Virología Ambiental

María Eugenia Galeano Dinatale, M.Sc.Universidad Nacional de Asunción

Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud

Dpto. de Biología Molecular y Genética

e-mail: maruphd@hotmail.com

Universidad Nacional de Asunción

Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud

IICS - UNA

Mimivirus Parvovirus

18 nm

Bacteriofago

Influenza virus

Diferente Estructura / Propiedades de superficie

Envueltos (Hidrofóbico)- No envueltos (Hidrofílico) Genoma: RNA ó DNA

Recordemos.....Virus. Características generales:

DNA

Diferentes

Tamaños/Formas

• Son tan pequeños por lo que pueden actuar como partículas coloidales

en el ambiente, pueden interactuar con vários medios y matrices (ej:

aire, agua, desechos, superficies).

Submicroscópicos

Parásitos intercelulares obligados

Biológicamente activos sólo en el huésped

(animal, humano, vegetal o bacteriano)

• Vários procesos de

transporte, dilución, secuestro, degradación e

inactivación...

Ambiente

• Directa

• Indirecta

• Vector

• Vehículos

TransmisiónRespiratoria

Fecal - Oral

Gotas

(dia >20 μm)

Aerosoles

(dia <5 μm)

Agua Alimentos Fomites/Superfícies

*Bacterias: Campylobacter spp, Clostridium perfringens, Salmonella spp.,

Shigella spp., Staphylococcus spp. Escherichia coli.

*Protozoarios: Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Toxoplasma gondii.

*Virus: Norovirus, Hepatitis A, Rotavirus, Hepatitis E.

Modificado de: Mead et al. 1999. Emerg Infect Dis. 5(5):607-25.

CONTAMINACIÓN MICRIOBIOLÓGICA DE

LOS ALIMENTOS y AGUAS DE CONSUMO

13%7%

80%

BACTERIAS

PROTOZOARIOS

VIRUS

Virología Ambiental

Aspecto aplicado de la Virología.

• Estudia a los virus en ambientes acuáticos, suelo,

alimentos, superfícies o aerosoles.

Virus: ¿Cuales?

• Virus entéricos ó de transmisión fecal-oral

• Virus respiratorios

• Virus de importancia agroganadera

-Parámetros de calidad de agua/alimentos: Coliformes

Fecales y Totales. E coli

-Facilidad de transporte y persistencia en el ambiente.

- Potencial / Riesgo de transmisión.

- Importancia clínica: capacidad de exposición del

hospedador, de infectar y causar enfermedad.

• Físicos

• Químicos

• Biológicos

• Ecológicos

Factores que afectan a los virus en el

ambienteHumedad Relativa (HR).

Temperatura.

Luz Solar / UV.

Secuestro ó retención.

Químicos antivirales específicos. ej: Amonio.

Niveles de pH (>8,5).

Asociación con sólidos. ej: biopelículas, flóculos.

Material orgánico: tipo y volúmen.

Composición del medio de suspensión.

Calidad del aire. Polución.

Tipo de virus. ej: envuelto / no-envuelto.

Propiedades de la superfície del vírus.

Formación de bioaerosoles

Antagonismo microbiológico

Condiciones climáticas. ej: Lluvia.

Actividad del medio. ej. flujo, caudal, etc.

Ciclo de transmisión del virus.

Comportamiento Humano

Degradación del ambiente

• Objetivo principal y Tipo de medio

• Características del medio vs. Concentración viral

• Concentración viral vs. Volumen de muestra

• Volumen de muestra vs. Maniobrabilidad y

Factibilidad costo/espacio/tiempo

Sistemas de Recuperación, Detección y

Cuantificación de partículas virales

• En heces, vísceras de animales, desechos

tratados, alimentos y muestras ambientales con alta

concentración de virus. Extracción simple con solventes y

elución. Microscopia electrónica y cultivo celular. (Deng and

Cliver, 1992; Turner et al., 1999)

• En muchos medios los virus se encuentran tan diluidos que

necesitan ser concentrados, separados y purficados de los

constituyentes del medio que puedan interferir con su

detección. (Bosch, 1998) Cultivo celular y métodos

moleculares.

• Vírus entéricos más frecuentes:

Rotavirus Astrovirus Adenovirus 40/41

Calicivirus HepatitisA Hepatitis E

Enterovirus Poliovirus Bocavirus

Aichivirus Coxsackie virus Echovirus

Reovirus Torqueteno virus

• Método de concentración IDEAL: técnicamente simple, rápido y

accesible, capaz de procesar grandes volúmenes de água, de

obtener volumen pequeño de concentrado, de promover una gran

recuperación y de detectar una ámplia variedad de virus, además

de ser repetitivo y reproducible (Bosch, 1998; Li et al., 1998; Wyn-

Jones & Sellwood, 2001).

Virus en sistemas acuáticos

Métodos de recuperación

NO EXISTE!!!

• Adsorción-Elución

• Trampas

• Ultracentrifugación

• Otras técnicas

Virus en sistemas acuáticos

Concentración de partículas virales

Muestra con el virus es puesta en una MATRIZ

que lo absorve bajo condiciones específicas de

pH y fuerza iónica. El agua resultante es

desechada y las partículas virales eluidas de la

matriz en un volumen menor y concentradas en

el eluato por precipitación ácida y centrifugado.

(Katzenelson et al. 1976)

MATRIZ

Pads de Gasa

Membranas o Cartuchos

cargados: Electropositivos o

Electronegativos

Vidrio: Polvo o Lana

MATRIZMUESTRA DE

AGUA

Agua

resultante

Precipitación

ácida y

Centrifugación

Virus

concentrado

pH

Fuerza iónica

Los virus en la muestra son retenidos en un Filtro en virtud de su Masa

Molecular, independientemente de su carga eléctrica total.

Ultrafiltración. Presión/Flujo tangencial.

(Poynter et al. 1975; Katayama et al. 2002)

FILTROS y

MEMBRANAS

de diferente

Porosidad

MUESTRA DE

AGUA

Agua

resultante

Retención de

partículas

mayores

Virus

concentrado

Masa Molecular

Por PRESIÓN

Elución de la

membrana

7 um

0,45 um

Hidroextración. (Wellings et al. 1976)

MUESTRA DE

AGUA

Agua

resultante

Retención de

partículas virales

Virus

concentrado

Retención en Sólido

Higroscópico

Por DIÁLISIS

Elución de la

membrana

PEG 6000 o

Sacarosa

Bolsa de

membrana de

Diálisis

Varias Horas a 4ºC

• Ultracentrifugación

Virus en sistemas acuáticos

Concentración de partículas virales

Centrifugación, capaz de concentrar todos

los virus aplicando suficiente fuerza de

gravedad y tiempo.

MUESTRA DE

AGUA

CENTRIFUGACIÓNAgua

resultante

Pellet

Virus

concentrado

Resuspensión

FUERZA G

TIEMPO

• Otros métodos

Floculación. (Calgua et al. 2008)

MUESTRA DE

AGUA

LECHE

DESCREMADA

pH 3,5

HCl [1N]

pH 3,5

SALES MARINAS

Conductividad

>1,5 mS

Agitador Magnético

8-10 HORAS

Reposo

8-10 HORAS

Agua

resultante

Pellet

CENTRIFUGACIÓN

RESUSPENSIÓNVirus

concentrado

Virus en Sistemas Sólidos

Métodos de recuperación

Gránulo maduro – esférico – de lodo

activado formado por bacterias y

polímeros extracelulares. Colonizado

por ciliados (subclasse Peritrichia).

Image: SEM – scanning electron

microscopy.

Weber et al. (2007).

• En Lodos -> Biopelículas: Los gránulos consistentes en

bacterias, polímeros extracelulares, protozoarios y hongos

ALIMENTOS

BIVALVOS: ALIMENTACION POR FILTRACIÓN

SISTEMA DIGESTIVO

Victoria et al. 2004

• Purificación

• Concentración

• Detección

Virus en Sistemas Sólidos

Métodos de recuperación

Determinación del Volumen de muestra:

secado 50mL a 103ºC-105ºC

Homogenización

Agitación

magnéticaMaceración

(Stomacher)

Ultra-sonicación

Degradación / Elución de los virus de las

partículas sólidas

ELUYENTES

•Competenicia por el sitio activo. Ej: Caseína, Extracto de carne,

Aminoácidos (Lisina, Glisina, Ac. Aspártico)

•Disminución de interacción electroestática/hidrofóbica. Ej: Detergentes

(SDS, EDTA), agentes caotrópicos/anticaotrópicos.

• Extracción de ácidos nucléicos: Isotiocianato de

Guanidina y sílica (Boom et al. 2002) ó Kit de

extracción. Compuestos fenólicos (ej.Trizol)

• Técnicas de Biología Celular y Molecular:

- Cultivo Celular

- Electroforesis en gel de acrilamida (PAGE)

- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

- Real time PCR (PCR cuantitativo)

Métodos de Detección

MUESTRA DE

AGUA

CONCENTRACIÓN Y

DETECCIÓN

CUANTIFICACIÓN

CARACTERIZACIÓN Y

TIPIFICACIÓN

En c/ 10 uL existen 4000 (4 x 103) copias

de genoma (partículas virales?)

En 1 Litro de muestra????

Cuántas copias de genoma (partículas virales)????

PARA LA INFECCIÓN….UNA SOLA PARTÍCULA VIRAL VIABLE BASTA!

Norovirus

Genogrupo GII

Genotipo GII.4

Importancia

• Brotes y Epidemias. Contención y paliación de

daños. Humanas, animales. Agroganadería.

• Manejo de sistemas hídricos. Plantas de

tratamientos afluentes y efluentes.

• Control de calidad de aguas de consumo,

alimentos y en la Industria.

• Zonas turísticas y recreacionales.

• Advertir a las autoridades nacionales e

internacionales. Legislación.

GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!!