Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1)

QFB Elizabeth Ernestina Godoy Lozano

D i r e c t o r :D r. D a n i e l E . N o y o l a C h e r p i t e l

A s e s o r e s :D r. C h r i s ti a n A . G a r c í a S e p ú l v e d a D r. F l a v i o M a r tí n e z M o r a l e s

Defensa de Tesis

2

Infecciones Respiratorias Agudas• IRAS son causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo.• En México

▫ 3° causa de muerte en niños <5años▫ Tasa de mortalidad 2005

18.8 por 100 000 habitantes • En niños menores de 5 años

▫ Tasa de mortalidad 2008 28.8 por 100 000 habitantes

• Los principales virus que causan IRAS son:

Virus de influenza A y BRinovirus VSR hMPVParainfluenza 1-4

Genómica de influenza A

Segmento Nombre de la proteína Longitud (nt)

1 PB2 Subunidad 2 de la polimerasa 2341

2 PB1 Subunidad 1 de la polimerasa 2341

3 PA Subunidad de la polimerasa 2233

4 HA Hemaglutinina 1778

5 NP Nucleoproteína 1565

6 NA Neuraminidasa 1413

7M1 Proteína de Matriz

1027M2 Proteína integral de

membrana

8NS1 Proteína no-

estructural 1 890NS2 Proteína no-

estructural 2

13,588 nt

Brown EG. Influenza virus genetics. Biomed & Pharmacother. 2000; 54:196-209

50-120 nm

Complejo Ribonucleoproteico

4

Variación genéticaDrift Antigénico

Derivación antigénicaShift Antigénico

Desplazamiento antigénico

• Cambios genéticos puntuales que llevan a modificaciones antigénicas menores.▫ Epidemias

• Cambios genéticos por rearreglo que llevan a modificaciones antigénicas mayores. ▫ 10-40 años▫ Rearreglo entre virus de

influenza humana y otras especies

▫ Pandemias

5

Influenza A (H1N1) pandémica• Marzo-abril 2009▫ Neumonías atípicas▫ Adultos jóvenes

• Nueva variante de la influenza A• 11 junio 2009 Nivel 6• Primera pandemia del Siglo XXI

6

Justificación

Problema de salud pública

Infecciones respiratorias y del

virus de influenza A

Cambios y diferencias

7

Objetivo general

•Definir las características epidemiológicas, virológicas y

genómicas de cepas de la nueva variante del virus de

influenza A (H1N1) responsables de pandemia en la

ciudad de San Luis Potosí.

Objetivos particulares1. Realizar un análisis epidemiológico de la nueva

variante del virus de influenza A (H1N1).

2. Conocer las secuencias del genoma completo de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).

3. Realizar un análisis de polimorfismos de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).

4. Realizar un análisis filogenético de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).

9

Materiales y métodos

10

Muestras

Sospecha de infección

Hospital Central “Dr. Ignacio Morones Prieto”

Laboratorio de Virología, departamento de

Microbiología, UASLP.

Exudado faríngeo, nasofaríngeo y lavado

nasofaríngeo

n=706

Extracción RNA viral

High Pure Viral RNA kit; Roche Diagnostics

Síntesis de cDNA

Transcriptasa reversa

Oligonucleótido UniFlu-RT

Detección influenza A(H1N1) pandémica

PCR anidada

8(NS)

Amplicón 429pb

Gómez-Gómez (2010)

11

Diseño de oligonucleótidos• Obtener secuencias “Influenza Virus Resource” NCBI

• Alineamiento Clustal W

• Robinson´s Alignment Reformatting

• Hairpins, homodímeros, heterodímeros y específicidad

12

Oligonucleótidos de amplificación genómica completa

Segmento Nombre Secuencia5’→3’

Tamaño amplicón (bp)

Tm (°C) Referencia

1 (PB2)SwPB2-F ATGGAGAGAATAAAAGAAC

2279 58

(Garcia-Sepulveda,

2009)

SwPB2-R TAATTGATGGCCATCC

2 (PB1)SwPB1-F ATGGATGTCAATCCGA

2273 56SwPB1-R TATTTTTGCCGTCTGAG

3 (PA)SwPA-F ATGGAAGACTTTGTGC

2151 59SwPA-R CTACTTCAGTGCATGTG

4 (HA)SwHA-F ATGAAGGCAATACTAGTAG

1696

56

SwHA-R CATATTCTACACTGTAGAGAC

5 (NP)SwNP-F ATGGCGTCTCAAGG

1496SwNP-R TCAACTGTCATACTCCTC

6 (NA)SwNA-F ATGAATCCAAACCAAAAG

1409SwNA-R TTACTTGTCAATGGTAAATG

7 (M)SwMP-F TAACCGAGGTCGAAA

970SwMP-R TACTCTAGCTCTATGTTGA

8 (NS)SwNS-F ATGGACTCCAACACC

890SwNS-R TTAAATAAGCTGAAACGAG

13

Oligonucleótidos para secuenciación genómica

1 1746

Frg 1Frg 2

Frg 3Frg 4

pb

115 pb83 pb 122 pb

61 pb

55 pb

4(HA)

14

Segmento Nombre Secuencia5’→3’

Tamaño amplicón

(bp)Referencia

1 (PB2)

SwPB2-F1 AAAGAACTGAGAGATCTA 504

(Godoy-Lozano, 2009)

SwPB2-R1 CCACTTCATTTGGGAASwPB2-F2 AGGTTGAAACATGGTACC 740SwPB2-R2 GCTCTTCTCCCAACCASwPB2-F3 GCTAACGGGCAACCT 889SwPB2-R3 CACATTCACAGTCAATGAGGSwPB2-F4 CCTAAGGCAACCAGAAGC 491SwPB2-R4 TGGCTGTCAGTAAGTATGCTAG

2 (PB1)

SwPB1-F1 ATGGATGTCAATCCGACTC 616SwPB1-R1 CTATTGTTCTTTGCGTGACCSwPB1-F2 AGGAAGGCTAATAGATTTCTTA 639SwPB1-R2 AGCATTTCTGCTGGTATSwPB1-F3 GAGTGGTTCAGAAACATC 738SwPB1-R3 TAACTCAAATGATCTTCTCGTSwPB1-F4 CAGATGGCTCTTCAATTGT 639SwPB1-R4 TTTTTGCCGTCTGAGTTC

3 (PA)

SwPA-F1 GGAAGACTTTGTGCGAC 703SwPA-R1 TCCATCTACATAGGCTCTAAASwPA-F2 CAGTAGGAGTCTATGGGAT 607SwPA-R2 TTTGCAGTCATCAAAGTCTASwPA-F3 TTGGAAGCAGGTGCT 700SwPA-R3 GGTTCCATTGGTTCTCACSwPA-F4 TGATGTGGTGAACTTTGTAAG 600SwPA-R4 AGTGCATGTGTGAGGA

4 (HA)

SwHA-F1 CCGCAAATGCAGACACAT 510SwHA-R1 TTAATGTAGGATTTGCTGASwHA-F2 GGCCCAATCATGACTCGA 501SwHA-R2 AGGCTGGTGTTTATAGCACCSwHA-F3 CCGAGATATGCATTCGC 636SwHA-R3 CGTTTCCAATTTCCTTGGCSwHA-F4 TTGATGATGGTTTCCT 387SwHA-R4 TTAGAGCACATCCAGAAA

15

Amplificación genómica•PCR anidada•Taq:Pfu•Secuenciación Programa de Termociclaje

Primera y segunda PCR

°C Tiempo Ciclos

95 5 min 1

95 20 seg35Tm 30 seg

72 90 seg72 5 min

14 5 min

16

Secuenciación genómica• Laboratorio Nacional de Genómica para la

Biodiversidad del CINVESTAV-Irapuato•Electroferogramas▫4peaks

17

Mutaciones asociadas a la resistencia a fármacos

•Zanamivir▫D-151▫N, G, E o V

•Oseltamivir▫H274Y y E119V

Neuraminidasa

18

Análisis bioinformático• Homología▫ BLAST

• dN/dS▫ “Codon-based Z-test of selection”▫ “Position-wise based selection estimation (HyPhy)”▫ MEGA 5

• Recombinación y similaridad▫ SimPlot versión 3.5.1

• Modelo evolutivo▫ FindModel

• Inferencia del ancestro común más reciente▫ BEAST v1.5.4, Tracer v1.5▫ TreeeAnnotator v1.5.4, FigTree v1.3.1

19

Resultados y discusión

20

Epidemiología• 1° marzo 2009- 9 abril 2010• 706 muestras

• 133 (18.8%) positivas• 17 muestras

21

Secuencias generadas• 2 genomas completos• 7 parciales

▫ 8(NS)• 8 parciales

▫ Mas de 1 segmento• Superposición para generar secuencia completa

▫ Sin ambigüedad

Segmento No.

1(PB2) 11

2(PB1) 11

3(PA) 11

4(HA) 9

5(NP) 11

6(NA) 10

7(M) 9

8(NS) 7

99% similitud

22

dN/dS• Hipótesis de neutralidad

▫ dN/dS=0 • Hipótesis de selección

purificadora▫ dN<dS

• Hipótesis de selección positiva▫ dN>dS

1 21 41 61 81 101 121 141 161 181 201 221 241 261 281 301 321 341 361 381 401 421 441 461 481 501 521 541 561

-4-3.5

-3-2.5

-2-1.5

-1-0.5

00.5

1

Hemaglutinina (HA) dN-dS

Proteína Valor p Hipótesis

PB2 0.001

Selección purificadora

PB1 0.00003

PA 0.004

HA 0.0004

NP 0.0001

NA 0.04

M1 0.008

M2 0.162

NS1 0.341

NS2 0.148

23

•Cepas circulantes en una misma temporada son muy parecidas.

•El virus tiende a la conservación después de venir de una serie de cambios que provocaron que el virus saltara de hospedero a hospedero.

•dN/dS Selección purificante

•Un año de circulación.

24

Análisis de similitud• Secuencias consenso por hospedero

Locales

Porcino

Humano

Aviar

25

Análisis de similitud• Secuencias consenso por subtipo

LocalesH1

H2H5

H9H4H3

26

Análisis de similitud• Secuencias consenso por región geográfica

LocalesNorte América

Asia

Europa

27

Análisis de Bootscan

Norte América

Europa

Asia

• Secuencias consenso por región geográfica

28

Origen geográfico

Segmento Hospedero Origen geográfico1(PB2) porcinos Asia2(PB1) humanos Oceanía3(PA) aves Norte América4(HA) porcinos Asia5(NP) porcinos Asia6(NA) aves Europa7(MP) aves Asia8(NS) porcinos Norte América

29

Fraser C. Pandemic Potencial of a Strain of Influenza A (H1N1): Early Findings. Sciencexpress. 11 Mayo 2009.

30

Eventos de recombinación

Segmento Recombinación Similitud Similitud de secuencia restante

1(PB2) 876-1124 porcinos Asia porcinos Norte América

3(PA) 1-2771014-1170

aves Europaaves Oceanía aves Norte América

4(HA) 1-300 porcinos Europa porcinos Norte América

6(NA) 1-2531330-1349

aves Oceaníaaves Sudamérica aves Europa

7(MP) 196-225850-1027

aves Oceaníaaves Europa aves Asia

31

•Mutaciones puntuales•He et al., 2009 ▫Recombinación

▫Diversidad mayor en virus de la influenza aviar.

32

•No existe ningún otro reporte que documente recombinación entre cepas de influenza.

•Nosotros encontramos:▫Recombinación de cepas de distintas regiones.▫Virus de influenza humana.

•Estos datos indican que además de la derivación y desplazamiento antigénico la diversidad genética de influenza también puede generarse por recombinación.

•Se desconoce el impacto de este mecanismo en la generación de nuevas variantes de influenza.

Ancestro común más reciente

JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE FEB MAR 2008 2009

7(M1)

6(NA)

3(PA)

2(PB1)5(NP)

1(PB2)4(HA)

8(NS1)

7(M2)8(NS1)

34

Ancestro común más recienteSegmento Smith (2009) Godoy (2010)

1(PB2) 9 SEP 2008 11 ENE 2009

2(PB1) 24 OCT 2008 16 DIC 2008

3(PA) 7 OCT 2008 2 NOV 2008

4(HA) 28 AGO 2008 30 ENE 2009

5(NP) 27 MAR 2008 20 DIC 2008

6(NA) 8 AGO 2008 19 OCT 2008

7(M1)3 AGO 2008

8 JUL 2008

7(M2) 16 MAR 2009

8(NS1)21 MAY 2008

21 FEB 2009

8(NS2) 22 MAR 2009

35

•El MRCA estima la fecha más probable en que el ancestro putativo comenzó a circular.

•A medida que más información se compara, la estimación se vuelve más refinada.

•Nuestro estudio incluye solamente secuencias mexicanas.

•Periodo de estudio: 30 marzo 2009 - 9 abril 2010

36

Tasas de mutación global

Segmento Tasa de mutación x 10-3(s/s/a) §1(PB2) 6.32

2(PB1) 5.31

3(PA) 4.22

4(HA) 17.6

5(NP) 6.53

6(NA) 6.30

7(M1) 5.09

7(M2) 49.5

8(NS1) 17.7

8(NS2) 58.5 § Substituciones nucleotídicas por sitio por año.

37

Mutación por posición codónicaPA

NS1

38

Tasa de mutación•Es mayor a lo anteriormente reportado.•El virus está evolucionando rápidamente.•Etapas tempranas de la evolución del virus hay una

gran diversidad.•Posteriormente predomina la cepa biológicamente

más exitosa.

39

Resistencia a antivirales

•No se encontraron las mutaciones▫Zanamivir 151▫Oseltamivir 119 y 274

•Presión selectiva•Harvala (2010)▫Cepas resistentes a oseltamivir

•OMS▫11 agosto 2010▫120 cepas resistentes a oseltamivir

40

Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad

0.0 100 200 300 400

5(NP)

445

41

0.0 100 200 300 400

M1

437

Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad

42

•Proceso evolutivo ▫Perpetuarse.

•Al principio de la pandemia se originó un número elevado de experimentos biológicos destinados a generar mucha diversidad con la posibilidad de que alguna de las cepas lograra colonizar a un hospedero y convertirse en una cepa biológicamente exitosa.

43

Conclusión•MRCA es más reciente.• La tasa de mutación global es mayor.•No se encontraron mutaciones que confieren

resistencia a antivirales.• La recombinación de segmentos del virus de la

influenza entre cepas circulantes en diversas regiones y hospederos es una posible manera en la que se puede explicar la diversidad de estos virus.

44

Actividades realizadas durante la maestríaFebrero 2009 SLP,SLPCurso sobre Infecciones Virales: Epidemiología, diagnóstico molecular y aplicación clínica

Junio 2009 SLP,SLPCurso sobre la Tecnología del ADN Recombinante: Producción y purificación de Taq ADN polimerasa

Septiembre 2009 SLP,SLPAsistente a la I Reunión Académica de Enfermedades infecciosas y su prevención y a la 8ª Reunión Internacional de vacunas

Octubre 2009 Guadalajara, JaliscoAsistente al XXXIV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica

Octubre 2009 SLP, SLPParticipación como ponente durante la 16ª Semana de Ciencia y Tecnología

45

Noviembre 2009 Merida, YucatánAsistente al VI Congreso Nacional de Virología

Mayo 2010 Guadalajara, JaliscoCartel XXXV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica “Hospitalización asociada a infección por virus de influenza pandémica A(H1N1) 2009 e influenza estacional en pacientes menores de 5 años”. Godoy-Lozano; Contreras-Treviño; Aranda-Romo; Lovato-Salas; Matienzo-Serment; Hernández-Salinas; Barrios-Compeán; Ochoa-Pérez; García-Sepúlveda; Noyola-Cherpitel. Facultad de Medicina. UASLP. SLP,SLP.

Aportaciones a GenBankGU811749, GU811750, GU811751, GU811752, GU811753, GU811754, GU811755, GU811756, GU811757, GU811758.

46

Manuscritos•Pandemic influenza A(H1N1) 2009 and respiratory

syncytial virus associated hospitalizations. Lovato-Salas; Matienzo-Serment; Monjarás-Ávila, Godoy-Lozano, Comas-García; Aguilera-Barragán; Durham-González; Contreras-Vidales; Ochoa-Pérez; Gómez-Gómez; García-Sepúlveda; Noyola . En revisión en Journal of Infection.

•Viral DNA Extractions from Blood Using Laudry Detergent. Guerra-Palomares; Godoy-Lozano; Noyola; García-Sepúlveda. En revisión en Nucleid Acid Research.

47

•CONACYT•Asesores• Laboratorio de Virología •Familia•Amigos

Agradecimientos

Gracias