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Universidad de Colima

FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS

"ESTABILIDAD DEL ANTIGENO PROSTATICO ESPECIFICO LIBRE Y TOTAL, Y SUS EFECTOS EN LOS RESULTADOS DE

LABORATORIO."

TESIS

Que para obtener el grado de:

Maestría en Ciencias Médicas

Presenta

El Q.F.B. Francisco Vargas Salas

Asesores

DR. RAFAEL COLL CARDENAS C.U.I.B., U. DE C.

1

DR. C. MOISES HERNANDEZ SUAREZ CIENCIAS BASICAS, U. DE C. Q.B.P. FRANCISCO VARGAS GOMEZ DIRECTOR L.Q.V.

Colima, Col. Julio del 2000

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AGRADECIMIENTOS

A Dios, por haberme permitido concluir un ciclo más de vida.

A mis padres, Francisco y Margarita, que con gran esfuerzo y dedicación

hicieron de mi un hombre de bien, siempre los mantendré en mente con un gran

cariño.

A mi esposa, Gabriela A., que siempre he contado con su apoyo y, he

compartido bellas experiencias y responsabilidades.

A mi hija, Gabriela Margarita, por su gran cariño, y su alegría que siempre me ha

inspirado.

A los doctores J. Rafael Coll y Carlos Moisés Hernández por su tiempo, asesoría,

dedicación y apoyo para la culminación de esta tesis .

Al Q.B.P. Francisco Vargas Gómez por transmitirme sus conocimientos y

experiencias, que sin duda alguna, han influído para forjarme.

A los doctores Luis R. Beas y Sergio Cevallos G. por su orientación y apoyo

para realizar el presente trabajo.

A todos aquellas personas que de alguna manera intervinieron en la realización

de este trabajo.

1

INDICE

RESUMEN.................................................................................................3 INTRODUCCION ...................................................................................... 5

ANTECEDENTES CIENTIFICOS .............................................................. 7

I.- Historia....................................................................................... 7

II.- El Antígeno Prostático................................................................ 8

III.- Síntesis del PSA....................................................................... 13

IV.- Formas Moleculares..................................................................13

V.- Relación PSA y Edad.................................................................15

VI.- Característica Enzimática y Estructural......................................18

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...................................................... 23

HIPÓTESIS................................................................................................ 24

OBJETIVOS............................................................................................... 25

METODOLOGIA ....................................................................................... 26

TECNICA DE MUESTREO ....................................................................... 27

CONTROL DE CALIDAD INTERNO........................................................ 32

2

ANALISIS DE RESULTADOS ..................................................................42

CONCLUSIONES Y DISCUSIONES ......................................................... 53

ANEXOS ...................................................................................................56

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.......................................................... 68

3

RESUMEN

Propósito: El antígeno prostático específico (PSA-T), el antígeno prostático fracción

Libre (PSA-L) y su cociente, se han utilizado para el diagnóstico de cáncer de próstata. Si las

muestras no son conservadas con su Buffer adecuado, ó conservadas a -20°C sus

concentraciones in vitro se ven modificadas con el paso del tiempo; dando como resultados

diagnósticos erróneos. En la presente investigación, se estudió la forma en que el PSA-T y

PSA-L y su cociente se alteran con el paso del tiempo bajo condiciones de temperatura de

cuarto, determinando cuales son los umbrales de riesgo de las concentraciones del antígeno

prostático específico.Se estudió la estabilidad in vitro de PSA-L , PSA-T y su cociente en

suero de pacientes con un PSA-T de 2 ng/mL a 30 ng/mL con cáncer prostático ó hiperplasia

prostática benigna (HPB), y en hombres de edad mayor sin enfermedad prostática.

Materiales y Métodos: Los efectos del almacenaje a temperatura ambiente in vitro de

PSA-T y su cociente, fueron analizados en el suero de 83 pacientes. Todos tuvieron PSA-T

mayor de 2 ng/mL y menores de 30 ng/mL PSA-T y PSA-L fueron medidos por

inmunoensayos enzimáticos comerciales. Los resultados fueron analizados mediante regresión

lineal.

Resultados: Se encontró una diferencia mínima entre las lecturas. a las 24 horas. A las

48 horas encontramos una diferencia de 1.05 ng/mL. El valor no confiable para las

mediciones es a partir de las 72 horas, que es de 1.96 ng/mL, mientras que a las 168 horas se

encontró la mayor probabilidad de obtener falsos positivos.

Conclusiones: Los rangos que se obtuvieron falsos positivos de acuerdo al tiempo

entre su extracción venosa y el tiempo de su inmunoanálisis son: 1) A las 24 horas son de

10.88 ng/mL a 10.47 ng/mL. 2) A las 48 horas son de 10.88 ng/mL a 9.83 ng/mL. 3) A las 72

horas son de 10.88 ng/mL a 8.91 ng/mL. 4) A las 96 horas son de 10.88 ng/mL a 7.69 ng/mL.

5) A las 120 horas son de 10.88 ng/mL a 6.16 ng/mL. 6) A las 144 horas son de 10.88 ng/mL a

4.32 ng/mL. 7) A las 168 horas son de 10.88 ng/mL a 2.18 ng/mL.

4

ABSTRACT

Purpose: The prostate-specific antigen (PSA) and the fraction Free prostate-specific

antigen (PSA-f) and its ratio have been used to diagnose prostate cancer. If the samples are not

conserved with their proper buffer or if the in vitro concentrations are conserved at -20°C,

their results become time-modified, causing diagnostic errors. In the present work, the way in

which the PSA and PSA-f and its ratio are altered by the passage of time under room

temperature conditions is studied, determining the risk thresholds for prostate- specific antigen

concentrations. The stability in vitro of PSA-f and PSA and its ratio was studied in the serum

of patients with prostate cancer or benign prostatic hyperplasia (BPH) with a PSA from 2

ng/mL to 30 ng/mL, and in elderly men with no prostate disease.

Materials and Methods: The effects of storage at room temperature in vitro of PSA

and its ratio were analyzed from the serum of 83 patients. All patients had a PSA greater than

2 ng/mL and less than 30 ng/mL. PSA and PSA-f were measured by commercial enzymatic

immunoassays. The results were analyzed by linear regression.

Results: A minimal difference among readings was found at a 24-hour time period.

At 48 hours a difference of 1.05 ng/mL was found. The unreliable value of 1.96 ng/mL for

measurings was found starting from a 72-hour time period, while the greatest probability of

false positives was found at 168 hours.

Conclusions: The ranges in which false positives were obtained, in accordance

with the time lapse from vein extraction to immune analysis are: 1) from 10.88 ng/mL to

10.47 at 24 hours 2) from 10.88 ng/mL to 9.83 ng/mL at 48 hours 3) from 10.88 ng/mL to

8.91 ng/mL at 72 hours 4) from 10.88 ng/mL to 7.69 ng/mL at 96 hours 5) from 10.88

ng/mL to 6.16 ng/mL at 120 hours 6) from 10.88 ng/mL to 4.32 ng/mL at 144 hours and 7)

from 10.88 ng/mL to 2.18 ng/mL at 168 hours.

5

INTRODUCCION:

El cáncer de próstata ha sido la enfermedad que mayor concierne al hombre y a las

organizaciones de salud a nivel mundial. En los últimos 12 años, la incidencia de cáncer de

Próstata se ha incrementado en un 50% y las muertes por esta enfermedad se han elevado en

un 40%. Para darnos una idea, en los Estados Unidos, aproximadamente 317,000 nuevos casos

y más de 40,000 muertes se han reportado en el año de 1996. Esto hace que el cáncer de

próstata sea la enfermedad de malignidad más frecuentemente detectada en hombres y es la

segunda causa de muerte debida a cáncer en hombres adultos. Es bien conocido, que en años

recientes, se han hecho esfuerzos para reducir la mortalidad, lo que ha obligado a una

detección temprana y a una terapia definitiva, ya que no hay un tratamiento sistemático para el

cáncer de próstata.

La mayoría de estos casos continúan siendo diagnosticados después de que el tumor se

ha diseminado más allá de la glándula prostática disminuyendo en forma considerable las

posibilidades de curación. Sabemos, que la mayoría de las alternativas terapéuticas disponibles

actualmente, aún tienen una alta morbilidad y la posibilidad de curación en estadios avanzados

es algo imposible.

Durante el último decenio, la concentración sérica de antígeno prostático específico

(PSA) se ha convertido en una herramienta esencial para el diagnóstico del cáncer prostático

precoz y curable. Su utilidad clínica se ha incrementado todavía más por la utilización de

parámetros como los valores de referencia específicos para cada edad que aumentan la

sensibilidad para la detección del adenocarcinoma prostático en hombres jóvenes, y el

porcentaje de PSA libre que permite una mayor especificidad para el cáncer de próstata

cuando el nivel sérico de PSA sólo está ligeramente elevado.

Los cambios que se han producido recientemente en la práctica de la medicina, han

obligado a los médicos no sólo a proporcionar una asistencia de elevada calidad sino también

6

a considerar los costos de tal asistencia. En pocas áreas de la medicina existe mayor

controversia a este respecto que en los que se refiere a los pacientes con cáncer prostático.

Se ha demostrado que la fracción no compleja de PSA-L es mayor en pacientes con

Hiperplasia Prostática Benigna que en pacientes con cáncer de próstata ; y que el uso de la

relación de PSA-L y PSA-T podría cambiar el diagnóstico.

En reportes de los últimos años, se ha observado que la molécula de PSA in vitro tiene

una degradación natural a 4°C por un espacio de 7 días, por lo que su naturaleza misma; lo que

podría resultar en diagnósticos erróneos en el laboratorio.

Como sabemos, las muestras que no se van a procesar se deben de congelar a -20°C

dentro de las tres horas de su separación ó en su defecto ajustar el pH del suero con un Buffer,

con 25 microL Con una concentración de 2.5 mol/L Con buffer de acetato de sodio para

obtener valores en suero de p H de 5.5 a 5.7 (69). En nuestra localidad no se acidifica el suero

en ningún laboratorio.

7

ANTECEDENTES CIENTIFICOS:

I.- HISTORIA

La primera descripción anatómica de la próstata de la cual se tiene conocimiento se

remonta al siglo III A. C. atribuída a Herófilo, médico nacido en el año 300 A. C. El cual vivió

en Alejandría. Ha sido llamado el padre de la anatomía por ser de los iniciadores de las

disecciones humanas. Describió a la glándula prostática como prostatae glandulosae

y prostatae cirsoides. De acuerdo a la descripción inicialmente realizada se

considera que pudo haber confundido los ductos deferentes y las vesículas seminales con la

próstata bífida observada en diversas especies animales. Galeno quien vivió en Roma del año

131 al 210 D. C. describe la presencia de un tejido glandular de tamaño variable, el cual se

encontraba en la base de la uretra, de aspecto esponjoso y que tenia pequeños conductos hacia

la uretra, la cual no se encontraba en las mujeres y la relacionó con dificultad para el

vaciamiento vesical, sentando las bases de la fisiopatolo gía de la obstrucción urinaria

secundaria a crecimiento prostático.

El término de hiperplásia prostática benigna de uso común por mucho tiempo es

incorrecto, ya que la hiperplásia por sí sola define un padecimiento benigno y hemos

propuesto el incluir aquellos pacientes con síntomas relacionados con la próstata y dificultad

para el vaciamiento vesical, como hiperplasia prostática obstructiva (HPO).

Aproximadamente a los 40 años, en la glándula prostática se inicia un crecimiento

singular que constituye lo que conocemos con el nombre de hiperplasia. Hay tres aspectos de

la hiperplasia prostática que van a ser especialmente analizados a continuación: su génesis y su

desarrollo morfológico, los factores que inducen y mantienen este proceso de Hiperplasia

prostática, la relación existente entre la Hiperplasia Prostática y el llamado Síndrome Clínico

del Prostatismo.

8

Sin lugar a duda la etiología de la Hiperplasia Prostática Obstructiva (HPO) es

multifactorial, es el resultado del crecimiento sin control de varios elementos celulares de

glándula prostática. Para que éste fenómeno ocurra, actualmente se reconocen dos factores,

uno la edad y en segundo lugar la presencia de andrógenos.

La edad se ha considerado como un factor de riesgo para el desarrollo de la HP en el

hombre. Paradójicamente se desarrolla cuando la función testicular se encuentra declinando.

La enfermedad rara vez se produce en hombres con edad inferior a los 40 años, ni tampoco en

varones castrados antes de ésa edad y el proceso a veces regresa si se practica una

orquiectomía. Por otro lado, los estudios experimentales han conseguido evidencia suficiente

para afirmar la relación entre hormonas y patogénesis de la HP. No obstante, se sospecha que

puede haber otros factores involucrados en ésta proceso. (44). La Hiperplasia Prostática es la

neoplasia benigna más frecuente en el hombre. En estudios de autopsia la frecuencia a los 40

años de edad es de un 25%, llegando a un 100% a los 80 años.

La enfermedad sintomática se presenta generalmente después de los 50 años, los

cambios histológicos tempranos, relacionados a la patogénesis de la HP, se observan como

focos microscópicos de hiperplasia y se pueden reconocer entre los 25 y 30 años, muy poco

tiempo después de que la glándula ha llegado a su tamaño. La hiperplásia prostática

obstructiva es una causa significativa de deterioro en la calidad de vida de los hombres

mayores y además tiene asociada morbilidades significativas. Según datos de la INEGI, en

México el 55% de la población con hiperplásia prostática obstructiva es mayor de 64 años y el

30% tiene entre 55 y 64 años, lo que equivale en nuestra población a 8% del total, con una

esperanza de vida de 70 años [44].

II.- EL ANTIGENO PROSTATICO.

El Antígeno Prostático Específico (PSA) es el marcador tumoral más importante de la

década de los 90’s. Podríamos mencionar que durante los diez últimos años, se han descrito

más de 2,000 artículos científicos en el ámbito mundial acerca de la glucoproteína que es

sintetizada principalmente por las células epiteliales de la glándula prostática. Es bien

9

conocido que la determinación de la fosfatasa ácida fracción prostática como marcador

tumoral, ha sido ampliamente sustituida por la determinación del PSA, siendo actualmente el

marcador tumoral ideal.

Teniendo en cuenta que el Antígeno Prostático Específico (PSA), no es realmente

específico para el cáncer de próstata y que el cáncer de próstata afecta a los pacientes a una

edad en que la prevalencia de Hiperplasia Prostática Benigna (H.P.B.) es elevada; se han

desarrollado e investigado en el ámbito mundial varios parámetros, que en su conjunto han

servido para mejorar la sensibilidad y especificidad del PSA, entre los que podemos

mencionar, la velocidad del PSA ( modificación del nivel sérico del PSA con el tiempo), los

valores de referencia específicas para la edad respecto al nivel sérico del PSA, el PSA Total,

PSA fracción Libre (PSA- L) y su cociente.

La conjunción de todos éstos parámetros junto con la indiscutible experiencia clínica

del médico especialista, permite diagnosticar en forma precoz un cáncer de próstata en

aquéllos que presentan una Hiperplasia Prostática Benigna. Las pruebas con PSA han

incrementado de manera significativa la tasa de detección de cáncer prostático, y también que

la mayor parte de los casos de cáncer que se detectan hoy en día son tumores confinados al

órgano y curables. Por tanto, con el paso del tiempo sería de esperar que disminuyera la tasa

de mortalidad por cáncer prostático. El valor de PSA se puede combinar con la puntuación de

Gleason y con el estadio clínico local del cáncer prostático para predecir fiablemente el estado

de los ganglios linfáticos pélvicos (1), debido a ello, se puede evitar la linfadenectomía pélvica

bilateral para estadificación en hasta un 60% de lo s pacientes con cáncer prostático en estadio

T1a hasta T2b.

Cuando queremos seguir a los pacientes con cáncer prostático tras un tratamiento

definitivo, no existe una herramienta mejor que el PSA. Es extraordinariamente sensible para

detectar la enfermedad persistente/recurrente tras la prostatectomía radical, la radioterapia, la

ablación crioquirúrgica de la próstata, el tratamiento de privación androgénica y la actitud

expectante. Un nivel detectable o en aumento de PSA tras el tratamiento aparece meses o años

10

antes de que se manifiesten los síntomas, de que encontremos alteración digital rectal o de que

la gammagrafía ósea "hipersensible" sea positiva.

Un marcador tumoral es una sustancia producida por un tumor, que se puede

cuantificar en líquidos corporales y que es útil para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer.

Hace 150 años se describió un marcador tumoral cuando Bence y Jones observaron la

presencia de proteínas anómalas en la orina de los pacientes que presentaban lo que ahora

conocemos como mieloma múltiple [2]. Un hecho interesante es que el APE se ha convertido

probablemente en el mejor marcador que existe en oncología, y ha dado lugar claramente a un

profundo impacto en todos los aspectos relativos a la curación del cáncer de próstata [3].

Podremos mencionar que el primer marcador tumoral para el cáncer de próstata fue la

fosfatasa ácida, ya descrita por Gutman y Gutman en 1938 [4]. En la época de los 40’s, el

tratamiento basándose en privación androgénica fue documentado por las disminuciones

séricas de la fosfatasa ácida; como sabemos, la fosfatasa ácida sérica se origina en hueso,

próstata, hígado, riñón y eritrocitos, por lo que pueden haber otros procesos patológicos que

podrían dar lugar a niveles alterados de la fosfatasa ácida [10]. Posteriormente, la Fosfatasa

ácida Fracción Prostática (PAP) como una isoenzíma exclusiva incrementó la utilidad clínica

de este marcador. En la época de los 50’s, la elevación de la PAP, se aceptó como evidencia

confirmadora de enfermedad metastásica, por lo que durante muchos decenios se basaron

fuertemente en tal determinación. Más recientemente, cuando se introdujo el

Radioinmunoanálisis (R.I.A.), para la determinación de la P.A.P., el rendimiento de este

marcador mejoró notablemente, al aumentar su sensibilidad y especificidad, aunque sabemos

que disminuyó su utilidad clínica, ya que como se demostró, que la detección elevada de la

PAP en el Radioinmunoensayo no siempre se asociaba a una enfermedad metastásica, sin

contar con las restricciones que represente actualmente el RIA sobre otras técnicas. Aunque el

marcador PAP (Fosfatasa ácida Fracción Prostática) mediante Radioinmunoensayo era mejor

que la PAP enzimática para la detección del cáncer de próstata, su sensibilidad y especificidad

eran insuficientes para permitir su utilización como técnica de detección. La mayor parte de

estos problemas desaparecieron tras la introducción del PSA. El cáncer de próstata, presenta

11

múltiples características especiales dentro de los tumores sólidos frecuentes, lo que también

complica su consideración diagnóstica

Un marcador tumoral es una sustancia producida por un tumor, que se puede

cuantificar en líquidos corporales y que es útil para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer.

Debemos de reconocer un hecho realmente importante, en donde el PSA se ha convertido

probablemente en el mejor marcador que existe actualmente en urología, y ha dado lugar

claramente a un profundo impacto en todos los aspectos relativos a la curación del cáncer de

próstata.

En el año de 1971, Hara y cols [6] Describieron la presencia de la proteína seminal

gamma en el líquido seminal y propusieron su utilización en el ámbito forense; en la

actualidad sabemos que esta proteína es la misma que el PSA. Posteriormente, en 1979, Wang

y cols. [7] demostraron que el PSA se encontraba en el tejido prostático. A partir de 1980, el

impacto sobre la práctica Urológica ha sido inmenso, a raíz de que Papsidero y cols. [8],

reportaron la presencia del PSA en el suero de hombres con cáncer de próstata.

El marcador tumoral perfecto debería ser elaborado exclusivamente por las células

tumorales y tendría que ser detectable en cualquier paciente que presentara la enfermedad. Si

supusiéramos que la primera célula tumoral transformada produjera el marcador, su

sensibilidad sería del 100%. En lo práctico, esta posibilidad sería problemática debido a que

haría imposible la identificación del lugar de origen del tumor. El marcador tumoral perfecto

también debería poseer una especificidad del 100%; es decir, si la persona no presenta cáncer,

el test es negativo. El rendimiento del marcador mejora a medida que su sensibilidad y

especificidad se aproxima al 100%. El área que queda bajo la curva se puede utilizar como una

medición cuantitativa de la precisión del test. La mayor parte de los marcadores son proteínas

normales o proteínas que se sintetizan en fases de desarrollo y que son producidas en

cantidades excesivas por el cáncer. Es prudente mencionar que, la elevación del PSA es

frecuente en enfermedades distintas del cáncer: hiperplásia prostática benigna, prostatitis

aguda y crónica, e infarto prostático; dichos procesos no se pueden identificar clínicamente,

por lo que la biopsia prostática representa el único medio para distinguir a los pacientes con

12

cáncer de próstata. Los pacientes con un PSA de 3 a 15 ng/mL , representa el grupo de mayor

interés, y se han propuesto varios métodos para mejorar el rendimiento del PSA.

Oesterling y cols. [9] Propusieron unos límites normales de PSA según la edad para

mejorar el rendimiento del marcador. Mencionan que la disminución del umbral normal

incrementa la sensibilidad en los hombres jóvenes, que son los pacientes en los que la

detección y el tratamiento precoces permiten obtener un mayor beneficio.

La mayor parte de los marcadores séricos se miden como una variable contínua, como

el PSA, los límites establecidos para los grupos pronósticos pueden depender de los métodos

estadísticos utilizados, por lo que la aplicación de estos límites puede disminuir la capacidad

predictiva del marcador. De acuerdo a los datos reportados, éstos confirman el valor del PSA

como marcador pronóstico independiente antes del tratamiento local. Inicialmente, el PSA fue

aprobado por la Food and Drug Administration sólo para el seguimiento de los pacientes con

cáncer de próstata, y es especialmente eficaz para este objetivo. La importancia clínica del

PSA queda subrayada por el hecho de que la detección precoz del cáncer de próstata facilita su

curación potencial

En 1996, se diagnosticaron 317,000 nuevos casos de cáncer de próstata en Estados

Unidos [14], debido en parte a la utilización de la determinación del PSA, así como al

conocimiento de la existencia de esta prueba y de la propia enfermedad en la población en

general. La importancia clínica del PSA queda subrayada por el hecho de que la detección

precoz del cáncer de próstata facilita su curación potencial.

Ablin y cols. [11, 12] demostraron la presencia de varios antígenos mediante estudios

de difusión precipitación en gel, con antisueros frente a extractos tisulares prostáticos

humanos fuertemente antigénicos [13]. Los estudios de especificidad tisular de estos antígenos

y su relación con el tejido prostático normal, hiperplásico y maligno sugieren la existencia de

diferencias entre estos antígenos y la molécula de PSA aceptada en la actualidad. En 1981,

Wang y cols. [15, 16] aislaron el antígeno prostático a partir del plasma seminal y lo

compararon con el antígeno prostático purificado del tejido prostático. Análisis bioquímicos

13

de las preparaciones con respecto al peso molecular, punto isoeléctrico, análisis inmunológico

mediante inmunodifusión reveló que los antígenos del tejido prostático y del plasma seminal

eran idénticos. Las comparaciones que se efectuaron posteriormente entre extractos tisulares

prostáticos y suero de los pacientes con cáncer de próstata demostraron una identidad

inmunológica [17, 18].

III.- SINTESIS DEL PSA

El PSA se sintetiza en el epitelio ductual y en los acinos prostáticos [19], y se localiza

en el interior de célula en gránulos y vesículas citoplásmicas, en el retículo endoplásmico

rugoso, en vacuolas y gránulos de secreción, y en cuerpos densos lisosomales [20]. El PSA se

encuentra en tejido prostático normal, hiperplásico, tumoral primario y tumoral meta stásico de

la próstata. El PSA es segregado en la luz de los conductos prostáticos mediante exocitosis y

se convierte en un componente del plasma seminal, alcanzando el suero tras su difusión desde

las células luminales a través de la membrana basal epitelial y de el estroma prostático,

pudiendo atravesar la membrana basal capilar y las células epiteliales e introducirse en los

linfáticos [21]. El PSA, que es segregado en la luz de la próstata, se introduce en el fluido

seminal cuando éste atraviesa la glándula prostática. El PSA actúa produciendo la licuefacción

del coágulo seminal mediante la proteólisis de las proteínas formadoras de gel en fragmentos

más pequeños y solubles, liberando de esta forma los espermatozoídes [21, 22, 23]. En una

observación rec iente se ha sugerido que el PSA también puede modular el crecimiento celular

y, por tanto, en cáncer de próstata [24].

IV.- FORMAS MOLECULARES.

Las concentraciones de PSA en el suero son aproximadamente 10E6 veces menores

que en el fluido seminal. Los estudios in vitro han determinado que el PSA enzimáticamente

activo se puede unir fácilmente con enlaces covalentes a los inhibidores de la proteasa ACT

(antiqimiotripsina) y alfa 2- Macroglobulina, formándose más rápidamente complejos con la

primera que con la segunda. El PSA se une a la ACT en un complejo 1:1 que inhibe la

actividad del PSA debido a la fragmentación de un péptido interno del ACT en la posición leu

14

135 [25, 26]. El PSA unido al ACT no ha sido detectado en el plasma de pacientes con cáncer

de próstata [27]. Un pequeño porcentaje de PSA sérico aparece en forma libre, lo que sugiere

que el PSA es inactivo en las formas de zimógeno e irregular[28]. Se ha descubierto que las

células prostáticas malignas, pero no las benignas pueden sintetizar AC T y, por tanto, liberar

hacia la sangre el complejo ACT-PSA [29].

Como se mencionó, el grupo Inmunoreactivo esta formado por dos formas moleculares

primarias. Una de estas formas es la denominada PSA libre (PSA-L); representa habitualmente

una fracción re lativamente pequeña ( 1 a 30%) del grupo inmumoreactivo y en su mayor parte

no representa actividad enzimática. La segunda forma es la del PSA unido al inhibidor de la

proteasa de serina alfa-1-antiquimiotripsina ( ACT), representa en promedio aproximadamente

de 70% al 85% del PSA total detectado mediante Inmunoanálisis, en hombres normales y con

HPB. La forma PSA-L sérica es menor en los pacientes con cáncer de próstata que en las

personas normales y que en los pacientes con hiperplasia prostática benigna.

Con respecto a las diferencias en los cocientes PSA-L/PSA-ACT entre los pacientes

con HPB o cáncer de próstata, Bjork y cols [30] han mencionado que las células neoplásicas

de la próstata expresan no solamente PSA sino también ACT; suponen que en el interior de la

célula neoplásica o en los espacios intersticiales esta doble producción facilita la formación de

complejos de PSA con ACT. Consideran que el PSA-L es la forma irregular, apareciendo

después de que el PSA ezimáticamente activo alcanza la circulación. Podemos suponer que la

disponibilidad de ACT en el interior de la célula neoplásica y en su proximidad inmediata al

PSA enzimáticamente activo podría dar lugar a una disminución del porcentaje de PSA-L en

los pacientes con cáncer, en comparación con los que presentan HPB.

Reportes recientes, mencionan que un paciente con exploración digital rectal positiva y

un porcentaje de PSA-L del 10% presentaría la probabilidad de por lo menos del 60% de

padecer cáncer de próstata y aproximadamente la mitad si la exploración rectal digital fuera

negativa. Un paciente con un nivel de PSA-L del 20% tendría cuando menos la probabilidad

de 36% de tener cáncer si la ERD fuera positiva y un 17% si la ERD fuera negativa. Un

paciente con un 30% de PSA-L tendría el 19% de probabilidad de padecer cáncer si la ERD

15

fuera positiva y un 8% si la ERD fuera negativa [31]. Estudios similares, que realizó Luderer y

cols. [32] en pacientes con valores de PSA de 3 a 10 ng/mL, observaron que el 73 % de los

hombres con cáncer presentó cocientes de PSA-L /PSA-T de 0.15 ( P< 0.0001). En resumen la

mayoría de los autores utilizando un valor límite porcentual del PSA-L del 20%, sugieren una

tasa de detección del cáncer superior al 90%. Catalona y cols. [33] demostraron en un estudio

prospectivo que las mediciones porcentuales de PSA-L eran útiles para la detección del cáncer

en los pacientes con PSA-T entre 3 y 10 ng/mL, lo que indica que éstos pacientes deben de ser

estudiados mediante PSA-L.

En este estudio se toma el límite inferior de 3 mg/mL, ya que Gann y cols.

demostraron que hombres con PSA de alrededor de dicho valor tienen una probabilidad 12

veces mayor de ser diagnosticados de cáncer de próstata durante los 10 años siguientes, en

comparación con los hombres cuyos niveles de PSA son menores de 1ng/ml [34].

V.- RELACION P.S.A. Y EDAD

En 1993 se publicaron importantes estudios independientes en lo que se estableció el

papel que desempeñan los valores de referencia con especificidad para la edad en la detección

del cáncer prostático precoz [9, 45]. Osterling y cols. [9] evaluaron el PSA como un marcador

tumoral, estudiando sus características en una población de hombres sanos y sin evidencia de

cáncer prostático escogidos al azar en la población de Olmsted County, Minnesota. Estos

pacientes constituyeron la base para el estudio de población. Osterling y cols. [9] observaron

que el nivel sérico de PSA se correlacionaba con la edad del paciente (r=0.43, P<0.0001) .

Además, la concentración sérica de PSA en esta población aumentó en un 3.2% anual, o en

0.04 ng/ml. A partir de estos datos y utilizando el percentil 95, se determinaron valores de

referencia específicos para la edad respecto al PSA sérico, y se desarrollo un algoritmo

diagnóstico.

16

Los valores de referencia específicos para la edad respecto al PSA sérico

recomendados en este estudio, efectuado sobre hombres de raza blanca, fueron:

40 a 49 Años de Edad 0.0 a 2.5 ng/mL.




Osterling señaló que la utilización de los valores de referencia específicos para la edad

podría aumentar la sensibilidad del PSA para detectar más casos de cáncer prostático

confinado al órgano en hombres jóvenes, al t iempo que aumentaría la especificidad del PSA al

eliminar biopsias prostáticas en hombres de edad más avanzada.

Oesterling y cols. [35] demostraron la utilidad clínica de los valores de referencia del

PSA en relación con la edad, observando un incremento en la especificidad del 11% y valor

predictivo positivo del 5%, con una pérdida del 9% en la sensibilidad. Arcangeli y cols. [36]

han publicado un estudio preliminar en el que el porcentaje de PSA libre fue útil para

distinguir los cánceres prostáticos potencialmente agresivos de los no agresivos. En dicho

estudio efectuado sobre 54 hombres consecutivos con cáncer prostático diagnosticado en las

pruebas de detección selectiva e intervenidos mediante prostatectomía radical, se observó que

los niveles bajos de PSA libre se asociaban a tumores potencialmente más agresivos; en estos

pacientes con niveles de PSA total entre 2 y 14 ng/mL (más del 90% entre 2 y 8 ng/mL), la

elevación del PSA total no se asoció de manera significativa con la presencia de características

anatomopatológicas adversas en el cáncer, mientras que los valores bajos de PSA total no

fueron predictivos de cánceres poco significativos. Por su contra parte, el nivel bajo de

porcentaje de PSA libre se asoció significativamente con la presencia de características

anatomopatológicas adversas en los tumores, como extensión extracapsular, infiltración

tumoral de los bordes quirúrgicos, mayor puntuación de Gleason y mayor volumen tumoral.

Lo que se pretende en el presente estudio es reproducirlo para saber si el porcentaje de PSA

libre podría ayudar a clínicos y pacientes a decidir qué tumores deben ser tratados y cuáles

pueden ser dejados a su evolución con garantías de seguridad. Ya que otros autores [37, 38,

17

39] no han observado una correlación significativa entre el porcentaje de PSA libre y el

estadio tumoral. Numerosos investigadores han observado que el nivel prequirúrgico de PSA

se correlaciona con el estudio anatomopatológico pero que, por sí mismo, no permite predecir

ninguno de los componentes de este estadio anatomopatológico (perforación de la cápsula,

infiltración de vesículas seminales o afectación de ganglios linfáticos en casos individuales

[40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47].

Para detectar el cáncer prostático con fiabilidad y en un estadio precoz se debe utilizar

en las pruebas de detección un nivel límite inferior de PSA sérico de 4 ng/ml. Sin embargo, la

aplicación de este valor límite bajo se acompaña de un riesgo apreciable de resultados

falsamente positivos, lo que disminuye su valor predictivo y da lugar a la realización de

biopsias innecesarias en procesos benignos. Aproximadamente, del 25% al 30% de hombres

con HPB, y el 80% de hombres con cáncer prostático demostrado, muestran concentraciones

séricas de PSA superiores a 4 ng/mL. [46, 47, 48, 49], por tanto, aproximadamente el 20% de

los hombres diagnosticados de cáncer prostático presentan concentraciones séricas de PSA

inferiores a 4 ng/mL [48]. En los estudios iniciales sobre esta cuestión se demostró que el 38%

al 48% de pacientes con cáncer prostático clínicamente significativo y confinado al órgano

presentaba niveles séricos de PSA dentro del espectro referencia estándar de 0 a 4 ng/mL

[50,51].

Con el objeto de mejorar la utilidad clínica de las mediciones séricas del PSA se han

desarrollado y evaluado varios conceptos nuevos, como la densidad del PSA, la velocidad del

PSA y los valores de referencia específicos para la edad. Además, varios investigadores han

demostrado que el PSA existe en diversas formas moleculares en el sue ro, y que las

concentraciones de estas formas moleculares varían según las características patológicas de la

glándula prostática.

18

VI.- CARACTERISTICA ENZIMATICA Y ESTRUCTURAL

El antígeno prostático específico (PSA) es una proteasa de la serina con una sola

cadena de 237 aminoácidos, que muestra una importante similitud estructural con los

diferentes productos genéticos de la familia de las calicreínas glandulares [52, 53, 54, 55]. En

el fluido seminal humano, el PSA existe en concentraciones muy elevadas ( 0.2 a 5mg/mL, o

10 a 150 micromol/L), debido principalmente a la actividad secretora del epitelio glandular de

la próstata, y aproximadamente el 70% del PSA muestra actividad enzimática de tipo

quimotripsina. La actividad del PSA se dirige principalmente hacia las proteínas gel

principales, semenogelina I y II, y la fibronectina, lo que da lugar a la licuefacción del semen y

a la liberación de los espermatozoides con una movilidad progresivamente mayor [52, 56, 57].

El PSA (hK3) está codificado por un gen localizado en el locus genético de la

calicreína glandular humana en el cromosoma 19, que también contiene los genes para la

calicreína tisular (hK1) y la calicreína glandular prostática humana (hK2 ó hGK-1)(58). La

calicreína tisular pancreático-renal (hK1) presenta una identidad de aproximadamente el 62%

con el PSA, en lo que se refiere a su estructura primaria[53, 54, 59]. La expresión del PSA y

de la hK2 depende de los andrógenos y está restringida principalmente al epitelio prostático

[60].

La proteína hK2 tiene una estructura primaria con una identidad de aproximadamente

el 80% respecto a la del PSA. Por tanto, se ha asumido que los anticuerpos mono y

policlonales frente al PSA podrían presentar reactividad cruzada con otras calicreínas

glandulares humanas, lo que generaría discrepancias en los resultados de la detección

inmunológica específica del PSA en el suero. Este problema ha sido abordado recientemente

mediante la producción de hK2 y PSA recombinantes [61]. Y en estos estudios se ha

demostrado que sólo unas pocas IgG monoclonales anti-PSA presentan reactividad cruzada

con la hK2 debido a afinidades idénticas por la hK2 recombinante, el PSA recombinante y el

PSA aislado del fluido seminal. Por el contrario, una mayoría de la IgG monoclonales anti-

PSA definen epitopos exclusivos para el PSA y no muestran reactividad cruzada con la

hK2[61]. Así esta información se puede usar en el diseño de determinaciones inmunológicas

19

que sean específicas para el PSA; el inmunoanálisis presenta un umbral de detección de 0.1

ng/mL y una reactividad cruzada menor del 0.7 % con el PSA recombinante [62].

La concentración del PSA en el suero se mantiene normalmente por debajo de 0.1

mmol/L (aproximadamente, 3 ng/mL, lo que corresponde a menos de 10^-6 de la

concentración normal del PSA liberado hacia el fluido seminal. En los fluidos extracelulares

existen dos inhibidores de proteasas que se originan principalmente en el hígado, la alfa-1-

anti-quimiotripsina (ACT) y la alfa-2-macroglobulina (AMC), que muestran un gran exceso

molar frente al PSA (10^4 -10^5 veces en estos fluidos extracelulares, y que poseen la

capacidad de regular la actividad del PSA en sangre in vitro mediante la formación de

complejos covalentes con la forma activa monocatenaria del PSA [63]. Además de la ACT,

existen otros inhibidores que pertenecen a la superfamilia serpina de los inhibidores de la

proteasa de serina (serpinas) y que forman complejos covalentes con el PSA, como la alfa-1-

antitripsina (inhibidor de la alfa1-proteasa, alfa1-PI) y el inhibidor de la proteína C (ICP).

Por tanto, los inmunoanálisis que existen en la actualidad para el PSA son incapaces de

reconocer y medir correctamente la concentración de los complejos PSA-AMG en el suero en

condiciones que no sean de desnaturalización. Por el contrario, existen varios epitopos

antigénicos en el PSA que permanecen expuestos en esta molécula tras la formación de un

complejo estabilizado con la ACT mediante enlaces covalentes y con cociente molar 1:1[64,

65]. Los epitopos en la porció n PSA de este complejo pueden interactuar con un número

apreciable de anticuerpos monoclonales anti-PSA, debido a afinidades que son igualmente

intensas que las que les unen la forma libre de PSA. No obstante, un número limitado de

epitopos específicos de la forma libre del PSA son completamente inaccesibles tras la unión

del PSA a la ACT o a otros complejos ligadores de la clase de las serpinas como el inhibidor

de la proteína C.

La existencia de múltiples formas moleculares del PSA en el suero fue publicada por

primera vez en 1991. El complejo covalentes estable PSA-ACT (tamaño molecular

aproximada 90kd) constituye la principal forma molecular del PSA en el suero. Existe una

forma libre de PSA que no forma complejos (tamaño molecular aproximado de 30kd) que es

20

menos abundante, aunque se ha establecido si aparece en el suero en una forma

enzimáticamente activa. Esta posibilidad parece poco probable dado el sustancial exceso

molar de la ACT y la AMG en el suero, que son capaces de reaccionar con una forma activa

del PSA.

En el momento actual, existen sólo datos limitados procedentes de estudios sobre las

condiciones preanalíticas en el análisis de las diferentes formas del PSA, por ejemplo estudios

de estabilidad in vitro de los preparados purificados de las diferentes formas del PSA. Estos

estudios se han realizado en función de varias consideraciones teóricas; una es la posible

influencia del PSA libre en el Inmunoanálisis debida a la posible conversión de la forma activa

monocatenaria del PSA en una forma inactiva bicatenaria [66].

La estabilidad del complejo PSA-ACT es especialmente elevada, al contrario de lo que

ocurre con otros complejos serpina-proteasa; aproximadamente, el 70% de los complejos

purificados PSA-ACT se disocian tras el almacenamiento durante cuatro semanas con un pH

neutro (pH 7.8) y a 35°C in vitro [62]. En el momento presente no ha sido aclarada con detalle

la naturaleza molecular de la forma libre del PSA en el suero, aunque parece que no reacciona

con el importante exceso molar de ACT y de AMG que existe en la sangre. El análisis de la

forma libre del PSA se puede realizar con un umbral de detección de 0.01 ng/mL. , Con menos

de una reactividad cruzada de 0.2% con el complejo PSA-ACT, y sin reactividad cruzada

detectable con la hK2 [61,62, 65]. Una captura específica de fase sólida del complejo PSA-

ACT se puede conseguir mediante anticuerpos monoclonales anti-PSA que no presentan

reactividad cruzada con la hK2, y en combinación con anticuerpos monoclonales marcados

anti -ATC para la detección de estos complejos.

Los inmunoanálisis disponibles diseñados para medir la concentración total de PSA en

los fluidos corporales ( es decir, la forma libre del PSA y el PSA que forma complejos con

diferentes ligadores con la ACT, la alfa-1-PI y el inhibir la proteína C) no detectan la señal del

complejo PSA - AMG. Se ha señalado que los niveles séricos de PSA total obtenidos con una

determinación de respuesta sesgada son significativamente menores que los obtenidos con una

determinación de respuesta equimolar para cocientes PSA- libre / PSA Total menores de 0.18

21

(un cociente PSA-libre/PSA-Total que se observa con frecuencia en el suero de pacientes con

cáncer prostático).

Actualmente no se ha aclarado todavía por qué existe una mayor proporción de PSA

formando complejo con la ACT en el suero de los pacientes con cáncer prostático que en el de

los pacientes que presentan HPB. No obstante, podríamos suponer que la hK2 no constituye

parte de la forma de PSA libre en el suero debido a que los anticuerpos monoclonales anti

PSA que se utilizan en la detección específica de PSA libre no presentan reactividad cruzada

con la hK2[61]. La transcripción de ACT y la expresión de la proteína ACT se detectan en la

mayor parte de las células tumorales de la mayoría de los cánceres prostáticos. Por el

contrario, la expresión y transcripción de la ACT son escasas en el epitelio productor de PSA

de los nódulos de la HPB. La producción local de ACT que se detecta en la mayor parte de las

células tumorales prostáticas puede proporcionar condiciones mejores para que el PSA forme

complejos con la ACT que se pueden introducir en la circulación sanguínea, en comparación

con las condiciones proporcionadas por el epitelio de los nódulos de la HPB en el que la

producción de ACT es escasa y puede facilitar la entrada de una forma de PSA libre que

carece de actividad de proteasa en la sangre.

Lilja y cols [64] demostraron que el PSA formando complejos con la ACT constituía la

forma inmunoreactiva predominante del PSA en el suero, lo que representaba

aproximadamente el 85% de PSA sérico, dejando el resto para el PSA Libre.

Más recientemente, Vashi y cols realizaron un estudio para establecer los límites

adecuados que permitieran utilizar el porcentaje de PSA libre[67]. Estos investigadores

investigaron la capacidad del porcentaje de PSA libre y del PSA Total para distinguir los

hombres con HPB con los pacientes con cáncer prostático precoz y curable en un grupo de 413

hombre con un valor sérico de PSA de 2 a 20 ng/mL. Lo que en el presente estudio se

utilizarán los mismos rangos. El espectro en el que el porcentaje de PSA libre contribuyó a la

mayor utilidad de la prueba del PSA fue el de 3 a 10 ng/mL. En este espectro, el porcentaje de

PSA Libre superó en rendimiento al valor de PSA To tal para distinguir el cáncer de próstata

de la HPB en más de un 21%.

22

En este estudio se seguirá el siguiente procedimiento : en los hombres con glándulas

prostáticas de mayor tamaño, fue necesario determinar un valor límite de 20% o menos para

detectar al menos el 90% de los cánceres. Es conveniente un valor límite del cociente PSA

libre/ PSA Total de 0.243 ó inferior para garantizar una sensibilidad del 90% en la detección

de cáncer. Existen cada vez más pruebas de que se detecta un cáncer prostático al cabo de 3 a

5 años en el 13% al 20% de los hombres cuyos niveles de PSA Total están entre 2.6 y 4ng/mL.

La detección de éstos cánceres es una base precoz y sin aumentar de forma importante el

número de biopsias innecesarias, haría que aumentasen el número de hombres que acuden en

buscar de tratamientos antes de que su cáncer se haya diseminado.

23

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:

¿EXISTE ALGUNA RELACION ENTRE LA ESTABILIDAD DEL PSA-T Y PSA-L IN

VITRO Y EL TIEMPO ENTRE SU EXTRACCION Y ANALISIS INMUNOENZIMATICO

A TEMPERATURA DE CUARTO?

24

HIPÓTESIS DE TRABAJO:

La relación PSA-L / PSA-T in vitro se altera con el tiempo bajo condiciones de

laboratorio. Este cambio puede resultar en diagnósticos equivocados, por lo que es importante

estudiar la forma en que estos cambios ocurren para determinar la probabilidad de

diagnósticos equivocados como función del tiempo y valores iniciales da PSA-T y PSA-L.

25

OBJETIVOS:

OBJETIVO GENERAL:

Establecer el tiempo máximo en días que se debe determinar la medición de PSA-T y

PSA-L in vitro a temperatura de medio ambiente, antes de que pierda su estabilidad.

OBJETIVOS PARTICULARES:

-Determinar el tiempo máximo que debe permanecer el suero a temperatura de cuarto antes

de que se empiece a degradar para la determinación del cociente PSA-L / PSA-T.

-Conocer las concentraciones del PSA-T que se convierten en falsos positivos en días,

cuando el cociente PSA-L/ PSA-T disminuye del 20%.

-Determinar el tiempo máximo en días que una muestra debe permanecer a temperatura

ambiente antes de que se pueda dar un resultado erróneo.

-Predecir a cuales concentraciones de PSA-T los pacientes se pueden diagnosticar como

falsos positivos (que tengan Cáncer de próstata) por un mal manejo de las muestras.

Dar a conocer la importancia que tiene el procesar y almacenar una muestra antes de la

determinación misma y; sus implicaciones que conlleva.

Obtener una ecuación, con la cual no sea necesaria la determinación de la fracción libre

(PSA-L) para obtener el cociente de acuerdo a las variables T (Tiempo) y PSA-T.

26

METODOLOGIA

DISEÑO DEL ESTUDIO:

Es un estudio descriptivo, prospectivo y de correlación, con análisis de regrsión

múltiple.

DEFINICION DEL UNIVERSO:

El Universo del estudio fueron los individuos a los que se le realizaron su

determinación de PSA - T sea mayor de 2 y menor de 20 ng/mL. y que su COCIENTE sea

menor del 20%.

LA UNIDAD DE OBSERVACION:

Los sueros de pacientes que fueron admitidos al Laboratorio y se determinaron los

valores de PSA-T y de PSA-L.

27

TECNICA DE MUESTREO:

Muestreo por cuota desde el 30 de Junio de 1999 hasta noviembre 19 de1999, aquellos

pacientes que fueron remitidos al Laboratorio por los asesores clínicos para la determinación

de PSA-T, PSA-L y su COCIENTE.

CRITERIOS DE INCLUSION:

Todos aquellos pacientes que fueron remitidos por los asesores clínicos con ó sin algún

diagnóstico inicial.

Todos aquellos pacientes que asistieron por su propia voluntad al Laboratorio.

Sueros que su concentración de PSA-T sea mayor ó igual que 2 ng/mL.y menor ó igual

a 20ng/mL.

Pacientes que no fueron tratados de patología prostática.

Pacientes con cualquier determinación de PSA-L como PSA-T.

28

CRITERIOS DE EXCLUSION:

Pacientes con antecedentes de haber recibido cualquier tipo de tratamiento para

patología prostática.

Sueros que no fueron determinados dentro de sus 24 horas correspondientes.

Muestras que no fueron tomadas en el mismo Laboratorio.

Pacientes que hubieran recibido masaje prostático.

Suero cuya concentración de PSA-T fué menor a 2 ng/mL y mayores a 20 ng/mL.

PROCEDIMIENTO Y RECOLECCION DE DATOS:

1. - Se les informó por escrito a los Urólogos (asesores clínicos) participantes de los

criterios de inclusión y exclusión que deben llenar los pacientes para el estudio.

2. - Después de haber sido estudiados clínicamente por el médico, y tener un diagnóstico

clínico; fueron remitidos al Laboratorio para la determinación de PSA-T, PSA-L y su

COCIENTE.

3. - En el Laboratorio se les asignó un número de folio donde se le tomó todos sus datos

como nombre completo, edad, médico tratante, domicilio, teléfono, diagnóstico inicial,

fecha de toma de la muestra.

4. - Se les tomó sangre venosa de 12 a 14 ml. con tubos con activador de SST; se

rotularon los tubos y después de haberse coagulado se centrifugaron.

29

5. - Se mantuvieron los sueros en recipientes a temperatura de medio ambiente a la

sombra. Debidamente rotulados y fechados.

6. - El día 0 (cero) será el día en que se recolecte la muestra; el día 1, 24 horas después; el

día 2, 48 horas después y así sucesivamente.

7. Se vaciaron los datos a la hoja de captura de datos de paciente, para su análisis

posterior.

8. Para conocer la temperatura de medio ambiente que tuvimos durante la investigación,

se llevó un registro y medición de temperatura del medio ambiente 3 veces al día para

su posterior análisis.

9. - Se llevó un registro de control de calidad interno de las mediciones de PSA-T, PSA-

L; para su posterior análisis estadístico.

10.- Las muestras fueron procesadas en el aparato AxSYM de ABBOTT

11. -EL Ensayo de PSA libre por AxSYM es un ensayo enzimático por micropartícula

(MEIA) para la determinación cuantitativa del antígeno prostático específico fracción

libre (PSA) en suero humano. El ensayo PSA libre AxSYM está diseñada para ser

usado en conjunción con el AxSYM ensayo Total PSAen hombres con edad de 50 años

y con exprolación rectal digital (ERD) no sospechosa para determinación del cociente

PSA libre / PSA Total. El AxSYM PSA Libre/ PSA Total cociente, puede ser usado

como una ayuda en la discriminación entre cáncer de próstata y enfermedad benigna.

El reactivo está constituído por los siguientes constituyentes:

A) 1 Botella (8.3mL) Anti-PSA (Raton, monoclonal) unido a Micropartículas in

Buffer TRIS con sucrosa. Preservativos: Azida de sodio. (Reactivo Botella 1).

30

B) 1 Botella (12.6 mL) Diluyente del Ensayo. Buffer TRIS con proteína (bovina)

estabilizadores. Preservativos: Azida de sodio y Agentes Antimicrobianos.

(Reactivo Botella 2).

C) 1 Botella (16.0) Anti-Libre PSA ( Ratón, Monoclonal) : Conjugado de Fosfatasa

Alcalina en Buffer TRIS con proteína (bovina) como estabilizadores.

Concentración mínima : 0.1 micro g/mL.Preservativo: Agentes Antimicrobianos

(Botella reactivo 3).

D) 1 Botella (25.7 mL) Especímen diluyente. Con Buffer TRIS con estabilizadores de

proteína (bovina). Preservativos: Azida de Sodio y Agentes Antimicrobianos.

(Reactivo Botella 4).

12. - El AxSYM PSA Total es un ensayo Inmunoenzimático por micropartículas (MEIA)

para la determinación cuantitativa de PSA Total( tanto como PSA libre y PSA

Complejo unida a alfa-1-antiquimiotripsina ) en suero humano: 1.- Como una ayuda en

la detección de cáncer de prostátacuando es usado en conjución con el exámen rectal

digital (ERD) en hombres de 50 años ó mayores. 2.- Como un exámen adjunto para la

ayuda en el manejo de pacientes con cáncer de próstata. El reactivo está constituído por

los siguientes constituyentes:

A) 1 Botella ( 8.3 mL ) Anti-PSA (Ratón, Monoclonal) Unido a Micropartículas en

Buffer TRIS con sucrosa. Preservativos : Azida de Sodio . (Botella Reactivo 1).

B) 1 Botella (9.4 mL) Diluyente del Ensayo. Buffer TRIS con proteína (bovina )

como estabilizadores. Preservativos: Azida de Sodio y Agentes Antimicrobianos.

(Botella Reactivo 2).

C) 1 Botella (13.5 mL) Anti-PSA (Ratón, Monoclonal : Conjugado de Fosfatasa

alcalina en Buffer TRIS con proteína (bovina) como estabilizadores.

31

Concentración Mínima : 0.1 microg/mL. Preservativos: Agentes Antimicrobianos

(Botella Reactivo 3).

Antígeno prostatico total (PSA-T): Es un método Inmunoenzimático por

micropoartículas (M.E.I.A.) para la determinación cuantitativa de PSA total (tanto

PSA libre como PSA ligado a alfa-1-antiquimiotripsina) en suero humano.

ANTIGENO PROSTATICO LIBRE (PSA-l): Es un método Inmunoenzimático por

micropartículas (M.E.I.A.) para la determinación cuantitativa del antígeno prostático

específico (PSA) libre en suero humano.

COCIENTE DE PSA-L/PSA-T: Se calculará con las determinaciones anteriores.

Cabe señalar que los calibradores de ambos reactivos se han determinado frente al

material de referencia de PSA 90:10 de Stanford. También que ambos reactivos son

monoclonales y de procedencia Alemana.

32

CONTROL DE CALIDAD INTERNO.

Para obtener unos resultados confiables, se instrumentó un control de calidad interno;

donde todos los días en que se corrían muestras, se corría por lo menos un control comercial

de valor conocido, ya fuera control bajo, control medio y/o control alto.

Se obtuvieron durante los meses de Julio, Agosto, Septiembre, Octubre y Noviembre,

los siguientes resultados:

PSA- T Control Bajo: un valor medio de 0.47, una Desviación Standard de 0.06 y un

Coeficiente de Variación de 13%.

PSAT- Control Medio : un valor medio de 3.72, una Desviación Standard de 0.18 y un

coeficiente de Variación del 4.87%

PSA-T Control Alto : un valor medio de 25.44, una Desviación Standard de 1.68 y un

Coeficiente de Variación del 6.61%

PSA-L Control Bajo : un valor medio de 0.39, una Desviación Standard de 0.04 y un

Coeficiente de Variación del 10.43%

PSA-L Control Medio : un valor medio de 1.06, una Desviación Standard de 0.06 y un

Coeficiente de Variación del 6.07%.

PSA-L Control Alto : un valor medio de 7.46 una Desviación Standard de 0.47 y un

Coeficiente de Variación del 6.31%.

33

Se presenta la tabla de captura del control de calidad interno solamente del mes de

Julio de PSA-T.

PRECISION Y EXACTITUD DEL

CONTROL DE CALIDAD

PSA - T ( ng/ml )

( JULIO ) Control Bajo Control Medio Control Alto

1 24.117 2 23.133 3 3.614 4 25.527 5 3.558 6 0.461 7 0.469 8 0.472 22.735 9 3.619

10 0.493 27.053 11 3.710 12 0.450 13 3.684 26.535 14 0.459 15 27.013 16 3.819 17 3.812 18 0.507 19 0.468 20 26.613 21 0.435 22 0.415 3.771 23 0.446 24 0.478 3.761 25 0.450 26 0.490 27 4.178 28 25.312 29 24.319 30 25.527 31 3.991

34

CTRL BAJO CTRL MEDIO CTRL ALTO PROMEDIOS 0.46 3.77 25.26

MEDIANA 0.46 3.76 25.53 DESV. STD. 0.0243 0.1796 1.5159

INTERV. CONFIANZA 0.0029 0.0218 0.1836

25.26

3.770.46

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

ng

/ml.

PROMEDIOS

Control Interno Mes de Julio

CTRL BAJO

CTRL MEDIO

CTRL ALTO

35

Se presenta la tabla de captura del control de calidad interno solamente del mes de

Julio de PSA-L.

PRECISION Y EXACTITUD DEL

CONTROL DE CALIDAD

PSA - L ( ng/ml )

( JULIO ) Control Bajo Control Medio Control Alto

1 0.285 7.600 2 1.030 3 1.025 4 0.363 7.060 5 1.035 6 0.285 7.091 7 1.037 8 7.210 9 7.164

10 7.160 11 1.040 12 1.042 13 0.379 7.609 14 0.384 15 1.130 16 7.713 17 0.386 1.125 18 0.400 8.181 19 0.403 20 1.131 21 1.122 22 0.323 8.103 23 8.101 24 0.339 8.100 25 0.401 26 0.358 1.041 27 1.043 28 1.050 29 0.293 7.619 30 0.296 7.633 31 0.359

36

CTRL BAJO CTRL MEDIO CTRL ALTO PROMEDIOS 0.35 1.07 7.60

MEDIANA 0.36 1.04 7.61 DESV. STD. 0.0439 0.0432 0.4106

INTERV. CONFIANZA 0.0053 0.0052 0.0497

7.60

1.070.35

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

ng/m

l.

PROMEDIOS

Control Interno Mes de Julio

CTRL BAJOCTRL MEDIOCTRL ALTO

37

MEDICION Y REGISTRO DE TEMPERATURA

Se llevó un registro de temperatura del medio ambiente, uno comprendido entre las 7

horas y las 10 horas, el segundo grupo comprendido entre las 14 y 16 horas; y el tercer grupo

el comprendido entre las 18 y 20 horas. Se presenta la tabla de registro de temperatura del mes

de Julio.

M EDICION Y REGISTRO DE TEMPERATURA

DE MEDIO AMBIENTE

( MES DE JULIO) HORA ° C HORA ° C HORA ° C

1 7.05 28.2 15.01 29.3 19.20 28.2 2 8.20 28.3 15.20 29.4 19.10 28.6 3 9.15 29.1 15.45 30.1 18.50 29.3 4 8.00 28.4 16.01 29.4 18.45 28.1 5 7.00 28.6 16.15 29.5 18.30 29.2 6 7.30 28.7 16.05 29.6 18.25 28.3 7 9.45 29.4 16.01 30.1 18.35 28.4 8 9.00 29.1 15.45 30.3 19.05 28.5 9 7.25 28.1 15.30 29.6 19.03 28.6

10 7.47 28.2 15.25 29.8 18.50 29.1 11 7.30 28.2 15.10 28.6 18.45 29.2 12 8.15 29.1 15.20 28.7 19.05 28.3 13 8.25 29.1 15.55 28.9 19.35 28.4 14 9.23 28.6 16.10 29.2 20.15 28.5 15 7.32 28.1 15.30 29.6 20.31 28.4 16 8.10 28.1 14.51 30.6 21.01 29.1 17 7.18 29.2 14.42 29.6 20.01 28.6 18 9.10 29.3 14.22 28.4 18.12 28.5 19 8.19 29.1 14.32 28.6 18.01 29.1 20 7.50 28.3 15.43 28.6 19.01 28.5 21 7.15 28.3 15.42 29.6 19.01 28.6 22 7.05 28.2 15.29 30.2 19.05 28.3 23 7.04 28.4 14.28 30.3 20.07 29.4 24 6.51 28.7 14.33 30.1 18.51 29.3

38

M EDICION Y REGISTRO DE TEMPERATURA

DE MEDIO AMBIENTE

( MES DE JULIO)

25 8.15 28.6 14.39 29.8 18.45 28.6 26 8.19 28.5 15.18 28.9 19.05 29.3 27 9.22 28.5 15.21 28.8 19.07 29.2 28 9.25 28.7 16.15 29.3 20.06 28.7 29 9.45 28.5 16.05 29.4 18.51 28.8 30 9.2 28.6 15.02 29.6 19.13 28.6 31 9.05 28.2 15.02 29.7 19.12 29.3

HORA1 HORA2 HORA3 Grados Mañana

Grados Tarde

Grados Noche

PROMEDIOS 8.08 15.24 19.04 28.59 29.47 28.74 MEDIANA 8.15 15.25 19.05 28.50 29.60 28.60

DESV. STD. 0.9084 0.6027 0.7224 0.3958 0.5775 0.3956 INTERV. CONFIANZA 0.1100 0.0730 0.0875 0.0479 0.0700 0.0479

28.59

28.50

29.47

29.60

28.7428.60

27.80

28.00

28.20

28.40

28.60

28.80

29.00

29.20

29.40

29.60

Gra

do

s

Grados Mañana Grados Tarde Grados Noche

Grados Mes de Julio

PROMEDIOSMEDIANA

39

Se presenta la tabla con los promedios de los meses de Julio, Agosto, Septiembre,

Octubre y Noviembre

HORA1 HORA2 HORA3 Grados Mañana

Grados Tarde

Grados Noche

PROMEDIOS 7.83 15.30 18.96 28.84 30.05 29.10 MEDIANA 7.78 15.32 19.05 28.68 30.17 29.20

DESV. STD. 0.8319 0.5587 0.7083 0.6896 1.0180 0.7200 INTERV. CONFIANZA 0.1015 0.0681 0.0862 0.0838 0.1240 0.0870

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Grados

Grados Mañana

Grados Tarde

Grados Noche

Grados Promedios en el Estudio

INTERV. CONFIANZA

DESV. STD.

MEDIANA

PROMEDIOS

40

DESCRIPCION DE LAS VARIABLES.

¡Error! Vínculo no válido.

SELECCIÓN DE LAS FUENTES, METODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE

RECOLECCION DE LA INFORMACION:

1. Mediante un muestreo por cuotas se seleccionaron a aquellos pacientes que se les

tomó sangre para determinación de PSA-T, PSA-L y que cumplan con los criterios de

inclusión a partir de Julio de 1999 hasta que se complete el tamaño muestral.

41

2. Con los médicos especialistas que participan como investigadores científicos e

investigadores asociados analizaron y definieron los procedimientos, forma de

recolección de los datos, reportes, etc. que se presentan en el estudio.

3. Los participantes en el estudio, estandarizaron las técnicas y procedimientos, para

informar de las ventajas de usar reactivo monoclonal y/o policlonal.

4. Previa a la solicitud del médico especialista, se le tomó una muestra de sangre venosa

para la determinación de PSA-T, PSA-L y su relación; para hacer determinaciones

cada 24 horas.

ANALISIS DE RESULTADOS

Se realizó el análisis de resultados que se obtuvieron mediante la recolección de las

hojas de resultados por paciente, donde el asterisco que se encuentra en el día cero es donde

inicia el análisis de cada uno de los pacientes. El tiempo está dado en días, donde el día cero es

el día de la extracción. T2 es el tiempo al cuadrado. El PSAT2, es el valor de PSAT obtenido

42

al cuadrado. TxP es el producto del Tiempo por la concentración del PSAT. PSAF2 es el valor

de PSA-L elevado al cuadrado. TxF, es el producto de la concentración de PSA-L por el

Tiempo. RATIO, es el cociente de dividir PSA-L entre PSA-T. Ver la tabla en el capítulo de

anexos.

Para obtener una ecuación por medio de modelo matemático por regresión múltiple, se

hizo el siguiente análisis de regresión múltiple, donde T2 es Tiempo elevado al

cuadrado,PSAT es la concentración de PSA-T, TxP es el producto del tiempo por la

concentración de PSA-T.

Análisis de Regresión Múltiple

Regresión para la variable dependiente: COCIENTE R = .36315381 R2 = .13188069 R2ajustada = .12240341 F(5 ,458) = 13.915 p<.00000 Error Std. Estimado: .09522

N = 464 B Std. Error o B t(458) p-level

Intercpt 0.282764 0.014924 18.94655 0.000000 TIEMPO -0.006188 0.007282 -0.84981 0.395876 T2 -0.000540 0.000966 -0.55907 0.576388 PSAT -0.009041 0.002031 -4.45100 0.000011 PSAT2 0.000132 0.000064 2.06887 0.039118 T_P 0.000402 0.000244 1.64468 0.100722

Donde se obtuvo el siguiente modelo polinomial ajustado, donde t es el Tiempo y P es

la concentración de PSA-T. El área sombreada con color verde son aquellos valores que su

cociente es menor del 0.20. y las tonalidades en rojo son las áreas sobre el cociente de 0.20.

43

De la ecuación f [ x_, y_ ] := 0.282764 - .006188 *x - .009041 *y + .000132 *y +

.000402 *x *y - 0.000540 *x *x, que se obtuvo por medio del modelo polinomial ajustado, lo

expresamos de la manera anterior. Para el Día cero el valor de X es igual a cero y nos resulta

la siguiente ecuación:

0.14 0.16 0.18 0.2 0.22 0.239 0.259 0.279 0.299 0.319 above

MODELO POLINOMIAL AJUSTADO

Cociente=0.282-0.006*T-0.009*P-5.4e-4*T2+4.02e-4*P*T+1.32e-4*P

2

PSAT

TIEMPO

COCIENTE

44

Día 0

Resulta la ecuación = 0.282764 - 0.009041y + 0.000132y2

Eje Z

5 10 15 20 25 30 35

0.14

0.16

0.18

0.22

0.24

0.26

Cociente

Para cuando ésta ecuación se intercepta con el valor de .20 que se encuentra en el eje

Z, ó sea cuando Z=0.20 nos da que Y, que es la concentración de PSA-T es igual a Y=

10.8838

Cuando Z = 0.2 o sea 20%

Y = 10.8838

De la ecuación f [ x_, y_]: = 0.282764 - .006188 *x - .009041 *y + .000132 *y +


expresamos de la manera anterior. Para el Día 1 el Valor de X es igual a Uno y nos resulta la

siguiente ecuación:

45

Día 1

Resulta la ecuación = 0.276036 - 0.008639y + .000132y2

Eje Z

5 10 15 20 25 30 35

0.14

0.16

0.18

0.22

0.24

0.26

Cociente

Para cuando ésta ecuación se intercepta con el valor de 0.20 que se encuentra en el eje

Z, ó sea cuando Z=0.20 nos da que Y, que se la concentración de PSA-T es igual a Y=

10.4795.


Y = 10.4795



expresamos de la manera anterior. Para el Día 2 el valor de X es igual a 2 y nos resulta la

siguiente ecuación.

46

Día 2


Eje Z

5 10 15 20 25 30 35

0.14

0.16

0.18

0.22

0.24

0.26

Cociente

Para cuando ésta ecuación se intersecta con el valor de 0.20 que se encuentra con el eje


9.83236


Y = 9.83236



expresamos de lamanera anterior. Para el Día 3 el valor de X es igual a 3 y nos resulta la


47

Día 3


Eje Z

5 10 15 20 25 30 35

0.16

0.18

0.22

0.24

Cociente

Para cuando ésta ecuación de intersecta con el valor de 0.20 que se encuentra con el

eje Z, ó sea cuando Z=0.20 nos da que Y, que es la concentración de PSA-T es igual a Y=

8.91171


Y = 8.91171



expresamos de la manera anterior. Para el Día a el valor de X es igual a 4 y nos resulta la


48

Día 4


Eje Z

5 10 15 20 25 30 35

0.16

0.18

0.22

0.24

Cociente



7.69337


Y = 7.69337

De la ecuación f [ x_, y_] := 0.282764 - .006188 *x - .009041 *y + .000132 *y +


expresamos de la manera anterior. Para el Día 5 X es igual a 5 y nos resulta la siguiente

ecuación:

Día 5

49


Eje Z

5 10 15 20 25 30 35

0.16

0.18

0.22

Cociente

Para cuando ésta ecuación se intersecta con el valor de 0.20que se encuentra con el eje

Z, ó sea cuando Z=0.20 nos da que Y, que es la concentración de PSA-T es igual a Y=6.16404


Y = 6.16404

De la ecuación f [ x_, y_ ] := 0.282764 - .006188 *x - .009041 *y + .000132 *y +




Día 6

50


Eje Z

5 10 15 20 25 30 35

0.16

0.18

0.22

Cociente



4.32404


Y = 4.32404





Día 7

51


Eje Z

5 10 15 20 25 30 35

0.14

0.15

0.16

0.17

0.18

0.19

Cociente



2.18716


Y = 2.18716

Gráfica de los días [ 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]

Eje Z

52

5 10 15 20 25 30 35

0.14

0.16

0.18

Cociente

CONCLUSIONES Y DISCUSIONES

76 5 4 3 2 1 0

53

1. En éste estudio se puede concluir que el tiempo máximo que debe permanecer el suero

a temperatura ambiente antes de que se empiece a degradar su cociente es el de 48

horas, ya que la literatura mundial reporta que la diferencia mayor a 1 ng/mL es

indicativo de una mal pronóstico para el paciente, a esto se le denomina velocidad de

PSA-T; en los resultados obtenido se observa una diferencia del valor de PSA-T

dentro de las 24 horas de la extracción de 0.40 ng/mL. , y dentro de las 48 ho ras se

observa una diferencia de 1.05 ng/mL.

Lo que podemos concluir que se puede confiar en la determinación del PSA-T y su

cociente, dentro de las 48 horas de su extracción.

2. - Las concentraciones de PSA-T que se convierten en falsos positivos en días, cuando

su cociente disminuye del 20% son las siguientes:

1) Cuando se tarda 24 horas en analizar a temperatura ambiente partir de la extracción

venosa de PSA-T, las concentraciones que nos dan falsos positivos son de entre 10.88

ng/mL. A 10.47 ng/mL.

2) Cuando se tarda 48 horas en analizar a temperatura ambiente a partir de la extracción



3) Cuando se tarda 72 horas en analizar a temperatura ambiente partir de la extracción


ng/mL a 8.91 ng/mL.




54










3. - El tiempo máximo en días que una muestra debe permanecer a temperatura ambiente,

antes de que se puedadar un resultado erróneo vaya a depender de la concentración de

PSA-T que tenga la muestra, así una muestra que tenga una concentración menor a 10.88

ng/mL. Se deberá de procesar estrictamente dentro del mismo día de la extracción, si es

que no se va procesar, ya que valores menores de PSA-T de 10.88 ng/mL., nos van a dar

falsos positivos; esto quiere decir que diremos que tienen un 90% de probabilidad de

padecer cancer, cuando esto no es real, cuando su cociente es mayor del 20%, tiene un

95% de probabilidad de no padecer cáncer.

4.- Las concentraciones de PSA-T se pueden diagnosticar como falsos positivos (que tengan

CaP) cuando en realidad no lo tienen por un mal manejo de las muestras, como lo ha

demostrado este estudio; son las concentaciones que se encuenten con un valo r menor de

10.88 ng/mL y mayor de 2.18 ng/ml:

5.- Como se demostró en éste trabajo, la determinación de un anáilisis tiene una gran

relevancia no solamente analítica, sino preanalítica como es el manejo y el almacenamiento

de las muestras antes de su determinación misma, con lo que se confirma que un mal manejo

de muestras es crítico en la determinación de un marcador tumoral, ya que se le informa al

paciente de un resultado erróneo (decirle que tiene Cáncer cuando en realidad no lo tiene).

55

Si las condiciones geográficas y socioeconómicas así lo determinan, y las muestras tienen

que ser enviadas fuera de nuestra localidad, lo mínimo que debemos hacer es enviarlas en las

condiciones apropiadas para la misma; así como la adición de algún Buffer ó ser enviadas en

algún medio especial, ya que una determinación errónea debido desde un proceso

preanalítico hasta el analítico trae consecuencias terribles al paciente y a su misma salud.

6. - La ecuación que se obtuvo para determinar el cociente de una muestra sin necesidad de

realizar la fracción libre (PSA-L) por medio de regresión lineal múltiple es la siguiente:

Cociente = 0.282-0.006T-0.009P-5.4e-4T2+4.02e-4PT+1.32e-4P2

T= Tiempo.

P= Concentracoón de PSA-T.

T2= Tiempo al cuadrado.

PT=Concentración de PSA-T por el Tiempo.

P2= Concentración de PSA-T elevado al cuadrado.

56

ANEXOS

TIEMPO T2 PSAT PSAT2 T_P PSAF PSAF2 T_F RATIO * 0 0 18.903 357.32341 0.000 1.915 3.667225 0.000 0.101307 1 1 17.670 312.22890 17.670 1.771 3.136441 1.771 0.100226 2 4 20.428 417.30318 40.856 1.604 2.572816 3.208 0.078520 3 9 20.730 429.73290 62.190 1.600 2.560000 4.800 0.077183 4 16 20.801 432.68160 83.204 1.580 2.496400 6.320 0.075958 5 25 21.101 445.25220 105.505 1.430 2.044900 7.150 0.067769 6 36 21.181 448.63476 127.086 1.330 1.768900 7.980 0.062792 7 49 20.311 412.53672 142.177 1.220 1.488400 8.540 0.060066

* 0 0 4.902 24.02960 0.000 1.176 1.382976 0.000 0.239902 1 1 5.339 28.50492 5.339 1.252 1.567504 1.252 0.234501 2 4 5.400 29.16000 10.800 1.256 1.577536 2.512 0.232593 3 9 6.788 46.07694 20.364 1.376 1.893376 4.128 0.202711 4 16 6.580 43.29640 26.320 1.309 1.713481 5.236 0.198936 5 25 6.602 43.58640 33.010 1.289 1.661521 6.445 0.195244 6 36 6.721 45.17184 40.326 1.221 1.490841 7.326 0.181669 7 49 6.833 46.68989 47.831 1.219 1.485961 8.533 0.178399

* 0 0 5.645 31.86603 0.000 1.315 1.729225 0.000 0.232950 1 1 5.787 33.48937 5.787 1.157 1.338649 1.157 0.199931 2 4 6.276 39.38818 12.552 1.078 1.162084 2.156 0.171765 3 9 7.040 49.56160 21.120 1.129 1.274641 3.387 0.160369 4 16 7.982 63.71232 31.928 1.094 1.196836 4.376 0.137058 5 25 7.993 63.88805 39.965 1.091 1.190281 5.455 0.136494 6 36 7.999 63.98400 47.994 1.090 1.188100 6.540 0.136267 7 49 8.010 64.16010 56.070 1.000 1.000000 7.000 0.124844

* 0 0 14.872 221.17638 0.000 1.713 2.934369 0.000 0.115183 1 1 15.675 245.70563 15.675 1.742 3.034564 1.742 0.111132 2 4 15.530 241.18090 31.060 1.467 2.152089 2.934 0.094462 3 9 16.063 258.01997 48.189 1.480 2.190400 4.440 0.092137 4 16 15.367 236.14469 61.468 1.359 1.846881 5.436 0.088436 5 25 15.449 238.67160 77.245 1.316 1.731856 6.580 0.085184 6 36 15.510 240.56010 93.060 1.221 1.490841 7.326 0.078723 7 49 15.519 240.83936 108.633 1.119 1.252161 7.833 0.072105

* 0 0 3.794 14.39444 0.000 1.242 1.542564 0.000 0.327359 1 1 4.891 23.92188 4.891 1.559 2.430481 1.559 0.318749 2 4 3.966 15.72916 7.932 1.257 1.580049 2.514 0.316944 3 9 3.693 13.63825 11.079 1.129 1.274641 3.387 0.305714 4 16 4.396 19.32482 17.584 1.320 1.742400 5.280 0.300273 5 25 4.282 18.33552 21.410 1.320 1.742400 6.600 0.308267 6 36 4.754 22.60052 28.524 1.423 2.024929 8.538 0.299327 7 49 3.917 15.34289 27.419 1.115 1.243225 7.805 0.284657

57


* 0 0 5.238 27.43664 0.000 1.316 1.731856 0.000 0.251241 1 1 9.683 93.76049 9.683 2.301 5.294601 2.301 0.237633 2 4 7.494 56.16004 14.988 1.730 2.992900 3.460 0.230851 3 9 4.123 16.99913 12.369 0.819 0.670761 2.457 0.198642 4 16 7.613 57.95777 30.452 1.493 2.229049 5.972 0.196112 5 25 4.593 21.09565 22.965 0.903 0.815409 4.515 0.196604 6 36 4.617 21.31669 27.702 0.892 0.795664 5.352 0.193199 7 49 7.681 58.99776 53.767 1.438 2.067844 10.066 0.187215

* 0 0 2.046 4.18612 0.000 0.433 0.187489 0.000 0.211632 1 1 2.199 4.83560 2.199 0.454 0.206116 0.454 0.206457 2 4 1.897 3.59861 3.794 0.368 0.135424 0.736 0.193991 3 9 2.280 5.19840 6.840 0.440 0.193600 1.320 0.192982 4 16 2.004 4.01602 8.016 0.384 0.147456 1.536 0.191617 5 25 2.047 4.19021 10.235 0.382 0.145924 1.910 0.186615 6 36 1.961 3.84552 11.766 0.362 0.131044 2.172 0.184600 7 49 2.302 5.29920 16.114 0.415 0.172225 2.905 0.180278

* 0 0 12.024 144.57658 0.000 1.296 1.679616 0.000 0.107784 1 1 11.701 136.91340 11.701 1.375 1.890625 1.375 0.117511 2 4 11.130 123.87690 22.260 1.230 1.512900 2.460 0.110512 3 9 10.603 112.42361 31.809 1.070 1.144900 3.210 0.100915 4 16 11.398 129.91440 45.592 1.410 1.988100 5.640 0.123706 5 25 11.903 141.68141 59.515 0.986 0.972196 4.930 0.082836 6 36 12.113 146.72477 72.678 1.206 1.454436 7.236 0.099562 7 49 14.566 212.16836 101.962 1.274 1.623076 8.918 0.087464

* 0 0 2.096 4.39322 0.000 0.448 0.200704 0.000 0.213740 1 1 2.226 4.95508 2.226 0.433 0.187489 0.433 0.194519 2 4 2.478 6.14048 4.956 0.472 0.222784 0.944 0.190476 3 9 2.874 8.25988 8.622 0.507 0.257049 1.521 0.176409 4 16 3.083 9.50489 12.332 0.551 0.303601 2.204 0.178722 5 25 3.991 15.92808 19.955 0.542 0.293764 2.710 0.135806 6 36 4.010 16.08010 24.060 0.539 0.290521 3.234 0.134414 7 49 4.019 16.15236 28.133 0.530 0.280900 3.710 0.131874

58


* 0 0 6.369 40.56416 0.000 0.691 0.477481 0.000 0.108494 1 1 7.014 49.19620 7.014 0.755 0.570025 0.755 0.107642 2 4 6.560 43.03360 13.120 0.659 0.434281 1.318 0.100457 3 9 7.286 53.08580 21.858 0.666 0.443556 1.998 0.091408 4 16 8.090 65.44810 32.360 0.754 0.568516 3.016 0.093201 5 25 8.161 66.60192 40.805 0.725 0.525625 3.625 0.088837 6 36 8.366 69.98996 50.196 0.793 0.628849 4.758 0.094788 7 49 7.925 62.80563 55.475 0.704 0.495616 4.928 0.088833

* 0 0 4.849 23.51280 0.000 0.846 0.715716 0.000 0.174469 1 1 5.086 25.86740 5.086 0.823 0.677329 0.823 0.161817 2 4 5.266 27.73076 10.532 0.807 0.651249 1.614 0.153247 3 9 6.798 46.21280 20.394 1.108 1.227664 3.324 0.162989 4 16 7.770 60.37290 31.080 1.376 1.893376 5.504 0.177091 5 25 7.912 62.59974 39.560 1.848 3.415104 9.240 0.233569 6 36 8.101 65.62620 48.606 1.601 2.563201 9.606 0.197630 7 49 8.303 68.93981 58.121 1.013 1.026169 7.091 0.122004

* 0 0 10.010 100.20010 0.000 0.702 0.492804 0.000 0.070130 1 1 9.060 82.08360 9.060 0.549 0.301401 0.549 0.060596 2 4 9.539 90.99252 19.078 0.568 0.322624 1.136 0.059545 3 9 10.233 104.71429 30.699 0.605 0.366025 1.815 0.059122 4 16 10.329 106.68824 41.316 0.583 0.339889 2.332 0.056443 5 25 9.734 94.75076 48.670 0.543 0.294849 2.715 0.055784 6 36 10.087 101.74757 60.522 0.530 0.280900 3.180 0.052543 7 49 11.019 121.41836 77.133 0.892 0.795664 6.244 0.080951

* 0 0 4.124 17.00738 0.000 0.682 0.465124 0.000 0.165373 1 1 3.655 13.35903 3.655 0.540 0.291600 0.540 0.147743 2 4 4.272 18.24998 8.544 0.519 0.269361 1.038 0.121489 3 9 4.315 18.61923 12.945 0.517 0.267289 1.551 0.119815 4 16 4.419 19.52756 17.676 0.513 0.263169 2.052 0.116090 5 25 4.421 19.54524 22.105 0.509 0.259081 2.545 0.115132 6 36 4.463 19.91837 26.778 0.487 0.237169 2.922 0.109119 7 49 5.131 26.32716 35.917 0.477 0.227529 3.339 0.092964

59


* 0 0 13.287 176.54437 0.000 2.781 7.733961 0.000 0.209302 1 1 12.864 165.48250 12.864 2.729 7.447441 2.729 0.212142 2 4 13.196 174.13442 26.392 2.702 7.300804 5.404 0.204759 3 9 14.127 199.57213 42.381 1.622 2.630884 4.866 0.114816 4 16 13.023 169.59853 52.092 1.364 1.860496 5.456 0.104738 5 25 14.237 202.69217 71.185 1.591 2.531281 7.955 0.111751 6 36 14.343 205.72165 86.058 1.431 2.047761 8.586 0.099770 7 49 15.109 228.28188 105.763 1.454 2.114116 10.178 0.096234

* 0 0 8.929 79.72704 0.000 0.691 0.477481 0.000 0.077388 1 1 8.535 72.84623 8.535 0.667 0.444889 0.667 0.078149 2 4 8.649 74.80520 17.298 0.709 0.502681 1.418 0.081975 3 9 9.442 89.15136 28.326 0.706 0.498436 2.118 0.074772 4 16 9.659 93.29628 38.636 0.509 0.259081 2.036 0.052697 5 25 8.836 78.07490 44.180 0.595 0.354025 2.975 0.067338 6 36 9.145 83.63103 54.870 0.525 0.275625 3.150 0.057408 7 49 9.591 91.98728 67.137 0.501 0.251001 3.507 0.052236

* 0 0 12.559 157.72848 0.000 0.968 0.937024 0.000 0.077076 1 1 13.274 176.19908 13.274 0.982 0.964324 0.982 0.073979 2 4 13.361 178.51632 26.722 0.971 0.942841 1.942 0.072674 3 9 13.413 179.90857 40.239 0.963 0.927369 2.889 0.071796 4 16 13.619 185.47716 54.476 0.924 0.853776 3.696 0.067846 5 25 11.655 135.83903 58.275 1.207 1.456849 6.035 0.103561 6 36 14.071 197.99304 84.426 1.352 1.827904 8.112 0.096084 7 49 15.171 230.15924 106.197 1.315 1.729225 9.205 0.086679

* 0 0 4.355 18.96603 0.000 0.659 0.434281 0.000 0.151320 1 1 4.607 21.22445 4.607 0.725 0.525625 0.725 0.157369 2 4 4.894 23.95124 9.788 1.411 1.990921 2.822 0.288312 3 9 7.802 60.87120 23.406 1.679 2.819041 5.037 0.215201 4 16 5.810 33.75610 23.240 1.374 1.887876 5.496 0.236489 5 25 5.938 35.25984 29.690 1.123 1.261129 5.615 0.189121 6 36 6.317 39.90449 37.902 1.037 1.075369 6.222 0.164160 7 49 6.937 48.12197 48.559 1.022 1.044484 7.154 0.147326

60


* 0 0 11.633 135.32669 0.000 1.491 2.223081 0.000 0.128170 1 1 11.450 131.10250 11.450 1.362 1.855044 1.362 0.118952 2 4 11.572 133.91118 23.144 1.559 2.430481 3.118 0.134722 3 9 12.571 158.03004 37.713 1.693 2.866249 5.079 0.134675 4 16 13.453 180.98321 53.812 3.635 13.213225 14.540 0.270200 5 25 13.522 182.84448 67.610 3.125 9.765625 15.625 0.231105 6 36 13.747 188.98001 82.482 2.011 4.044121 12.066 0.146286 7 49 14.018 196.50432 98.126 1.734 3.006756 12.138 0.123698

* 0 0 17.076 291.58978 0.000 4.302 18.507204 0.000 0.251933 1 1 16.617 276.12469 16.617 4.002 16.016004 4.002 0.240838 2 4 16.723 279.65873 33.446 3.713 13.786369 7.426 0.222030 3 9 16.812 282.64334 50.436 3.703 13.712209 11.109 0.220259 4 16 16.923 286.38793 67.692 3.639 13.242321 14.556 0.215033 5 25 17.017 289.57829 85.085 3.602 12.974404 18.010 0.211671 6 36 17.029 289.98684 102.174 3.503 12.271009 21.018 0.205708 7 49 17.037 290.25937 119.259 3.413 11.648569 23.891 0.200329

* 0 0 2.991 8.94608 0.000 0.756 0.571536 0.000 0.252758 1 1 3.783 14.31109 3.783 0.872 0.760384 0.872 0.230505 2 4 4.089 16.71992 8.178 0.941 0.885481 1.882 0.230130 3 9 4.903 24.03941 14.709 0.935 0.874225 2.805 0.190700 4 16 4.937 24.37397 19.748 0.930 0.864900 3.720 0.188374 5 25 4.457 19.86485 22.285 0.813 0.660969 4.065 0.182410 6 36 4.531 20.52996 27.186 0.803 0.644809 4.818 0.177224 7 49 4.679 21.89304 32.753 0.745 0.555025 5.215 0.159222

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* 0 0 16.500 272.25000 0.000 1.316 1.731856 0.000 0.079758 1 1 17.857 318.87245 17.857 1.121 1.256641 1.121 0.062777 2 4 17.949 322.16660 35.898 0.962 0.925444 1.924 0.053596 3 9 17.955 322.38203 53.865 0.960 0.921600 2.880 0.053467 4 16 17.977 323.17253 71.908 0.873 0.762129 3.492 0.048562 5 25 18.013 324.46817 90.065 0.855 0.731025 4.275 0.047466 6 36 18.015 324.54023 108.090 0.841 0.707281 5.046 0.046683 7 49 18.057 326.05525 126.399 0.832 0.692224 5.824 0.046076

* 0 0 2.193 4.80925 0.000 0.318 0.101124 0.000 0.145007 1 1 1.895 3.59103 1.895 0.305 0.093025 0.305 0.160950 2 4 1.871 3.50064 3.742 0.314 0.098596 0.628 0.167825 3 9 1.959 3.83768 5.877 0.341 0.116281 1.023 0.174068 4 16 2.445 5.97803 9.780 0.342 0.116964 1.368 0.139877 5 25 2.497 6.23501 12.485 0.336 0.112896 1.680 0.134561 6 36 2.519 6.34536 15.114 0.320 0.102400 1.920 0.127035 7 49 2.639 6.96432 18.473 0.311 0.096721 2.177 0.117848

* 0 0 0.295 0.08703 0.000 0.089 0.007921 0.000 0.301695 1 1 0.228 0.05198 0.228 0.083 0.006889 0.083 0.364035 2 4 0.257 0.06605 0.514 0.079 0.006241 0.158 0.307393 3 9 0.224 0.05018 0.672 0.074 0.005476 0.222 0.330357 4 16 0.249 0.06200 0.996 0.069 0.004761 0.276 0.277108 5 25 0.275 0.07563 1.375 0.060 0.003600 0.300 0.218182 6 36 0.305 0.09303 1.830 0.054 0.002916 0.324 0.177049 7 49 0.330 0.10890 2.310 0.047 0.002209 0.329 0.142424

* 0 0 32.071 1028.54904 0.000 6.366 40.525956 0.000 0.198497 1 1 26.613 708.25177 26.613 5.156 26.584336 5.156 0.193740 2 4 31.269 977.75036 62.538 4.959 24.591681 9.918 0.158592 3 9 27.653 764.68841 82.959 5.144 26.460736 15.432 0.186020 4 16 25.639 657.35832 102.556 5.014 25.140196 20.056 0.195561 5 25 30.241 914.51808 151.205 4.973 24.730729 24.865 0.164446 6 36 31.179 972.13004 187.074 4.813 23.164969 28.878 0.154367 7 49 32.113 1031.24477 224.791 4.709 22.174681 32.963 0.146638

62


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* 0 0 4.358 18.99216 0.000 0.890 0.792100 0.000 0.204222 1 1 3.548 12.58830 3.548 0.747 0.558009 0.747 0.210541 2 4 3.631 13.18416 7.262 0.713 0.508369 1.426 0.196365 3 9 3.540 12.53160 10.620 0.406 0.164836 1.218 0.114689 4 16 3.579 12.80924 14.316 0.400 0.160000 1.600 0.111763 5 25 3.689 13.60872 18.445 0.371 0.137641 1.855 0.100569 6 36 3.731 13.92036 22.386 0.343 0.117649 2.058 0.091932 7 49 3.949 15.59460 27.643 0.302 0.091204 2.114 0.076475

* 0 0 6.087 37.05157 0.000 0.778 0.605284 0.000 0.127813 1 1 6.573 43.20433 6.573 0.800 0.640000 0.800 0.121710 2 4 6.473 41.89973 12.946 0.691 0.477481 1.382 0.106751 3 9 5.126 26.27588 15.378 0.667 0.444889 2.001 0.130121 4 16 6.002 36.02400 24.008 0.673 0.452929 2.692 0.112129 5 25 6.199 38.42760 30.995 0.008 0.000064 0.040 0.001291 6 36 6.228 38.78798 37.368 0.739 0.546121 4.434 0.118658 7 49 6.331 40.08156 44.317 0.044 0.001936 0.308 0.006950

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* 0 0 4.366 19.06196 0.000 1.163 1.352569 0.000 0.266377 1 1 5.230 27.35290 5.230 0.969 0.938961 0.969 0.185277 2 4 4.521 20.43944 9.042 1.262 1.592644 2.524 0.279142 3 9 4.344 18.87034 13.032 1.242 1.542564 3.726 0.285912 4 16 4.009 16.07208 16.036 1.161 1.347921 4.644 0.289598 5 25 3.862 14.91504 19.310 1.257 1.580049 6.285 0.325479 6 36 4.002 16.01600 24.012 1.173 1.375929 7.038 0.293103 7 49 4.129 17.04864 28.903 1.009 1.018081 7.063 0.244369

* 0 0 0.892 0.79566 0.000 0.214 0.045796 0.000 0.239910 1 1 0.866 0.74996 0.866 0.241 0.058081 0.241 0.278291 2 4 0.803 0.64481 1.606 0.218 0.047524 0.436 0.271482 3 9 0.853 0.72761 2.559 0.238 0.056644 0.714 0.279015 4 16 0.864 0.74650 3.456 0.216 0.046656 0.864 0.250000 5 25 0.787 0.61937 3.935 0.189 0.035721 0.945 0.240152 6 36 0.789 0.62252 4.734 0.192 0.036864 1.152 0.243346 7 49 1.084 1.17506 7.588 0.266 0.070756 1.862 0.245387

* 0 0 24.053 578.54681 0.000 2.482 6.160324 0.000 0.103189 1 1 20.429 417.34404 20.429 2.392 5.721664 2.392 0.117088 2 4 24.001 576.04800 48.002 2.289 5.239521 4.578 0.095371 3 9 27.029 730.56684 81.087 2.746 7.540516 8.238 0.101595 4 16 26.082 680.27072 104.328 2.707 7.327849 10.828 0.103788 5 25 24.599 605.11080 122.995 3.884 15.085456 19.420 0.157893 6 36 25.139 631.96932 150.834 3.646 13.293316 21.876 0.145034 7 49 25.637 657.25577 179.459 3.019 9.114361 21.133 0.117759

* 0 0 1.923 3.69793 0.000 0.749 0.561001 0.000 0.389496 1 1 1.987 3.94817 1.987 0.719 0.516961 0.719 0.361852 2 4 2.185 4.77423 4.370 0.669 0.447561 1.338 0.306178 3 9 2.218 4.91952 6.654 0.646 0.417316 1.938 0.291253 4 16 3.419 11.68956 13.676 1.016 1.032256 4.064 0.297163 5 25 4.085 16.68723 20.425 1.093 1.194649 5.465 0.267564 6 36 4.125 17.01563 24.750 1.067 1.138489 6.402 0.258667 7 49 4.159 17.29728 29.113 1.051 1.104601 7.357 0.252705

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* 0 0 0.295 0.08703 0.000 0.089 0.007921 0.000 0.301695 1 1 0.228 0.05198 0.228 0.083 0.006889 0.083 0.364035 2 4 0.257 0.06605 0.514 0.079 0.006241 0.158 0.307393 3 9 0.224 0.05018 0.672 0.074 0.005476 0.222 0.330357 4 16 0.249 0.06200 0.996 0.069 0.004761 0.276 0.277108 5 25 0.275 0.07563 1.375 0.060 0.003600 0.300 0.218182 6 36 0.305 0.09303 1.830 0.054 0.002916 0.324 0.177049 7 49 0.330 0.10890 2.310 0.047 0.002209 0.329 0.142424

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* 0 0 32.071 1028.54904 0.000 6.366 40.525956 0.000 0.198497 1 1 26.613 708.25177 26.613 5.156 26.584336 5.156 0.193740 2 4 31.269 977.75036 62.538 4.959 24.591681 9.918 0.158592 3 9 27.653 764.68841 82.959 5.144 26.460736 15.432 0.186020 4 16 25.639 657.35832 102.556 5.014 25.140196 20.056 0.195561 5 25 30.241 914.51808 151.205 4.973 24.730729 24.865 0.164446 6 36 31.179 972.13004 187.074 4.813 23.164969 28.878 0.154367 7 49 32.113 1031.24477 224.791 4.709 22.174681 32.963 0.146638

* 0 0 1.234 1.52276 0.000 0.277 0.076729 0.000 0.224473 1 1 0.894 0.79924 0.894 0.279 0.077841 0.279 0.312081 2 4 0.901 0.81180 1.802 0.244 0.059536 0.488 0.270810 3 9 0.896 0.80282 2.688 0.242 0.058564 0.726 0.270089 4 16 0.999 0.99800 3.996 0.229 0.052441 0.916 0.229229 5 25 0.962 0.92544 4.810 0.200 0.040000 1.000 0.207900 6 36 0.996 0.99202 5.976 0.196 0.038416 1.176 0.196787 7 49 1.026 1.05268 7.182 0.190 0.036100 1.330 0.185185

65


* 0 0 4.358 18.99216 0.000 0.890 0.792100 0.000 0.204222 1 1 3.548 12.58830 3.548 0.747 0.558009 0.747 0.210541 2 4 3.631 13.18416 7.262 0.713 0.508369 1.426 0.196365 3 9 3.540 12.53160 10.620 0.406 0.164836 1.218 0.114689 4 16 3.579 12.80924 14.316 0.400 0.160000 1.600 0.111763 5 25 3.689 13.60872 18.445 0.371 0.137641 1.855 0.100569 6 36 3.731 13.92036 22.386 0.343 0.117649 2.058 0.091932 7 49 3.949 15.59460 27.643 0.302 0.091204 2.114 0.076475

* 0 0 6.087 37.05157 0.000 0.778 0.605284 0.000 0.127813 1 1 6.573 43.20433 6.573 0.800 0.640000 0.800 0.121710 2 4 6.473 41.89973 12.946 0.691 0.477481 1.382 0.106751 3 9 5.126 26.27588 15.378 0.667 0.444889 2.001 0.130121 4 16 6.002 36.02400 24.008 0.673 0.452929 2.692 0.112129 5 25 6.199 38.42760 30.995 0.008 0.000064 0.040 0.001291 6 36 6.228 38.78798 37.368 0.739 0.546121 4.434 0.118658 7 49 6.331 40.08156 44.317 0.044 0.001936 0.308 0.006950

* 0 0 10.415 108.47223 0.000 3.230 10.432900 0.000 0.310130 1 1 11.705 137.00703 11.705 2.999 8.994001 2.999 0.256215 2 4 11.793 139.07485 23.586 2.903 8.427409 5.806 0.246163 3 9 11.813 139.54697 35.439 2.893 8.369449 8.679 0.244900 4 16 11.923 142.15793 47.692 2.881 8.300161 11.524 0.241634 5 25 12.017 144.40829 60.085 2.873 8.254129 14.365 0.239078 6 36 12.123 146.96713 72.738 2.869 8.231161 17.214 0.236658 7 49 12.206 148.98644 85.442 2.857 8.162449 19.999 0.234065

* 0 0 2.150 4.62250 0.000 0.478 0.228484 0.000 0.222326 1 1 2.489 6.19512 2.489 0.535 0.286225 0.535 0.214946 2 4 2.519 6.34536 5.038 0.530 0.280900 1.060 0.210401 3 9 2.623 6.88013 7.869 0.521 0.271441 1.563 0.198628 4 16 2.639 6.96432 10.556 0.519 0.269361 2.076 0.196665 5 25 2.713 7.36037 13.565 0.500 0.250000 2.500 0.184298 6 36 2.737 7.49117 16.422 0.483 0.233289 2.898 0.176471 7 49 2.872 8.24838 20.104 0.479 0.229441 3.353 0.166783

66


* 0 0 0.892 0.79566 0.000 0.214 0.045796 0.000 0.239910 1 1 0.866 0.74996 0.866 0.241 0.058081 0.241 0.278291 2 4 0.803 0.64481 1.606 0.218 0.047524 0.436 0.271482 3 9 0.853 0.72761 2.559 0.238 0.056644 0.714 0.279015 4 16 0.864 0.74650 3.456 0.216 0.046656 0.864 0.250000 5 25 0.787 0.61937 3.935 0.189 0.035721 0.945 0.240152 6 36 0.789 0.62252 4.734 0.192 0.036864 1.152 0.243346 7 49 1.084 1.17506 7.588 0.266 0.070756 1.862 0.245387

* 0 0 24.053 578.54681 0.000 2.482 6.160324 0.000 0.103189 1 1 20.429 417.34404 20.429 2.392 5.721664 2.392 0.117088 2 4 24.001 576.04800 48.002 2.289 5.239521 4.578 0.095371 3 9 27.029 730.56684 81.087 2.746 7.540516 8.238 0.101595 4 16 26.082 680.27072 104.328 2.707 7.327849 10.828 0.103788 5 25 24.599 605.11080 122.995 3.884 15.085456 19.420 0.157893 6 36 25.139 631.96932 150.834 3.646 13.293316 21.876 0.145034 7 49 25.637 657.25577 179.459 3.019 9.114361 21.133 0.117759

* 0 0 1.923 3.69793 0.000 0.749 0.561001 0.000 0.389496 1 1 1.987 3.94817 1.987 0.719 0.516961 0.719 0.361852 2 4 2.185 4.77423 4.370 0.669 0.447561 1.338 0.306178 3 9 2.218 4.91952 6.654 0.646 0.417316 1.938 0.291253 4 16 3.419 11.68956 13.676 1.016 1.032256 4.064 0.297163 5 25 4.085 16.68723 20.425 1.093 1.194649 5.465 0.267564 6 36 4.125 17.01563 24.750 1.067 1.138489 6.402 0.258667 7 49 4.159 17.29728 29.113 1.051 1.104601 7.357 0.252705

* 0 0 3.473 12.06173 0.000 0.752 0.565504 0.000 0.216527 1 1 3.521 12.39744 3.521 0.738 0.544644 0.738 0.209600 2 4 5.072 25.72518 10.144 1.113 1.238769 2.226 0.219440 3 9 5.279 27.86784 15.837 1.573 2.474329 4.719 0.297973 4 16 7.247 52.51901 28.988 1.891 3.575881 7.564 0.260936 5 25 6.389 40.81932 31.945 1.672 2.795584 8.360 0.261700 6 36 6.450 41.60250 38.700 1.376 1.893376 8.256 0.213333 7 49 6.737 45.38717 47.159 1.731 2.996361 12.117 0.256939

67


* 0 0 4.300 18.49000 0.000 0.876 0.767376 0.000 0.203721 1 1 3.617 13.08269 3.617 0.832 0.692224 0.832 0.230025 2 4 3.822 14.60768 7.644 0.832 0.692224 1.664 0.217687 3 9 4.985 24.85023 14.955 1.216 1.478656 3.648 0.243932 4 16 4.993 24.93005 19.972 1.203 1.447209 4.812 0.240937 5 25 5.019 25.19036 25.095 1.234 1.522756 6.170 0.245866 6 36 5.039 25.39152 30.234 1.312 1.721344 7.872 0.260369 7 49 5.148 26.50190 36.036 1.339 1.792921 9.373 0.260101

* 0 0 24.275 589.27563 0.000 3.878 15.038884 0.000 0.159753 1 1 24.793 614.69285 24.793 3.513 12.341169 3.513 0.141693 2 4 21.930 480.92490 43.860 3.150 9.922500 6.300 0.143639 3 9 26.918 724.57872 80.754 3.275 10.725625 9.825 0.121666 4 16 26.103 681.36661 104.412 3.919 15.358561 15.676 0.150136 5 25 25.217 635.89709 126.085 4.528 20.502784 22.640 0.179561 6 36 21.696 470.71642 130.176 4.113 16.916769 24.678 0.189574 7 49 21.347 455.69441 149.429 4.014 16.112196 28.098 0.188036

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