ºC encontraron que a las 48 horas la inulina es hidrolizado en esta especie.

Se concluye que la temperatura, además del pH son factores importantes para la hidrólisis de inulina, por lo

tanto el tiempo de la hidrólisis de la inulina del Agave potatorum sometida a 85 ºC es menor en comparación de los

resultados encontrados por López y col. (2002).

0 12 24 36 48 60 72 84Horas

G F

DP3

DP4

DP5

La hidrólisis del Agave potatorum sometida a condiciones controladas de pH y

temperatura ( pH 4.5 y a 95 ºC) a las doce horas se observa manchas que corresponde al DP3, DP4, DP5, además de

glucosa y fructosa, por lo tanto a este tiempo la inulina se encuentra completamente hidrolizado. Además López

(2002) encontró en la identificación de carbohidratos en la hidrólisis de inulina del Agave angustifolia Haw a pH de

5.0 y a 95 ºC que la inulina de esta especie se hidroliza a las 48 horas. En la figura 17 se observa la hidrólisis del

Agave potatorum sometida a condiciones controladas de pH y temperatura (pH 5.5 y a 85 ºC) en esta figura aparece

que a las 12 horas la inulina está hidrolizada completamente, se puede apreciar que a esta hora solo se aprecia la

glucosa y fructosa y a este pH ya no se observan los fructooligosacaridos.

El tiempo de la hidrólisis va a depender de la temperatura y del pH, así como de la longitud de la cadena de

inulina de cada especie de agave, por lo tanto es importante tomar en cuenta la temperatura con la finalidad de evitar

la formación de otros compuestos no deseables.

La hidrólisis del Agave potatorum sometida a condiciones controladas de pH y temperatura (pH 4.5 y a 105 ºC),

a partir de las doce horas se encontró la presencia de glucosa y fructosa, además a este tiempo la inulina está

completamente hidrolizada.

La hidrólisis del Agave potatorum sometida a condiciones controladas de pH y temperatura (pH 5.5 y a 105 ºC)

se presenta la hidrólisis de inulina del agave potatorum Zucc a pH de 5.5 y a la misma temperatura se observa que a

las doce horas solo se observa la presencia de glucosa y la inulina se encuentra completamente hidrolizado. Es

importante conocer el tiempo de la hidrólisis de inulina, debido que cada especie tiene diferente longitud de cadena

de inulina, además el tiempo de la hidrólisis depende de la temperatura.

Determinación de azucares reductores directosdurante la hidrólisis térmica de inulina del Agave potatorum.

La figura 9 muestra se presenta los resultados de azucares reductores directos obtenidos en la hidrólisis de

inulina del Agave potatorum sometida a condiciones controladas de pHs (4.5 y 5.5) y temperatura (85 ºC), se observa

una concentración inicial de 46.51 mg/g para el pH de 4.5 y de 42.59 mg/g para el pH de 5.5, conforme el tiempo de

la hidrólisis de inulina la concentración de azucares reductores aumenta, a partir de las 48 horas los valores empiezan

a ser casi constantes en los dos pHs, por lo que a esta hora se puede detener la hidrólisis de la inulina del agave

potatorum Zucc. Estudios realizados por López y col. (2002) durante la hidrólisis de inulina de Agave angustifolia

Haw a pH de 5.0 y a 95 ºC obtuvieron que a las 48 horas la inulina es hidrolizada completamente; mientras que a pH

de 5.5 es hidrolizado a las 40 horas y a pH 7.8 no hubo hidrólisis de inulina.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 12 24 36 48 60 72 84

Tiempo (horas)

Con

cent

raci

ón e

n m

g/g

pH 4.5 pH 5.5

Figura 9. Azucares reductores directos de A. potatorumdurante la hidrólisis a 85 ºC a dos pHs.

En la figura 10 se observa la hidrólisis de inulina del Agave potatorum a condiciones controladas de pHs

(4.5 y 5.5) y temperatura (95 ºC), con una concentración inicial de 49.89 mg/g para el pH de 4.5 y para el pH de 5.5

con una concentración inicial de 44.42 mg/g, se observa que para el pH de 4.5 a las 24 horas los valores empiezan a

ser constantes; mientras que para el pH de 5.5 los valores empiezan a ser constantes a partir de las doce horas.

La hidrólisis de inulina del Agave Potatorum a condiciones controladas de pHs (4.5 y 5.5) y temperatura

(105 ºC), empieza con una concentración de 46.35 mg/g en el pH de 4.5 y para el pH de 5.5 de 45.12 mg/g, a las 12

horas alcanzan una concentración de azucares reductores de 121.11 mg/g para el pH de 4.5 y de 124.56 mg/g en el

pH de 5.5, después de este tiempo los valores empiezan a disminuir.

French (1993) menciona que la hidrólisis de la inulina se debe de realizar con cuidado especial para evitar la

formación de otros subproductos. Además estudios realizados por Blecker et al (2002) mencionan que la velocidad

de formación de fructosa durante la hidrólisis a condiciones controladas de pH y temperatura, depende de la longitud

de la cadena de inulina, por lo que una cadena corta se transformará rápidamente en fructosa que una cadena larga.

Mientras López (2002) encontró en la hidrólisis de inulina a 95 ºC y pH 5.0 del A. angustifolia Haw obtuvo que a las

48 horas la inulina es hidrolizada completamente; mientras que a pH de 5.5 es hidrolizado a las 40 horas y a pH 7.8

no hubo hidrólisis de inulina.

Determinación del contenido de azucares totales de la hidrólisis térmica.

Los valores obtenidos de la hidrólisis de inulina del A. potatorum a condiciones controladas de temperatura (85 ºC) y

a dos pHs (4.5 y 5.5), fueron de 124.81 mg/g en el pH de 4.5, conforme el tiempo de la hidrólisis de la inulina del

agave, a las 48 horas alcanza una concentración máxima de 146.05 y valores similares se obtuvo para el pH de 5.5.

La hidrólisis de inulina del Agave potatorum a condiciones controladas de temperatura (95 ºC) y a dos pHs (4.5

y 5.5), varió de 122.94 mg/g en ell pH de 4.5 y 120.84 mg/g en el pH de 5.5, a las 24 horas estos valores alcanzaron

una concentración máxima de 137.63 mg/g en el pH de 4.5 y de 144.75 en el pH de 5.5, después de este tiempo los

valores de la concentración empezaron a disminuir.

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