UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

FACULTAD DE INGENIERAS Y TECNOLOGAS

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

DETERMINACIN DE Salmonella sp

ALBERNIA DELGADO JOHAN

BOLIVAR ZULETA ELKIN

GUERRERO MORENO NELSON

HERRERA ROCHA FABIO ESTEBAN

MARTINEZ MARTINEZ DAVINSON

PEALOZA MERCADO SANDY

VALLEDUPAR CESAR 12/ 11 / 2014

PROCEDIMIENTO1. ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO

Mezclar muy bien la muestra (si es liquida) para asegurar su homogenizacin.Desinfectar con alcohol al 75% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra.Abrir aspticamente ( con el mechero en medio) y adecuadamente la muestra.Si es slida tomar porciones de diferentes sitios de la muestra.Pesar 25 gramos de la muestra en balanza analtica si es slida, sobre un papel graff estril o medir 25 mililitros si es liquida en recipiente estril.Macerar, picar o triturar.Aadir al recipiente de dilucin que contiene 225 ml de agua peptonada Cuando se analiza leche en polvo, utilizar agua destilada adicionada de 5 ml de solucin verde brillante al 0.1%Incubar a 35 + / - 2C por 18 24 horasRealizar controles positivos y negativos con cepas conocidas 2. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVOTransferir 0.1 ml de cultivo obtenido del enriquecido no selectivo en 10 ml de caldo Rappaport Vassiliadis Transferir 1ml para el Caldo Muller - Kauffmann Incubar el caldo Rappaport Vassiliadis a 44.5C por 18-24 horas y el caldo Muller Kauffmann a 37C durante 18-24horas.3. SIEMBRA EN PLACAS CON MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALESSe debe utilizar como minimo dos medio s selectivos por cada caldo de enriquecimiento no selectivo y selectivo para el aislamiento del microorganismo, se recomienda el agar bismuto sulfito, al agar verde verde brillante lactosa sacarosa con novobiocina y el agar XLD.

A partir de cada uno de los cultivos obtenidos del enriquecimiento no selectivo y selectivo, sembrar en superficie con asa por agotamiento placas con agar verde brillante lactosa sacarosa, agar bismuto sulfito o agar XLD. Incubar las placas a 35C + / - 2C durante 24 48 horasEscoger 3 colonias tpicas sospechosas de SalmonellaAislarlas en Agar selectivo para garantizar su pureza.Proceder a su identificacin teniendo en cuenta que las colonias presuntivas de salmonella deben estar bajo este esquema: Salmonella tipica: TSI: K/A, H2S + ; LIA: K/ k, K/A, H2S + Salmonella atipica: TSI K/A, H2S - ; LIA: : K/ k, K/A, H2S Salmonella grupo III: TSI: A/A , H2S + ; LIA: k/k, H2S + 4. IDENTIFICACIN DE SalmonellaLa identificacin de cultivos sospechosos de pertenecer al gnero Salmonella sp incluye dos Etapas seguidas: Comprobacin de las colonias sospechosas mediante pruebas bioqumicas confirmativas Identificacin serolgica de las cepas sospechosas mediante el uso de antisueros.4.1. Realizar las siguientes pruebas bioqumicascoloracin de Gram, prueba de oxidasa, fermentacin de carbohidratos(glucosa, lactosa y sacarosa),prueba de la lisina descarboxilasa, movilidad, reduccin de nitrato rojo de metilo voges proskauer (MR-VP), produccin de indol, reaccin en agar citrato de Simmons, reaccin en agar urea, desaminacin de la fenilalanina(APP)

INTERPRETACION DE RESULTADOS La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describio un esquema general que consiste de 5 pasos bsicos: 1. Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra fue enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permitio restaurar las clulas de Salmonella daadas, logrando de esta manera una condicin fisiolgica estable. 2. Enriquecimiento selectivo, se logro a partir de un medio de cultivo que conjuntaras dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. En nuetro caso fue Caldo Vassiliadis-Rappaport y Caldo Mller Kauffmann 3. Seleccin en medios slidos, este punto se derivo directamente del anterior y se utilizaron medios selectivos, que restringieron el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y que permitio el reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas. Los medios usados fueron Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD); Agar SS y Agar Bismuto Sulfito.

Medio selectivoCaractersticascoloniales deSalmonella sppComposicion y fundamentoResultados

Agar XLDRosas o rojas pueden ser transparentes, con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras o del mismo color del medio con centro negro. las colonias de Salmonella H2S negativo (ej. S. Paratyphi en el XLD son rosadas con un centro rosa oscuro y las de Salmonella lactosa positivas son de color amarillo con o sin centro negro.

Utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por consiguiente, inhibe los microorganismos gram positivos.Xilosa , Lactosa sacarosa (genera la produccin de cido haciendo virar el indicador (rojo fenol) de rojo a amarillo.) L-Lisina, se incuye para aumentar la diferenciacion de Salmonella ya que sin la lisisna estos microoganismos fermentan rapidamente la xilosa porduciendo acidificaciond del medio y no pudiendolas diferenciar. Cloruro sdico Extracto de levadura Rojo fenol Desoxicolato de sodio Citrato frrico de amonio , Tiosulfato sdico (indicador de produccion de H2S, colonias de centro negro)AgarSe observ colonias rosadas algunas con centro negro.

Agar SSTranslcidas en ocasiones opacas. Algunas con centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojasExtracto de carne bovina Digerido pancretico de casena Digerido pptico de tejido animal Lactosa Sales biliares Citrato sdico Tiosulfato sdico (formacion de SH2)Citrato frrico Rojo neutro (indicador)Agar Verde brillante

pH: 7,2

Los microrganismos fermentadores de lactosa acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicado de pH obtenindose como resultado colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Mientras que Salmonella que es un microorganismo no fermentador de la lactosa creci adecuadamente en el medio de cultivo y produjo colonias transparente.La produccin de cido sulfhdrico se evidenciara como colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro. Ninguna de las colonias presento centro negro.

Agar Bismuto SulfitoCaf, grises o negras; con o sin brillo metlico. Algunas veces presencia de halo caf o negro.Extracto de carne, digerido pancreatico (inhibe crecimiento Gram (+), digerido peptico de tejido animal dextrosa, fosfto de sodio, sulfato ferroso, indicado de sulfito de bisuto, agar, verde brillante, agua destilada. Antes de inocular era opaco, verde palidoSe observaron colonias translucidas con centro negras con poco brillo metlico. (sin halo negro)

4. Identificacin bioqumica, este paso permitio la identificacin genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.

Las reacciones biquimicas de Salmonella que fueron aplicadas en agar LIA y TSI. Se tomaron colonias presuntivas y se procedio a realizar pruebas biquimicas.

LIA FUNDAMENTO Y COMPOSICIONla peptona y el extracto de levadura (nutrientes); La glucosa(hidrato de carbono fermentable) ; lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico; El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentadaLos microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierrRESULTADOS 1. Decarboxilacin de la lisina:Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.2. Desaminacin de la lisina:Pico rojizo/fondo amarillo..3. Produccin de cido sulfhdrico:Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y fondo)Para Salmonella typhimurium y Salmonella enteritidis, el control de calidad es:Microoganismo Color en el pico de flautaColor en la base del tubo Ennegrecimieto del medio

Salmonella typhimurium PurpuraPurpuraPositivo

Salmonella enteritidisPurpuraPurpurapositivo

Informe de resultado para LIA

No se presento ennegrecimiento del medio, el fondo del tubo se manifesto color amarillo, el pico de flauta se manifesto color purpura. No se evidencio presencia de Salmonella typhimurium o de Salmonella enteritidi.

TSI FUNDAMENTO Y COMPOSICION extracto de carne, pluripeptona (nutrientes)cloruro de sodio lactosa, sacarosa y glucosa (hidratos de carbonos fermentables)sulfato de hierro y amonio (produccion de acido sulfhidrico)tiosulfato de sodio (se reduce a sulfuro de hidrogeno que reaccina luego con una sal de hierro proporcionando el color tipico sulfuro de hierro de color negro)rojo de fenol(indicador acido)agar INTERPRETACION DE RESULTADOS 1. Superficie alcalina/profundidad cida (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa2. superficie acida/profundida acida (pico amarillo/fondo amarillo): el microoganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.3. superficie alcalina/profundidad alcalina(pico rojo/fondo rojo):el microoganismo es no fermentador de azucares4. la presencia de burbujas o ruptura del medio de cultivo indica que el microoganismo produce gas.5. el ennegrecimiento del medio indica que el microoganismo produce acido sulhidrico.

Para Salmonella typhimurium el control de calidad debe ser:

MicrooganismoSuperficie/profundidadProduccion de gasProduccion de SH2

Salmonella typhimuriumK/ANegativoPositivo

Donde A es reaccion acida (color amarilla) y K es reccion alcalina (color rojo)Informe de Resultados para TSI

Se evidenca presencia de gas por la separacion del medio, K/A (pico rojo, fondo amarillo), no se evidencio enengrecimiento del medio, es decir, no hay produccion de acido sulfhidrico. Negativo para Salmonella typhimurium

Nuestro anlisis fue comparado con la investigacin Presencia del gen de invasividad inv A en cepas de Salmonella spp. aisladas de alimentos del Caribe Colombiano(Espinal-Prieto, et al; 2006) cuyo objetivo fue establecer la presencia del gen de invasividad invA en aislamientos de Salmonella spp. obtenidos de alimentos en la regin Caribe Colombiana. Los resultados obtenidos en la investigacion fueron los siguiente: se recuperaron 74 aislamientos de Salmonella spp. , en carne de res 30 (40,5 %), embutidos 13 (17,6 %), pollo 12 (16,2 %), queso 9 (12,2 %), cerdo 6 (8,1 %) y otros 4 (5,5 %). Los serotipos ms frecuentes fueron: S. anatum 14 (18,9 %), S. uganda 13 (17,6 %), S. newport 9 (12,2 %) y S. typhimurium 7 (9,5 %). el gen invA se detect en 72 (97,3 %) aislamientos de Salmonella.El procedimiento que se realizo en el estudio fue similar al realizado en el laboratorio (con excepcin de la realizacion de las pruebas serologicasque no fueron realizadas): se pesaron 25 g de cada muestra de alimento que fueron inoculados en 225 mL de medios de preenriquecimiento, agua peptonada y caldo infusin cerebro corazn y se incubaron a 37 C durante 18-24 h. Se inocul 1 mL de cada muestra anterior en 9 mL de medio Rappaport y se incubaron a 43 C entre 18-24 h. Se inocul 1 mL de cada muestra en 9 mL de Tetrationato lquido y se incubaron a 37 C durante 18-24 h. Cada muestra fue subcultivada tomando una asada de los tubos de enriquecimiento y su siembra por agotamiento en agar base XLT4 (Difco Detroit, Mi USA), XLD, SMID (Biomeriux, etoiac, France), SS, Hekctoen y Sulfito Bismuto; estas placas se incubaron a 37 C por 18-24 h. A las colonias sospechosas de Salmonella se les realizaron pruebas bioqumicas convencionales (Urea, LIA y TSI) incubndolas a 37 C durante 18-24 h para ser identificadas. Se confirmaron con antisueros polivalentes para Salmonella (Difco, Detroit, Mi, EE.UU.). Cada cepa se conserv por triplicado en tubos de Skin Milk a -70 C.Mediante las pruebas serologicas se detect la presencia del gen invA en los serotipos de Salmonella circulantes en alimentos en la regin Caribe Colombiana.los alimento que fueron analizados fueron:agua, arepa de huevo, carne de res, cerdo, embutido, pollo quesos viceras en ciudades como Barranquilla, Cartagena, Monteria, Sincelejo:

INFORME DE RESULTADOS DE LABORATORIO Ausencia de de Salmonella sp/ 25 gramos de muestra de salchicha Ranchera marca Zenu.

CONCLUCIONDebido a que no se evidencio Salmonella sp. en una salchicha Ranchera marca Zenu, se puede deducir que es apta para el consumo humano y que cumple la Norma Tecnica Colombiana NTC 1325 el cual reza que entre los requisitos microbiologicos para productos carnicos procesados cocidos la deteccion de Salmonella,/25 g debe ser ausencia; sin embargo, no se descarta la evidencia de otros microoganismo en la muestra, por lo que no podemos concluir si es apta o no. Posiblemente se evidencio el crecimiento de otros microganismos debio a que la mala manipulacion y almacenamiento del producto, pues el producto se adquirio de un establecimiento donde para su comercializacion las salchichas son sacadas de su empaque original para ser comercializadas al detal, y expuestas a contaminacion cruzadas por otros productos almacenados en la cadena de frio, tales como verduras, frutas, carnes crudasde pollo y res , leches empacadas en bolsa, sanguazas, etc.

BIBLIOGRAFIA Instituto COLOMBIANO DE NORMAS TECNICAS Y CERTIFICACION. Industrias Alimentarias. Productos Crnicos no Procesados.5 actualizacin, Bogot. ICONTEC (NTC 1325).ESPINAL MARIN, Paula; PRIETO SUAREZ, Edgar; OTERO JIMENEZ, Vanessa y MATTAR VELILLA, Salim. Presencia del gen de invasividad inv A en cepas de Salmonella spp: aisladas de alimentos del Caribe Colombiano. Rev Cubana Salud Pblica [online]. 2006, vol.32, n.2 [citado 2014-11-04], pp. 0-0 . Disponible en: . ISSN 0864-3466.Referencia en internetHoja tcnica para LIAURL:http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroagar.htmHoja tcnica para TSI URL:http://www.britanialab.com/productos/332_hoja_tecnica_es.pdfHoja tcnica para Agar XLD URL:http://www.britanialab.com/productos/337_hoja_tecnica_es.pdfHoja tcnica para Agar SSURL: http://www.britanialab.com/productos/337_hoja_tecnica_es.pdfHoja tcnica para Agar Bismuto de Sulfito (laboratorio Pronadisa)URL:http://www.condalab.com/uploads/media/1011__AGAR_BISMUTO_SULFITO_REv_0_Abril_2010_01.pdf