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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA ASOCIACION DE POLIMORFISMOS DE LOS GENES ECA, FV, FII y MTHFR CON DIABETES MELLITUS TIPO 2 CON COMPLICACIONES QUE PRESENTA M. en C. JOSE FERNANDO RIVAS SOLIS Como Tesis para obtener el Grado de Doctor en Ciencias Médicas Asesores: DR. MIGUEL HUERTA VIERA DR. RANAJIT CHAKRABORTY Colima, Colima Julio 2004
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS DE LOS GENES ECA, FV, FII y MTHFR
CON DIABETES MELLITUS TIPO 2 CON COMPLICACIONES
QUE PRESENTA
M. en C. JOSE FERNANDO RIVAS SOLIS
Como Tesis para obtener el Grado de
Doctor en Ciencias Médicas
Asesores:
DR. MIGUEL HUERTA VIERA DR. RANAJIT CHAKRABORTY
Colima, Colima
Julio 2004
Este trabajo fue realizado en
La UMF 88 y el CIBO
del Instituto Mexicano del Seguro Social en Guadalajara
y está dedicado:
•
• A los pacientes, que depositan su confianza en nosotros
•
• A las instituciones de salud y educación,
que me han brindado la oportunidad
de existir y desarrollarme académicamente. En particular
al IMSS, a la UNAM, a la Universidad de Texas,
a la Universidad de Guadalajara y a la Universidad de Colima
•
• A mis amigos y colaboradores en este proyecto:
Ana María Silber, Augusto Sarralde, Carmen Cervantes,
Chuy Márquez, Fer Rivas Jr, Jorge Padilla, Katya Rodarte,
Laura Valdez, Luz María Robles, Memo Hernández,
Norma Olivares, Omar Sedano, Otto Hugo Mercado,
Rocío Ortiz, Toño Quintero, Yemi Valle
INDICE
CONTENIDO PAGINA
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1. ANTECEDENTES 3
2. PLANTEAMIENTO 11
3. HIPOTESIS 12
4. OBJETIVOS 13
5. MATERIAL Y METODOS 14
6. RESULTADOS 18
7. DISCUSION 46
8. CONCLUSION 49
9. BIBLIOGRAFIA 50
10. ANEXOS 57
1
RESUMEN
La diabetes mellitus tipo 2 conlleva altos costos en la salud, sociales y económicos.
Sus complicaciones, resultantes de interacciones entre factores genéticos y
ambientales, se relacionan frecuentemente con anormalidades vasculares. Por ende,
los genes trombofílicos son candidatos a estudiarse en tales complicaciones. Este
trabajo compara las características genotípicas de los genes polimórficos ECA, FV,
FII y MTHFR en pacientes diabéticos (grupo DM2) con y sin complicaciones y en una
población de referencia o control (Con). Las comparaciones inter-grupo (DM2 vs
Con) no mostraron diferencias significativas. Algunas distribuciones genotípicas intra-
grupo DM2 se observaron diferentes en pacientes complicados. En especial, el
polimorfismo MTHFR parecen asociarse con hipertensión, sobrepeso y retinopatía.
En virtud de las limitaciones propias del tamaño de muestra, los resultados requieren
corroboración con estudios dirigidos más extensos. La importancia de la confirmación
de estos hallazgos radica en la posibilidad de intervención médica en la prevención
de algunas complicaciones de la DM2.
2
ABSTRACT Type 2 diabetes mellitus poses high health-related, social, and economic burdens. Its
complications, being the result of interactions between genetic and environmental
factors, are frequently associated to vascular abnormalities. Therefore, thrombophilic
genes are candidates to be studied in relation with complications of type 2 diabetes
mellitus. The present work compares genotypic profiles of polymorphic genes ECA,
FV, FII and MTHFR in diabetic patients (DM2 group) with or without complications
and in a reference or control group (Con). Inter-group comparisons (DM2 vs. Con) did
not show significant differences. Some intra-group genotype distributions were
different in complicated patients. Particularly, the MTHFR polymorphism seems to be
associated with hypertension, obesity, and retinopathy. Given the limitations from
sample size, larger studies are required to confirm these results. The importance of
confirming such results lays in the possibility of preventive medical intervention in
some of the complications of type 2 DM.
3
1. ANTECEDENTES
Introducción
La diabetes mellitus (DM) es un conjunto heterogéneo de enfermedades que se
caracterizan por niveles elevados de glucosa en el plasma. Existen varios tipos
claramente distintos de DM y son causados por complejas interacciones entre
factores genéticos, ambientales y estilos de vida. Las alteraciones metabólicas
propias de la DM constituyen las bases fisiopatológicas de la enfermedad, siendo
afectados múltiples órganos y sistemas. La DM, por sus complicaciones y su
asociación con enfermedades cardio- y cerebrovasculares, impone una enorme
carga sobre el individuo afectado, así como a todos los sistemas de salud pública en
el mundo. En algunos países desarrollados la DM es la primera causa de amputación
no traumática, así como de ceguera en adultos y nefropatía terminal (Powers 2001).
Su elevado costo individual y social, así como su incidencia en aumento, convierten a
la investigación en DM en una prioridad a nivel de salud pública.
Clasificación
Los distintos tipos de DM comparten en común el fenotipo de hiperglucemia. Sin
embargo, los mecanismos subyacentes a la misma difieren notablemente entre cada
tipo.
La DM se clasifica en términos generales en tipos 1 y 2 (DM1 y DM2). La DM1 se
caracteriza por la destrucción (más frecuentemente de origen autoinmune) de las
células beta del páncreas. Esto se traduce en producción y secreción insuficiente de
la hormona insulina. La DM2 es un grupo heterogéneo de desórdenes que
comprenden la resistencia a la insulina en sus distintos grados, una secreción
inadecuada de la misma, así como una producción aumentada de glucosa por parte
del hígado. Otros tipos de DM incluyen defectos genéticos específicos en la
producción/acción de la insulina, así como la diabetes gestacional (Powers 2001).
Por otro lado, la prevalencia de la DM en la población se ha elevado de manera
4
dramática en las últimas dos décadas. Se calcula que en los Estados Unidos de
América la prevalencia de DM en adultos es del 8.9-12.3%. La Organización Mundial
de la Salud (OMS) estima que en México existen 2,178,507 personas(~2% de la
población) afectadas con DM2. Cálculos de la misma OMS proyectan el número de
individuos afectados para el 2030 en 6,130,209 (OMS 2003). De acuerdo con el
censo de la población en México, se señala que en el 2000 existen en el país
alrededor de 9.5 millones de personas mayores de 40 años (INEGI 2003). En
consecuencia, las personas diabéticas en México constituyen más del 20 por ciento
de la población mayor de 40 años, lo que ilustra la magnitud del problema de la DM
(Powers 2001).
Criterios diagnósticos para DM (cualquiera de los siguientes, Powers 2001):
• síntomas de DM y al menos una determinación de glucosa al azar superior a
200 mg/dl.
• glucemia en ayuno > 126 mg/dl.
• glucosa plasmática > 200 mg/dl después de una carga de 75g de glucosa.
Insulina
La insulina es producida en las células beta del páncreas como un precursor de 86
aminoácidos llamado preproinsulina. Ésta es escindida en polipéptido C y las
cadenas A y B de insulina, que se asocian por uniones disulfuro. La glucosa
plasmática es el regulador principal de la secreción de insulina pancreática, con
niveles de 70 mg/dL de glucosa siendo suficientes para estimular la síntesis de
insulina. Una vez secretada la insulina, entra a la circulación enterohepática siendo
inactivado el 50% de la hormona a su paso por el hígado. El resto pasa a la
circulación sistémica y se une a moléculas de la clase tirosin kinasa de receptores
unidos la membrana celular y activa una serie de reacciones de fosforilación y
desfosforilación que culminan en la introducción de glucosa al medio intracelular, y
estimulan la síntesis de glucógeno, lipogénesis y procesos de regulación génica
(Taylor 2001).
5
Patogénesis Los individuos con DM1 nacen con una masa pancreática normal de células beta, sin
embargo, la pérdida de dichas células por procesos autoinmunes puede ocurrir en
meses o años. Es posible que el proceso autoinmune sea inicialmente disparado por
factores ambientales o un estímulo infeccioso. Los marcadores inmunológicos
(autoanticuerpos) aparecen antes de que la DM se vuelva clínicamente evidente, lo
que ocurre al perderse aproximadamente 80% de células beta (Cotran y Crawford
1999). La destrucción es progresiva e irreversible, por lo que el individuo afectado
eventualmente se vuelve completamente dependiente de insulina exógena para
sostener sus funciones vitales (Powers 2001). Los factores genéticos asociados a
DM involucran múltiples genes, considerándose particularmente importante el papel
jugado por moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad Humana (MHC),
específicamente la región HLA del cromosoma 6. Dicha región codifica moléculas de
clase II de MHC, responsables de la presentación antigénica a células T,
estrechamente relacionadas con el inicio de la respuesta inmune. Variaciones
genéticas de ésta región podrían ser responsables de hasta un 50% del riesgo
genético para DM1. Algunas asociaciones específicas han sido descritas, por
ejemplo, la mayor parte de los individuos con DM1 tienen el haplotipo que incluye los
alelos HLA DR3 ó DR4. Los alelos DQA1 *0301, DQB1*0302, DQA1*501 y
DQB1*0201 se asocian estrechamente con DM1 (Jorde y cols. 1999). Además de la
región HLA, otros 17 loci podrían conferir susceptibilidad a DM1. Asimismo se han
descrito haplotipos protectores como el DQA1*0102-DQB1 *0602, cuya frecuencia es
de 20% de la población de EUA mientras que sólo es del 1% en los individuos
afectados (Powers 2001).
El proceso autoinmune en DM1 comprende la aparición de autoanticuerpos contra
células del islote, mediada por un detonador ambiental que aún se desconoce.
Algunos de los detonadores más estudiados son la exposición temprana a proteínas
de lácteos bovinos, así como infección por virus coxsackie y rubéola (Cotran y
Crawford 1999, Sack Jr. 1999).
6
La DM2 es compleja en su etiología. Como pilares centrales en su fisiopatología se
encuentran la resistencia a la insulina así como su secreción anormal. La DM2 tiene
un fuerte componente genético. No se han identificado genes responsables de la
predisposición a ésta enfermedad, aunque es claro que es poligénica y multifactorial
(Sack Jr. 1999). Factores genéticos relacionados con la síntesis y producción de
insulina, así como sus receptores determinan el perfil glucémico de un individuo.
Factores ambientales como la nutrición y el ejercicio físico inciden y modulan lo
determinado por los genes. La concordancia para DM2 entre gemelos idénticos es
entre un 70 y un 90%. Con ambos padres diabéticos, el riesgo para un hijo puede ser
tan alto como 40%. Algunas mutaciones específicas de varias moléculas
relacionadas con la acción de la insulina se han ligado a DM2, pero constituyen una
muy pequeña fracción de los casos de DM. Dada su gran complejidad, la búsqueda
de los genes que confieren susceptibilidad a la DM2 se encuentra hoy en día en el
campo de la genómica.
La fisiopatología de la DM2 va estrechamente relacionada a la obesidad. La mayoría
de los individuos con DM2 son obesos. Los adipocitos sintetizan TNF alfa, leptina y
ácidos grasos libres, que inciden en el metabolismo de la insulina contribuyendo a la
resistencia a la misma (Taylor 2001). La resistencia a la insulina se caracteriza por
una habilidad disminuida de la hormona para actuar en tejidos periféricos de manera
efectiva. En un intento de compensación, las células beta producen una mayor
cantidad de insulina. Un estado prolongado de hiperinsulinemia lleva eventualmente
al páncreas a una incapacidad para mantener dicho estado, lo que resulta en un
estado de hiperglucemia postprandial. Esta elevación sostenida, condiciona una
mayor disfunción de las células beta, que a su vez acentúa la hiperglucemia, con el
resultado final de hiperglucemia sostenida aún en ayunas (Powers 2001).
Complicaciones de la diabetes mellitus
7
Las complicaciones de la DM se clasifican en agudas y crónicas. Las agudas
suponen una alteración súbita del metabolismo de la glucosa en un individuo que se
desconoce diabético o con una evolución clínica estable. Factores de stress
metabólico frecuentemente precipitan éstos eventos (no adherencia a tratamiento,
ingestión de alcohol y fármacos, transgresiones dietéticas). Las complicaciones
agudas más frecuentes son la cetoacidosis diabética (más frecuente en DM1) y el
estado hiperosmolar no cetónico, más común en individuos con DM2.
Las complicaciones crónicas representan la mayor morbimortalidad por DM.
Involucran múltiples órganos y sistemas y se dividen en términos generales en
vasculares y no vasculares. Las vasculares se subdividen en microvasculares
(nefropatía, neuropatía, retinopatía) y en macrovasculares (enfermedad
cardiovascular, enfermedad cerebrovascular, enfermedad vascular periférica). Las no
vasculares incluyen disfunción sexual, gastroparesis y cambios en la piel. El riesgo y
la severidad de las complicaciones crónicas se relacionan estrechamente con la
intensidad y la duración de la hiperglucemia (Hanssen 1997). Debido a que la DM2
suele dar manifestaciones tras dos décadas de hiperglucemia, el individuo recién
diagnosticado frecuentemente presenta ya complicaciones. Los procesos
responsables de las complicaciones crónicas se desconocen, aunque existen tres
mecanismos propuestos (Crabb y Harris 1997). Todos ellos suponen a la
hiperglucemia como condicionante de la acumulación de metabolitos tóxicos, o
inductores de disfunción de la fisiología celular. Independientemente de la causa
particular, existen cambios morfológicos notables comunes a los diabéticos
complicados. La arteriosclerosis generalizada es responsable de disfunción orgánica
como en el caso del riñón, o de la coronariopatía diabética. El engrosamiento de la
membrana basal de la microvasculatura, como en el caso de la retina es también
responsable de la disfunción orgánica final (Cotran y Crawford 1999). Cualquier
patología o condición asociada a estos cambios morfológicos, tiene el potencial para
acrecentar o modificar estas complicaciones, por ejemplo la hipertensión arterial, el
sedentarismo, las dislipidemias, tabaquismo, y las deficiencias nutricionales, por
nombrar sólo algunas. De esta forma, ciertos factores genéticos asociados con
8
enfermedades como las mencionadas podrían estar relacionados con la
susceptibilidad de un individuo para desarrollar complicaciones crónicas de la DM.
Entre ellos, se han investigado los genes del sistema renina-angiotensina
(Chowdhury y cols. 1999, Jeffers y cols. 1997) y los trombofílicos directa
(polimorfismos genéticos) (Ajabnoor y cols. 2003) o indirectamente (proteínas) en
relación con anormalidades asociadas a la DM2(Okumura y Aso 2003, Szolnoki y
cols. 2003, Tanis y cols. 2003).
GENES TROMBOFILICOS Y SUS MUTACIONES
Se denominan genes trombofílicos a aquéllos que codifican para proteínas
relacionadas con la coagulación y que aumentan la tendencia a este fenómeno
(Bertina y cols. 1990, Tobelem 1991, De Stefano y Leone 1995). Estos genes ejercen
su función en una forma directa y en interacción, tanto entre ellos mismos como con
el medio ambiente (Bernardi y Marchetti 2002). Conforme avanza el conocimiento,
más genes, aún algunos no directamente relacionados con la coagulación se
reconocen en esta categoría, como el de las enzimas metileno tetrahidrofolato
reductasa y convertidora de angiontensina. De manera análoga, existen algunos
genes con efecto contrario; es decir, de los cuales algunas variantes se consideran
“protectoras” para la coagulación. Los genes más comúnmente estudiados por la
asociación de alguna de sus variantes o mutaciones con diferentes enfermedades
son la protrombina (factor II, FII, Rosendaal y cols. 1998), el factor V (FV, Bertina y
cols. 1994), el gen de la MTHFR (Fodinger y cols. 2000, Shcherbak y cols. 1999) y el
de la enzima convertidora de angiotensina (ECA, Doria y cols. 1994, Thomas y cols.
2001).
Gen de la enzima convertidora de angiotensina (polimorfismo insertion/deletion, ins/del, indel, I/D)
9
Algunos componentes del sistema renina-angiotensina como el angiotensinógeno, la
enzima convertidora de angiotensina (angiotensin converting enzyme, ECA), la
quimasa y el angiotensinógeno II representan candidatos potenciales en la etiología
de la hipertensión y otras complicaciones vasculares (Gutiérrez y cols. 1997, Thomas
y cols. 2000). La actividad de ECA determina la circulación y nivel tisular de
angiotensina II, contribuye a regular el tono vascular y puede tener múltiples efectos
en la masa y estructura venosa (Jalil y cols. 1999). Entre los polimorfismos del gen
ECA localizado en el brazo largo del cromosoma 17, se encuentra la
inserción/deleción (I/D) intrónica (intrón 16) debida a una deleción de 287 pb. El
polimorfismo I/D del gen ECA se ha asociado con enfermedades cardiovasculares y
con un riesgo relativo incrementado para trombosis (Ko y cols. 1997), probablemente
debido a la acción vasoconstrictora de angiotensinógeno.
Gen del factor V (polimorfismo G1691A, mutante Leiden)
El gen del FV tiene aproximadamente 80 Kb en 25 exones y está localizado en una
región de 300 Kb en q21-25 del cromosoma 1. Una de las variantes de este gen,
conocido como el polimorfismo G1691A ocurre en el nucleótido 1691 y consiste en
el cambio de una base G por A (Kalafatis y Mann 1997). Este polimorfismo, conocido
también como mutante Leiden (Factor V Leiden) y el siguiente del FII se han
asociado con anormalidades trombóticas diversas, en especial con trombosis
venosas (Endler y Mannhalter 2003).
Gen del factor II o protrombina (polimorfismo G20210A)
La protrombina es el precursor de la trombina, proteasa de serina, la cual es una
enzima con actividad anticoagulante y fibrinolítica. Su gen es codificado por un
segmento de 21 kb que se localiza en la banda 11p11-q12 y se organiza en 14
exones separados por 13 intrones además de las regiones no traducidas 5' y 3’
10
(Hillarp y cols. 1997). El gen de la protrombina presenta una mutación ampliamente
estudiada consistente en el cambio de una base sencilla (G por A) en el nucleótido
20210 (polimorfismo G20210A).
Gen de la enzima metileno tetrahidro folato reductasa (polimorfismo C677T)
La enzima metileno tetrahidrofolato reductasa (MTHFR) participa en la síntesis de
purinas, timidilato y de los ácidos nucleicos. Esta enzima cataliza la reducción de
5,10-metileno tetrahidrofolato a 5-metil tetrahidrofolato, forma predominante del folato
en la circulación y un cofactor para la metilación de homocisteína a metionina
(Fenton y Rosenblatt 2001). El gen de la MTHFR del humano se localiza la región
1p36.3 (Goyette y cols. 1994) y se conocen varios polimorfismos del mismo. El más
común es un cambio C por T en la posición 677 del exón 4, lo que sustituye una Ala
por Val y resulta en la termolabilidad de la enzima y consecuentemente su actividad.
Esta mutación es considerada tanto un polimorfismo genético poblacional inocuo
como una mutación que determina un factor de riesgo para diversas enfermedades
(Frosst y cols. 1995, Kang y cols. 1988, 1991).
11
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
La morbimortalidad de la DM2 es substancialmente alta en mexicanos. Esto hace
que sea un problema médico considerable por las consecuencias en la salud,
sociales y económicas en un gran número de personas en nuestro país. El estudio
de los factores etiológicos de la DM2, en consecuencia, prioritario en la investigación
científica biomédica en el área de la salud. Algunas de las complicaciones clásicas
de la DM2 pueden estar asociadas con variaciones de proteínas que favorecen la
trombosis y sus genes (genes trombofílicos); en especial, los polimorfismos en los
genes genes ECA, FII, FV y MTHFR. Por ello, se propone el presente estudio
diseñado con el fin de investigar una posible asociación entre los polimorfismos de
dichos genes y la DM2 sin y con complicaciones en una población de Guadalajara,
Jalisco.
En resumen, la prevalencia del 2 por ciento en la población general o 20 % en la
población mayor de 40 años y la gravedad de la DM2 en los mexicanos la convierten
en un problema médico considerable que impone un impacto en la salud y elevados
costos económicos a nivel social e individual. En consecuencia, se justifican los
estudios que investiguen la contribución de factores tanto genéticos como
ambientales al inicio y evolución de esta enfermedad y sus complicaciones.
12
3. HIPOTESIS
Los polimorfismos genéticos ECA I/D, FV G1691A , FII G20210A, MTHFR C677T y
A1298C se asocian con la DM2 complicada.
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4. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Investigar la posible asociación entre los polimorfismos genéticos FV G1691A , FII
G20210A, MTHFR C677T y A1298C con las complicaciones de DM2 en una
población de Guadalajara, Jalisco, México.
OBJETIVO PARTICULAR
Estimar la frecuencia de polimorfismos de genes trombofílicos ECA, FV, FII y MTHFR
en pacientes diabéticos tipo II que cursen con alguna complicación diabética y
compararlo una muestra de la población de Guadalajara, Jalisco, México.
14
5. MATERIAL Y METODOS
Tipo de Estudio Transversal analítico. Se consideraron para el estudio pacientes diabéticos con DM2
(grupo DM2) e individuos no diabéticos de la población general (grupo de referencia
o control, Con).
Procedencia de los participantes Los pacientes del grupo DM2 fueron captados en el registro de pacientes diabéticos
de la Clínica 88 del IMSS en la ciudad de Guadalajara durante el 2º semestre de
2001 y participaron en el estudio de manera voluntaria, para lo cual se les solicitó,
previa plática, su consentimiento por escrito (Anexo 1). Las personas del grupo de
referencia o controles (grupo Con) son individuos sanos (al interrogatorio), no
emparentados, residentes en Guadalajara que han aceptado ser voluntarios en
diversos estudios del laboratorio de polimorfismos del CIBO.
En el grupo DM2 se registraron los siguientes datos generales, demográficos y
clínicos. Este grupo fue subdividido para algunas de las características con el fin de
evaluar la distribución de los genotipos por variable dicotómica: sexo; edad; tiempo
de evolución después del diagnóstico; índice de masa corporal (IMC); glucemia en
ayuno; antecedentes familiares de DM2; sobrepeso; hipertensión arterial sistémica
(HAS); anormalidad cardiovascular; nefropatía; retinopatía; pie diabético;
anormalidad dental y dislipidemia.
Criterio de Inclusión
Paciente de cualquier sexo que haya acudido a la invitación de la Jefatura de
Consulta Externa de la Clínica 88 del IMSS para formar parte del estudio y que haya
15
tenido al menos cinco años con diagnóstico de DM2. De acuerdo con la norma
institucional, se incluyen en el registro de diabéticos de la unidad de procedencia los
criterios de la American Diabetes Association (Powers 2001).
Criterio de exclusión Se excluyeron del análisis las personas cuya tipificación no fue posible para
determinado polimorfismo.
Tamaño de la Muestra Con el objeto de encontrar diferencias intergrupales de 5% o mayores y con un
intervalo de confianza de 95%, el tamaño de muestra mínimo fue de 30 personas (60
cromosomas independientes) por grupo (Chakraborty 1992).
Pruebas estadísticas Se analizaron las distribuciones alélicas o genotípicas de los polimorfismos
estudiados mediante las pruebas X2 y exacta de Fisher, utilizando programas
iterativos de cómputo. Los datos se manejaron mediante el programa SPSS v.10
(SPSS Co, St. Louis Missouri) y los odds ratios (ORs), con IC= 95%, realizados
solamente cuando p<0.10, se calcularon mediante el programa EpiInfo v.6.
Se recolectaron los datos de cada paciente mediante un cuestionario y con la
información procedente de los consultorios médicos a través de la Jefatura de
Consulta Externa de la Clínica 88. Algunas estimaciones estadísticas utilizaron
combinaciones de estas variables: sobrepeso-hipertensión-anormalidad
cardiovascular y nefropatía-retinopatía-pie diabético-neuropatía.
16
Obtención de la muestra y extracción de ADN De cada participante se obtuvo una muestra de sangre venosa en tubos al vacío con
EDTA, a partir de la cual se extrajo el ADN por el método de Miller (Miller y cols.
1988). La cuantificación y el cálculo de pureza (cantidad de proteínas) del ADN se
hizo mediante espectrofotometría.
Tipificación de polimorfismos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Los contenidos de las mezclas de reacción, las condiciones y programas de las
PCRs, así como de las digestiones enzimáticas en los polimorfismos de fragmentos
de longitud variable con enzimas de restricción (RFLP) y de los corrimientos
electroforéticos se presentan con mayor detalle en el Anexo 2.
La tipificación de FII G20210A se realzó mediante la técnica iniciador secuencia-
específico (sequence-specific primer, SSP) de acuerdo con el método publicado por
Rosendaal y cols. (1998). Las reacciones SSP requieren consistentemente tener
controles en los mismos ensayos de amplificación. En la tipificación del polimorfismo
de FII y en otras SSP de este trabajo, se utilizó como control de amplificación el gen
del factor de necrosis tumoral (tumor necrosis factor, TNF, Wilson y cols. 1992).
Las mutaciones FV G1691A se investigaron mediante RFLP con la enzima NcoI,
según el método de Bertina y cols. (1994).
Los polimorfismos MTHFR C677T y A1298C, que constituyen los más comúnmente
estudiados del gen MTHFR, se estudiaron mediante RFLP. Para el marcador C677T
se utilizó la enzima HinfI (Frosst y cols. 1995) y para el C1298C la enzima MboII
(van der Put y cols. 1998).
17
El polimorfismo I/D del gen ECA se tipificó mediante la técnica de iniciadores
secuencia-específicos (SSP) con dos pares de iniciadores. El primer par amplificó
fragmentos de 190 pb para el alelo deleción (D) y de 490 pb en el caso del alelo de
inserción (I). Por razones de especificidad de los iniciadores, en cada muestra
homocigota para D se realizó una segunda amplificación con objeto de descartar con
seguridad una heterocigocidad. En el segundo sistema, el amplificado fue de 335 pb
en el caso del alelo de inserción (Gutiérrez y cols. 1997).
18
6. RESULTADOS
En el presente estudio el número de personas estudiadas por grupo (Con y DM2) no
fue el mismo en todos los genes investigados. En el caso de las personas del grupo
Con, se incluyen 101 individuos para el polimorfismo C677T y en los demás
polimorfismos el número fue >163. Parte de los datos relativos a este grupo han sido
previamente publicados por nuestro grupo. En el caso de C677T, por Dávalos y cols.
(2000) y para los otros por Valdez y cols. (2004).
En el grupo DM2 se estudió también un número variable de individuos, con un
mínimo de 90. Para cada polimorfismo, se indica el número de personas estudiado
en las tablas correspondientes. En este grupo se obtuvieron adicionalmente ciertas
características descriptivas (variables), que se presentan en la Tabla 1. Para cada
variable, el número de personas con los datos disponibles se registra entre
paréntesis (n=). En la variable género se muestra la cantidad de personas por sexo;
para las variables cuantitativas, el promedio y la desviación estándar (DE); y para las
variables categóricas el número y porcentaje de individuos positivos para cada una.
Las variables 1, 6-13 y 14 se evaluaron para las distribuciones de los polimorfismos
por variable categórica (o en combinación de variables).
19
Tabla 1. Características generales de los pacientes diabéticos.
Característica promedio, DE ó % de positividad
1) Relación de sexos F : M (n = 114) 74 F : 40 m
2) Edad (n = 104) 57.45, 11.3 años
3) Evolución (n = 49) 10.45, 5.6 años
4) IMC (n = 49) 29.1, 5.2
5) Glucosa en ayuno (n = 49) 161, 54 mg/dl
6) Antecedentes familiares (n =114) 76%
7) Sobrepeso (n = 104) 54%
8) Hipertensión (n = 110) 56%
9) Anormalidad Cardiovascular (n = 81) 33%
10) Nefropatía (n = 108) 13%
11) Retinopatía (n = 114) 29%
12) Pie diabético (n = 106) 10%
13) Anormalidad dental (n = 53) 60%
14) Dislipidemia (n = 52) 56%
Las frecuencias de los genotipos y alelos en cada uno de los grupos (DM2 y Con),
así como en el grupo DM2 (intragrupo, de acuerdo con la presencia o ausencia de la
variable estudiada) se presentan en las Tablas 2.1 a 6.15 en cuentas numéricas y
valores porcentuales.
20
Tabla 2.1. Frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo ECA D/I en diabéticos (D)
comparadas con el grupo control (C) en cuentas y porcentaje; n = individuos
estudiados. La “p” resultante de la comparación inter-grupo de las distribuciones (X2 y
prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón.
Locus Grupo Genotipo Alelo DD DI II D I ECA D/I C (n=171) 34 (20) 86 (50) 51 (30) 154 (45) 188 (55) D (n=104) 22 (21) 54 (52) 28 (27) 98 (47) 110 (53) p ≥ 0.85 ≥ 0.65 Tabla 2.2. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con el género (femenino vs masculino). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por género (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Género Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Femenino 15 36 20 71 Masculino 7 18 8 33
Total 22 54 28 104 p ≥ 0.75 Tabla 2.3. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos según la existencia de antecedentes familiares de diabetes, Ant Fam (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por este antecedente (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Ant Fam Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 4 11 7 22 Con 17 38 18 73
Total 21 49 25 95 p ≥ 0.45
21
Tabla 2.4. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos clasificados por la variable sobrepeso (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 11 21 12 44 Con 11 30 16 57
Total 22 51 28 101 p ≥ 0.75 Tabla 2.5. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos por la variable hipertensión arterial sistémica, HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones genotípicas por la presencia de HAS (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 9 21 12 42 Con 13 30 16 59
Total 22 51 28 101 p ≥ 0.95 Tabla 2.6. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso ó HAS Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 7 12 6 25 Con 15 39 22 76
Total 22 51 28 101 p ≥ 0.65
22
Tabla 2.7. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos por la variable anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable CV (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus CV Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 9 23 9 41 Con 6 16 11 33
Total 15 39 20 74 p ≥ 0.50 Tabla 2.8. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por tales variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso ó CV Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 9 15 9 33 Con 13 36 19 68
Total 22 51 28 101 p ≥ 0.60 Tabla 2.9. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables HAS ó anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS / CV Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 8 18 7 33 Con 14 33 21 68
Total 22 51 28 101 p ≥ 0.55
23
Tabla 2.10. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos de acuerdo a la existencia de nerfropatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable nefropatía (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Nefropatía Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 18 43 25 86 Con 4 6 3 13
Total 22 49 28 99 p ≥ 0.70 Tabla 2.11. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos considerando la retinopatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Retinopatía Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 18 40 19 77 Con 4 14 9 27
Total 22 54 28 104 p ≥ 0.50 Tabla 2.12. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con la presencia de pie diabético, PD (sin v.s. con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la ausencia o presencia de pie diabético (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Pie diabético Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 19 44 24 87 Con 2 4 4 10
Total 21 48 28 97 p ≥ 0.70
24
Tabla 2.13. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos separados por la presencia de cualquiera de las variables nefro- retino- neuropatía o pie diabético (NRNP, sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus NRNP Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 14 34 15 63 Con 8 20 13 41
Total 22 54 28 104 p ≥ 0.65 Tabla 2.14. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos considerando la existencia de anormalidad dental (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus A. Dental Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 3 8 9 20 Con 6 13 8 27
Total 9 21 17 47 p ≥ 0.50 Tabla 2.15. Frecuencia genotípica del polimorfismo ECA D/I dentro del grupo de diabéticos según la coexistencia de dislipidemia (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la presencia de dislipidemia (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Dislipidemia Genotipos DD DI II Total ECA D/I
Sin 5 11 5 21 Con 8 15 6 29
Total 13 26 11 50 p ≥ 0.90
25
Tabla 3.1. Frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo FV G1691A en diabéticos (D) comparadas con el grupo control (C) en cuentas y porcentaje; n = individuos estudiados. La “p” resultante de la comparación inter-grupo de las distribuciones (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Grupo Genotipo Alelo AA AG GG A G FV G1691A
C (n=163) 0 (0) 8 (5) 155 (95) 8 (3) 318 (98)
D (n=90) 1 (1) 5 (6) 84 (93) 7 (4) 173 (96) p ≥ 0.45 ≥ 0.40 Tabla 3.2. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con el género (femenino vs masculino). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por género (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Género FV G1691A AA AG GG Total FV G1691A
Femenino 1 4 56 61 Masculino 0 1 28 29
Total 1 5 84 90 p ≥ 0.35 Tabla 3.3. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos según la existencia de antecedentes familiares de diabetes, Ant Fam (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por este antecedente (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Ant Fam Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 0 20 20 Con 1 4 59 64
Total 1 4 79 84 p ≥ 0.20
26
Tabla 3.4. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos clasificados por la variable sobrepeso (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 3 37 40 Con 1 2 45 48
Total 1 5 82 88 p ≥ 0.40 Tabla 3.5. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos por la variable hipertensión arterial sistémica, HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones genotípicas por la presencia de HAS (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 3 34 37 Con 1 2 48 51
Total 1 5 82 88 p ≥ 0.40 Tabla 3.6. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso ó HAS Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 3 19 22 Con 1 2 63 66
Total 1 5 82 88 p ≥ 0.15
27
Tabla 3.7. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos por la variable anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable CV (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus CV Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 1 3 35 39 Con 0 1 24 25
Total 1 4 59 64 p ≥ 0.45 Tabla 3.8. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por tales variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso ó CV Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 2 29 31 Con 1 3 53 57
Total 1 5 82 88 p ≥ 0.60 Tabla 3.9. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables HAS ó anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS / CV Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 2 29 31 Con 1 3 53 57
Total 1 5 82 88 p ≥ 0.60
28
Tabla 3.10. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos de acuerdo a la existencia de nerfropatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable nefropatía (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Nefropatía Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 1 4 69 74 Con 0 1 12 13
Total 1 5 81 87 p ≥ 0.80 Tabla 3.11. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos considerando la retinopatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Retinopatía Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 4 62 66 Con 1 1 22 24
Total 1 5 84 90 p ≥ 0.20 Tabla 3.12. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con la presencia de pie diabético (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la ausencia o presencia de pie diabético (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Pie diabético Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 1 4 71 76 Con 0 1 8 9
Total 1 5 79 85 p ≥ 0.70
29
Tabla 3.13. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos separados por la presencia de cualquiera de las variables nefro-, retino-, neuropatía o pie diabético (NRNP, sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus NRNP Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 2 53 55 Con 1 3 31 35
Total 1 5 84 90 p ≥ 0.20 Tabla 3.14. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos considerando la existencia de anormalidad dental (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus A. Dental Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 1 13 14 Con 1 1 25 26
Total 1 2 38 41 p ≥ 0.65 Tabla 3.15. Frecuencia genotípica del polimorfismo FV G1691A dentro del grupo de diabéticos según la coexistencia de dislipidemia (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la presencia de dislipidemia (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Dislipidemia Genotipos AA AG GG Total FV G1691A
Sin 0 0 16 16 Con 1 2 25 28
Total 1 2 41 44 p ≥ 0.20
30
Tabla 4.1. Frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo FII G20210A en diabéticos (D) comparadas con el grupo control (C) en cuentas y porcentaje; n = individuos estudiados. La “p” resultante de la comparación inter-grupo de las distribuciones (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Grupo Genotipo Alelo AA AG GG A G FII G20210A
C (n=164) 0 (0) 4 (2) 160 (98) 4 (1) 324 (99)
D (n=102) 0 (0) 2 (2) 100 (98) 2 (1) 202 (99) p 1.0 ≥ 0.65 Tabla 4.2. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con el género (femenino vs masculino). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por género (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Género Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Femenino 0 1 69 70 Masculino 0 1 31 32
Total 0 2 100 102 p ≥ 0.55 Tabla 4.3. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos según la existencia de antecedentes familiares de diabetes, Ant Fam (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por este antecedente (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Ant Fam Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 0 22 22 Con 0 2 69 71
Total 0 2 91 93 p ≥ 0.25
31
Tabla 4.4. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos clasificados por la variable sobrepeso (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 1 39 40 Con 0 1 57 58
Total 0 2 96 98 p ≥ 0.70 Tabla 4.5. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos por la variable hipertensión arterial sistémica, HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones genotípicas por la presencia de HAS (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 1 38 39 Con 0 1 58 59
Total 0 2 96 98 p ≥ 0.75 Tabla 4.6. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso ó HAS Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 1 21 22 Con 0 1 75 76
Total 0 2 96 98 p ≥ 0.30
32
Tabla 4.7. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos por la variable anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable CV (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus CV Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 1 39 40 Con 0 0 33 33
Total 0 1 72 73 p ≥ 0.25 Tabla 4.8. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por tales variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Peso ó CV Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 1 29 30 Con 0 1 67 68
Total 0 2 96 98 p ≥ 0.50 Tabla 4.9. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables HAS ó anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS ó CV Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 1 30 31 Con 0 1 66 67
Total 0 2 96 98 p ≥ 0.55
33
Tabla 4.10. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos de acuerdo a la existencia de nerfropatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable nefropatía (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Nefropatía Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 2 83 85 Con 0 0 12 12
Total 0 2 95 97 p ≥ 0.45 Tabla 4.11. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos considerando la retinopatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Retinopatía Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 2 72 74 Con 0 0 28 28
Total 0 2 100 102 p ≥ 0.25 Tabla 4.12. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con la presencia de pie diabético (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la ausencia o presencia de pie diabético (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Pie diabético Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 2 83 85 Con 0 0 10 10
Total 0 2 93 95 p ≥ 0.50
34
Tabla 4.13. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos separados por la presencia de cualquiera de las variables nefro-, retino-, neuropatía o pie diabético (NRNP, varios, sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus NRNP Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 2 59 61 Con 0 0 41 41
Total 0 2 100 102 p ≥ 0.20 Tabla 4.14. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos considerando la existencia de anormalidad dental (A. dental, sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus A. dental Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 0 19 19 Con 1 1 27 29
Total 1 1 46 48 p ≥ 0.30 Tabla 4.15. Frecuencia genotípica del polimorfismo FII G20210A dentro del grupo de diabéticos según la coexistencia de dislipidemia (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la presencia de dislipidemia (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Dislipidemia Genotipos AA AG GG Total FII G20210A
Sin 0 0 20 20 Con 0 0 29 29
Total 0 0 49 49 p 1.0
35
Tabla 5.1. Frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo MTHFR C677T en diabéticos (D) comparadas con el grupo control (C) en cuentas y porcentaje; n = individuos estudiados. La “p” resultante de la comparación inter-grupo de las distribuciones (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Grupo Genotipo Alelo CC CT TT C T MTHFR C677T
C (n=101) 31 (31) 51 (51) 19 (19) 113 (56) 89 (44)
D (n=97) 28 (29) 53 (55) 16 (16) 109 (56) 85 (44) p ≥ 0.85 1.0 Tabla 5.2. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con el género (femenino vs masculino). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por género (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Género Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Femenino 21 32 13 66 Masculino 7 21 3 31
Total 28 53 16 97 p ≥ 0.15 Tabla 5.3. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos según la existencia de antecedentes familiares de diabetes, Ant Fam (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por este antecedente (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Ant Fam Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 5 11 5 21 Con 20 41 7 68
Total 25 52 12 89 p ≥ 0.20
36
Tabla 5.4. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos clasificados por la variable sobrepeso (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 16 17 8 41 Con 11 35 7 53
Total 27 52 15 94 p 0.1>p>0.05 Tabla 5.5. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos por la variable hipertensión arterial sistémica, HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones genotípicas por la presencia de HAS (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 14 19 7 40 Con 13 33 8 54
Total 27 52 15 94 p ≥ 0.40 Tabla 5.6. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso ó HAS Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 8 8 7 23 Con 19 44 8 71
Total 27 52 15 94 p <0.05
37
Tabla 5.7. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos por la variable anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable CV (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus CV Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 9 21 8 38 Con 7 20 3 30
Total 16 41 11 68 p ≥ 0.40 Tabla 5.8. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por tales variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso ó CV Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 13 12 6 31 Con 14 40 9 63
Total 27 52 15 94 p 0.1>p>0.05 Tabla 5.9. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables HAS ó anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS ó CV Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 11 16 5 32 Con 16 36 10 62
Total 27 52 15 94 p ≥ 0.65
38
Tabla 5.10. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos de acuerdo a la existencia de nerfropatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable nefropatía (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Nefropatía Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 22 45 14 81 Con 4 7 1 12
Total 26 52 15 93 p ≥ 0.65 Tabla 5.11. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos considerando la retinopatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Retinopatía Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 21 41 10 72 Con 7 12 6 25
Total 28 53 16 97 p ≥ 0.45 Tabla 5.12. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con la presencia de pie diabético (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la ausencia o presencia de pie diabético (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Pie diabético Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 25 44 12 81 Con 1 7 2 10
Total 26 51 14 91 p ≥ 0.30
39
Tabla 5.13. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos separados por la presencia de cualquiera de las variables nefro-, retino-, neuropatía o pie diabético (NRNP, sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus NRNP Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 17 34 9 60 Con 11 19 7 37
Total 28 53 16 97 p ≥ 0.80 Tabla 5.14. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos considerando la existencia de anormalidad dental (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus A. dental Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 2 13 3 18 Con 9 15 3 27
Total 11 28 6 45 p ≥ 0.20 Tabla 5.15. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR C677T dentro del grupo de diabéticos según la coexistencia de dislipidemia (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la presencia de dislipidemia (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Dislipidemia Genotipos CC CT TT Total MTHFR C677T
Sin 2 12 4 18 Con 6 18 4 28
Total 8 30 8 46 p ≥ 0.55
40
Tabla 6.1. Frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo MTHFR A1298C en diabéticos (D) comparadas con el grupo control (C) en cuentas y porcentaje; n = individuos estudiados. La “p” resultante de la comparación inter-grupo de las distribuciones (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Grupo Genotipo Alelo AA AC CC A C MTHFR A1298C
C (n=197) 108 (55) 83 (42) 6 (3) 299 (76) 95 (24)
D (n=104) 68 (70) 32 (26) 4 (4) 168 (81) 40 (19) p ≥ 0.15 ≥ 0.15 Tabla 6.2. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con el género (femenino vs masculino). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por género (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Género Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Femenino 46 21 4 71 Masculino 22 11 0 33
Total 68 32 4 104 P ≥ 0.35 Tabla 6.3. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos según la existencia de antecedentes familiares de diabetes, Ant Fam (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por este antecedente (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Ant Fam Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 12 9 1 22 Con 53 17 3 73
Total 65 26 4 95 P ≥ 0.25
41
Tabla 6.4. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos clasificados por la variable sobrepeso (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 30 10 3 43 Con 40 16 1 57
Total 70 26 4 100 P ≥ 0.35 Tabla 6.5. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos por la variable hipertensión arterial sistémica, HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones genotípicas por la presencia de HAS (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 27 13 2 42 Con 43 13 2 58
Total 70 26 4 100 P ≥ 0.30 Tabla 6.6. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó HAS (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso ó HAS Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 16 7 2 25 Con 54 19 2 75
Total 70 26 4 100 P ≥ 0.45
42
Tabla 6.7. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos por la variable anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable CV (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus CV Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 29 9 2 40 Con 23 9 1 33
Total 52 18 3 73 P ≥ 0.80 Tabla 6.8. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables sobrepeso ó CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por tales variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Sobrepeso ó CV Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 22 8 2 32 Con 48 18 2 68
Total 70 26 4 100 P ≥ 0.70 Tabla 6.9. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos por cualquiera de las variables HAS ó anormalidad cardiovascular, CV (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus HAS ó CV Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 21 11 1 33 Con 49 15 3 67
Total 70 26 4 100 P ≥ 0.45
43
Tabla 6.10. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos de acuerdo a la existencia de nerfropatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la variable nefropatía (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Nefropatía Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 60 23 2 85 Con 9 3 2 14
Total 69 26 4 99 P ≥ 0.10 Tabla 6.11. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos considerando la retinopatía (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Retinopatía Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 54 21 1 76 Con 18 6 3 27
Total 72 27 4 103 P 0.10>p>0.05 Tabla 6.12. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos de acuerdo con la presencia de pie diabético (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la ausencia o presencia de pie diabético (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Pie diabético Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 57 25 4 86 Con 10 1 0 11
Total 67 26 4 97 P ≥ 0.20
44
Tabla 6.13. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos separados por la presencia de cualquiera de las variables nefro-, retino-, neuropatía o pie diabético, NRNP (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones según estas variables (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus NRNP Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 42 18 0 60 Con 30 9 4 43
Total 72 27 4 103 P <0.05 Tabla 6.14. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos considerando la existencia de anormalidad dental (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por esta variable (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus A. dental Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 15 4 0 19 Con 17 9 2 28
Total 32 13 2 47 P ≥ 0.20 Tabla 6.15. Frecuencia genotípica del polimorfismo MTHFR A1298C dentro del grupo de diabéticos según la coexistencia de dislipidemia (sin vs con). La “p” resultante de la comparación de las distribuciones por la presencia de dislipidemia (X2 y prueba exacta de Fisher) se presenta en el último renglón. Locus Dislipidemia Genotipos AA AC CC Total MTHFR A1298C
Sin 17 3 0 20 Con 21 6 2 29
Total 38 9 2 49 P ≥ 0.25
45
Comparaciones entre ambos grupos. Cuando se compararon las distribuciones
entre los grupos DM2 y Con, las diferencias observadas en todos los polimorfismos
fueron estadísticamente no significativas (p>0.4).
Comparaciones en el grupo DM2. La mayoría de las diferencias en las
comparaciones intra-grupo por variable binomial bién resultaron no significativas
(p>0.10). Algunas comparaciones, aunque resultaron con valores de “p” cercanos al
límite para significancia (limítrofe, 0.10>p>0.05), no alcanzaron pasar dicho umbral.
Sin embargo, se señalan estas comparaciones que resultaron con p<0.10: el
polimorfismo MTHFR C677T en la variable sobrepeso de manera aislada
(0.10>p>0.05) o combinado con otras variables como la hipertensión arterial (p<0.05)
o anormalidad cardiovascular (0.10>p>0.05) y el polimorfismo MTHFR A1298C en la
variable retinopatía, sola (0.10>p>0.05) o combinada con con otras (p<0.05). Para
estas comparaciones intra-grupo, los ORs se obtuvieron para el fenotipo mutante
(heterocigoto + homocigoto mutante) MTHFR 677 T (CT+TT) y 1298 C (AC+CC). El
OR para el fenotipo MTHFR 677T y sobrepeso fue 1.54 (0.94-2.51), para MTHFR
677T y sobrepeso o HAS: 1.10 (0.84-1.45) y para MTHFR 677T y sobrepeso o CV:
1.41 (0.95-2.09); mientras que para MTHFR 1298C y retinopatía el OR fue 1.16
(0.59-2.29) y para MTHFR 1298C y cualquiera de varias complicaciones: 1.01 (0.61-
1.65). De estos ORs, los más notorios, aunque en el límite de la significancia son
para el polimorfismo MTHFR 677T y sobrepeso.
46
7. DISCUSION
Características de los pacientes
En el grupo DM2 estudiado llaman la atención las siguientes características:
La alta prevalencia de sobrepeso y obesidad, con un promedio del IMC > 29. En
estudios previos de nuestro laboratorio (datos no publicados), el IMC promedio de los
pacientes no diabéticos se encuentra por debajo del umbral de sobrepeso es ≤ 25).
Esta observación es concordante con lo conocido en la literatura acerca de la
asociación de sobrepeso y DM2 (Powers 2001).
Considerando que los pacientes tienen un manejo y seguimiento institucional, el
promedio de glucosa en ayuno (161 mg/dl) en el grupo DM2 es un reflejo de una
descompensación y consecuentemente de un control subóptimo de su padecimiento.
El inesperado hallazgo de un elevado número de pacientes que refieren
antecedentes heredofamiliares positivos para DM2 (positivo en más del 75% de
ellos). Esta observación no corresponde a lo descrito en la literatura (Powers 2001) y
sugiere que en nuestro medio existe un componente familiar particular,
probablemente genético como factor contribuyente para la génesis del padecimiento.
La coexistencia de HAS en un 50% de los pacientes es de particular interés, ya que
se trata de una manifestación asociada con otras complicaciones de la DM2, en
especial con la nefropatía, que constituye la complicación más grave de la DM2. De
hecho, se conoce que la nefropatía es más común en los pacientes con HAS que en
aquéllos que no muestran dicho rasgo (Alebiosu y cols. 2003).
Aunque es posible que un análisis estadístico exhaustivo de los datos en estos
pacientes pudiera generar información relevante, dicho análisis va más allá de los
objetivos de este trabajo. Además, salvo uno o dos rasgos particulares relevantes en
47
nuestro medio, las asociaciones entre complicaciones de la DM2 han sido
ampliamente discutidas en la literatura.
Comparaciones inter-grupo
Las proporciones genotípicas estuvieron en concordancia con las expectativas de la
ley de Hardy-Weinberg en el grupo Con para todos los genes estudiados. En relación
con estos polimorfismos, las comparaciones intergrupales mostraron en todos los
casos diferencias N.S. entre los grupos DM2 y Con (p>0.4), tanto en las
distribuciones genotípicas como alélicas. Esta observación de una falta de
diferencias significativas entre los grupos DM2 y Con constituye un indicador de que
los genes estudiados no representan riesgo diferencial alguno para la instauración de
la DM2. Sin embargo, ante la falta de una robustez de poder en análisis debido al
tamaño de la muestra, no es posible abundar más o alcanzar conclusiones definitivas
en este sentido.
Características intra-grupo
Desde 1995 (Fujisawa y cols. 1995, Mizuiri y cols. 1995) se planteó la posibilidad de
que algunos polimorfismos genéticos contribuyen al desarrollo de las complicaciones
de la DM. En particular los estudios se han referido a la génesis y la evolución de la
cardiopatía, la nefropatía y la retinopatía en diabéticos (Mizuiri y cols. 1995, Parving y
cols. 1996, Neugebauer y cols. 1998, Wirta y cols. 2002, Sun y cols. 2003). Estos
estudios involucran solamente los genes ECA y MTHFR y aunque sus resultados
sugieren cierto grado de contribución al riesgo de complicaciones, las conclusiones
de los mismos no son aún definitivas. Aunque otros genes trombofílicos y
anormalidades en la coagulabilidad se han investigado en padecimientos
relacionados con la DM y con la DM misma (Ouvina y cols. 2001), no se conocen
estudios de asociación entre genes trombofílicos y las complicaciones de la DM. Los
OR para estas comparaciones de genotipos se efectuó con los fenotipos mutantes.
Sin embargo, la distribución de los genotipos diferentes no mostró diferencias
48
significativas en los ORs. Los ORs más significativos fueron los correspondientes al
fenotipo MTHFR 677 T (CT+TT) para sobrepeso, con un valor aproximado de 1.5 y
rangos en el límite de la significancia (0.94-2.51). Es probable que la falta de
significancia obedezca al tamaño relativamente pequeño de la muestra.
Aunque las conclusiones son limitadas por este tamaño muestral y los resultados del
presente trabajo no evidencian una relación entre la mayoría de los polimorfismos y
las complicaciones estudiados, los polimorfismos MTHFR variantes (T para 677 y C
para 1298) se observaron con más frecuencia en los pacientes con sobrepeso y
micoangiopatías diabéticas vs los que no refirieron esta complicación. Resultados
similares que involucran estos polimorfismos han sido publicados previamente por
Shpichinetsky y cols. (2000) en relación con la nefropatía diabética. Es probable que
dichos resultados guarden paralelismo con los aquí observados.
Algunas alteraciones en la dieta tienen repercusión en el metabolismo del ácido fólico
e influyen en el riesgo para ciertas malformaciones (Smithells y cols. 1980). Se ha
sugerido también que algunos factores genéticos influyen en dicho metabolismo,
entre los cuales se consideran los polimorfismos del gen de la enzima MTHFR (van
der Put y cols. 1995) y la suplementación con ácido fólico previene dichas
anormalidades (Smithells y cols. 1980).
Tanto las observaciones de Shpichinetsky como las del presente trabajo contribuyen
a que se considere la eventual intervención preventiva/terapéutica con ácido fólico en
personas diabéticas a fin de retrasar la aparición de algunas complicaciones.
49
8. CONCLUSION
En este trabajo se analiza la posible asociación de genes trombofílicos con algunas
de las complicaciones de la DM2. Los resultados muestran diferencias intragrupales
de los polimorfismos estudiados del gen MTHFR, observación previamente no
descrita en la literatura.
En virtud de las limitaciones del presente estudio, se requieren investigaciones
adicionales en pacientes con sobrepeso y retinopatía diabética con el fin de
corroborar estos hallazgos. De ser así, una alternativa intervencionista con ácido
fólico quedaría sustentada.
50
9. BIBLIOGRAFIA
Ajabnoor MA, AL-Ama MN, Banjar Z, Rafee AA, Sheweita SA. Homocysteine level
and other biochemical parameters in cardiovascular disease patients with diabetes
mellitus. Med Sci Monit 9:CR523-7, 2003.
Alebiosu CO, Odusan O, Jaiyesimi A. Morbidity in relation to stage of diabetic
nephropathy in type-2 diabetic patients. J Natl Med Assoc. 95:1042-7, 2003.
Bernardi F, Marchetti G. Modulation of thrombophilia genes by environmental factors.
Pathophysiol Haemost Thromb. 32:335-7, 2002.
Bertina RM, Koeleman BPC, Koster T, Rosendaal FR, Driven RJ, Ronde H, Van Der
Velden PA, Reitsma PH. Mutation in blood coagulation factor V associated with
resistance to activated protein C. Nature 369:64–7, 1994.
Bertina RM, Ploos van Amstel HK, van Wijngaarden A, Coenen J, Leemhuis MP,
Deutz-Terlouw PP, van der Linden IK, Reitsma PH. Heerlen polymorphism of protein
S, an immunologic polymorphism due to dimorphism of residue 460. Blood 76:538-
48, 1990.
Chakraborty R. Sample size requirements for addressing the population genetic
issues of forensic use of DNA typing. Hum Biol 64:141-59, 1992.
Chowdhury TA, Dyer PH, Kumar S, Barnett AH, Bain SC. Genetic determinants of
diabetic nephropathy. Clin Sci (Lond) 96:221-30, 1999.
Cotran R y Crawford J. The Exocrine Pancreas. En: Cotran S, Kumar V, Collins T
Robbins Pathologic Basis of Disease. WB Saunders. EUA, 1999, p. 913-26.
51
Crabb D y Harris R. Metabolic Interrelationships of Tissues in Various Nutritional and
Hormonal States. En: Devlin y cols. Textbook of Biochemistry. Wiley-Liss, EUA, 1997,
p. 548-51.
Davalos IP, Olivares N, Castillo MT, Cantu JM, Ibarra B, Sandoval L, Moran MC,
Gallegos MP, Chakraborty R, Rivas F. The C677T polymorphism of the
methylenetetrahydrofolate reductase gene in Mexican mestizo neural-tube defect
parents, control mestizo and native populations. Ann Genet 43:89-92, 2000.
De Stefano V, Leone G. Resistance to activated protein C due to mutated factor V as
a novel cause of inherited thrombophilia. Haematologica 80:344-56, 1995.
Doria A, Warram JH, Krolewski AS. Genetic predisposition to diabetic nephropathy.
Evidence for a role of the angiotensin I-converting enzyme gene. Diabetes 43:690-5,
1994.
Endler G, Mannhalter C. Polymorphisms in coagulation factor genes and their impact
on arterial and venous thrombosis. Clin Chim Acta 330:31-55, 2003.
Fenton W, Rosenblatt D. Inherited Disorders of Folate and Cobalamin Transport and
Metabolism. En: Scriver y cols., editores. The Metabolic Bases of Inherited Disease
8th ed. McGraw-Hill, EUA, 2001, p. 3897-909.
Fodinger M, Horl WH, Sunder-Plassmann G. Molecular biology of 5,10-
methylenetetrahydrofolate reductase. J Nephrol 13:20-33, 2000.
Frosst P, Blom H, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Mathews RG, Boers GJ, den
Heijer M, Kluijtmans LAJ, van den Heuvel LP, Rozen R. A candidate genetic risk
factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate
reductase. Nat Genet 10:111-3, 1995.
52
Fujisawa T, Ikegami H, Shen GQ, Yamato E, Takekawa K, Nakagawa Y, Hamada Y,
Ueda H, Rakugi H, Higaki J. Angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism is
associated with myocardial infarction, but not with retinopathy or nephropathy, in
NIDDM. Diabetes Care 18:983-5, 1995.
Goyette P, Sumner JS, Milos R, Duncan AM, Rosenblatt DS, Matthews RG, Rozen R.
Human methylenetetrahydrofolate reductase: isolation of cDNA, mapping and
mutation identification. Nat Genet 7:195-200, 1994.
Gutiérrez C, Vendrell J, Pastor R, Llor C, Aguilar C, Broch M, Richart C. Angiotensin
I – converting enzyme and angiotensinogen gene polymorphisms in non – insulin –
dependent diabetes mellitus. Lack of relationship with diabetic nephropathy and
retinopathy in a caucasian mediterranean population. Metabolism 46:976–80, 1997.
Hanssen KF. Blood glucose control and microvascular and macrovascular
complications in diabetes. Diabetes 46:S101-3, 1997.
Hillarp A, Zoller B, Svensson PJ, Dahlback B. The 20210 A allele of the prothrombin
gene is a common risk factor among Swedish outpatients with verified deep venous
thrombosis. Thromb Haemost 78:990-2, 1997.
INEGI.http://www.inegi.gob.mx/est/contenidos/espanol/tematicos/mediano/med.asp?t
=mpob03&c=3180. Acceso: 7 diciembre 2003.
Jalil JE, Piddo AM, Cordova S, Chamorro G, Braun S, Jalil R, Vega J, Jadue'P L,
Lavandero S, Lastra P. Prevalence of the angiotensin I converting enzyme
insertion/deletion polymorphism, plasma angiotensin converting enzyme activity, and
left ventricular mass in a normotensive Chilean population. Am J Hypertens 12:697-
704, 1999.
53
Jorde L, Carey J, Bamshad M, White R. Multifactorial Inheritance and Common
Disease. Medical Genetics. Mosby, EUA, 1999 p. 259-61.
Kalafatis M, Mann KG. Factor VLeiden and thrombophilia. Arterioscler Thromb Vasc
Biol 17:620-7, 1997.
Kang SS, Wong PW, Susmano A, Sora J, Norusis M, Ruggie N. Thermolabile
methylenetetrahydrofolate reductase: an inherited risk factor for coronary artery
disease. Am J Hum Genet. 48:536-45, 1991.
Kang SS, Wong PW, Zhou JM, Sora J, Lessick M, Ruggie N, Grcevich
G.Thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase in patients with coronary artery
disease. Metabolism 37:611-3, 1988.
Ko YL, Ko YS, Wang SM, Chu PH, Teng MS, Cheng NJ, Chen WJ, Hsu TS, Kuo CT,
Chiang CW, Lee YS. Angiotensinogen and angiotensin-I converting enzyme gene
polymorphisms and the risk of coronary artery disease in Chinese. Hum Genet
100:210-4, 1997.
Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA
from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 16:1215, 1988.
Mizuiri S, Hemmi H, Inoue A, Yoshikawa H, Tanegashima M, Fushimi T, Ishigami M,
Amagasaki Y, Ohara T, Shimatake H, et al.Angiotensin-converting enzyme
polymorphism and development of diabetic nephropathy in non-insulin-dependent
diabetes mellitus. Nephron 70:455-9, 1995.
Neugebauer S, Baba T, Watanabe T Methylenetetrahydrofolate reductase gene
polymorphism as a risk factor for diabetic nephropathy in NIDDM patients. Lancet
352:454, 1998.
54
Okumura K, Aso Y.High plasma homocysteine concentrations are associated with
plasma concentrations of thrombomodulin in patients with type 2 diabetes and link
diabetic nephropathy to macroangiopathy. Metabolism 52:1517-22, 2003.
OMS. http://www.who.int/ncd/dia/databases4.htm. Acceso: 7 diciembre 2003.
Ouvina SM, La Greca RD, Zanaro NL, Palmer L, Sassetti B. Endothelial dysfunction,
nitric oxide and platelet activation in hypertensive and diabetic type II patients.
Thromb Res 102:107-14, 2001.
Parving HH, Tarnow L, Rossing P. Genetics of diabetic nephropathy. J Am Soc
Nephrol 7:2509-17, 1996.
Powers A. Diabetes Mellitus. En: Braunwald y cols., Editores. Harrison’s Principles of
Internal Medicine,15th ed. McGraw-Hill, EUA, 2001, p 2109-37.
Rosendaal FR, Doggen CJM, Zivelin A, Arrunda VR, Aiach M, Siscovick DS, Hillarp
A, Watzke HH, Bernardi F, Cumming AM, Preston FE, Reitsma PH. Geographic
distribution of the 20210 G to A prothrombin variant. Throm Haemost 79:706–8, 1998.
Sack G. Jr. Genetics and Common Diseases. En: Sack G. Jr. Medical Genetics.
McGraw-Hill, EUA 1999, p. 217-18.
Shcherbak NS, Shutskaya ZV, Sheidina AM, Larionova VI, Schwartz EI.
Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism as a risk factor for diabetic
nephropathy in IDDM patients. Mol Genet Metab 68:375-8, 1999.
Shpichinetsky V, Raz I, Friedlander Y, Goldschmidt N, Wexler ID, Ben-Yehuda A,
Friedman G. The association between two common mutations C677T and A1298C in
human methylenetetrahydrofolate reductase gene and the risk for diabetic
nephropathy in type II diabetic patients. J Nutr 130:2493-7, 2000.
55
Smithells RW, Sheppard S, Schorah CJ, Seller MJ, Nevin NC, Harris R, Read AP,
Fielding DW. Possible prevention of neural-tube defects by periconceptional vitamin
supplementation. Lancet 1:339-40, 1980.
Sun J, Xu Y, Zhu Y, Lu H, Deng H, Fan Y, Sun S, Zhang Y. The relationship between
MTHFR gene polymorphisms, plasma homocysteine levels and diabetic retinopathy
in type 2 diabetes mellitus. Chin Med J 116:145-7, 2003.
Szolnoki Z, Somogyvari F, Kondacs A, Szabo M, Fodor L, Bene J, Melegh
B.Evaluation of the modifying effects of unfavourable genotypes on classical clinical
risk factors for ischaemic stroke. J Neurol Neurosurg Psychiatry 74:1615-20, 2003.
Tanis BC, Bloemenkamp DG, van den Bosch MA, Kemmeren JM, Algra A, van de
Graaf Y, Rosendaal FR. Prothrombotic coagulation defects and cardiovascular risk
factors in young women with acute myocardial infarction. Br J Haematol 122:471-8,
2003.
Taylor S. Insulin Action, Insulin Resistance, and Type 2 Diabetes Mellitus. En: Scriver
y cols., editores. The Metabolic Bases of Inherited Disease 8th ed. McGraw-Hill, EUA,
2001, p. 1433-69.
Thomas GN, Tomlinson B, Chan JCN, Sanderson JE, Cockram CS, Critchley JAJH.
Renin-Angiotensin system gene polymorphisms, blood pressure, dyslipidemia, and
diabetes in Honk Kong Chinese. Diabetes Care 24:356-61, 2001.
Thomas GN, Young RP, Tomilinson B, Woo KS, Sanderson JE, Critchley JAJH.
Renin-angiotensin-aldosterone system gene polymorphisms and hypertension in
Honk Kong Chinese. Clin and Expper Hypertension 22:87-97, 2000.
Tobelem G. Molecular basis of thrombosis. Nouv Rev Fr Hematol 33:71-5, 1991..
56
Wilson AG, di Giovine FS, Blakemore AI, Duff GW. Single base polymorphism in the
human tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) gene detectable by NcoI restriction of
PCR product. Hum Mol Genet 1:353, 1992.
Valdez LL, Quintero A, Garcia E, Olivares N, Celis A, Rivas F Jr, Rivas F.
Thrombophilic polymorphisms in preterm delivery. Blood Cells Mol Dis (en prensa, Jul
2004).
van der Put NM, Steegers-Theunissen RP, Frosst P, Trijbels FJ, Eskes TK, van den
Heuvel LP, Mariman EC, den Heyer M, Rozen R, Blom HJ. Mutated
methylenetetrahydrofolate reductase as a risk factor for spina bifida. Lancet
346:1070-1, 1995.
van der Put NM, Steegers-Theunissen RP, Frosst P, Trijbels FJ, Eskes TK, van den
Heuvel LP, Mariman EC, den Heyer M, Rozen R, Blom HJ. Mutated
methylenetetrahydrofolate reductase as a risk factor for spina bifida. Lancet
346:1070-1, 1995.
Wirta V, Saransaari P, Wirta O, Rantalaiho V, Oja SS, Pasternack A, Koivula T,
Lehtimaki T. Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism,
hyperhomocysteinemia and occlusive retinal vascular disease in type 2 diabetic and
non-diabetic subjects. Clin Nephrol 58:171-8, 2002.
57
10. ANEXO 1. FORMA DE CONSENTIMIENTO INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL CENTRO DE INVESTIGACION BIOMEDICA DE OCCIDENTE (CIBO) Nombre __________________________________ IMSS _________________ Año ó edad de inicio _______ Escolaridad _______ Ocupación _________ Evolución estable/inestable ____ Dieta sí - no Sobrepeso sí - no Hipertensión sí - no Familiares con diabetes tipo 2_______________________________________ Medicamentos ________________________________________________________ Complicaciones _ninguna _riñón _retina _neurológico _vasculares _úlceras _dentales _otras ________________________ CONSENTIMIENTO PARA PARTICIPAR EN UN PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Por este documento manifiesto que: 1. He sido informado acerca del proyecto “POLIMORFISMOS DE GENES TROMBOFILICOS EN PACIENTES CON DIABETES MELLITUS TIPO 2 Y SUS COMPLICACIONES” que realizan los investigadores del CIBO, IMSS y cuyo responsable es el Dr. Fernando Rivas. 2. He sido invitado a participar voluntariamente en el mismo, aportando información y muestras de sangre de mi persona y de mi familia. 3. Entiendo que el procedimiento para la toma de muestras no representa mayores molestias para mi persona. 4. Autorizo al Dr. Rivas del CIBO y a quienes él indique para realizar los procedimientos de laboratorio de ADN convenientes al proyecto y otros relacionados, y a hacer uso de las muestras y de la información resultante con fines científicos, docentes y estadísticos, siempre y cuando se haga en el marco de la ética profesional y se guarde la confidencialidad de los mismos. 5. Se me ha orientado para dirigirme al responsable del proyecto en caso de querer tratar cualquier asunto relacionado con mi participación. Nombre de la persona que entrevistó: _______________________________ Nombre de la persona que tomó la muestra: ___________________________ Fecha, nombre y firma del paciente __________________________________ Testigo (Nombre y firma) Testigo (Nombre y firma) ______________________________ _______________________________
58
ANEXO 2. METODOS DE LABORATORIO
En todos los casos el volumen total de las mezclas de reacción para PCR fue de 10
µl y para las digestiones 10-12 µl aforados con agua.
GEN O MARCADOR: FII (protrombina) REFERENCIA: Rosendaal y cols. 1998
ALELOS: 194 pb (alelo normal G) y 194 pb (alelo mutado A)
INICIADORES G: 5’-CTG GGA GCA TTG AAG CTC-3’ (20210G)
5’-GGG AAA TAT GGC TTC TAC A-3’ (20210F)
INICIADORES A: 5’-CTG GGA GCA TTG AAG CTT-3’ (20210A)
5’-GGG AAA TAT GGC TTC TAC A-3’ (20210F)
INICIADORES CONTROL: TNF-3’ y TNF–5’.
REACTIVOS DE PCR
Buffer 10X 1 µl
MgCl2 (50 mM) 0.3 µl
dNTP’s (10 mM) 0.2 µl
Iniciador F (100 pmol/µl) 0.2 µl
Iniciador R (100 pmol/µl) 0.2 µl
Iniciador 3’ TNF (20 pmol/µl) 0.2 µl
Iniciador 5’ TNF (20 pmol/µl) 0.2 µl
Taq (0.25 U/µl) 1.0 µl
ADN (100 ng/µl) 1.0 µl
CONDICIONES
Desnaturalización inicial: 94 °C 3’
Desnaturalización: 94 °C 30’’
Alineamiento: 59 °C 30’’
Síntesis: 70 °C 30’’
59
Ciclos: 30
Síntesis: 70 °C 10’
Enfriamiento: 4 °C 5’
Gel: Poliacrilamida (29:1) 6 %, Voltaje 180 V, Tiempo 70 min.
60
GEN O MARCADOR: ECA REFERENCIA: Gutiérrez y cols. 1997
ALELOS: 190 pb (alelo mutado, D), 490 pb (alelo normal, I)
ALELO D, 190 pb
INICIADORES: 5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3’(ECA – 16F)
5’-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3’ (ECA – 16 R)
REACTIVOS DE PCR
Buffer 10X 1 µl
MgCl2 (50 mM) 0.4 µl
dNTP’s (10 mM) 0.2 µl
Iniciador F (100 pmol/µl) 0.1 µl
Iniciador R (100 pmol/µl) 0.1 µl
Taq (0.25 U/µl) 1.0 µl
ADN (100 ng/µl) 1.0 µl
CONDICIONES
Desnaturalización inicial: 94 °C 3’
Desnaturalización: 94 °C 1’
Alineamiento: 62 °C 30’’
Síntesis: 72 °C 2’
Ciclos: 30
Síntesis: 72 °C 10’
Enfriamiento: 4 °C 5’
Gel: Poliacrilamida (29 : 1) 6 %, Voltaje 180 V, Tiempo: 90 min.
61
ALELO I, 335 pb
INICIADORES: 5’-TGG GAC CAG AGC GCC CGC CAC TAC-3’ (ECA-F)
5’-TCG CCA GCC CTC CCA TGC CCA TAA-3’ (ECA-R)
REACTIVOS DE PCR
Buffer 10X 1 µl
MgCl2 (50 mM) 0.4 µl
dNTP’s (10 mM) 0.2 µl
Iniciador F (100 pmol/µl) 0.1 µl
Iniciador R (100 pmol/µl) 0.1 µl
Taq (0.25 U/µl) 1.0 µl
ADN (100 ng/µl) 1.0 µl
CONDICIONES
Desnaturalización inicial: 94 °C 3’
Desnaturalización: 94 °C 1’
Alineamiento: 69 °C 30’’
Síntesis: 72 °C 2’
Ciclos: 30
Síntesis: 72 °C 10’
Enfriamiento: 4 °C 5’
Gel: Poliacrilamida (29:1) 6 %, Voltaje 180 V, Tiempo 90 min.
62
GEN O MARCADOR: Factor V Leiden REFERENCIA: Bertina y cols. 1994
RFLP (digestión con Mnl1)
INICIADORES: 5´-TGC CCA GTG CTT AAC AAG ACC A-3´ (FVL-F)
5´-TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA-3´ (FVL-R)
Tamaño del producto 267 pb.
REACTIVOS DE PCR
Buffer 10X 1 µl
MgCl2 (50 mM) 0.4 µl
dNTP’s (10 mM) 0.2 µl
Iniciador F (100 pmol/µl) 0.2 µl
Iniciador R (100 pmol/µl) 0.2 µl
Taq (0.25 U/µl) 1.0 µl
ADN (100 ng/µl) 1.0 µl
CONDICIONES
Desnaturalización inicial: 94 °C 3’
Desnaturalización: 91 °C 40’’
Alineamiento: 55 °C 40’’
Síntesis: 71 °C 2’
Ciclos: 36
Síntesis: 72 °C 10’
Enfriamiento: 4 °C 5’
Gel: Poliacrilamida (29:1) 6 %, Voltaje 180 V, Tiempo: 90 min.
63
FACTOR V LEIDEN DIGESTION (Mnl1)
REACTIVOS
Buffer (10X) 1 µl
BSA (100 X) 0.1 µl
Mnl1 (5000 U/µl) 0.2 µl
Amplificado 5.0 µl
Incubar a 37 °C durante 3 h.
ALELOS: 37, 67 y 163 pb (alelo normal 1691G), 67 y 200 pb (alelo mutado 1691A).
Gel: Poliacrilamida (29:1) 6 %, Voltaje 180 V, Tiempo 60 min.
64
GEN O MARCADOR: MTHFR (C677T) REFERENCIA: Frosst y cols. 1995
RFLP (digestión con Hinf I)
INICIADORES: 5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CG GGA-3’ (MTHFR-F)
5'- GGA CGG TGC GGT GAG AGT G-3' (MTHFR-R)
Tamaño del amplificado 198 pb.
PCR REACTIVOS
Buffer 10X 1µl
MgCl2 (50 mM) 0.5 µl
dNTP’s (10 mM) 0.2 µl
Iniciador F(100 pmol/µl) 0.1 µl
Iniciador R(100 pmol/µl) 0.1 µl
Taq (0.25 U/µl) 1.0 µl
ADN (100 ng/µl) 1.0 µl
CONDICIONES
Desnaturalización inicial: 94 °C 5’
Desnaturalización: 94 °C 50’’
Alineamiento: 65 °C 50’’
Síntesis: 72 °C 50’’
Ciclos: 28
Síntesis: 72 °C 7’
Enfriamiento: 4 °C 5’
Gel: Poliacrilamida (29:1) 6 %, Voltaje 180 V, Tiempo 70 min.
65
DIGESTIÓN PARA MTHFR (Hinf 1)
REACTIVOS
Buffer (10X) 1.2 µl
BSA (100 X) 0.1 µl
Hinf 1 (10,000 U/ml) 0.4 µl
Amplificado 3.0 µl
Incubar a 37 °C durante 3 h.
ALELOS: 198 pb (alelo normal 677C), 23 y 175 pb (alelo mutado 677T)
Gel: Poliacrilamida (29:1) 6 %, Voltaje 180 V, Tiempo 70 min.
66
GEN O MARCADOR: MTHFR (A1298C) REFERENCIA: van der Put y cols. 1998
RFLP (digestión con MboII)
INICIADORES: 5’-CTT TGG GGA GCT GAA GGA CTA CTA C-3’ (1298 F)
5’-CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG-3’ (1298 R)
Tamaño del amplificado 163 pb
REACTIVOS PCR
Buffer 10X 1 µl
MgCl2 (50 mM) 0.3 µl
dNTP’s (10 mM) 0.2 µl
Iniciador F(100 pmol/µl) 0.05 µl
Iniciador R(100 pmol/µl) 0.05 µl
Taq (0.25 U/µl) 1.0 µl
ADN (100 ng/µl) 1.0 µl
CONDICIONES
Desnaturalización inicial: 94 °C 5’
Desnaturalización: 94 °C 50’’
Alineamiento: 65 °C 50’’
Síntesis: 72 °C 50’’
Ciclos: 28
Síntesis: 72 °C 7’
Enfriamiento: 4 °C 5’
Gel: Poliacrilamida (29:1) 6 %, Voltaje 180 V, Tiempo 70 min.
67
DIGESTIÓN PARA MTHFR 1298 (MboII)
ALELOS: 56, 28, 31, 30 y 18 pb (alelo A), 84, 31, 30 y 18 pb (alelo C)
DIGESTION REACTIVOS
Buffer (10X) 1 µl
Mbo II (10,000 U/ml) 0.3 µl
Amplificado 4.0 µl
Incubar a 37 °C durante 2 horas.
Gel: Poliacrilamida (29:1) 6 %, Voltaje 180 V, Tiempo 70 min.
REFERENCIAS en la sección 9. Bibliografía
