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Manual de Prácticas de Laboratorio de Genética Acuícola Introducción Página 1

Dra. Ivone Giffard-Mena, Dr. Luis Enríquez-Paredes Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Universidad Autónoma de Baja

California

Facultad de Ciencias Marinas

Dra. Ivone Giffard Mena, Dr. Luis Enríquez Paredes

Responsables de la elaboración del manual de GENÉTICA ACUÍCOLA

Manual de Prácticas de Laboratorio de

GENÉTICA ACUÍCOLA



Universidad Autónoma de Baja

California

Facultad de Ciencias Marinas

Directorio

Dr. Felipe Cuamea Velázquez

Rector UABC

Dr. Oscar Roberto López Bonilla

Vicerrector, UABC Campus Ensenada

Dr. José Luis Fermán Almada

Director FCM

Dr. Juan Guillermo Vaca Rodríguez

Subdirector, FCM



Índice Introducción ......................................................................................................................................... 4

Encuadre del Sistema de Prácticas....................................................................................................... 5 Competencias a las que contribuye ................................................................................................................... 6

Niveles de Desempeño ................................................................................................................................. 6

Sistema de Evaluación .......................................................................................................................... 9 Aspectos a evaluar ............................................................................................................................................. 9

Asistencia, Puntualidad y Participación ........................................................................................................ 9

Protocolos y Reportes de Laboratorio .......................................................................................................... 9

Trabajo Final ............................................................................................................................................... 10

Detalle del peso específico de las distintas evaluaciones ................................................................................ 11

Reportes o exposiciones de laboratorio (25%) ........................................................................................... 11

Participación en laboratorio (5%) .............................................................................................................. 11

Presentación del trabajo final (15%) ........................................................................................................... 11

Ubicación de la materia dentro del mapa curricular ......................................................................... 12

Programa del Sistema de Prácticas .................................................................................................... 13

1. Actividades Académicas y de Investigación que se desarrollan en el Área de Genética dentro de la

Unidad Académica Punta Morro de la UABC. .............................................................................................. 15

1.1 Personal docente y técnico, laboratorios y cursos vinculados con el Área de Genética en la

Unidad Punta Morro de la UABC. ........................................................................................................ 16

1.2 Panorama general sobre la vinculación del sector académico que desarrolla investigación en

Genética Acuícola y el sector productivo. ........................................................................................... 20

1.3 Limpieza, precauciones y otras recomendaciones para el trabajo dentro de los laboratorios. ............ 23

2. Estructura y naturaleza del material genético ........................................................................................... 28

2.1 Cariotipado ........................................................................................................................................... 29

2.2 Extracción y cuantificación de ADN....................................................................................................... 33

2.3 Extracción y cuantificación de ARN ....................................................................................................... 42

3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)............................................................................................... 50

3.1 PCR de punto final................................................................................................................................. 51

3.2 Principales variantes de la PCR ............................................................................................................. 58

4. Proteínas……..… ........................................................................................................................................... 60

4.1 Extracción y cuantificación de proteínas ............................................................................................... 61

5. Herramientas Bioinformáticas .................................................................................................................... 71

5.1 Análisis de secuencias de ADN .............................................................................................................. 72

5.2 Diseño de cebadores ............................................................................................................................. 81

5.3 Análisis de datos genéticos ................................................................................................................... 95

Anexos .............................................................................................................................................................. 112



Introducción

Este manual está diseñado para estudiantes del área de las Ciencias Naturales y está destinado a servir de complemento a la materia de Genética Acuícola de la carrera de Biotecnólogo en Acuicultura de la Facultad de Ciencias Marinas de la Universidad Autónoma de Baja California, pero podrá, mediante algunas adaptaciones y modificaciones menores, ser usado en cualquier otra carrera del área.

Aunque las sesiones de laboratorio de la materia de Genética Acuícola tienen un fuerte componente práctico y el manual incluye básicamente protocolos estándar para la extracción y análisis de las tres biomoléculas que son la base del dogma central de la biología molecular, durante las prácticas se discutirán aquellos aspectos teóricos que enriquezcan y retroalimenten el contenido de las sesiones teóricas y que complementen el trabajo de laboratorio. Adicionalmente, el manual incluye una serie de talleres en los que se analizan en forma general las estrategias de búsqueda en las bases de datos de recursos genéticos de acceso público (Internet) y algunas de las herramientas bioinformáticas para el análisis de marcadores moleculares y su potencial de aplicación en el campo de la acuicultura.

De esta forma, el estudiante puede ahondar en los detalles metodológicos de las técnicas que esta utilizando y comprender más claramente los procesos bioquímicos involucrados, lo que le da el potencial para explorar modificaciones y alternativas a los protocolos estándar. Asimismo, un primer acercamiento a las bases de datos y las herramientas biotecnológicas disponibles hoy en día, permite no solo que el alumno amplié significativamente el panorama del campo de aplicación de la genética y la biotecnología, sino que tome conciencia del importante desarrollo actual y potencial de esta área, así como de la necesidad de que los recursos humanos que se esten formando en nuestro país, empiecen a involucrarse y a impactar en dichos campos.

Manual de Prácticas de Laboratorio de Genética Acuícola Encuadre del Sistema de Prácticas Página 5


Encuadre del Sistema de Prácticas

Al estarte formando como biotecnólogo en acuacultura, debes tener presente en todo momento que en nuestro país existe no solo un creciente desarrollo de la acuacultura, sino un enorme potencial para que dicha actividad se diversifique y tenga un mayor impacto social y económico al corto plazo; las proyecciones a futuro sugieren que, en un par de décadas, la producción acuícola podría estar aportando cerca de la mitad de la demanda de alimentos de la población humana. Ante este panorama, los biotecnólogos en acuacultura deberán enfrentar y resolver problemas relacionados con una producción intensiva, que demandará los más altos rendimientos, así como de un profundo compromiso con la protección del ambiente para garantizar su sustentabilidad. Ya que hoy en día, la producción acuícola intensiva no está necesariamente relacionada con grandes extensiones de cultivo, sino con un alto nivel de tecnificación y el uso de complementos nutricionales, probióticos y hormonas, así como de herramientas moleculares para el diagnóstico de patógenos y evaluación de los niveles de consanguinidad, el biotecnólogo en acuacultura deber estar familiarizado no solo con las técnicas y estrategias de vanguardia para los sistemas de producción, sino con los protocolos de seguridad y buenas prácticas de los laboratorios en los que se llevan a cabo ese tipo de análisis. Las estrategias de mejoramiento genético, ya sea a través de la domesticación y la selección de pie de cría, la cruza híbrida o mediante la controversial estrategia de transferencia de genes, ha impactado de forma significativa el rendimiento en la producción en algunas especies, particularmente de aquellas que tradicional e históricamente han formado parte del consumo masivo de la población humana (cereales y ganado). Aunque dentro del sector acuícola apenas ha empezado a incursionarse en este tipo de manejo, existe la gran ventaja asociada con la fecundación externa y la facilidad para manipular a los organismos a lo largo de su desarrollo, lo que ha permitido modificar el número de juegos cromosómicos o el sexo de los individuos alterando el proceso de división celular. Aunado a esto, el desarrollo tan acelerado de la bioinformática ha promovido un conocimiento cada vez más amplio y detallado de los genomas de diversas especies. En el futuro próximo se espera obtener una gran cantidad de datos asociados de manera directa con la estructura y la función de muchos de los genes que influyan significativamente en las características fenotípicas de interés para el consumidor y el productor; muchos de esos genes quizá sean los siguientes en ser considerados candidatos para ser transferidos de una especie a otra con el objeto de incrementar su crecimiento, su fecundidad o su supervivencia.



Por todo lo anterior, debe resultarles evidente la relevancia de un curso de Genética Acuícola como parte de las materias obligatorias del mapa curricular del biotecnólogo en acuacultura. No obstante, es importante hacer énfasis en el carácter integrativo de la genética, en donde convergen la biología molecular, la bioquímica, la fisiología, las matemáticas y la estadística, entre muchas otras disciplinas, este curso se ha diseñado para que durante la etapa disciplinaria de formación, adquieran los conocimientos básicos sobre la estructura y función de los ácidos nucleicos (biología molecular), la herencia y la variabilidad genética (genética mendeliana), la forma de cuantificarlas y analizarlas (genética cuantitativa), así como de las aplicaciones con un mayor potencial, impacto y relevancia para la acuacultura (genética aplicada). El curso de Genética Acuícola tiene un fuerte componente teórico, pero las sesiones de laboratorio no solo tienen como principal objetivo el enfatizar los conceptos y fundamentos teóricos de la biología molecular, sino el que aprendan: 1) los protocolos más comunes de extracción, evaluación y análisis del ADN, ARN y las proteínas, 2) la naturaleza y el potencial que tienen estas biomoléculas como marcadores en cualquier rama de las ciencias biológicas, y particularmente, 3) el uso de estos marcadores en el desarrollo, manejo adecuado y seguimiento de un programa de mejoramiento genético en acuacultura. Como profesionistas formados en este campo, ustedes podrán integrar los conocimientos adquiridos en el campo de la genética en miras de que su empresa o la empresa para que trabaje, sea más productiva y competitiva, pero a la vez más responsable con el ambiente.

Competencias a las que contribuye

Niveles de Desempeño

Debido a que muchos de los insumos que se requieren para la realización de las prácticas representan algún riesgo para la salud, aunado a hecho de que muchos de esos reactivos y equipos son extremadamente delicados, costosos y se usan principalmente para las actividades de investigación, dedicaremos la primera sesión a establecer y discutir los reglamentos generales de los laboratorios que estaremos usando. Con ello se pretende establecer la línea de base sobre la que podrás trabajar de forma segura, disciplinada y responsable en este y cualquier otro laboratorio. Mediante una dinámica de grupo, revisaremos el protocolo de limpieza, precauciones y otras recomendaciones para el uso de los laboratorios, cuyo estricto seguimiento se vera reflejado en tu calificación. La disciplina en el laboratorio y tu nivel de compromiso con la seguridad y el cuidado del equipo se evaluará en términos del seguimiento de los reglamentos y recomendaciones para el cuidado de tu integridad y la de tus compañeros, tu participación en las actividades de mantenimiento y manejo adecuado del equipo,



instrumental e instalaciones, así como de la correcta disposición de los residuos generados durante la práctica. Tomando en cuenta los elevados costos de los insumos para esta asignatura, incluyendo los de los programas de cómputo de datos genéticos, en las sesiones de laboratorio y en los talleres del curso, se te proporcionará información adicional sobre protocolos alternos y programas de acceso libre. Con ello se busca que evalúes en forma crítica las ventajas y desventajas de uso de estas alternativas en términos de costo, tiempo, esfuerzo y riesgo; aspecto que te irá formando como un profesionista responsable y comprometido con su trabajo, conciente de la necesidad de hacer más eficiente el uso de los recursos, pero siguiendo siempre un protocolo de buenas prácticas. El curso contempla la posibilidad de realizar una salida de campo en la que se visitarían las instalaciones de alguna granja o laboratorio acuícola de la región. Durante esta visita esperamos que desarrolles tu capacidad de interactuar con el sector productivo, lo que te permitirá conocer las inquietudes y la problemática particular que enfrentan. Más adelante, integrarás los conocimientos adquiridos a lo largo del curso al plantear una propuesta o anteproyecto para la implementación de un programa de mejoramiento genético en alguna especie de interés local o regional. Esta actividad la elaborarán a lo largo del cuatrimestre, la presentarán en forma oral y escrita la última semana dentro del periodo oficial de clases y será parte importante de tu calificación. Por lo tanto, esperamos que explotes al máximo esta salida de campo, observando, preguntado y quizá estableciendo un potencial vínculo con la empresa o alguno de sus proveedores o clientes. Como estudiantes y futuros profesionistas, deberán desarrollar habilidades que les permitan mejorar su capacidad para comunicar los avances y resultados de sus actividades de manera clara, organizada y consensual. Por esta razón se les requerirá de la entrega de un protocolo resumido o diagrama de flujo de las actividades a realizar al inicio de la sesión de laboratorio y un informe para cada práctica, el cual incluye también un breve cuestionario. La rigurosidad en las fechas de entrega, así como una estricta revisión del contenido de los reportes pretende no solo que organicen adecuadamente su tiempo, sino que fortalecerá sus habilidades de redacción. Los reportes de laboratorio serán analizados mediante herramientas y tecnologías de la información (Blackboard) con el objeto de motivar y fomentar el hábito de la lectura con fines de mantenerse actualizados, haciendo una búsqueda más profunda y cuidadosa de la información que incluirán en sus reportes, evitando el plagio y potencializando su ética profesional. En este sentido, como parte inicial de las actividades del laboratorio, revisaremos y discutiremos detalladamente una serie de recomendaciones y lineamientos sobre el contenido y los formatos que deberán seguir para la realización de los protocolos iniciales (evaluación diagnóstica), los reportes de laboratorio (evaluación de proceso) y el trabajo final de laboratorio (evaluación sumativa). Aunque deben seguir los lineamientos, estos les



permiten un margen amplio de independencia para desarrollar su reporte, con lo que pretendemos potencializar el desarrollo de competencias de comunicación escrita.

La autocrítica y la crítica constructiva se promoverán exponiendo los contenidos esperados en el reporte de laboratorio y solicitando la nota que consideran haber obtenido (autoevaluación), para posteriormente hacer entrega de la evaluación por parte del docente (heteroevaluación). Asimismo, evaluarán el contenido y la calidad de los protocolos resumidos de algunos de sus compañeros a lo largo del curso (coevaluación).

Finalmente, para la evaluación de su presentación oral del trabajo final, se convocará a algunos académicos con experiencia en la especie sobre la que hayan desarrollado su investigación, así como al responsable técnico de alguna de las granjas o laboratorios de producción en los que se trabaje con la especie (heteroevaluación diversificada).

El conjunto de prácticas y talleres de este manual te permitirá llegar a un nivel de desempeño 2 de la clasificación CONOCER:

Nivel 2.- Se realizan un conjunto significativo de actividades de trabajo, variadas y aplicadas en diversos contextos. Algunas actividades son complejas y no rutinarias. Presenta un bajo grado de responsabilidad y autonomía en las decisiones. A menudo requiere colaboración con otros y trabajo en equipo.

Las razones por las que el nivel de desempeño alcanza tan solo el nivel 2 son: 1. La realización de actividades en la sesión en forma organizada presupone cierto dominio

de diversas habilidades y conocimientos, pero representan un bajo grado de responsabilidad.

2. La elaboración de un protocolo y un reporte escrito por práctica requiere de disciplina

en la planeación y organización del resto de las actividades académicas, así como la utilización de herramientas computacionales para acceder a la información, elaborar un reporte de calidad y contestar los cuestionarios.

3. La realización de reportes y trabajos finales en equipo requiere de la participación

consensual y equiativa de los elementos. El balance entre la capacidad de liderazgo y de mediación deberá ser óptimo para llevar a cabo tanto las actividades de laboratorio (protocolos), como la consulta bibliográfica para la integración de los reportes y los cuestionarios.

4. La presentación de un trabajo final, orientada a plantear una estrategia para el

mejoramiento de la producción en interacción con el sector social productivo regional, además de fomentar la colaboración y el trabajo en equipo, representa una primera aproximación a la toma de decisiones responsables y éticas de forma autónoma.



Sistema de Evaluación

Aspectos a evaluar Asistencia, Puntualidad y Participación

La puntualidad y la participación activa en las sesiones de laboratorio es la única forma en la que pueden desarrollarse en tiempo y forma las actividades planeadas. Por lo tanto, se les tomará lista 10 minutos después de la hora de inicio y 20 minutos antes de concluir la sesión de laboratorio. El acumular tres retardos (llegar después de los 10 minutos de tolerancia o ausentarse antes de concluir la sesión) se considerará como una falta. Más de una falta injustificada al laboratorio hará que pierdan el derecho a exentar el examen final aunque tengan el promedio requerido. El acumular más de tres faltas injustificadas al laboratorio, les quita automáticamente el derecho a una calificación final, por lo que deberán presentar examen extraordinario. Las faltas podrán ser justificadas solamente a través de un reporte médico o mediante la autorización debidamente firmada por el subdirector académico de la Facultad.

Protocolos y Reportes de Laboratorio

Las sesiones de laboratorio y la elaboración de reportes de las prácticas las trabajarán en equipos de dos integrantes. El trabajo final de laboratorio se podrá trabajar en equipos de entre dos y tres integrantes, en función del número de alumnos inscritos al curso. El manual del curso lo podrán descargar de la página electrónica del docente titular del curso. Sin excepción alguna, se les negará la permanencia a la sesión de laboratorio si no traen consigo cualquiera de los siguientes elementos: bata y calzado cerrado, el protocolo resumido o diagrama de flujo correspondiente al trabajo de la sesión y el reporte de la práctica anterior. En ninguno de los laboratorios vinculados al de Genética Acuícola se prestarán batas y/o manuales. Antes de iniciar con las actividades específicas de cada sesión de laboratorio, cada equipo deberá limpiar su área de trabajo con alcohol y hacer entrega del protocolo resumido de las actividades que se realizarán durante la sesión (diagrama de flujo). En dicho resumen o diagrama se deberán de identificar claramente la secuencia de



procedimientos que se llevarán a cabo en la sesión, el equipo que usarán y el tiempo estimado o requerido para cada paso. Esto presupone que revisaron el manual y que el trabajo se podrá realizar de forma más ágil y dinámica.

El protocolo que entreguen será evaluado tanto por otro de los equipos, como por el docente. No se aceptarán protocolos elaborados a mano, por lo que deberán elaborarlo previamente. Elaborarán un reporte de cada práctica, ajustándose a las recomendaciones incluidas en los lineamientos para la elaboración de los reportes de laboratorio que encontrarás en este manual (Anexo 1). El reporte de laboratorio lo deben entregar una semana después de concluida la práctica (una práctica puede constar de más de una sesión de laboratorio). Deberán entregar el reporte en formato impreso, al inicio de las sesiones de laboratorio, y en formato electrónico (*.doc, *.docx o *.pdf) la noche anterior o en el transcurso del día de entrega. En caso de que no envíen la versión electrónica, se evaluará la versión impresa pero se restarán dos puntos a la calificación obtenida. No se aceptarán reportes elaborados a mano, ni se recibirán fuera de la fecha de entrega previamente establecida. Los reportes corregidos por el responsable del curso de laboratorio se les regresarán una semana después de haberlos entregado. Aquellos reportes con una calificación inferior a 75 deberán ser elaborados de nuevo, atendiendo las correcciones indicadas por el docente, y entregados para una segunda evaluación exactamente una semana después de haber recibido la primera evaluación. En caso de no entregar el reporte para su segunda evaluación, no obtendrán nota para dicha práctica y se promediará como cero para la evaluación final. Antes de concluir la sesión, cada equipo se hará responsable de limpiar de nuevo su espacio de trabajo y de lavar el material que haya usado para regresarlo al almacén. Antes de retirarse llenarán un breve formato de autoevaluación que entregarán al responsable del laboratorio y que les será devuelto al inicio de la siguiente sesión con la evaluación del docente (Anexo 2).

Trabajo Final

Elaborarán un trabajo final en el que plantearán una propuesta de programa de mejoramiento genético para alguna especie de interés local o regional. El trabajo final se deberá desarrollar durante el semestre y podrán entregar avances para que el profesor los revise y les haga correcciones cuantas veces lo consideren necesario, hasta dos semanas antes de entregar y presentar la versión final. Para la evaluación del trabajo final considerará la calidad y presentación del escrito y de la exposición, la claridad y la habilidad para responder las dudas de la audiencia durante la presentación oral, los comentarios de los académicos o responsables técnicos que asistan y la evaluación de sus compañeros.



El formato del escrito debe seguir los mismos lineamientos y recomendaciones generales que se seguirán para los reportes de laboratorio (Anexo 1), excepto por el hecho de que no habrá resultados, discusión y conclusiones. El diseño experimental y las variables de respuesta que planteen en su propuesta serán los aspectos de mayor peso para la evaluación de la misma. El formato de la presentación oral será libre, pero contarán solamente con 20 minutos para hacer su exposición y 10 minutos para responder preguntas.

Detalle del peso específico de las distintas evaluaciones

Reportes o exposiciones de laboratorio (25%) Calidad y organización del contenido del reporte, así como la profundidad de la revisión bibliográfica y de las respuestas al cuestionario anexo al reporte. Los detalles sobre el formato y el puntaje para cada sección del reporte se indican en el Anexo 1. Participación en laboratorio (5%) Puntualidad, protocolos resumidos, comportamiento en clase y formato de autoevaluación cotejado por el profesor (Anexo 2). Presentación del trabajo final (15%) Al igual que los reportes de las prácticas, en la versión escrita se evaluarán la calidad y organización de la información, así como la profundidad de la revisión bibliográfica. Por su parte, en la evaluación de la presentación oral del trabajo se tomarán en cuenta, además de la calidad y organización de la información, la habilidad en el manejo del tema y el nivel de participación de cada miembro del equipo. Adicionalmente, se tomará en cuenta la percepción general y el impacto del trabajo a través de las evaluaciones de otros académicos o personal técnico invitados y del resto de los compañeros de grupo:

a) Evaluación del docente al trabajo escrito (5%). b) Evaluación del docente a la presentación oral (5%). c) Evaluación general de los académicos o técnicos invitados (3%). d) Evaluación general de los otros equipos de alumnos (2%).

Manual de Prácticas de Laboratorio de [MATERIA] Encuadre del Sistema de Prácticas Página 12


Ubicación de la materia dentro del mapa curricular



Programa del Sistema de Prácticas

Tema Práctica o prácticas programadas Ámbito de

desarrollo Duración*

1. [UNIDAD I]

Personal docente y técnico, laboratorios y cursos vinculados con el Área de Genética en la UABC

Recorrido por el Campus

3 horas

Panorama general de la vinculación Academia-Sector Productivo

Salida de Campo 3 horas

Reglamentos de Seguridad de los Laboratorios

Laboratorio 1 hora

2. [UNIDAD II]

Cariotipado Taller de Computación 2 horas

Extracción de ADN Laboratorio 8 horas

Extracción de ARN Laboratorio 8 horas

3. [UNIDAD III] PCR de punto final Laboratorio 6 horas

Variantes del PCR Taller 2 horas

4. [UNIDAD IV] Extracción de Proteínas Laboratorio 8 horas

5. [UNIDAD V]

Análisis de secuencias de ADN Taller de Computación 4 horas

Diseño de cebadores Taller de Computación 8 horas

Análisis de datos genéticos Taller de Computación 8 horas

* Duración en horas para cada práctica, y semana del semestre en la que se realizará.

Contenido de Prácticas de Laboratorio

GENÉTICA ACUÍCOLA

Dra. Ivone Giffard Mena, Dr. Luis Enríquez Paredes

Responsables de la elaboración del manual de GENÉTICA ACUÍCOLA

Manual de Prácticas de Laboratorio de Genética Acuícola [UNIDAD I] Página 15


1. Actividades Académicas y de Investigación que se desarrollan en

el Área de Genética dentro de la Unidad Académica Punta Morro

de la UABC.

Facultad de ciencias Marinas de la Universidad Autónoma de Baja California

Responsable(s): Dra. Ivone Giffard-Mena, Dr. Luis Enríquez-Paredes

Número de alumnos por práctica: 10 alumnos máximo

Propósito General de las Prácticas de la Primera Unidad

Que conozcan la ubicación, la función, los proyectos y a los investigadores responsables de los distintos laboratorios de docencia o investigación en los que se desarrollan actividades relacionadas con la genética de organismos marinos. Asimismo, informarlos sobre los reglamentos de dichos laboratorios, las medidas de seguridad más relevantes y la importancia del seguimiento de buenas prácticas tanto para proteger su integridad física, como para la generación de resultados confiables, haciendo un mejor y adecuado uso de los equipos y los recursos.

Finalmente, acercarlos al sector social y al trabajo de vinculación que realiza la Facultad de Ciencias Marinas mediante una visita guiada a alguna granja acuícola de la región.



1.1. Personal docente y técnico, laboratorios y cursos vinculados con el

Área de Genética en la Unidad Punta Morro de la UABC.

1.1.1. Introducción

Actualmente, el conocimiento de los fundamentos de la genética y el uso de herramientas moleculares y bioinformáticas, constituyen un elemento central dentro de la formación de profesionales en cualquier disciplina dentro del área de las ciencias naturales.

Las líneas de investigación y las aplicaciones de la genética en las ciencias del mar son muy diversas. La sistemática molecular, la genética de poblaciones, la expresión de genes y la ingeniería genética, entre muchas otras disciplinas, han complementado de manera importante la investigación de los recursos bióticos marinos. También han promovido la creación de muchas nuevas líneas de investigación que bien pudieran englobarse en los conceptos de genómica y proteómica, cuya finalidad es la de conocer la estructura, la función y las interacciones de los genes y de las proteínas para las que estos codifican. El conocimiento detallado de estos aspectos permitirá entender como es que funcionan los organismos a nivel molecular, con lo que seguramente la biotecnología marina tendrá un importante impacto en campos como la farmacología, la terapia génica de organismos cultivados, la tecnología de alimentos y el mejoramiento genético de especies de importancia.

Aunque en la Facultad de Ciencias Marinas de la UABC no existe físicamente un laboratorio de Genética Acuícola, existen diferentes grupos de investigación y laboratorios en los que se trabaja con aspectos genéticos moleculares en especies marinas de importancia para la acuicultura, bioindicadoras o con estatus que requieren de esfuerzos para su conservación.

Mediante un recorrido guiado por todos los laboratorios involucrados con el uso de la genética en las ciencias marinas, se pretende que el alumno conozca la ubicación de estos y a los investigadores responsables de cada uno de ellos. Así, recibirán información de primera mano sobre el tipo de trabajo que realizan estos investigadores y sus estudiantes de licenciatura y posgrado, ampliando el especto de opciones dentro de las que, más adelante, se integren como ayudantes docentes o de investigación, o bien como servicios sociales o tesistas.

A la vez, aunque la mayor parte de las sesiones de laboratorio de Genética Acuícola se desarrollan en el Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias Marinas, por cuestiones de espacio y ubicación de los equipos que se estarán usando a lo largo del curso, ocasionalmente se hará uso de estas otras instalaciones dentro de la Unidad Punta Morro.



Por lo anterior, la primera sesión de laboratorio, está orientada a que los alumnos ubiquen el laboratorio de Ecología Molecular “Dr. Jorge de la Rosa Vélez” (FCM), los laboratorios de Biología Molecular y “Dra. Meredith Gould” (FC), así como los de Patología Experimental Acuícola, Biología del Desarrollo y el de Genética (IIO).

1.1.2. Objetivo

Que el alumno conozca la ubicación, la función, a los investigadores responsables de los distintos laboratorios de docencia o investigación en los que se imparten cursos y se desarrollan proyectos relacionados con la genética de organismos marinos.

1.1.3. Material

Para el desarrollo de esta práctica solo se requerirá de una libreta de notas y de una cámara fotográfica de bolsillo (bien puede ser la cámara digital integrada al teléfono celular.

1.1.4. Desarrollo

Guiados por el docente, realizarán un recorrido por los distintos laboratorios del Campus, en donde se realicen actividades de docencia o investigación relacionadas con la Genética. En cada laboratorio, alguno de los investigadores, académicos o técnicos responsables, les explicarán el tipo de actividades que ahí se llevan a cabo, el tipo de equipo con el que cuenta, y los proyectos más relevantes que ahí se estén desarrollando. Escucharán y observarán atenta y respetuosamente, preguntando todas sus dudas al docente o al responsable que los reciba en cada laboratorio. Tomarán notas acerca de los aspectos que consideren más relevantes, así como fotografías para sus registros. En el mapa que se muestra en la página siguiente, se ha señalado la ubicación de los distintos laboratorios que serán visitados:



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1.1.5. Método de Evaluación

Para evaluar esta práctica entregarán un breve reporte enlistando los laboratorios que visitaron, los nombres de los investigadores y técnicos responsables de cada uno, así como una breve descripción del tipo de cursos, estudios e investigaciones que ahí se lleven a cabo.

En la evaluación se considerará también el comportamiento que hayan guardado y la participación durante las visitas.

1.1.6. Bibliografía

http://www.ens.uabc.mx/Mapa_UABC_Ensenada.pdf (consultada el 3 de mayo de 2012)



1.2. Panorama general sobre la vinculación del sector académico que

desarrolla investigación en Genética Acuícola y el sector productivo.


En México, existen varias especies de importancia para el cultivo acuícola. Ante la intensa competencia nacional e internacional, los productores mexicanos han empezado a buscar la manera de obtener material genético de alta calidad, es decir, de larvas con velocidades de crecimiento y tasas de sobrevivencia mayores, así como organismos menos susceptibles o resistentes a ciertos patógenos.

Aunque la mayoría de los consumidores no se percata de que hay estudios científicos complejos detrás de lo que ellos compran para poner sobre su mesa cada día, la acuicultura está explorando las opciones para lograr avances que otras fuentes de proteína animal ya han alcanzado y que las tiene dominado el mercado.

El sector de producción avícola, con las mayores tasas de consumo en los EE.UU., ha implementado la investigación genética durante décadas con el fin de mejorar el crecimiento de los organismos y la producción de huevo. De forma similar, en el sector ganadero, los programas de mejoramiento genético basados en la selección de animales que crecieran más rápido o fueran más grandes, mostraron ser una práctica exitosa.

Si bien la acuicultura se encuentra en etapas iniciales de este proceso, hay indicadores muy prometedores de que habrá avances muy exitosos en esta industria. La selección familiar ha mostrado mejoras fenomenales, sobre todo en la cría de camarón. Por su parte, la manipulación genética ha comenzado a dar muy buenos resultados en el cultivo de peces y moluscos.

Estamos por ser testigos en los próximos años de algunos cambios muy interesantes en la forma en que se produce la proteína acuícola, bajando tiempos y costos de producción y dando al consumidor proteína de alta calidad.

La vinculación entre el sector académico y los centros de investigación con la industria acuícola, a través del desarrollo de programas de selección y mejoramiento genético es un ejemplo claro de la importancia que tiene la investigación aplicada para resolver los problemas que enfrentan las empresas mexicanas. Por ello, es de vital importancia que como futuros profesionales biotecnólogos en acuicultura, tengan la visión y la capacidad de establecer los puentes de comunicación y de intercambio tecnológico entre el sector académico y el sector productivo.

1.2.2. Objetivo



Que reconozcan el impacto que han tenido los programas de mejoramiento y

manipulación genética en la producción animal y el importante papel de la vinculación

entre el sector científico-académico y el sector productivo en el área de la genética

acuícola.

1.2.2.1. Que identifiquen, mediante una revisión bibliográfica, las especies con mayor

potencial para el futuro de la acuicultura en México y el tipo de investigaciones a

nivel genético que se están desarrollando

1.2.2.2. Que evaluen, a través de una visita a una granja o laboratorio de producción

acuícola, la percepción y el interés de los productores para el desarrollo de un

proyecto en el que se involucre el mejoramiento o manipulación genética.

1.2.3. Material

Para el desarrollo de esta práctica solo se requerirá de una libreta de notas y de una cámara fotográfica de bolsillo (bien puede ser la cámara digital integrada al teléfono celular.

1.2.4. Desarrollo

Guiados por el docente y el responsable técnico de la granja o laboratorio acuícola, realizarán un recorrido por las instalaciones. El técnico o técnicos responsables les explicarán el tipo de actividades que se llevan a cabo en cada área, así como la forma en la que realizan sus actividades, el tipo de equipo con el que cuentan y las normas de bioseguridad que se siguen. Escucharán y observarán atenta y respetuosamente, preguntando todas sus dudas al docente o al responsable técnico que los reciba en cada área. Tomarán notas acerca de los aspectos que consideren más relevantes, así como fotografías para sus registros.


Para evaluar esta práctica entregarán un breve reporte en el que describan de forma general la biología de la especie y el tipo de cultivo que se realiza en las instalaciones visitadas, haciendo énfasis en el nivel de tecnificación y la existencia de algún tipo de programa de manejo o mejoramiento genético, así como la percepción y el nivel de interés del productor con respecto a ese tipo de programas.



Se considerará también para la evaluación, el comportamiento que hayan guardado durante la visita y su participación.


,

1. Hulata, G. 2001. Genetic manipulations in aquaculture: a review of stock improvement by classical and modern technologies. Genetica 111: 155–173.

2. Página de Internet de la Revista Panorama Acuícola.

http://www.panoramaacuicola.com/articulos_y_entrevistas/2009/10/30/mej

oramiento_genetico_del_camaron.html (consultada el 30 de octubre de 2009)


http://www.panoramaacuicola.com/columnas/2011/06/30/agua__cultura/2

011/11/01/es_la_manipulacion_genetica_el_futuro_de_la_acuicultura.html

(consultada el 01 de noviembre de 2011)

4. Página de Internet de la Revista Panorama Acuícola. http://www.panoramaacuicola.com/columnas/2011/06/30/el_fenomenal_mundo_de_las_tilapias/2012/01/05/capitulo_4_la_industria_de_las_semillas_de_tilapia_un_comparativo_entre_asia_y_america_latina_.html (consultada el 05 de enero de 2012)


http://www.panoramaacuicola.com/editorial/2012/01/05/las_cuatro_especi

es_que_van_a_predominar_en_la_acuicultura__mundial_en_el_futuro.html

(consultada el 05 de enero de 2012)



1.3. Limpieza, precauciones y otras recomendaciones para realizar el

trabajo dentro de los laboratorios.


Los laboratorios en los que estarán trabajando para este curso son sitios en donde se pueden ubicar situaciones potencialmente peligrosas por la presencia de 1) compuestos químicos flamables, tóxicos o carcinogénicos, 2) equipo eléctrico delicado que trabaja a altas temperaturas o voltajes, 3) sistemas de ultracongelación, 4) agentes biológicos infecciosos o patógenos y 5) DNA recombinante.

Por lo tanto, es necesario que sigan un protocolo dentro del que se cuenta con reglas de seguridad y algunas recomendaciones que deberán tomar en cuenta.

1.3.2. Objetivo

Se les dará a conocer, en forma clara y precisa, el reglamento de uso de laboratorio y de

los equipos que se utilizarán a lo largo del curso.

1.3.2.1. Que conozcan el reglamento de los laboratorios de los que se hará uso durante el

curso y las consecuencias por no cumplir con el mismo.

1.3.2.2. Que se familiaricen con los diferentes tipos de pipeteadores automáticos con los

que se cuenta para el laboratorio, así como con la ubicación del equipo y de las

bitácoras que se estarán usando a lo largo del curso.

1.3.2.3. Que reconozcan el rombo de seguridad de los reactivos, la tabla de

incompatibilidades químicas y que ubiquen los contendores para disponer

adecuadamente de los deshechos que se generen durante las sesiones de

laboratorio.

1.3.3. Material

Para el desarrollo de esta práctica solo requerirán de una libreta de notas.



1.3.4. Desarrollo

Escucharán atenta y respetuosamente tanto al docente, como al responsable del Almacén General de la Facultad de Ciencias Marinas, quiénes les comunicarán los reglamentos, así como algunas recomendaciones para el trabajo en los laboratorios.

Reglas de seguridad no negociables

El laboratorio es un lugar que te permite cierta libertad en cuanto a la forma de vestir. Normalmente los laboratorios de biología molecular o genética en instituciones académicas son más relajados en el código de vestir que los hospitales o compañías particulares. No obstante, en el laboratorio de Genética Acuícola y otros de los laboratorios asociados a este curso:

Bajo ninguna circunstancia se permite comer, beber, fumar o usar el telefono celular para hacer o recibir llamadas dentro del laboratorio

El uso de la bata es obligatorio en todo momento dentro del laboratorio. La bata siempre es un elemento del vestir en el laboratorio que te permitirá mantener protegida tu piel de substancias que pueden ser realmente dañinas como el fenol o el bromuro de etidio. Por otra parte mantendrá protegida tu ropa y evitará llevar contaminación fuera del laboratorio.

El uso de guantes de nitrilo previenen que los reactivos, material esterilizado y las muestras se contaminen con la grasa y el sudor de nuestras manos, residuos que contienen tanto ácidos nucleicos como las enzimas que los degradan. Además son indispensables para manejar ciertas sustancias irritantes para la piel, pero sobre todo para manejar el bromuro de etidio (cancerígeno), el fenol, cloroformo, trizol y la acrilamida (neurotóxicos).

Evita llevar la bata y los guantes fuera del laboratorio. Quitarse la bata y los guantes antes de salir del laboratorio debe ser una costumbre.

Es obligatorio el uso de calzado cerrado. Utilizar huaraches o sandalias puede exponer los pies a una salpicadura con algún reactivo peligroso o a una lesión en caso de algún accidente con la cristalería.

Por ningún motivo se debe pipetear con la boca. Resulta evidente lo que puede ocurrir al pipetear de esta forma algún reactivo tóxico o irritante, además de que seguramente se contaminará con saliva o células del epitelio bucal. Por lo tanto, se deben usar siempre pipeteadores automáticos o semiautomáticos.



Los pipeteadores automáticos son exactos y muy precisos, por lo tanto muy delicados. Si un pipeteador se usan de manera inadecuada (fuera de su capacidad volumétrica), se deja caer o se utiliza para otra cosa que no sea pipetear se descalibra.

Verificar como ayudar a los demás y a uno mismo en caso de emergencia. Ubicar el teléfono y el extintor para poder utilizarlos en caso de emergencia y consulta los procedimientos a seguir en caso de que ocurra un imprevisto.

Verifica los riesgos de trabajar con cada uno de los compuestos que manejas y en caso de contaminación infórmate cómo vas a manejarla y cual será su disposición final. No disponer de los deshechos indistintamente en cualquier bote de basura o verter reactivos en las tarjas a menos que así se indique.

Todos los reactivos y/o muestras que se preparen y se almacenen en los refrigeradores, congeladores o estantes, deberán estar debidamente etiquetados con tu nombre, fecha, contenido y rombo de seguridad.

Si el reactivo que se esta usando se agota o queda una cantidad mínima avisa oportunamente al encargado del laboratorio.

Antes de usar cualquiera de los equipos del laboratorio, si no se encuentra alguno de los responsables del laboratorio, se deberá revisar el manual de uso o pedir asesoría inicial a algún compañero de laboratorio que lo haya utilizado anteriormente. Si no se sabe usar o se tiene alguna duda, preguntar la forma adecuada de uso de un aparato puede evitar un accidente o la descompostura innecesaria del mismo.

Los peores enemigos de los ácidos nucleicos, nuestro objeto de estudio en el laboratorio, son las enizmas nucleasas (DNAsa y RNAsa). Es por ello que todo el material de vidrio, las puntas plásticas de las micropipetas y el agua dd (destilada y desionizada) deben ser esterilizados en autoclave. Es particularmente importante que cuando se trabaja con RNA, todo el material sea tratado con DEPC (ver protocolos relacionados con RNA).

El laboratorio es un espacio muy dinámico y la contaminación de muestras y/o reactivos es una amenaza constante para el buen término de los experimentos. Por lo tanto, debe alertarse de las posibles fuentes de contaminación de muestras, área de trabajo, material y reactivos, y respeta los de tus compañeros de laboratorio. Invariablemente deberá limpiarse el área de trabajo antes y al concluir el trabajo.



Un buen técnico o científico se distingue por ser ordenado, disciplinado y por llevar un registro meticuloso de las actividades relacionadas con sus experimentos, así como del uso y mantenimiento de los equipos. Las bitácoras de laboratorio son la única prueba fidedigna del trabajo que se lleva a cabo, por lo que deben mantenerse al día, revisarlas antes de comenzar tu siguiente sesión de trabajo y jamás llevarlas fuera del laboratorio.

Otras recomendaciones

A menos que explícitamente se señale en un protocolo lo contrario, SIEMPRE deberán manipularse las muestras en frío antes de iniciar su proceso y PARTICULARMENTE durante la homogenización o lisado del tejido. Esto se debe a que, a pesar de estar trabajando con reactivos y materiales estériles (libres de DNAsas o RNAsas), en los lisosomas celulares se encuentran nucleasas que podrían degradar los ácidos nucleicos que nos interesa estudiar.

Aunque siempre se debe de pensar en la estrategia más económica para llevar a cabo un protocolo, NUNCA se debe comprometer su éxito por el ahorro de un par de guantes, menos tubos o menos puntas. Cada vez que exista la menor duda sobre una posible contaminación con DNAsas o RNAsas, debemos cambiar guantes y/o eliminar material sospechoso.

La gran mayoría de los reactivos que se utilizan en Biología Molecular son sustancias lábiles a la temperatura y/o a la luz, además de ser muy costosas. Cuando se utilicen, hay que hacerlo adecuadamente, ya sea en hielo y/o protegidos de la luz, regresándolos a su sitio de almacenaje lo más pronto posible (refrigeración o congelación).

Un consejo muy importante, que para este curso tendrá carácter de obligatorio: Siempre que se vaya a efectuar un experimento en el laboratorio, se deberá haber leído y comprendido el protocolo. El haber realizado el ejercicio mental del proceso, imaginando las necesidades en cada paso, permitirá tener listos y a la mano cada uno de los reactivos, materiales, implementos y equipos necesarios.

Cuando se planea hacer un experimento, es necesario asegurarse que el material y/o los equipos requeridos van a estar disponibles. Es una buena práctica de laboratorio el que cada equipo cuente con una bitácora y un cronograma donde se registren los turnos. Esto evitará retrasos innecesarios y conflictos con otros usuarios.



Si aún después de todas estas recomendaciones, rompes, dejas caer, descompones, contaminas o dejas fuera del refrigerador/congelador muestras o reactivos importantes..…¡AVISA!. Lo ético es avisar que algo dejó de funcionar o que posiblemente ya no funcione, evitando así que los demás sigan trabajando con reactivos o muestras que de antemano, por un error nuestro, sabemos que no van a funcionar.

Por último, es importante que estén informados de la forma en la que se puede reconocer la peligrosidad de algún reactivo, sobre la ubicación de las hojas de seguridad y acerca de los procedimientos para el manejo y disposición de residuos peligrosos. En el Anexo 3 de este manual, encontrarán información importante sobre todos estos aspectos, por lo que se les recomienda revisarlo detenidamente.


Debido a que muchas de las reglas y recomendaciones son de vital importancia para evitar riesgos a la salud o contaminar los espacios, equipos y reactivos que usan otros compañeros, tesistas e investigadores, se evaluará el seguimiento de las mismas en forma permanente, a lo largo de cada sesión. Aquellos que no sigan las reglas y recomendaciones tendrán puntos menos en las evaluaciones correspondientes a la participación dentro del laboratorio (ver sección de Encuadre del Sistema de Prácticas y Anexos 1 y 2).


Barker, K. 2005. At the Bench: A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 465 p.



2. Estructura y naturaleza del material genético




Propósito General de las Prácticas de la Segunda Unidad

La gran mayoría de las técnicas de biología molecular con aplicaciones en el área de las ciencias naturales incluyen algún tipo de manipulación y análisis del material genético. El poder de resolución que se puede obtener del análisis de los ácidos nucleicos radica tanto en sus propiedades biofísicas como en las bioquímicas, por lo que una adecuada extracción y preservación, que garantice la integridad de estas moléculas, resulta crucial para la obtención de resultados confiables y reproducibles.

Sin importar el tipo de organismos que estén estudiando; ya sean unicelulares o multicelulares, procariotas o eucariotas, todos tienen al DNA y/o al RNA como vehículos de su información genética. Por ello, es importante que aprendan los fundamentos bioquímicos universales de los procedimientos empleados para el análisis de su organización estructural, extracción, purificación y la preservación de los ácidos nucleicos a partir de cualquier tipo de tejido vegetal o animal.

El cariotipado fue uno de los primeros métodos para el estudio de la organización del material genético, el mapeo de genes y el análisis de anormalidades genéticas. Hoy en día, existen diversas técnicas de tinción en los laboratorios de citogenética que ofrecen una alta resolución en la identificación y el análisis estructural a nivel cromosómico, lo que ha permitido entender su comportamiento durante la mitosis y la meiosis, así como la influencia de ciertas alteraciones cromosómicas en el fenotipo de los individuos.

Por otra parte, aunque actualmente existe una gran disponibilidad y diversidad de kits comerciales para la extracción de ácidos nucleicos, que agilizan y hacen más eficiente el procedimiento, consideramos más didáctico el uso de un protocolo clásico y la discusión de sus variantes, para ilustrar los diferentes pasos del proceso de extracción y las alternativas disponibles para su preservación y que podrán ajustar a los requerimientos particulares de su experimento o proyecto.



2.1. Cariotipado


El cariotipo es el patrón cromosómico de una especie expresado a través de un código

en el que describe las características de sus cromosomas o cariograma. En otras

palabras es una representación gráfica de los cromosomas de una célula metafísica,

basada en su morfología (p.e. metacéntricos, submetacéntricos, telocéntricos,

subtelocéntricos y acrocéntricos), tamaño y propiedades bioquímicas. Normalmente el

cariotipo es el mismo para todos los individuos de una especie.

En los laboratorios de citogenética se hace uso de diversas técnicas de tinción que

generan un patrón de bandeo cromosómico a causa de diferencias en la interacción

bioquímica. En el cariotipado clásico se utiliza solución de Giemsa (específica para los

grupos fosfato del ADN), lo que colorea diferencialmente ciertas regiones del

cromosoma (Bandas-G), por lo que cada cromosoma tiene un patrón característico de

bandeo que ayuda a identificarlo y que permite localizar regiones de interés. Pese a que

actualmente existen técnicas mucho más eficientes y con mayor resolución para el

estudio de los cromosomas (p.e. cariotipado espectral, bandeo extendido, hibridación

fluorescente in situ, análisis de microarreglos cromosomales, etc.), todos ellos tienen el

principio básico del cariotipado clásico.

Debido a que la obtención de cariotipos es un proceso tardado y delicado, esta práctica

consta solamente de una serie de ejercicios en la computadora en que reconstruirán

genotipos con base en las imágenes digitales de cromosomas obtenidas en estudios

reales de genética humana. No obstante, el procedimiento es el mismo que se utiliza en

cualquier especie.

En genética acuícola, una de las principales líneas de investigación a nivel de los

cromosomas es el manejo o manipulación del número de juegos cromosómicos para la

obtención de organismos triploides. Estos organismos poliploides, a pesar de ser

estériles, presentan una tasa de crecimiento mayor a la de los organismos con un

número normal de cromosomas.



2.1.2. Objetivo

Asignar correctamente los pares cromosómicos en un cariotipo normal e identificar

anormalidades en el patrón cromosómico mediante ejercicios de simulación en la

computadora.

2.1.3. Material

Para el desarrollo de esta práctica/taller solo requerirás de una computadora con acceso

no restringido a la Internet. Si así lo deseas puedes usar tu computadora, pero se

dispondrá de un aula con computadoras en el Departamento de Información Académica

(DIA).

2.1.4. Desarrollo

Asignación de los pares cromosómicos de un cariotipo humano normal

1. Ingresa a la página de Internet de la Universidad de Utah (http://learn.genetics.utah.edu/content/begin/traits/karyotype) en la que se representa en forma gráfica un cariograma de bandas G para humano.

2. Coloca el cursor sobre cualquiera de los cromosomas que se te presentan al lado izquierdo de la página. Comparando el tamaño, la forma y el patrón de bandas G del cromosoma problema, arrástralo y llévalo hasta alguno de los cromosomas que no tienen pareja. Si tu elección es correcta, el simulador te permitirá dejar el cromosoma en esa posición y tomar uno nuevo, de lo contrario deberás corregir la elección.



Interpretación de patrones cromosómicos anormales en humanos

1. Ingresar a la página de Internet de la Universidad de Arizona (http://www.biologia.arizona.edu/human/act/karyotyping/karyotyping.html) en la que se representa en forma gráfica un cariograma de bandas G para humano.

2. Compara el tamaño, la forma y el patrón de bandas G del cromosoma problema y selecciona a cual de los cromosomas que no tienen pareja corresponde. Para ello solo deberás dar un toque sobre el número señalado en color azul debajo del cromosoma que hayas elegido.

3. Si tu elección es correcta, el simulador te permitirá avanzar, de lo contrario deberás corregirla.

4. Interpreta los resultados del cariotipado usando como base los diagnósticos de las tablas que se presentan al final de cada ejercicio.




El alumno entregará el reporte de práctica con el siguiente cuestionario:

1. Investiguen y describan brevemente al menos otros dos métodos de tinción, diferentes al de bandas G, empleados para el análisis de genotipos.

2. ¿En qué consiste el método de hibridación fluorescente in situ (FISH)?

3. Investiguen de que forma se ha logrado manipular el juego de cromosomas en peces para obtener triploides (p.e. trucha arcoiris)


1. Liga a la página electrónica de la Universidad de Utah.

http://learn.genetics.utah.edu/content/begin/traits/karyotype (consultada el 03

de mayo de 2012).

2. Liga a la página electrónica de la Universidad de Arizona.

www.biologia.arizona.edu/human/act/karyotyping/karyotyping.html (consultada

el 03 de mayo de 2012).

3. Pineda-Santis, H., J.E. Jaramillo-Pino, D.M. Echeverri-Echeverri y M. Olivera-Angel.

2004.Triploidía en trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss): posibilidades en Colombia.

Rev Col Cienc Pec 17(1): 45-52



2.2. Extracción y cuantificación de ADN


El ácido desoxiribonucleico (DNA) es la molécula que guarda el código genético de todas las células. El DNA genómico total de la célula eucariota incluye tanto al ADN nuclear (organizado en forma de cromosomas y contenido dentro de la membrana nuclear), al ADN mitocondrial (localizado dentro de la mitocondria), así como el ADN plastídico (ubicado dentro del cloroplasto) en el caso de las células vegetales. Por su parte, en la célula procariotas, el ADN se encuentra tanto en forma de cromosoma como en forma de ADN extracromosomal (plasmídico).

Aunque todas las células de todos los tejidos del organismo tienen exactamente el mismo ADN, tanto la cantidad como la calidad de su extracción varían considerablemente en función de las características bioquímicas y fisiológicas de cada tejido, así como del tiempo y el método de preservación que se hayan empelado.

2.2.1.1. Extracción y purificación de ADN

Si bien existen diversos protocolos para la preparación de las muestras y la extracción de ADN, en todos ellos pueden distinguirse una serie de pasos generales, fundamentados en las propiedades fisicoquímicas de la célula y de las biomoléculas que la conforman. En general, un protocolo de extracción incluye la preservación de los tejidos, la liberación de los ácidos nucleicos a partir de estos, su purificación o aislamiento (tanto de otras biomoléculas como de otros tipos o variedades de ácido nucleico) y la estabilización o protección final del ADN para su almacenamiento y posterior análisis.

2.2.1.2. Evaluación de la cantidad y la calidad del ADN por electroforesis

La electroforesis es un método en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica. Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta es colocada en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posea la carga opuesta; las moléculas con carga neta positiva se desplazarán hacia el polo negativo y aquellas con carga neta negativa lo harán hacia el polo positivo.

El movimiento de las moléculas esta gobernado también por otras dos fuerzas; la fricción y la difusión. La velocidad de migración electroforética depende de la densidad de carga de la molécula (relación carga / peso), del voltaje aplicado y de la concentración (porosidad) de la matriz de gel. El voltaje no se puede



incrementar indiscriminadamente porque se genera un excesivo calor, pero al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre separación por causa de la difusión.

Una vez que hayan completado la separación electroforética de los fragmentos de DNA contenidos en sus muestras, podrán visualizarlos usando un marcador específico para el ADN (p.e. bromuro de etidio, SyberGreenTM). Paralelamente, determinarán su tamaño al contrastarlo con un marcador estándar que contiene fragmentos lineares de longitud conocida (escalera de ADN).

Una concentración alta de ADN se refleja en un brillo intenso en el gel, mientras que las concentraciones muy bajas no permiten evidenciar la presencia de este. Por su parte, el ADN de alta calidad presenta tamaños moleculares relativamente grandes (>10,000 pares de bases), pero diversos factores puede alterar su integridad, degradándolo en fragmentos cada vez más pequeños.

2.2.1.3. Cuantificación del ADN por espectrofotometría

La determinación precisa de la cantidad del ADN que lograron obtener en su muestra la harán por espectrofotometría. Como ustedes ya lo saben, la espectrofotometría es un método analítico fundamentado en evaluación de la interacción entre las radiaciones electromagnéticas y las moléculas, medidas a través de la absorción o la transmisión de luz de las sustancia en cuestión.

De acuerdo con el tipo de radiación o luz empleada, la espectrofotometría puede ser de absorción visible (colorimetría), ultravioleta o infrarroja. La principal aplicación de la espectrofotometría en el campo de la biología molecular y la genética, es el análisis cuantitativo de ácidos nucleicos y proteínas.

Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas o nucleotidos, cada una de las cuales tiene su propio y único espectro de absorción (dGTP: 255 nm; dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247 nm) y por lo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de una molécula de ADN (~260 nm). La espectrofotometría proporciona una estimación simple y precisa de la concentración de ADN cuando este se encuentre relativamente puro, sin contaminación significativa de proteínas o solventes orgánicos que absorben a longitudes de onda similares.



2.2.2. Objetivo

Extraerán ADN a partir de diferentes tejidos de algún organismo de interés en

acuacultura (p.e. microalgas, macroalgas, moluscos, crustáceos o peces).

2.2.2.1. Extraerán ADN mediante la técnica de Fenol-Cloroformo

2.2.2.2. Evaluarán el ADN purificado mediante electroforesis en gel de agarosa

2.2.2.3. Cuantificarán el ADN purificado por espectrofotometría

2.2.3. Material

2.2.3.1. Materiales

Tejido de organismos congelados, vivos o preservados en etanol al 95%.

Muestras de DNA como control positivo o negativo

Guantes de nitrilo

Charola de disección

Papel secante

Marcador indeleble de punto fino

Navajas estériles o equipo de disección

Pistilos o palillos estériles.

Tubos de microcentrífuga de 1.5 mL.

Cajas pétri estériles o papel aluminio para pesar tejido

Pipeteador automático de 1000 µl.

Puntas estériles para pipeteador automático de 1000 µl.







Recipientes y bolsas para desecho de material con fenol-cloroformo

Cinta adhesiva

Papel Parafilm

Bolsas para desechos de BrEt

Matraz Erlenmeyer 100 mL

Probeta de 50 mL

Magneto

Navecillas para pesar

Cubetas o celdas de 3 mL para espectrofotómetro.

2.2.3.2. Instrumental

Balanza analítica

Microcentrífuga

Vórtex

Baño María u horno de incubación a 55 °C

Campana de extracción

Espectrofotómetro UV-Vis

Sistema de electroforesis horizontal (Cámara, peine, casette y fuente de poder)

Plancha de calentamiento con agitación

Transiluminador

Sistema fotodocumentador para geles de agarosa

Hielera

2.2.3.3. Reactivos

Fenol:cloroformo:isoamílico (25:24:1)

Isopropanol 99% grado molecular (2-propanol)

Etanol 70% grado molecular

Amortiguador de lisis SNET (Tris-HCl 20mM pH8.0, EDTA 5mM, NaCl 400mM, 1% SDS)

Proteinasa K [10mg/mL]

RNAsa [10mg/mL]

Manual de Prácticas de Laboratorio de [MATERIA] [UNIDAD I] Página 37

[Dra. Ivone Giffard-Mena, Dr. Luis Enríquez-Paredes Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Amortiguador TE 0.1X (Tris-HCl 1mM pH 7.5, EDTA 0.1 mM)

Etanol 70% grado reactivo (para limpieza y desinfección)

Agarosa

Amortiguador de carga LB 6X. (Azul de bromofenol 0.25%, Xileno cianol FF 0.25%, Sacarosa 40% )

Amortiguador TBE 0.5X (Tris-HCl 50mM, Ácido Bórico 45mM, EDTA 0.5mM) para electroforesis.

Marcador de peso molecular

Bromuro de Etidio [10 mg/ml]

Hielo

Hielo seco

2.2.4. Desarrollo

Extracción de ADN

PRECAUCIÓN: El fenol y cloroformo son solventes orgánicos irritantes y neurotóxicos, por lo que deberán de trabajar con ellos en la campana de extracción y disponer en recipientes especiales todas las puntas y tubos que hayan sido impregnadas con estos solventes.

5. Pesen aproximadamente 30 mg de tejido y transfiéranlo a un tubo estéril de microcentrífuga. Manténganlo en hielo.

6. Adicionen 300 µl de amortiguador de lisis SNET, 3 µL de proteinasa K [10mg/m] y 2 µL de RNAsa [10mg/mL) .

7. Homogenicen con un pistilo estéril el tejido hasta disgregarlo, asegúrense de cerrar perfectamente el tubo e incúbenlo a 55 °C durante 30-45 min con agitación.

8. Centrifuguen el tubo por 5 min a 11,000 x g. Si la centrífuga que están usando tiene unidades RPM (revoluciones por minuto), usen una tabla de conversión para ajustar la velocidad (Anexo 4).

9. Transfieran el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio y añadan un volumen (≈0.3 mL) de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1).

10. Agiten vigorosamente usando el vórtex a velocidad alta durante 15 s.

11. Centrifuguen 5 min a 11,000 x g para separar la fase acuosa de la orgánica.

12. Transfieran el sobrenadante (fase acuosa) a un tubo de microcentrífuga limpio y añadan un volumen (≈0.3 mL) de isopropanol.



13. Asegúrense que el tubo este perfectamente cerrado y mezclen por inversión unas 5 veces antes de incubarlos por 10 min a -70°.

14. Centrifuguen a 13,250 x g durante 15 min.

15. Eliminen el isopropanol por decantación teniendo precaución de no perder el precipitado de ADN.

16. Agreguen 0.5 mL de etanol al 70% frío para lavar el precipitado y centrifuguen por otros 5 min a 13,250 x g.

17. Descartar el etanol al 70% por decantación y colocar los tubos con la boca hacia abajo sobre papel secante durante 15 min.

18. Dejen que el ADN se resuspenda en 30 l de amortiguador TE 0.1X (T°A 6-12 h).

19. Almacenar a -20 °C.

Evaluación de la calidad del ADN por medio de electroforesis en agarosa

PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un reactivo mutagénico, por lo que deberán usar los guantes en todo momento y manejarlo con cuidados extremos. Los guantes y todo el material que entre en contacto con el bromuro debe disponerse en contenedores especiales. No depositen estos materiales en los botes de basura de uso común y no laven en el laboratorio los matraces en los que hayan usado bromuro.

1. En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, mezclen 0.45 g de agarosa en 30 ml de amortiguador TBE 0.5X.

2. Disolver la agarosa lentamente en una plancha con agitación magnética y

temperatura hasta completar la disolución. La agitación debe ser constante y deben esperar a que el líquido sea translúcido, sin rastro de partículas sólidas. Dejen que llegue a su punto de ebullición pero eviten que se derrame la agarosa.

3. Retiren el matraz de la plancha magnética y apáguenla. Es importante que enfríen

la agarosa hasta alcanzar unos 55°C pero evitar que solidifique. 4. Mientras la agarosa se enfría, preparen la charola para el vaciado del gel y la

cámara de electroforesis siguiendo las instrucciones del docente.



5. Cuando la agarosa se encuentre aproximadamente a 50°C, coloquen el matraz dentro de la campana de extracción y agreguen con mucha precaución 1.5 µl BrEt [10 mg/ml].

6. Mezclen suavemente para homogeneizar el bromuro y viertan la agarosa en la

charola sobre una superficie completamente plana. Coloquen inmediatamente el peine y dejar solidificar durante 15 minutos.

7. Retiren el peine y los sellos (gomas o cinta adhesiva) de la charola y colóquenla

dentro de la cámara de electroforesis. 8. Coloquen amortiguador TBE 0.5X en la cámara de electroforesis hasta cubrir

completamente el gel. 9. Coloquen 1 µL de amortiguador de carga LB 6X sobre papel Parafilm y mézclenlo

con 5 µL de su muestra de ADN. Tomen 5.5 µL con el pipeteador automático y depositenlos dentro de alguno de los pozos del gel de agarosa. Eviten tocar el gel pero asegúrense que la punta del pipeteador rompa la superficie del líquido antes de vaciar la muestra en el pozo.

10. Registren el orden en el que colocaron sus muestras, tapen y conecten la cámara

de electroforesis a la fuente de poder y lleven a cabo la electroforesis a 100 V por 30 min.

11. Una vez que haya concluido la electroforesis, apaguen la fuente de poder, retiren

la charola con el gel y transpórtenla cuidadosamente hasta el fotodocumentador de geles para llevar a cabo el registro fotográfico.

Cuantificación del ADN por espectrofotometría

RECOMENDACIÓN: Independientemente del tipo de espectrofotómetro que este disponible, la cantidad de ADN se estima con base en la absorbancia de estas moléculas en el espectro de luz ultravioleta. Si usan el NanoDrop®, es muy importante que revisen el boletín técnico acerca de las razones de absorción a las diferentes longitudes de onda (Anexo 5). Esto les ayudará a interpretar más fácilmente sus resultados.

1. Descongelen y mezclen sus muestras de ADN por pipeteo. Manténganlas a 4°C. Si la concentración aparente obtenida en la electroforesis es alta, efectúen un par de diluciones 1:10 y 1:25 con TE 0.1X en tubos limpios.



2. Limpien cuidadosamente los sensores en el pedestal y en la base del Nanodrop usando agua destilada esterilizada y un pequeño recorte de toalla de papel Kinwipes®

3. Ingresen al programa del equipo en la computadora (ND-1000) y seleccionen la aplicación correspondiente para evaluar ácidos nucleicos/DNA.

4. Inicien la calibración del aparato con la lectura de la muestra blanco (TE 0.1X)

5. Tomen 1.5-2.0 µL de su muestra y deposítenlos directamente sobre el sensor del

Nanodrop, teniendo el cuidado de no tocarlo con la punta de la pipeta.

6. Bajen suavemente el pedestal, registren los datos de la muestra en la computadora y seleccionen la opción para la lectura de la muestra (MEASURE).

7. Es importante que limpien a conciencia los sensores entre cada lectura para obtener resultados confiables. Pueden verificar la precisión del aparato repitiendo algunas de las mediciones.

8. Aunque la computadora genera un reporte con los datos de todas las lecturas efectuadas, registren en su manual la concentración de ADN, así como los valores obtenidos para las diferentes longitudes de onda (260, 280 y 230 nm) y razones (260/280, 260/230).


El alumno entregará el reporte de práctica con el siguiente cuestionario.

1. ¿Cuál es la concentración final de Proteinasa K en la mezcla de lisis y cuál es siu función?

2. ¿Cuál es la ventaja de resuspender el ADN en TE y no en agua?

3. Investiguen y describan brevemente la manera en que interactúa el bromuro de etidio con la cadena de ADN y que nos permite visualizarlo.

4. ¿En qué se basa la determinación espectrofotométrica de la pureza del ADN?




Escorza, S., C.A. Lux, A.S. Costa. 1997. Methods of DNA Extraction: from Initial Tissue Preservation to Purified DNA Storage. In Molecular Genetics of Marine Mammals (Special Publication 3). A.E. Dizon, S.J. Chivers, W.F. Perrin (eds.) Society for Marine Mammology, Lawrence, KS. 87-106 p.

NanoDrop® Technical Support Bulletin T009. 2010. 260/280 and 260/230 ratios for NanoDrop® ND-1000 and ND-8000 8-Sample.

Sambrook, J. y W.D. Russell. 2006. The condensed protocols from molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 800 pp.

Strauss, W.M. 1994. Preparation and analysis of DNA. In Current Protocols in Molecular Biology. K. Janssen (ed.) John Wiley & Sons Inc., New York. 2.2.1–2.2.3

Zyskind J.W. y S.I. Bernstein. 1992. Recombinant DNA laboratory manual. Academic Press. San Diego, California. 187 pp.

.



2.3. Extracción y cuantificación de ARN


El ARN es el ácido nucleico más abundante en las células y se presenta en diferentes tamaños y conformaciones estructurales. Juega un papel biológico de suma importancia como intermediario en la síntesis de proteínas y es la base para el estudio del transcriptoma y la fisiología de la célula a nivel molecular.

Por su estructura química el RNA se hidroliza más facil que el DNA y por lo tanto es más susceptible a la degradación. Además, las enzimas que degradan el RNA (RNAasas) son enzimas muy estables y resistentes, por lo que resulta difícil deshacerse de ellas. Por lo anterior, es de gran relevancia que aprendan el protocolo para extraerlo, aislarlo y preservarlo adecuadamente.

2.3.1.1. Extracción y purificación de ARN.

El método más comúnmente usado para la extracción de RNA se basa en una extracción sucesiva con tiocianato de guanidina-fenol-cloroformo. En principio el método es similar a todos los protocolos de extracción de ácidos nucleicos; deben disgregar el tejido, romper las células y aislar, aprovechando sus propiedades fisico-químicas, el ácido nucleicos del resto de las biomóleculas (lípidos, carbohidratos y proteínas).

El TRIzol® es un producto comercial que simplifica la extracción del RNA, usando los mismos reactivos que el método antes mencionado, pero reduciendo significativamente el tiempo y el número de pasos intermedios. Sin embargo, el uso extendido de este producto se debe más al hecho de que los reactivos son purificados bajo controles de calidad extremos para garantizar la ausencia de contaminación con RNAsas y cuidando al máximo el pH de las soluciones empleadas.



2.3.1.2. Evaluación de la cantidad y calidad del ARN por electroforesis y

espectrofotometría.

Al igual que para el ADN, realizarán la evaluación de la integridad y la cantidad de

ARN obtenido mediante electroforesis en agarosa y espectrofotometría.

2.3.2. Objetivo

Extraer ARN a partir de diferentes tejidos de algún organismo de interés en acuacultura

(p.e. microalgas, macroalgas, moluscos, crustáceos o peces)

2.3.2.1. Extraer ARN mediante la técnica de TRIzol.

2.3.2.2. Evaluar el ARN purificado mediante electroforesis en gel de agarosa.

2.3.2.3. Cuantificar el ARN purificado por espectrofotometría.

2.3.3. Material

2.3.3.1. Materiales

Tejido de organismos vivos, congelados (-70 °C) o preservados en Etanol 95%

Guantes de nitrilo

Charola de disección

Recipientes con hielo (hieleras)

Papel secante

Marcador indeleble de punto fino

Navajas estériles o equipo de disección tratado con DEPC

Pistilos o palillos estériles tratado con DEPC

Tubos de microcentrífuga tratados con DEPC

Cajas pétri estériles o papel aluminio para pesar tejido

Pipeteadores automáticos de 100-1000 µl



Puntas estériles para pipeteador automático de 100-1000 µl

Pipeteadores automáticos de 20-200 µl

Puntas estériles para pipeteador automático de 20-200 µl

Pipeteadores automáticos de 0.5-10 µl

Puntas estériles para pipeteador automático de 0.5-10 µl

Recipientes y bolsas para desechar el material punzo-cortante, los solventes orgánicos (trizol y cloroformo y los residuos contaminados con bromuro de etidio (geles de agarosa).

Magnetos

Hielera


Balanza analítica

Microcentrífuga refrigerada

Vórtex

Campana de extracción

Espectrofotómetro UV-Vis

Sistema de electroforesis horizontal (Cámara, peine, charola y fuente de poder)

Plancha de calentamiento con agitación

Transiluminador

Sistema fotodocumentador para geles de agarosa

2.3.3.3. Reactivos

Peróxido de hidrógeno al 3%


almacenado a -20°C


almacenado a -20°C

Isopropanol 99% grado

molecular (2-propanol)

Cloroformo 99% grado

molecular

TRIzol ® (Invitrogen)



Acetato de sodio 3M pH 4.0

Amortiguador “”High Salt Buffer” (NaCl 0.3M, Tris-HCl 20mM pH 7.6, EDTA 10mM EDTA, 1% SDS)

Alcohol 70% grado reactivo

para limpieza y desinfección

Agua PPi estéril (Libre de

fosfatos)

Agua tatada con DEPC (Di-

Etil- PiroCarbonato)

Agua destilada estéril (H2Ode)

Agarosa

6X Amortiguador de carga.

(Azul de bromofenol 0.25%,

Xileno cianol FF 0.25%,

Sacarosa 40 % )

Amortiguador TBE 1X (Tris-HCl 100mM, Ácido Bórico 90mM, EDTA 1mM) para electroforesis.


Bromuro de Etidio [10

mg/ml]

2.3.4. Desarrollo

Extracción de ARN

PRECAUCIÓN: Para evitar la potencial contaminación y degradación del ARN, todos los materiales y reactivos que se utlizan en la extracción de RNA deberán haber sido tratados o preparados con agua DEPC (DiEtil-PiroCarbonato al 0.1%) que inactiva las RNAsas. Aunque este reactivo es extremadamente tóxico, el material y reactivos tratados con DEPC se esterilizan durante 30 minutos a 120°C para desactivar el DEPC. El uso de guantes limpios en todo momento, más que protegernos de la toxicidad del DEPC, es requerido para que el material y el área de trabajo se mantengan limpias y libres de RNAsa.

El Trizol es muy tóxico, por lo que deben trabajarlo en la campana de extracción y disponer en recipientes especiales todo el material (tubos y puntas) que hayan estado en contacto con este reactivo.

RECOMENDACIÓN: Para reducir el riesgo potencial de degradación por RNAsas, mantengan los tubos en hielo a menos que se les indique lo contrario.

Manual de Prácticas de Laboratorio de Genética Acuícola [UNIDAD II] Página 46


1. Pesen 50 mg de tejido y trasfiéranlo a un tubo de microcentrífuga tratado con DEPC. Mantengan el tubo en hielo todo el tiempo.

2. Agreguen al tubo con el tejido 5 volúmenes de TRIzol (~250 µL de TRIzol por cada

50 mg de tejido) y homogenicen el tejido con un pistilo estéril tratado con DEPC (o bien sobre un portaobjetos con una navaja estériles tratados con DEPC).

3. Añadan un volumen igual de TRIzol (~250 µL) para obtener una relación final de

1:10 p/v entre el tejido y el reactivo.

4. Incuben el homogenizado durante 15 min en cama de hielo y con agitación constante.

5. Añadir 1/5 de volumen de cloroformo (~100 µL de cloroformo por cada 500 µL

de TRIzol) y agiten vigorosamente en el vórtex por 15 s. 6. Incuben los tubos temperatura ambiente durante 2 min. 7. Centrifuguen a 4°C por 15 min a una velocidad de 12,000 x g para separar las

fases orgánica y acuosa. 8. Transfieran la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga estéril y tratado con

DEPC. Es muy importante evitar acarrear restos de la capa subyacente, por lo que es mejor recuperar tan solo un 80-90% del volumen de la muestra.

9. Añadan 250 µL de isopropanol frio al 99% (~250 µL por cada 5001 µL de TRIzol

empleado) y agiten vigorosamente en el vórtex durante 10 s. 10. Incuben la mezcla a temperatura ambiente durante 10 min. 11. Centrifuguen a 13,000 x g durante 20 min a 4 °C.. 12. Decanten cuidadosamente el sobrenadante para no despegar el precipitado de

ARN que se forma en el fondo del tubo. 13. Agreguen 0.5 mL de etanol frío al 75% para lavar el precipitado. En este paso es

recomendable despegar el precipitado golpeando suavemente el fondo del tubo. 14. Centrifuguen nuevamente a 12,000 x g a 4 °C por otros 5 min. 15. Decanten el etanol y eliminen cualquier exceso del mismo con ayuda de una

pipeta, pero tratando de no disgregar o despegar el precipitado de ARN.



16. Secar el pellet a temperatura ambiente por 10 min con tapa abierta. 17. Agreguen 50 µL de H2O PPi al precipitado de ARN, tapen bien el tubo e incuben a

temperatura ambiente durante 20 min. 18. Almacenen la muestra a -70 °C.

Evaluación de la calidad del ARN por medio de electroforesis en agarosa

PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un reactivo mutagénico, por lo que deberán usar los guantes en todo momento y manejarlo con cuidados extremos. Los guantes y todo el material que entre en contacto con el bromuro debe disponerse en contenedores especiales. No depositen estos materiales en los botes de basura de uso común y no laven en el laboratorio los matraces en los que hayan usado bromuro.

1. Sigan el protocolo para la preparación de geles de agarosa de la práctica de Extracción de ADN (ver Sección 2.2.1.2). Tengan en cuenta que la única modificación entre ambos protocolos será la concentración del amortiguador de electroforesis y las condiciones voltaje de la corrida electroforética.

2. Usar amortiguador TBE 1X para preparar el gel y llenar la cámara de

electroforesis. 3. Realicen la electroforesis a 70 V por 50 min. 4. Transporten cuidadosamente su gel hasta el fotodocumentador de geles,

visualicen el gel en el transiluminador y obtengan el registro fotográfico.

Cuantificación del ADN por espectrofotometría

RECOMENDACIÓN: Independientemente del tipo de espectrofotómetro que este disponible, la cantidad de ADN se estima con base en la absorbancia de estas moléculas en el espectro de luz ultravioleta. Si usan el NanoDrop®, es muy importante que revisen el boletín técnico acerca de las razones de absorción a las diferentes longitudes de onda (Anexo 5). Esto les ayudará a interpretar más fácilmente sus resultados.



1. Descongelen y mezclen sus muestras de ARN por pipeteo y manténganlas a 4°C. Si la concentración aparente obtenida en la electroforesis es alta, efectúen un par de diluciones 1:10 y 1:25 con agua PPi estéril en tubos limpios.

2. Limpien cuidadosamente los sensores en el pedestal y en la base del Nanodrop usando agua destilada esterilizada y un pequeño recorte de toalla de papel Kinwipes®.

3. Ingresen al programa del equipo en la computadora (ND-1000) y seleccionen la aplicación correspondiente para evaluar ácidos nucleicos/RNA.

4. Inicien la calibración del aparato con la lectura de la muestra blanco (H2O PPi).

5. Procedan de la misma forma que para la lectura de las muestras de ADN en el espectrofotómetro (ver Sección 2.2.1.3).

Método de Evaluación

El alumno entregará el reporte de la práctica complementado con el siguiente

cuestionario:

1. ¿Cuáles son las proporciones de los diferentes tipos de ARN en las células?

2. ¿Qué objeto tiene la adición opcional de acetato de sodio y el amortiguador

“High Salt Buffer” en la extracción del ARN?

3. ¿Qué problema se podría presentar si la centrifugación no se lleva a cabo a 4°C?

4. ¿Cuál es la importancia de tratar el material con DEPC?

5. ¿Por qué comúnmente se recomienda llevar a cabo la electroforesis de ARN un

gel de agarosa desnaturalizante?


1. Sambrook, J. y W.D. Russell. 2006. The condensed protocols from molecular

cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New

York. 800 pp.

2. Página de Internet de la hoja de seguridad del reactivo TRIzol Invitrogen Inc.

https://tools.invitrogen.com/content/sfs/msds/2012/15596018_MTR-

NALT_MS.pdf (consultada el 25 de agosto de 2007)



3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)




Propósito General de las Prácticas de la Tercera Unidad

La reacción en cadena de la DNA polimerasa (PCR por siglas en inglés; Polymerase Chain

Reaction) es una forma simple y particularmente rápida de amplificar la cantidad de ADN

presente en cualquier tipo de muestra biológica. Mediante esta reacción, que reproduce el

proceso de duplicación del ADN en la célula, se generan millones de copias de una sección

específica del ADN que posibilitan la manipulación y la realización de una gran cantidad de

ensayos con el fragmento amplificado. Este método fue desarrollado por el químico Kary B.

Mullis, quien ganó por sus trabajos el premio Nobel de química en 1993. La tecnología del PCR

ha revolucionado la investigación y el diagnóstico en muchos campos de la biología.

Hoy en día la PCR es un protocolo estándar y el primer paso para la gran mayoría de los ensayos

o técnicas relacionados con la biología celular a nivel molecular, los estudios del genoma y el

trascriptoma, así como para el diseño y uso de marcadores genéticos.

Debido a la relevancia y al extendido uso de esta técnica en todas las disciplinas biológicas, es

indispensable que como biotecnólogos en acuacultura aprendan a llevar a cabo la amplificación

por PCR usando un protocolo estándar y que reconozcan la gran variedad de estrategias y

aplicaciones que tiene esta técnica.



3.1. PCR de punto final


La PCR amplifica un segmento específico del ADN a través de una serie de pasos cíclicos

que incluyen la desnaturalización de la doble cadena de DNA, la incorporación de los

cebadores y la síntesis de nuevas cadenas de ADN a partir de la cadena original.

Una de sus aplicaciones más relevantes en el campo de la acuicultura es el diagnóstico

patológico microbiológico. A través de la PCR pueden detectase directamente, en

diferentes tipos de muestras, patógenos tradicionalmente difíciles de cultivar y/o

aquellos que requieren de largos períodos para su desarrollo in vitro y/o que se

encuentra en muy baja concentración en los líquidos biológicos. En esta práctica,

usarán esta técnica para detectar la presencia de uno de los patógenos con mayor

impacto en la producción acuícola del camarón; el virus del síndrome de la mancha

blanca (WSSV).

Mediante un par de cebadores específicos que reconocen y amplifican una porción del

gen que codifica para la proteína de la cápside viral VP28 (~450 pares de bases) y otro

par de cebadores específico para un gen que codifica la proteína ribosomal L8 del

camarón (~700 pares de bases), podrán distinguir una muestra infectada de una no

infectada y evaluar la posible ocurrencia de falsos positivos y falsos negativos.

3.1.2. Objetivo

Utilizar la reacción en cadena de la polimerasa como herramienta de diagnóstico para

identificar la ausencia/presencia de virus de la mancha blanca en camarones sanos e

infectados.



3.1.2.1. Identificarán los componentes básicos de la reacción de PCR y aprenderán a

interpretar un perfil de amplificación

3.1.2.2. Elaboraran el conjunto de reacciones de PCR y su correspondiente evaluación por

electroforesis en agarosa, que les permitirá realizar un diagnostico confiable de la

infección con virus de la mancha blanca (WSSV) en camarón blanco.

3.1.2.3. Realizarán una investigación sobre las variantes más comunes de la reacción de

PCR y sus principales aplicaciones.

3.1.3. Material

3.1.3.1. Materiales

ADN extraído previamente

(camarón, almeja, pez)

Guantes de nitrilo

Charola con hielo

Papel secante

Marcador indeleble de punto

fino

Tubos para PCR (0.2 mL-0.5

mL)

Tubos de microcentrífuga

estériles (0.5 mL)

Pipeteador automático de

100 µl

Puntas estériles para

pipeteador automático de

100 µl

Pipeteador automático de 10

µl


pipeteador automático de 10

µl

Cinta adhesiva

Papel Parafilm

Bolsas para desechos de BrEt.

Matraz Erlenmeyer 250 mL

enjuagado con alcohol

Probeta de 50 mL enjuagada

con alcohol

Navecillas para pesar

estériles


[NOMBRE DEL RESPONSABLE] Facultad de Ciencias Marinas de la UABC


Microcentrífuga

Vórtex

Termociclador

Sistema de electroforesis

horizontal (cámara, peine,

casette y fuente de poder)

Plancha de calentamiento

con agitación magnética.

Balanza analítica

Transiluminador

Sistema fotodocumentador

para geles de agarosa.

3.1.3.3. Reactivos

Alcohol 70% grado reactivo

para limpieza

Agua destilada estéril (H2Ode)

Agarosa (0.3 g)

Buffer LB 6X. (Azul de

bromofenol BB 0.25%, Xileno

cianol XC 0.25%, Sacarosa 40

%)

TBE 0.5X (Tris-HCl 50mM,

Ácido Bórico 45mM, EDTA

0.05 mM pH 8.0)


(100 pb APeX)

Bromuro de Etidio [BrEt 10

mg/mL]

Diluciones de ADN (35 ng/µL)

de camarón infectado (S1) y

camarón sano (S2)

Cebador WSSVF [10 µM]

Cebador WSSVR [10 µM]

Cebador LvL8F [10 µM]

Cebador LvL8R [10 µM]

Buffer para PCR (10X)

MgCl2 (25 mM)

Mezcla dNTPs (10 mM)

Enzima DNA Taq Polimerasa

[1 U/µL]

Agua PPi (Libre de fosfatos)

Manual de Prácticas de Laboratorio de [MATERIA] [UNIDAD II] Página 54

[Dra. Ivone Giffard-Mena, Dr. Luis Enríquez-Paredes] Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

3.1.4. Desarrollo

Identificación de los componentes de la reacción de PCR

1. Descongelen los tubos de los componentes para la reacción de PCR, mezclen por inversión un par de veces y centrifuguen brevemente. Mantengan los reactivos en el hielo mientras preparan las reacciones.

2. Identifiquen cada componente de la reacción y mediante la analogía con la construcción de una barda y los siguientes elementos participantes: ladrillos, albañiles, comida, estado del tiempo, planos, arquitectos; discutan el papel que desempeña cada reactivo en la mezcla de PCR. Así como cada uno de los elementos y participantes en la construcción de la barda es crítica para que se concluya la obra, los componentes de la reacción son indispensables para que se lleve a cabo la síntesis de ADN.

Preparación de la reacción de PCR

PRECAUCIÓN: Los tubos y puntas deben estar estériles para evitar contaminación cruzada con residuos de otro ADN y la degradación por parte de las DNAsas. Tengan mucho cuidado de no contaminar los reactivos por usar la misma punta dos veces; cambien de punta cada vez que tomen un reactivo nuevo o cuando no tengan la seguridad de que se encuentre limpia.

RECOMENDACIONES: De ser posible trabajar en una estación de PCR o en una campana de flujo laminar equipada con sistema de luz UV para evitar contaminación. Los reactivos que se emplean para la PCR son extremadamente costos y sensibles a los cambios de temperatura. Ya que una de las potenciales fuentes de contaminación de sus reactivos es el mismo ADN que estarán usando, las muestras de ADN y los reactivos deben mantenerse en hielo y en recipientes separados. Adicionalmente, se recomienda ampliamente que los cebadores y el ADN sean, respectivamente, el penúltimo y el último componente que añadan a la reacción.

1. Antes de mezclar los componentes, revisen la concentración a la que se encuentra cada uno de ellos y verifiquen los cálculos de los volúmenes que agregarán para obtener las concentraciones finales requeridas. Retomando la analogía de la barda, discutan lo que pasaría si los elementos no se encuentran en las cantidades necesarias.

2. Incorporen en un tubo para microcentrífuga de 0.6 mL, uno a uno, los componentes necesarios para el número de reacciones que planeen preparar. Para el caso particular de esta práctica, cada equipo deberá preparar suficiente mezcla para 4 reacciones: la muestra de camarón infectado (positivo), la muestra de camarón sano (negativo para WSSV), el control negativo de reacción (sin ADN, esta se reemplaza por agua esterilizada) y una reacción adicional para asegurar una cantidad suficiente en caso de algún error de pipeteo.



3. Se les recomienda agregar los componentes, excluyendo el ADN, en el orden especificado en la siguiente tabla:

4. Tapen bien el tubo de la mezcla de reacción, homogenicen por inversión y centrifuguen brevemente.

5. Etiqueten adecuadamente tres tubos para PCR y coloquen en cada uno de ellos 24 µL de la mezcla de reacción. Tapen todos los tubos y procedan a agregar el ADN correspondiente a los tubos S1 (camarón infectado) y S2 (camarón sano), así como agua al tubo C- (control negativo de reacción). Centrifuguen los tubos brevemente.

6. Programen el perfil de amplificación que se detalla en la siguiente tabla en el termociclador, coloquen los tubos y verifiquen que se encuentren correctamente cerrados antes de iniciar el programa.

7. Al finalizar el programa, retiren los tubos del termociclador, registren el uso del equipo en la bitácora correspondiente y almacenen los tubos en el congelador a -20°C para su posterior evaluación por electroforesis en agarosa.

Componente Volumen Concentración Final

H2OPPi esterilizada 14.8 µL

Solución Amortiguadora para PCR 10X 2.5 µL Tris-HCl 20mM pH 8.4

KCl 50mM

MgCl2 25 mM 1.5 µL 1.5 mM

dNTP’s 2.5 mM 2.2 µL 0.22 mM

Taq DNA Polimerasa 1.0 µL 1 U

Cebador WSSVF 10 µM 0.5 µL 0.2 µM

Cebador WSSVR 10 µM 0.5 µL 0.2 µM

Cebador LvL8F 10 µM 0.5 µL 0.2 µM

Cebador LvL8R 10 µM 0.5 µL 0.2 µM

Muestra DNA (35 ng/µl) 1.0 µL 10 ng

Volumen Final 25.0 µL

Ciclos Etapa T emperatura (°C) Tiempo

1 X Desnaturalización inicial 94 4 min

25 X

Desnaturalización 94 30 s

Alineamiento 52 30 s

Extensión 70 30 s

1 X Extensión final 72 5 min



Diagnóstico de la infección con base en los patrones de amplificación evaluados

mediante electroforesis en agarosa

1. Peparen un gel de agarosa al 1.5% (0.45 g de agarosa en 30 mL de buffer TBE 0.5X) y 0.5 µg/mL de BrEt (ver Sección 2.2.1.2).

2. Carguen entre 5 y 7 µl de cada uno de los productos de PCR, mezclados con 2 µl de

amortiguador de carga LB 6x, en un pozo distinto del gel y 5 µl de marcador de peso molecular de 100 pb en otro de los pozos.

3. Lleven a cabo la separación de los productos de PCR a 85 V por 50 min. 4. Visualicen el gel en el transiluminador y documenten el patrón de bandas por medio

de un registro fotográfico. 5. Recordando que la banda de 450 pares de bases corresponde al gen viral y la de 700

pares de bases al gen del camarón, discutan de que forma se debería de interpretar cada uno de los siguientes casos:


El alumno entregará el reporte de práctica, el cual deberá incluir el siguiente cuestionario.

1. Mencionen dos ejemplos, distintos al diagnóstico de patógenos, en los que se utilice la PCR en acuacultura.

2. ¿Cuál es la diferencia entre un cebador específico y uno degenerado?

Muestra Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4 Caso 5 Caso 6

S1 450

700

700

450 450

700

S2

700

700

450 450

700

C-

700

450 450

700

450

700



3. Existe una técnica para el análisis de polimorfismos en el ADN que se denomina RAPDs, esta se basa en una reacción de PCR pero utiliza un solo cebador. Expliquen como es que se logra la amplificación del ADN en ausencia de un segundo cebador.


1. Mullis, K. 1990. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific

American 262 (4): 56-61.

2. Mullis, K. 1998. Dancing Naked in the Mind Field. Pantheon Books. New York. 18 pp.

3. Sambrook, J. y W.D. Russell. 2006. The condensed protocols from molecular

cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New

York. 800 pp.

4. Página de Internet de una animación del proceso de PCR. http://highered.mcgraw-

hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf (consultada el 23 de febrero de 2010)

5. Página de Internet de una animación del proceso de PCR.

http://www.scanelis.com/webpages.aspx?rID=679 (consultada el 23 de

febrero de 2010)

6. Página de Internet de una animación del proceso de PCR.

http://www.thehealthnews.org/news/06/08/02/pcr.html (consultada el 23

de febrero de 2010)



3.2. Principales variantes de la PCR


Como ya hemos revisado, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental que constituye la base de un gran número de protocolos con aplicaciones en la biología y ecología molecular. Una vez comprendida las bases base teóricas y prácticas de la PCR, es importante conocer la gran cantidad de tipos y variantes de la PCR convencional.

3.2.2. Objetivo

Identificar la amplia gama de tipos y variantes de la PCR convencional a través de una

investigación bibliográfica y discutir sus principales aplicaciones.

3.2.3. Material

Recursos de la Internet, libros y artículos científicos o de divulgación.

3.2.4. Desarrollo

1. A partir de la siguientes listas de tipos y variantes de la PCR, cada equipo seleccionará un elemento de cada lista:

2. El equipo realizará una investigación bibliográfica y preparará una breve exposición al

respecto (10 a 15 minutos) 3. Dicha presentación deberá enfocarse en el fundamento teórico de la técnica y en sus

principales aplicaciones en el campo de la genética acuícola

Lista A Lista B

PCR tiempo real PCR sustractivo

RACE-PCR PCR asimétrico

RT-PCR Touch-Down PCR

PCR múltiple Hot-Start PCR

PCR in situ PCR anidado




La presente práctica se evaluará con base en la calidad y claridad de la presentación, así

como en la habilidad de cada equipo para responder a los cuestionamientos de sus

compañeros y el docente.


1. Asuar, L. 2007. Guía prática sobre la técnica de PCR. En: L. Eguiarte, V. Souza e X. Aguirre (eds.) Ecología molecular. Instituto Nacional de Ecología, 574 p.

2. Griffin, H.G. y A.M. Griffin. 1994. PCR technology: current innovations. CRC Press,

Boca Raton, Florida, USA. 370 pp. 3. McPherson M.J. y S.G. Moller. 2000. PCR. BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK.

4. Sambrook, J. y W.D. Russell. 2006. The Condensed Protocols from molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New york. 800 p.



4. Proteínas




Propósito General de las Prácticas de la Cuarta Unidad

Las proteínas son cadenas de aminoácidos que conforman el grupo de biomoléculas más abundantes en la célula, llegando a representar hasta más del 50% del peso seco de estas. En función de la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica para cada proteína, existe un enorme potencial para que los 22 aminoácidos conocidos queden unidos formando cadenas peptídicas con diversas conformaciones espaciales.

En términos generales, el tamaño y la conformación estructural de las proteínas determinan su función o actividad. Si bien todas las células de un organismo tienen los mismos genes, estos se transcriben diferencialmente en cada tipo celular, permitiéndoles así el desempeño de funciones especializadas. Mientras ciertas proteínas funcionan básicamente como matrices de soporte o esqueleto de las diferentes estructuras celulares, la gran mayoría exhibe una mayor actividad al estar involucradas a todos los niveles en los distintos procesos metabólicos, estas son las llamadas enzimas.

El contenido proteico de las células dependerá del conjunto de genes que se encuentren activos o “encendidos” en un momento dado, lo que a su vez se da en respuesta a las señales que estas reciben de las células vecinas y del ambiente. Por lo tanto, como primera aproximación para evaluar los patrones de expresión de las proteínas en diferentes tejidos o bajo diferentes condiciones fisiológicas, llevarán a cabo la extracción y purificación parcial de las proteínas presentes en diferentes tejidos de organismos de importancia para la acuacultura, para finalmente evaluar la diversidad y la cantidad de proteínas obtenidas mediante su separación por electroforesis y cuantificación por espectrofotometría.



4.1. Extracción y cuantificación de proteínas


Invariablemente, para la extracción de las proteínas intracelulares es necesaria la lisis celular, para lo que comúnmente se homogenizan los tejidos mediante procedimientos mecánicos o químicos, pero evitando la degradación térmica, oxidativa o proteolítica para preservando la integridad de estas biomoléculas. El extracto crudo de proteínas suele separarse y purificarse del resto de los componentes celulares por centrifugación, eliminando así las proteínas asociadas a las membranas y dejando aquellas solubles en el sobrenadante. Adicionalmente, el extracto puede someterse a una serie de tratamientos que, en función del tamaño o la carga neta, separen las proteínas en varias fracciones.

4.1.1.1. Fraccionamiento del extracto proteíco por solubilidad diferencial

Para el desarrollo de esta práctica, someterán el extracto crudo de proteínas que obtengan a un proceso de precipitación salina que permitirá la separación de fracciones con diferente solubilidad. Existen diversos factores que afectan la solubilidad (p.e. la proporción de aminoácidos polares o hidrofóbicos, su conformación tridimensional y las condiciones de temperatura, constante dieléctrica, pH y fuerza iónica del medio.

4.1.1.2. Cuantificación de proteínas mediante el Ensayo de Bradford

La cantidad de proteínas en la muestra o en las fracciones puede estimarse por espectrofotometría, leyendo directamente a 280 nm o indirectamente a través de un ensayo colorimétrico. Estos ensayos involucran la adición de una sustancia química que produce una reacción cromogénica ante ciertos residuos aminoacídicos. Aunque existen varios ensayos de esta naturaleza, usarán el ensayo de Bradford que es relativamente rápido, sencillo y muy sensible.

4.1.1.3. Evaluación de las fracciones de proteínas por SDS-PAGE

La electroforesis vertical en geles de poliacrilamida se usa principalmente para la separación fina de las proteínas o fragmentos de ADN pequeños. Para el caso particular de la separación de proteínas, la electroforesis puede realizarse en un sistema continuo o discontinuo. En el sistema continuo se usa solamente una concentración de gel y un solo tipo de amortiguador, mientras que el sistema discontinuo hace uso de un gel con dos capas de diferente concentración de poliacrilamida, cada una con un amortiguador distinto, que a su vez difieren del amortiguador que se coloca en la cámara de electroforesis. Con este sistema se obtiene una mayor resolución en la separación debido a que el gel de menor concentración o “stacking gel”, al tener un mayor tamaño de poro, funciona como



apilador o concentrador de las proteínas antes de su ingreso al gel separador “resolving gel” de la capa subyacente.

La electroforesis en poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) genera condiciones que minimizan la aglomeración o agregación de las proteínas durante su separación. Esto se logra mediante el uso un detergente aniónico como el dodecilsulfato de sodio, un agente reductor (β-mercaptoetanol o ditiotreitol) y calor, lo que disocia las proteínas multiméricas en subunidades.

4.1.2. Objetivo

Extraerán y purificarán parcialmente las proteínas presentes en distintos tejidos de

organismos de importancia para la acuacultura, contrastando la diversidad y la cantidad

de las mismas.

4.1.2.1. Extraerán proteínas de distintos especies y tejidos

4.1.2.2. Fraccionarán el extracto crudo de proteínas con base en su solubilidad diferencial

4.1.2.3. Evaluarán la diversidad y la cantidad de proteínas mediante una electroforesis en

poliacrilamida y un ensayo colorimétrico, respectivamente.

4.1.3. Material

4.1.3.1. Materiales

Tejido de organismos vivos o

congelados (-70°C): camarón,

almeja, pez.

Guantes de látex.

Charola de disección.

Tubos cónicos de plástico (15

ml).

Papel secante.

Marcador indeleble punto

fino.

Navajas estériles o equipo de

disección.

Pistilos de plástico estériles.

15 Tubos de microcentrífuga

estériles (0.5 ml).


estériles (1.5 ml).




con empaque (O-ring)

Gradilla para tubos de

microcentrífuga.


1000 µl.



1000 µl.


100 µl.



100 µl.

Pipeteador automático de 10

µl.


pipeteador automático de 10

µl

Cinta adhesiva

Recipientes de plástico (para

teñir geles)

Termómetro

10 Cubetas para

espectrofotómetro.

Flotador para tubos de

microcentrífuga

Bolsas para desechos

Placa para Ensayo de ELISA o

de PCR (96 pozos)


Microcentrífuga

Vórtex

Baño maría (90°C)

Balanza analítica

Campana de Extracción

Espectofotómetro

(Nanodrop)

Agitador

Plancha de calentamiento

Sistema de electroforesis

vertical (cámara, peine,

casette y fuente de poder).

Cámara fotográfica

Manual de Prácticas de Laboratorio de [MATERIA] [UNIDAD III] Página 64


4.1.3.3. Reactivos

Amortiguador de extracción

de proteínas (10 mM Tris-HCl

pH 7.8, 10 mM EDTA, 1.5%

SDS, 2 µl inhibidor de

proteasa)

Solución concentrada (10

mg/mL) de albúmina de

suero bovino (BSA).

Solución saturada de sulfato

de amonio (760g/L)

Reactivo de Bradford®

Solución de

acrilamida:bisacrilamida

(30%:0.8%)

1.5 M Tris-HCl pH 8.8

1.0 M Tris-HCl pH 6.8

10% Dodecil Sulfato de Sodio

(SDS)

10% Persulfato de amonio

(APS)

N,N,N',N'-

Tetrametiletilendiamina

(TEMED)

Amortiguador de carga para

la muestra 2X (50 mM Tris-Cl

pH 6.8, 2 % SDS, 10 %

Glicerol, 0.1 % Azul de

Bromofenol, 5% -

mercaptoetanol)

Amortiguador para

electroforesis Tris-Glicina 1X

(25 mM Tris base, 250 mM

glicina, 0.1% SDS, pH 8.3).

Solución de tinción de Azul

de Coomassie (0.4% Azul de

coomassie, 10% ácido

acético, 30% metanol)

Solución decolorante (10%

ácido acético, 30% metanol)


(BSA 100 µg/µl).

Agua destilada esterilizada

(H2Ode)

Hielo

Manual de Prácticas de Laboratorio de [MATERIA] Anexos Página 65


4.1.4. Desarrollo

Extracción y preparación de muestras

Coloquen 0.15 g de tejido en un tubo de microcentrífuga, agregen 250 µl de amortiguador para extracción de proteínas y homogenicen con un pistilo plástico hasta disgregar el tejido. Mantengan la mayor parte del tiempo el tejido y el tubo en el hielo.

Añadan otros 250 µL de amortiguador. Dependiendo de la naturaleza del tejido, deberán homogenizar más vigorosamente o por más tiempo.

Incubar el homogenizado a 100 °C por 3 min. Centrifugar a 14,000 x g, 10 min a 4 °C. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y mantener en hielo.

Precipitación con Sulfato de amonio 1. Diluyan con la solución de sulfato de amonio saturada parte del extracto crudo de

proteína de acuerdo con la siguiente tabla:

Porcentaje de Sulfato de Amonio

0% 20% 35% 50%

H2Ode 50 µL 30 µL 17.5 µL 0 µL

(NH4)2SO4 Saturada 0 µL 20 µL 32.5 µL 50µL

Extracto crudo de proteínas 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL

2. Etiqueten adecuadamente los tubos correspondientes a cada dilución. 3. Agiten vigorosamente durante algunos segundos. Pueden hacerlo en el vortex a

velocidad media por entre 10 y 15 segundos. 4. Centrifuguen por 10 minutos a 14,000 rpm. 5. Transfieran el sobrenadante a tubos limpios correctamente etiquetados. 6. Mantengan los tubos en el hielo junto con el tubo del extracto crudo.



Cuantificación del extracto crudo de proteínas mediante el Ensayo de Bradford

1. Preparen las siguientes diluciones a partir de la solución concentrada de BSA (10 mg/mL), con ellas harán la curva estándar para la cuantificación de proteínas.

Muestra Dilución Concentración final

(mg/mL)

S0 200 µl agua 0.00

S1 2 µl BSA + 198 µL agua 0.10

S2 5 µl BSA + 195 µL agua 0.25

S3 10 µL BSA + 190 µL agua 0.50

S4 15 µl BSA + 185 µL agua 0.75

S5 20 µl BSA + 180 µL agua 1.00

S6 30 µl BSA + 170 µL agua 1.50

S7 40 µl BSA + 160 µL agua 2.00

2. En un tubo de microcentrifuga de 0.5 mL mezclen 10 µl de la muestra con 40 µl de amortiguador de extracción de proteína. De esta manera el factor de dilución (FD) será 1:5.

3. Colocar por triplicado 10 µl de la dilución anterior en la placa, en la que incluirán también las diluciones de la curva estándar (S0-S7) por duplicado.

4. Añadir rápidamente 200 µl de reactivo Bradford tanto a las muestras como a las diluciones de la curva estándar. Cubrir la placa con papel aluminio y leer cada dilución

en el Espectrofotometro Nanodrop a 595 nm.

5. Graficarán los valores obtenidos de la curva estándar y ajustarán los puntos a un modelo lineal para poder calcular la concentración de las muestras en base a las siguientes ecuaciones:

y = mx+b

donde y = Densidad Optica (Abs595 x 100)

x = concentración de proteína (mg/ml)

m = pendiente

b = ordenada al origen

despejando x:

x = (DO-b)/m

Sustituyendo:

[Proteína total en mg/mL] = [(Abs595 x 100) – b]/m x (FD)



10. Preparen alícuotas a concentración final de entre 10–30 µg/µL.

11. Etiqueten sus alicuotas y mantengan los tubos en el hielo.

12. Al finalizar la sesión, entreguen sus tubos al docente para que los almacene a -20°C hasta la siguiente sesión.

Electroforesis en poliacrilamida con SDS-PAGE

1. Siguiendo las instrucciones del docente, descongelarán sus muestras y diluciones de de la sesión anterior y las cargarán en un par de geles discontinuos previamente preparados.

2. Una vez descongeladas las muestras y diluciones mezclarán, en una serie de tubos limpios con empaque, 10 µL de la muestra o dilución con 10 µL de amortiguador de carga recién preparado (proporción 1:1).

3. Incuben la mezcla a 99°C por 3 min y enfríenlos rápidamente manteniéndolos en el hielo.

4. Cargarán entre 15 y 30 µl de la muestra en cada carril del gel (y en el duplicado del gel), manteniendo el mismo orden y registrando en sus manuales la posición y el orden de las muestras. Carguen finalmente la cantidad apropiada del marcador de proteínas siguiendo las especificaciones de la casa comercial o proveedor.

5. La electroforesis se realizará a 250-300v y 80 mA hasta que el frente del colorante alcance la base del gel (≈ 1 h).

Montaje del cartucho y preparación del gel de poliacrilamida con SDS

1. Aunque existe una gran variedad de sistemas para preparar y montar los geles de poliacrilamida, en esta práctica aprenderán una de las estrategias más económicas, pero no necesariamente la más sencilla y rápida.

2. Como primer paso limpiarán el vidrio y el plástico con los que armarán el cartucho o “emparedado” donde posteriormente verterán la poliacrilamida. Usen etanol al 70% y papel secante para la limpieza.

3. Identifiquen el lado de la sección del plástico sobre el que se desliza el vidrio y ensámblenlos con ayuda de cinta adhesiva transparente siguiendo las instrucciones del docente.



4. Coloquen broches de presión a ambos costados del cartucho, para mantenerlo en posición vertical. Deberán colocar los broches sobre el borde plástico y evitar hacer presión sobre el vidrio.

5. Preparar la mezcla de acrilamida del gel separador al 15% (Resolving gel) en el orden que se indica en la tabla que se muestra a continuación:

*NOTA: Las concentraciones de poliacrilamida de los geles pueden variar en función de la resolución que se requiera (ver Anexo 6). La polimerización de la acrilamida inicia una vez que se agregan el APS y el TEMED, por lo que deben mezclar los componentes y de inmediato verter en el cartucho

6. Para verter la mezcla usen el pipeteador automático de 5000 µL, colocándolo en un costado del cartucho y apoyándose en el escalón o borde que forman el vidrio y el plástico. Usen una velocidad moderada pero continua para vaciar la mezcla, evitando así la formación de burbujas. Solo deben verter suficiente mezcla para ocupar las ¾ partes del cartucho.

7. Agregar muy lentamente 1 mL de agua desionizada esterilizada sobre el gel que acaban de vaciar en el cartucho. Esto evitará el contacto con el aire y acelerará la polimerización.

8. Una vez que haya polimerizado el gel, drenen el agua del interior del cartucho y eliminen el excedente de agua con ayuda de papel secante.

Componente Volumen Concentración final

Agua destilada 1.472 mL -

Solución de acrilamida-bisacrilamida al 30% 3.200 mL 15.000 %

1.5 M Tris pH 8.8 1.600 mL 0.375 M

10% SDS 0.064 mL 0.100 %

10% APS* 0.064 mL 0.100 %

TEMED* 5.120 µL 0.080 %

Volumen final 6.400 µL



9. Preparen ahora la mezcla correspondiente al gel concentrador al 5% (Stacking gel) con base en las proporciones que se indican en la siguiente tabla:

10. Verter la mezcla lentamente por uno de los costados del cartucho, llenando hasta que la poliacrilamida rebase el borde entre el vidrio y el plástico.

11. Coloquen lenta y cuidadosamente el peine para evitar la formación de burbujas. Antes de colocar el peine revisen que la parte rugosa de la base quede orientada hacia fuera y no hacia la parte plástica del cartucho.

12. Dejen que polimerice el gel durante unos 25 minutos.

13. Una vez polimerizado, deben eliminar la cinta adhesiva de porción basal del cartucho, por donde pasará la corriente eléctrica a través del gel.

14. Coloquen el cartucho con el gel en la cámara de electroforesis, quiten el peine y llenen la cámara con el amortiguador de electroforesis Tris-Glicina.

15. Con ayuda de una jeringa, enjuaguen los pozos con el amortiguador de electroforesis y remuevan todas las burbujas presentes en la cámara, tanto por debajo como arriba del gel. El gel ya puede usarse para realizar una nueva corrida electroforética.

Montaje de los vidrios y preparación del gel de poliacrilamida con SDS

1. Una vez concluida la electroforesis apaguen la fuente de poder y retiren el cartucho del gel de la cámara.

Componente Volumen Concentración final

Agua destilada 2.176 mL -

Solución de acrilamida-bisacrilamida al 30% 0.538 mL 5.000 %

1.0 M Tris-HCl pH 6.8 0.403 mL 0.125 M

10% SDS 0.032 mL 0.100 %

10% APS 0.032 mL 0.100 %

TEMED 5.120 µL 0.080 %

Volumen final 3.200 µL



2. Desprendan el componente plástico del cartucho del vidrio. El gel generalmente quedará adherido al vidrio y puede desprenderse fácilmente con ayuda de una espátula.

3. Depositar el gel en la un contendor con solución de tinción de azul de Coomassie por al menos 6 horas con agitación moderada y constante. El proceso puede acelerarse si se utiliza el horno de microondas pero es importante no permitir la ebullición de la solución de Coomassie (un par de periodos de 15 s).

4. Destiñan el gel con solución decolorante por unas 12 horas con agitación media para evitar que el gel se rompa. Deberán realizar de 3 a 4 recambios de solución desteñidora. El número de recambios dependerá del contraste que deseen obtener entre las bandas de proteínas teñidas de azul y el gel. El proceso también puede acelerarse usando el horno de microondas.

5. Finalmente, coloquen el gel sobre una hoja blanca forrada con plástico transparente y obtengan un registro fotográfico.


Para evaluar esta práctica, entregarán un reporte con los resultados obtenidos en la

práctica, el cual complementarán con el siguiente cuestionario.

1. ¿Qué otros métodos para fraccionar proteínas existen?

2. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del ensayo Bradford con respecto a los otros

métodos comúnmente usados para cuantificar proteínas?

3. ¿Qué función específica tiene el -mercaptoetanol en el amortiguador de carga para

para proteínas?


1. Sambrook, J. y W.D. Russell. 2006. The condensed protocols from molecular cloning:

A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 800 pp.



5. Herramientas Bioinformáticas




Propósito General de las Prácticas de la Quinta Unidad

El término bioinformática hace referencia al uso de la tecnología de cómputo para generar, organizar, almacenar, distribuir y analizar datos de tipo biológico. Es un área de investigación multidisciplinaria que integra a las matemáticas aplicadas, la estadística, las ciencias de la computación, la química y la física, para el análisis de datos para solucionar problemas o simular procesos de naturaleza biológica, principalmente (más no exclusivamente) a nivel molecular.

El núcleo central de todas estas técnicas reside en el aprovechamiento de las tecnologías en información para solucionar o investigar problemas a escalas que sobrepasan el discernimiento humano, principalmente en campos de investigación que incluyen el almacenamiento y alineamiento de secuencias, análisis de secuencias para la predicción de genes (estructura-función), mapeo del genoma, análisis y predicción de la expresión génica, interacciones entre proteínas y el modelado de la evolución.

Mediante esta serie de prácticas o talleres, aprenderás a accesar a la red de bancos de datos de recursos genéticos, a extraer información de los mismos y a utilizar algunas de las herramientas bioinformáticas y de biología computacional más comúnmente empleadas para el análisis de secuencias de ADN, ARN y proteínas, desde el nivel de la estructura de la molécula hasta el análisis de datos a nivel individual, poblacional, intra e interespecífico.



5.1. Análisis de secuencias de ADN


El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en conocer el orden secuencial de los nucleótidos que definen cada gen. El proceso de secuenciación del ADN engloba un conjunto de métodos de biología molecular y técnicas bioquímicas que permiten determinar las posiciones ocupadas por cada uno de los cuatro nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN.

La secuencia de ADN constituye la información genética heredable que codifica y regula los elementos involucrados con el desarrollo y el mantenimiento de los seres vivos. Por lo tanto, el determinar la secuencia de ADN es trascendental para la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en otros campos aplicados (p.e. identificación de especies, patógenos e individuos)

Aunque el avance en la tecnología de secuenciación ha avanzado aceleradamente en los últimos años, el método enzimático de terminación de cadena de Sanger, también conocido por el método dideoxi, es la base del método de secuenciación automática que es el más comúnmente usado.

5.1.2. Objetivo

Esta serie de prácticas/talleres te permitirán conocer los métodos a través de los que se lleva a cabo la secuenciación de los genomas y algunas de las herramientas bioinformáticas de acceso público diseñadas para la lectura, almacenamiento y análisis de secuencias de ADN.

5.1.2.1. Conocerás, a través de video-animaciones, el proceso de secuenciación de Sanger y el método de secuenciación cíclica automatizada.

5.1.2.2. Aprenderás a interpretar archivo de resultados generado por el secuenciador automático (cromatogramas) utilizando uno de los programas de cómputo para la lectura de archivos de secuencia más comunes.

5.1.2.3. Aprenderás las rutinas para empatar las cadenas de ADN secuenciadas y, revisar errores de lectura del secuenciador, así como la edición, traducción y acceso a los bancos de datos genéticos para identificar el origen de la secuencia o el nivel de similitud con aquellas depositadas en las bases de datos de acceso público.



5.1.3. Material




(DIA).

5.1.4. Desarrollo

5.1.4.1. Fundamentos teóricos de la secuenciación del ADN

Como primer paso revisaremos un par de video-animaciones en las que se describe el

proceso de secuenciación y con los que podrán darse cuenta del avance tecnológico tan

significativo que ha tenido este método.

5.1.4.2. Ensamblaje, edición y análisis preliminar de cromatogramas de ADN.

Posteriormente usarán las computadoras y el programa ChromasPro (Technelysium Pty Ltd) para el análisis de secuencias de ADN. El docente los guiará proyectando la pantalla de su computador en el pizarrón y ustedes seguirán la rutina en sus computadores o en los que se les asignen. A continuación se describe la rutina:

1. Localizar e inciar el programa ChromasPro V1.5 que deberá estar instalada en el computador o del que pueden descargar la version DEMO en la siguiente liga electrónica: http://www.technelysium.com.au/ChromasPro.html

2. El programa despliega en pantalla la ventana principal del programa en donde podrás encontrar (parte superior izquierda) el menú principal de comandos (File, Options, View, Help):

3. Usarán el comando Archivo (File) y los subcomandos New/Sequencing Project (Nuevo/Proyecto de Secuenciación) se despliega la pantalla de análisis. Aparecerá también un nuevo comando en el menú (Project) y una serie de íconos aparecerá debajo del menú de comandos.



4. Usando el ícono Add Files (Agregar Archivos), que está representado por una serie de hojas con un símbolo aditivo (cuarto ícono de izquierda a derecha), desplegarán la ventana para localizar y cargar los archivos que analizarán.

5. El docente les indicará la ruta de acceso de los cromatogramas o archivos de salida del secuenciador automático (extensión *.ab1). Seleccionen los archivos que les indiquen y abranlos. Los archivos aparecerán en la ventana de análisis y ahora pueden analizarse.

6. Seleccionen uno de los archivos haciendo doble toque sobre este. Aparecerá una pantalla que despliega el cromatograma y en que pueden revisar la secuencia en la que los cuatro nucleótidos (A, G, T, C), cada uno identificado con un color distinto, aparecen en la cadena de ADN que se esté analizando.

7. Cierren la ventana del cromatograma y seleccionen ahora ambos archivos en la ventana de análisis dando un solo toque sobre cada uno. Seleccionen el comando Project (Proyecto) y el subcomando Assemble Selected (Ensamblar Selección) para ensamblar las secuencias individuales.

8. La ventana que se despliega ahora tiene un solo archivo llamado Contig0 y contiene el empate o ensamble de las cadenas complementarias del ADN que fue secuenciado. En esta ventana se exploraran algunas de las opciones para editar y corregir errores de lectura del secuenciador.

9. Noten que en el menú principal aparece ahora otro comando nuevo: Analysis (Análisis). Una vez que la secuencia ensamblada ha sido revisada y editada, usen el comando File (Archivo) y el subcomando Export To Editor (Exportar al Editor) para desplegar la secuencia consenso editada. Esta puede salvarse en formato de texto o con alguna otra extensión compatible con los programas de análisis de secuencias (*.seq).



10. Sin cerrar la ventana del editor, usen el comando Analysis (Análisis) y el subcomando BLAST Search (Búsqueda en BLAST). Esta rutina los redireccionará hacia una de las bases de datos que revisaremos más adelante.

11. Aparece una ventana que les indica la página electrónica a la que enviarán la solicitud de análisis y algunas opciones avanzadas sobre la búsqueda. Acepten y en la siguiente ventana soliciten ver el reporte

12. Aunque en ocasiones la red se encuentra saturada y el tiempo de análisis en línea se prolonga considerablemente, la base de datos les proporcionará un informe completo sobre el porcentaje de similitud de su secuencia con aquellas que tuvieron los valores más altos de homología en los registros del banco de datos. De esta forma podemos identificar si la secuencia que ingresamos corresponde a alguna especie en particular o bien, identificar el gen o la proteína de la que proviene.

13. Cierren las ventanas del análisis en la base de datos y regresen a la ventana donde tienen la secuencia editada en formato de texto en ChromasPro. Explorarán rápidamente dos de los comandos que utilizarán en las próximas prácticas.

14. Usen la el comando Analysis (Análisis) y el subcomando Translate (Traducir) para obtener la secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos analizada. Repitan el procedimiento de búsqueda de secuencias relacionadas desde el paso 10 pero ahora para la secuencia de aminoácidos. La base de datos del banco de recursos genéticos ahora les dará el análisis de similitud con los registros de secuencias de proteínas.

15. Ahora, en la ventana del ChromasPro en la que tienen la secuencia de nucleótidos (Editor de Texto), usen el comando Reverse + Complement (Reverso Complementario). Este comando lo pueden identificar con el ícono que tiene un par de flechas en sentido contrario (octavo ícono de izquierda a derecha bajo el menú de comandos). Este comando despliega la secuencia inversa complementaria de cualquier secuencia de nucleótidos.

16. Cuando tienen una secuencia de aminoácidos en el Editor de Textos del ChromasPro, pueden usar el comando Analysis (Análisis) y el subcomando Reverse Translation



(Traducción inversa) para obtener la secuencia de nucleótidos correspondiente a su secuencia de aminoácidos.

17. Discutan las diferencias obtenidas al usar la traducción directa de la secuencia de nucleótidos y la traducción inversa de la secuencia de aminoácidos que corresponde a esa secuencia de nucleótidos.

5.1.4.3. Búsqueda de secuencias específicas en las bases de datos genéticos

De manera análoga a lo que hace el programa ChromasPro, ustedes pueden buscar directamente en la bases de datos genéticos, si la secuencia que obtuvieron del análisis de los cromatogramas tiene similitudes con alguna de las secuencias depositadas en estos bancos de información electrónica.

Explorarán algunas de las rutinas más empleadas para la búsqueda de secuencias relacionadas o búsqueda de secuencias de su interés. El docente los guiará proyectando la pantalla de su computador en el pizarrón y ustedes seguirán la rutina en sus computadores o en los que se les asignen. A continuación se describe la rutina:

1. Ingresen las palabras clave GenBank o NCBI en el navegador de Internet y procedan a la búsqueda. El navegador desplegara alguna de las siguientes dos opciones:

a) National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/)

b) GenBank Home (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)

2. Si seleccionaron la opción de GenBank, den un toque en la esquina superior izquierda de la página, en donde se pueden leer las iniciales NCBI para desplegar la siguiente pantalla:



3. En el cuadro en blanco en la parte superior de la página del NCBI, ingresen alguna palabra clave que haga referencia a una especie o grupo en particular. Deberán ingresar el nombre científico o el nombre común en inglés. Por ejemplo para buscar recursos genéticos relacionados con el mejillón: Mytilus ó mussel.

4. El navegador desplegará un resumen de la información relacionada con el mejillón y que está depositada en el bancon de datos del NCBI. Las más relevantes para el desarrollo de nuestro taller son las referencias bibliográficas (PubMed y PubMed central), las secuencias de nucleótidos (Nucleotide), las secuencias de proteínas (Protein) y las etiquetas de secuencia expresada (Expressed Sequence Tag ó EST) o secuencias transcritas.

5. Ingresen a cada una de las opciones arriba mencionadas para que exploren el universo de información a la que pueden acceder. Al activar cada opción, se abrirá una nueva ventana en la que se desplegarán todos los registros correspondientes a esa categoría. Si activan la esquina superior izquierda, en donde están las iniciales de cada categoría (p.e. EST, PubMed, etc.), tendrán información más detallada de lo que significa cada una y de todos los recursos que se vinculan a estas.

6. Dando un toque a alguna de las secuencias que aparezcan en su lista, la base desplegara las características completas de cada secuencia, que incluyen: el número de acceso o identificador de la secuencia en la base de datos (GenBank Accession Number), el organismo fuente y su clasificación taxonómica completa, la autoría de la secuencia, referencias bibliográficas asociadas a la secuencia, el tamaño de la secuencia, detalles del mapa estructural o subregiones de la secuencia y la secuencia de nucleótidos. Con ayuda del docente, explorarán las opciones disponibles en la página para que se vayan familiarizando con la base de datos.



7. Aunque la base de datos más comúnmente usada es la del NCBI, existen otros recursos de igual importancia. Tal es el caso de la base de datos del European Bioinformatics Institute. Ingresen a esta base haciendo una búsqueda en su navegador con las palabras claves Europe Bioinformatics o EMBL:

a) The EMBL Nucleotide Sequence Database | EBI (www.ebi.ac.uk/embl/)

b) European Bioinformatics Institute | Homepage | EBI (www.ebi.ac.uk/)

8. Al igual que en el GenBank, la EMBL despliega un resumen detallado de los distintos recursos (secuencias de nucleótidos, proteínas, expresión de genes, etc.) disponibles para la especie o el gen de interés:

9. Exploren brevemente la página y comparen su versatilidad y el número de recursos disponibles para le especie o el gen que hayan seleccionado, con respecto a la del NCBI.

.




Todas las actividades realizadas en esta sesión de taller, las irán copiando y pegando en

un archivo de WORD (*.doc o *.docx) al que anexarán las respuestas al siguiente

cuestionario:

1. Investiga en qué consiste la secuenciación de las proteínas, describiendo

brevemente los principales métodos empleados.

2. ¿Qué son y cómo se obtienen las secuencias denominadas EST?

Se les recomienda que al terminar la sesión, o más tarde ese mismo día, ingresen a su

cuenta de correo electrónico y se lo envíen a su misma cuenta. Posteriormente, una vez

que hayan completado el cuestionario lo enviarán a la cuenta de correo del docente.

El archivo con las actividades realizadas en la computadora y el cuestionario,

corresponderá al reporte de laboratorio o taller, por lo que no tendrán derecho a

realizar el siguiente taller si no hacen llegar al docente el archivo electrónico a más

tardar una noche antes de la siguiente sesión de taller.


1. Liga a la página electrónica del programa ChromasPro v1.5.

http://www.technelysium.com.au/ChromasPro.html (consultada el 03 de mayo de

2012).

2. Liga a la página electrónica del Centro Nacional de Información Biotecnológica

(NCBI). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/guide o

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank (consultada el 03 de mayo de 2012).

3. Liga a la página electrónica del Instituto Europeo de Bioinformática del Laboratorio

de Biología Molecular Europeo (EMBL-EBI). http://www.ebi.ac.uk/ (consultada el

03 de mayo de 2012).



5.2. Diseño de cebadores


Como ustedes ya lo saben, la reacción en cadena de la polimerasa tiene muchas aplicaciones en biología, medicina y biotecnología. Todas estas aplicaciones dependen del empleo de los cebadores o primers específicos, que son cadenas cortas de ADN monohebra (oligonucleótidos) que funcionan como puntos de inicio de la síntesis o la extensión de la nueva cadena. La extensión de los cebadores se da en dirección 5'→3', por lo que estos deben poseer ciertas características termodinámicas y estructurales que pueden calcularse con base en su composición de nucleótidos. Algunas de las características recomendadas son las siguientes:

a) Secuencia única de nucleótidos, complementaria a la región de interés al menos en un 85%.

b) Contenido de al menos un 60-65% de G-C.

c) Extremo 3' con al menos 1 o 2 núcleotidos G-C.

d) Longitud de entre 17 y 25 nucleótidos.

e) Secuencia que no se autocomplemente.

f) Secuencias no complementarias entre los cebadores antisentido.

g) Una composición nucleotídica similar entre los cebadores antisentido (Tm similar).

h) Diferencia mínima entre las temperaturas de fusión similares de los cebadores antisentido (<3°C) y de preferencia mayores a 55°C.

i) Longitud del fragmento esperado no mayor a 2500 pb.

Debido a que la entropía de la reacción es elevada, los cebadores deben incorporarse y despegarse al mismo tiempo para garantizar que la cantidad de producto sintetizado en ambas direcciones sea equitativa, por lo que la suma de todas las características mencionadas deberá tener como resultado una mayor eficiencia y especificidad en la amplificación.



5.2.1.1. DISEÑO DE CEBADORES ESPECÍFICOS

Cuando conocemos la secuencia de ADN de la región que nos interesa amplificar, el cebador se diseña basándose exclusivamente en dicha secuencia. Esto se debe a que tenemos la certeza de que los cebadores complementarán en un 100% con la secuencia del ADN genómico blanco.

Pese a que una característica deseable de los cebadores es que sean altamente específicos, estos comúnmente funcionan también en especies cercanas. Al filogenéticamente relacionadas, la similitud en la secuencia de nucleótidos entre las cadenas de ADN de dos especies es muy alto.

Pueden diseñarse cebadores con diferentes niveles de especificidad al analizar de las secuencias de varios individuos de distintas poblaciones, especies, géneros, familias, órdenes, etc. Recuerden que hay genes altamente conservados, mientras que otras regiones del ADN son altamente variables. Por lo tanto, una estrategia adecuada para trabajar con el mismo gen pero en distintos grupos taxonómicos, es diseñar los cebadores con base en un alineamiento múltiple que permita reconocer los sitios altamente conservados de la secuencia y seleccionarlos como sitio de unión de los cebadores.

5.2.1.2. DISEÑO DE CEBADORES DEGENERADOS

Cuando desconocemos la secuencia del gen o de la región de ADN en cuestión,

podemos recurrir al diseño de cebadores degenerados. Estos son en realidad una

mezcla de cebadores muy similares pero no idénticos. Son particularmente útiles

cuando se desea amplificar el mismo gen de organismos y no existen regiones

altamente conservadas que sirvan como punto de unión de un cebador

específico. Esto es, cuando los genes mismos pueden ser similares pero no

idénticos.

Otra de las situaciones en las que los cebadores degenerados son una mejor

opción, es cuando el diseño de estos se base en secuencias de proteínas. Debido

a la redundancia del código genético, distintos codones pueden codificar para el

mismo aminoácido, por lo que suele ser difícil deducir qué codón usar para cada

caso particular.



El uso de cebadores degenerados tiene la desventaja de que puede reducir

drásticamente la especificidad de la amplificación por PCR, generando productos

de PCR alternos no homólogos. Sin embargo, este y otros problemas pueden

resolverse ajustando las condiciones del perfil de amplificación, principalmente

la temperatura y la velocidad de incremento de la temperatura.

5.2.2. Objetivo

Con esta práctica/taller reconocerán la importancia del diseño adecuado de cebadores

para el análisis de las secuencias de ADN, ARN y proteínas, y aprenderán las rutinas

estratégicas más comunes de diseño de cebadores a través de distintas herramientas

bioinformáticas.

5.2.2.1. Aprenderán a extraer datos sobre las secuencias de nucleótidos y/o

aminoácidos disponibles en las bases de datos de acceso público.

5.2.2.2. Aprenderán a realizar alineamientos mútiples de ADN y de proteínas,

reconociendo las regiones variables y aquellas altamente conservadas.

5.2.2.3. Usarán las herramientas bioinformáticas más comunes para el diseño

de cebadores específicos y cebadores degenerados.

5.2.3. Material




(DIA).

5.2.4. Desarrollo

Como primer paso en el diseño de cebadores para PCR harán una búsqueda en las bases de datos de recursos genéticos de acceso público. Para ello ingresarán a la página electrónica del Centro Nacional de Información Biotecnológica de los Estados Unidos (NCBI: National Center for Biotechnological Information) a través de la siguiente liga: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/



El docente los guiará proyectando la pantalla de su computador en el pizarrón y ustedes seguirán la rutina en sus computadores o en los que se les asignen. A continuación se describen las rutinas:

5.2.4.1. Diseño de cebadores sobre secuencias de nucleótidos conocidas.

1. En el recuadro de búsqueda, en la ventana principal de la página electrónica de la NCBI, ingresen la palabra clave o el número de acceso de la secuencia específica que sea de su interés. Escriban las palabras cytochrome oxidase Mytilus y verifiquen que la opción del pequeño recuadro a la izquierda indique Nucleotide. Procedan a la búsqueda dando un toque en el cuadro Search (Buscar) y seleccionen la primera secuencia que aparezca en la lista (citocromo oxidasa de mejillón).

2. El citocromo oxidasa es un complejo de proteína transmembranal formada por cuatro subunidades. Esta enzima participa en la última etapa de la cadena de transporte electrónico, convirtiendo el oxígeno molecular en moléculas de agua y permitiendo con ello la síntesis de ATP. Su secuencia de nucleótidos se ha usado extensivamente para la identificación de especies y análisis filogenéticos.

3. En la parte superior izquierda del recuadro de la secuencia que desplegaste hay un texto en color azul en el que se lee Display Settings (Ajuste de Despliegue), activen la opción dando un toque sobre el texto y seleccionen el formato FASTA (text, aceptando el cambio usando el cuadro que dice Apply (Aplicar). Con ello desplegarán la secuencia de nucleótidos en uno de los formatos más comunes.



4. Copien la secuencia y péguenla en un archivo WORD (*.doc ó *.docx)

5. Regresen en el navegador a la página en la que hicieron la búsqueda y apareció la lista de secuencias de citocromo oxidasa de mejillón. En la parte inferior hay cinco columnas con diferentes herramientas del banco de datos. Localicen en la cuarta columna la herramienta Primer-BLAST y actívenla. Esto activará el programa Primer3.

6. El navegador desplegará una pantalla en la que encontrarán un recuadro en el que pueden pegar la secuencia de nucleótidos o el número de acceso al GenBank de ka secuencia de interés. También hay muchos otros recuadros en los que deberán especificar los criterios de búsqueda para las posibles parejas de cebadores que pueda diseñarse sobre la secuencia ingresada.

7. Ingresen el número de acceso de la secuencia seleccionada o copien solo los nucleótidos correspondientes en los recuadros señalados. Modifiquen solamente las opciones de tamaño del producto de PCR (PCR product size), especificando tamaños mayores a 100 pero menores a 750. Activen el recuadro inferior Get Primers (obtener prinmers).

8. El programa generará cinco pares de cebadores, ubicándolos en forma gráfica sobre la secuencia original y especificando sus secuencias en dirección 5’ ►3’, así como sus temperaturas de fusión y complementariedad consigo mismos.



9. El docente explicará algunas de las otras opciones para el diseño de cebadores y ustedes explorarán los resultados al modificar dichas opciones. Lo más importante es que mantengan en mente en todo momento que, mientras más exigencias tengamos en cuanto al diseño, menores serán las probabilidades de que el programa encuentre una pareja de cebadores óptima para la amplificación por PCR de la región de ADN solicitada.

10. Localicen el primer y el quinto par de cebadores sobre la secuencia original en el archivo de WORD. Utilicen el resaltador para indicar de dónde a dónde va cada cebador y verifiquen la extensión del fragmento esperado de PCR usando las herramientas de edición y formato en el WORD (Edit/Find ó Edición/Buscar; Review/Word Count ó Revisión/Contar Palabras). Aunque por convención las secuencias de los cebadores siempre se expresan en dirección 5’ ►3’, recuerden que las cadenas de ADN son antiparalelas.

11. Finalmente, usarán una herramienta de Integrated DNA Technologies (OligoAnalyzer 3.1) para evaluar los cebadores que se hayan diseñado. Esta herramienta checa si los cebadores forman dímeros y heterodimeros, asi como la complejidad y estabilidad de las estructuras secundarias que pudiera generar cada uno de ellos (horquillas). Usa las palabras claves Oligo y Analyzer en el buscador de Internet para acceder a la página http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/

12. Ingresen en la ventana cada uno de los cebadores del primer y quinto par que generaron en el programa Primer 3. Activen el recuadro Analyze (Analizar) y las distintas opciones que contiene el programa: Harpin (Horquillas), Self-Dimer & Hetero-Dimer (Dimeros), NCBI Blast (Búsqueda en GenBank) y Tm Mismatch (Diferencias en Temperaturas de Fusión) y discutan los resultados.



5.2.4.2. Diseño de cebadores sobre bloques conservados de nucleótidos

1. Ingresen en el buscador de la página de la NCBI las palabras claves Cytochrome

Oxidase I y Scianidae. Soliciten el Display Settings (Ajustes de Despliegue) que les

genere 100 resultados en formato FASTA (text) y copien la lista de secuencias en su

archivo de WORD.

2. Esta búsqueda desplegará las secuencias de citocromo oxidasa de peces de la familia

Scianidae (a la que pertence la totoaba). Borren aquellas secuencias que

pertenezcan a la misma especie, dejando al menos 10 secuencias del gen pero

asegurándose que pertenezcan a diferentes especies de scianidos (p.e.

gi|154760899|, gi|154760893|, gi|154760895|, gi|154760897|, gi|154760901|,

gi|340034731|, gi|158187497|, gi|158187499|, gi|158187495|, gi|158187493|,

gi|294988806|, gi|294988926|, gi|306993060|, gi|306992976|, gi|154761067|,

gi|328484282|, gi|315423490|, gi|166362032|)

3. Con estas secuencias harán un alineamiento múltiple que les permitirá detectar las

regiones variables y conservadas entre estas especies peces. Para ello ingresarán las

palabras clave Multiple y Alignment en su navegador de Internet. De entre las

diversas opciones que aparecerán, todas ellas útiles y confiables, seleccionarán la

página del programa Multalin:

a) Multiple Sequence Alignment (http://multalin.touluse.inra.fr/multalin/)

b) CAP3 Sequence Assembly Program (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)

c) Clustal Multiple Alignment (http://www.genome.jp/tools/clustalw/)

d) Multiple Alignment MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)



4. Las secuencias en formato Fasta deben ingresarse en la ventana en blanco en la página del Multalin. En la parte de Optional Parameters (Parámetros Opcionales), seleccionen la tabla de comparación de símbolos apropiada para secuencias de ADN (AltDNA-30-0 ó DNA-5-0). Finalmente, en Presentation Options (Opciones de Despliegue) indiquen 5000 en el cuadro de Maximum Line Lenght (Longitud Máxima de la Línea).

5. El resultado del alineamiento se despliega en colores indicando en rojo aquellos sitios conservados, en azul los sitios moderadamente variables y en negro lo sitios variables.



6. De la lista de opciones que se despliegan debajo del resultado, seleccionen Results as an htlm page (resultados en formato de página htlm), copien la secuencia consenso en su archivo de WORD y salven ambos archivos. Editen la secuencia consenso en el Block de Notas (NOTEPAD) eliminando los espacios y reemplazando los puntos por letras N.

7. Usando el programa Primer3 (Primer-BLAST) diseñen un cebador universal para amplificar el citocromo oxidasa en sciánidos. Ahora tendrán que usar las opciones avanzadas indicando en que región o posición desean que el cebador quede ubicado, o bien, señalar los cebadores que ustedes consideren adecuados y evaluarlos.

8. Peguen la secuencia consenso editada en la ventana del Primer-BLAST y soliciten un producto de PCR de entre 500 y 650 pares de bases. Para ello, será recomendable que disminuyan las temperaturas de fusión de los cebadores para que sea más fácil que localicen un par adecuado. Usen 50°C, 55°C y 60°C como temperaturas mínima, óptima y máxima, respectivamente. Pidan al programa que ubique los cebadores entre las posiciones 1-90 y 580-620 de su secuencia consenso.

9. Copien y peguen las secuencias del primer par de cebadores que genere el programa y localícenlos sobre la secuencia consenso usando las herramientas del WORD como en la práctica anterior.

10. Intenten ahora solicitar cebadores determinados previamente sobre la secuencia. Seleccionen una sección de unos 20 pares de bases en el extremo izquierdo del alineamiento (de preferencia que altamente conservada o de color rojo en su mayor parte). Peguen esta secuencia corta en el recuadro para el cebador hacia adelante (My Own Forward Primer, desactiven las opciones de posición del cebador, temperaturas y tamaños del producto de PCR, dejando que el programa encuentre una pareja adecuada. Usen por ejemplo el siguiente cebador predeterminado.

11. Seleccionen la pareja de cebadores que amplifiquen el producto de PCR de mayor tamaño y localícenlos sobre la secuencia consenso en su archivo de WORD.

12. Localicen ambos pares de cebadores en el archivo de salida del Multalin que salvaron anteriormente (*.htlm). Revisen si los sitios donde están los cebadores son variables o conservados. En caso de que alguna posición nucleotidica resulte variable, editen sus cebadores reemplazando el nucleótido de este sitio por el código degenerado para la combinación correspondiente (disponible en la página del programa OligoAnalyzer 3.1).

13. Por último, analicen los cebadores seleccionados en el programa OligoAnalyzer 3.1.



5.2.4.3. Diseño de cebadores basados en secuencias de aminoácidos:

Cebadores degenerados

1. En el recuadro de búsqueda, en la ventana principal de la página electrónica de la NCBI, ingresen la palabra clave o el número de acceso de la secuencia específica que sea de su interés. Escriban las palabras fish aquaporine y verifiquen que la opción del pequeño recuadro a la izquierda indique Protein. Procedan a la búsqueda dando un toque en el cuadro Search (Buscar) y seleccionen algunas de las secuencias que aparezcan en la lista (aquaporinas de peces). De preferencia de 5 a 7 secuencias de varias especies.

2. Las aquaporinas son proteínas transmembranales encargadas de transportar el agua a través de los compartimentos celulares. La importancia de las aquaporinas radica en la relación que guardan con los cambios rápidos del volumen celular causados por la entrada o salida del agua en respuesta a cambios fisiológicos y/o alteraciones patológicas.

3. En la parte superior izquierda del recuadro de la secuencia que desplegaste hay un texto en color azul en el que se lee Display Settings (Ajuste de Despliegue), activen la opción dando un toque sobre el texto y seleccionen el formato FASTA (text, aceptando el cambio usando el cuadro que dice Apply (Aplicar). Con ello desplegarán las secuencias de aminoácidos seleccionadas en formato FASTA. Copien y guarden estas secuencias en un archivo WORD.



4. Ingresen en el buscador de Internet las

palabras claves Block Maker y Protein.

Seleccionen la opción Bioinformatics

Weizmann para desplegar el programa

BlockMaker.

5. El programa despliega varios recuadros. En el

recuadro de mayor tamaño pueden pegar las

secuencias de las aquaporinas que

seleccionaron previamente. Recuerden que

estas deben estar en formato FASTA.

6. Den un toque en el recuadro sombreado en

color azul con la leyenda Make Blocks para

iniciar el alineamiento y la búsqueda de

bloques conservados en las secuencias de

proteína ingresadas.

7. El programa despliega, además de los

resultados del alineamiento en forma de

bloques homólogos, las ligas electrónicas

necesarias para su análisis. Copien y guarden

los bloques resultantes en el archivo de WORD

correspondiente a esta sesión de trabajo.

8. Usarán la liga al programa CODEHOP

(COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide

Primers). CODEHOP busca regiones

relativamente conservadas entre secuencias

homólogas de proteínas y genera distintas

opciones de cebadores degenerados que

permitan la amplificación por PCR del gen

correspondiente a la proteína de interés. Para

activar el programa den un toque sobre la liga

Primers: [CODEHOP] en la página de resultados

del Block Maker.



9. Una vez en la página del CODEHOP, activen la

búsqueda de cebadores dando un toque en el

recuadro de color gris con la leyenda “Look

for Primers” (buscar cebadores). El resultado

se despliega en forma de una lista de

cebadores para cada bloque, tanto en la

dirección 5’►3’ como en la dirección

complementaria,

10. Copien el resultado del CODEHOP en el

archivo de WORD y localicen uno de los pares

de cebadores que permitan la amplificación

de la secuencia de interés en una de las

secuencias de aminoácidos originales. El

alfabeto degenerado pueden consultarlo en

la parte inferior de la página de resultados

del CODEHOP: Degenerate alphabet.



un archivo de WORD (*.doc o *.docx). Se les recomienda que al terminar la sesión, o

más tarde ese mismo día, ingresen a su cuenta de correo electrónico y manden este

archivo a la cuenta de correo que el docente les indique. El archivo con las actividades

realizadas en el taller corresponderá al reporte del taller, por lo que no tendrán derecho

a realizar el siguiente taller si no hacen llegar al docente el archivo electrónico a más





1. Liga a la página electrónica del programa ChromasPro v1.5.

http://www.technelysium.com.au/ChromasPro.html (consultada el 03 de mayo de

2012).

2. Liga a la página electrónica del Centro Nacional de Información Biotecnológica

(NCBI). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/guide o

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank (consultada el 03 de mayo de 2012).

3. Liga a la página electrónica del Instituto Europeo de Bioinformática del Laboratorio

de Biología Molecular Europeo (EMBL-EBI). http://www.ebi.ac.uk/ (consultada el

03 de mayo de 2012).

4. Liga a la página electrónica del programa Reverse-Complement

http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_comp.html (consultada el 03 de mayo

de 2012).

5. Liga a la página electrónica de recomendaciones para el diseño de cebadores del

NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/search_tips.html

(consultada el 03 de mayo de 2012)

6. Liga a la página electrónica del programa OlygoAnalyzer de la compañía Integrated DNA Technologies. http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer (consultada el 03 de mayo de 2012)

7. Liga a la página electrónica del programa Multiple Sequence Alignment.

http://multalin.touluse.inra.fr/multalin (consultada el 03 de mayo de 2012)

8. Liga a la página electrónica del programa CAP3 Sequence Assembly Program.

http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php (consultada el 03 de mayo de 2012)

9. Liga a la página electrónica del programa Clustal Multiple Alignment.

http://www.genome.jp/tools/clustalw (consultada el 03 de mayo de 2012)

10. Liga a la página electrónica del programa Multiple Alignment MAFFT

http://mafft.cbrc.jp/alignment/server (consultada el 03 de mayo de 2012)

11. Liga a la página electrónica del programa Block Maker para la búsqueda de bloques

conservados entre secuencias de aminoácidos homólogas no alineadas.

http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/blockmkr/www/make_blocks.html

(consultada el 03 de mayo de 2012)



12. Liga a la página electrónica del programa Consensus-Degenerate Hybrid

Oligonucleotide Primers (CODEHOP) para el diseño de cebadores degenerados.

http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html (consultada el 03 de

mayo de 2012)



5.3. Análisis de datos genéticos


El análisis de datos genéticos de alta densidad está ocupando un lugar preponderante en el estudio integral del funcionamiento del genoma (p.e. cadenas de regulación y expresión conjunta de genes), así como en la detección de alteraciones relacionadas con las enfermedades. Por lo tanto, la genómica puede considerarse el estudio conjunto de gran cantidad de genes y los productos de su expresión con el objeto de entender y predecir su funcionamiento.

Con la reducción en los costos y el avance tecnológico que incrementa la densidad de los dispositivos de lectura de información genética (secuenciación masiva, microarreglos, chips de proteínas, etc.), los datos genéticos se vuelven más accesibles día con día. Actualmente se cuenta con tecnologías para estudiar características de decenas de miles de genes, incluyendo secuencias, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), cuantificación de RNA y proteínas. El análisis eficiente de estos datos requiere de una gran cantidad de herramientas analíticas para recolección de datos (p.e. bases de datos en línea, experimentos biológicos específicos, etc.), pre-procesamiento y control de calidad, normalización, determinación de hipótesis y el análisis estadístico en si mismo, basado en las hipótesis a probar.

Para un correcto análisis de los datos, es crucial el uso de métodos y algoritmos adecuados, con fundamentos matemáticos, que permitan, por ejemplo, determinar la exactitud de las respuestas obtenidas. Avances teóricos, en el área de análisis, incluyen el desarrollo de nuevos métodos de clasificación, estimación de errores y selección de variables para diversos tipos de estudios genéticos.

Aunque este curso dista mucho de manejarán datos complejos, aprenderán a usar algunos de los programas más sencillos y versátiles para calcular los principales índices que nos permiten identificar las variantes genéticas, cuantificar sus frecuencias y relacionarlas con la incidencia de enfermedades o de fenotipos con tasas de crecimiento elevadas.

5.3.2. Objetivo

Con base en los conocimientos adquiridos en las sesiones teóricas, esta serie de prácticas/talleres te permitirán explorar algunos de los programas de cómputo más empleados para la obtención y el análisis de datos genéticos poblacionales.



5.3.2.1. Identificarás, con base en el análisis de secuencias de ADN (región control mitocondrial), las variantes genéticas de un gen presentes a nivel intra e interpoblacional y aprenderás a construir un árbol filogenético.

5.3.2.2. Identificarás, con base en el análisis de fragmentos de PCR marcados con fluorocromos (microsatélites), el genotipo multilocus de individuos de diferentes familias y entenderás las bases del análisis de pedigree y los índices de parentesco.

5.3.2.3. Aprenderás a calcular los niveles de diversidad y los coeficientes de diferenciación genética, que permiten la caracterización de familias, subpoblaciones y poblaciones, a partir de secuencias de ADN y genotipos multilocus.

5.3.3. Material




(DIA), las cuales estarán preparadas con los programas necesarios para el análisis de los

datos.

5.3.4. Desarrollo

5.3.4.1. Análisis de secuencias de ADN mitocondrial

1. Utilizarán el programa MEGA 5.1 (Molecular

Evolutionary Genetics Analysis) que permite

el análisis integral de secuencias de ADN, su

alineamiento, identificación de sitios

variables y regiones conservadas, así como

la reconstrucción filogenética.



2. Busca el ícono del programa en el menú de

inicio y abre el programa. (es una letra M

gris, sobre un cuadro rojo con negro). El

docente te indicará la ubicación temporal de

un folder etiquetado como “Ejemplos Curso

GA”. Localiza dentro de ese folder el archivo

“mtDNA.fas” y ábrelo con el block de notas

(NOTEPAD).

3. Selecciona el comando File/Open en el MEGA

y abre el archivo “mtDNA.fas”, el cual

contiene una lista de secuencias de ADN no

alineadas en formato FASTA.

4. Selecciona del menú del MEGA la opción

Alignment/Align by ClustalW para iniciar el

alineamiento de las secuencias (usa los

criterios automáticos que despliega el

programa).

5. El resultado se puede visualizar tanto como secuencia de nucleótidos (DNA

Sequences), como traducida a proteína (Translated Protein Sequences). Este

archivo lo exportarán usando el comando Data/Export Alignment/MEGA Format

y lo salvarán en el folder “Ejemplos Curso GA” con el nombre “mtDNA.meg”. El

programa solicita un encabezado para el archivo y les preguntará si están

trabajando con una secuencia codificante o no. Seleccionen la opción según sea

el caso.

6. En la ventana principal del MEGA usa el

comando File/Open de nuevo para cargar el

archivo. Activen el archivo dando un toque

sobre el ícono TA, lo que despliega una nueva

pantalla en la que podrán visualizar la secuencia

de nucleótidos completa (ícono TA), la

traducción a proteínas (ícono UUC ►Phe), los

sitios conservados (ícono C), los sitios variables

(ícono V), los sitios parsimoniosamente

informativos (ícono Pi) y los sitios con una sola

sustitución o singletons (ícono S).



7. Selecciona los sitios variables y usa el

comando Data/Export Data y selecciona

la opción Format/Excel Datasheet para

salvar el resumen del análisis en un

formato que despliega solo los sitios

variables para todo el conjunto de

secuencias. Determinen el número de

secuencias distintas (haplotipos) con base

en ese archivo de salida.

8. Finalmente, seleccionen el comando Phylogeny/Construct/Test Neighbor-

Joining Tree en la ventana principal del MEGA. El programa desplegará una

pantalla de preferencias de análisis. Modifiquen los recuadros de Phylogeny Test

para efectuar 1000 réplicas por bootstrap y el recuadro Model/Method para

seleccionar el número de diferencias nucleotidicas (No. of differences).

Procedan con el análisis usando el ícono Compute, que generará el árbol

filogenético.



5.3.4.2. Análisis de fragmentos marcados con fluorescencia: Microsatélites

1. Utilizarán el programa GeneMarker® v1.71, el cual permite la lectura y

asignación de genotipos mediante la detección del tamaño de los alelos durante

una electroforesis capilar en el secuenciador automático.

2. Localicen el folder etiquetado “Msats”

dentro del folder “Ejemplos Curso GA”,

este contiene un número considerable

de archivos con extensión *.fsa. Abran el

programa GeneMarker dando un doble

toque sobre el ícono en el menú de

inicio (es una letra M amarilla/naranja

con la leyenda “Marker” al pie). Al abrir

el programa aparece un cuadro con el

que se inicia el proyecto y se cargan los

archivos para visualizarlos. Usar el

comando Open Data para cargar los

archivos de trabajo.

3. El programa ofrece la opción de agregar

(Add) o eliminar (Remove) archivos de

la lista que será incluida en el análisis.

Los archivos se pueden manejar de

forma individual o como un folder

completo usando el comando Add

folder. En la ventana pueden revisar la

lista de archivos que serán incluidos y

pulsar OK para iniciar el análisis.

Conforme cada muestra se va cargando

aparece una leyenda indicando

Completed.

Manual de Prácticas de Laboratorio de [MATERIA] Anexos Página

100


4. Una vez que hayan cargado la lista

completa, pulsen OK para desplegar la

ventana donde se observan las

gráficas de tamaño de los alelos con

respecto a su intensidad fluorescente

relativa. En esta ventana despliega

solo los datos crudos de cada uno de

los fluorocromos (PET, VIC, NED y

FAM).

5. Al centro de la ventana principal

aparece un recuadro en el que se

muestran dos formatos para iniciar el

análisis (Run y Autorun). Seleccionen

la primera opción, ya que en esta

podrán revisar las opciones del

análisis y confirmar que el estándar o

escalera de fragmentos de tamaño

conocido (size standard) sea la que se

haya utilizado durante la

electroforesis capilar automatizada

(generalmente la Liz®GS600).

6. El siguiente cuadro muestra las

opciones para controlar el ruido de

fondo (background) durante el

análisis. En esa ocasión manejaremos

solamente los valores

predeterminados presionando la

opción Next. El siguiente cuadro

proporciona opciones adicionales en

caso de contar con una escalera

alélica específica para el organismo

que se este analizando (p.e. el sistema

CODIS: Combined DNA Index System).

En este caso no modificarán estos


101


valores y pulsarán directamente OK.

7. Después de hacer las modificaciones

necesarias se inicia el análisis final de

las muestras. Una vez que se despliega

el total de las muestras procesadas,

aparece de nueva cuenta el formato

gráfico corregido con una línea de base

y eliminando la señal de fluorescencia

correspondiente a regiones en las que

no se esperan fragmentos. En esta

nueva ventana se observará la escalera

GS600 (en color naranja) y los

fluorocromos empleados.

8. En el submenú superior izquierdo de la ventana se observan en la tercera, cuarta

y quinta posición, unos cuadros con flechas negras apuntando en diferentes

direcciones. Si se seleccionan, se despliegan los datos en diferentes formatos

(patrón electroforético, alelos en formato numérico y alelos en formato gráfico).

9. En el lado izquierdo de la pantalla se observa la lista de muestras que pueden

activarse en la parte central de la pantalla. Para que puedan visualizarse las

muestras se dan dos toques sobre el archivo correspondiente. También es

posible analizarlas todas a la vez usando el botón derecho del ratón y activando

el comando Select Max.


102



103


10. Para facilitar el análisis, es posible observar de manera específica cada color o la

combinación de colores deseada si se utiliza el ícono de cuadros de colores

dentro de las opciones del submenú (séptimo ícono de izquierda a derecha). Al

dar clic sobre el cuadro de colores aparecerá un cuadro azul, esto muestra sólo

los fragmentos que han sido marcados con FAM.

11. El siguiente toque sobre el cuadro azul despliega el color verde, mostrando sólo

los fragmentos que se hayan marcado con el colorante VIC. En el mismo ícono,

del lado derecho se observa una pequeña pestaña que al abrir muestra todas las

opciones de colores que pueden activarse o desactivarse una por una.


104


12. En las siguientes dos opciones

del submenú se observan dos

lupas, una para reducir o

aumentar las dimensiones de los

picos correspondientes a los

alelos. Manteniendo presionado

el botón izquierdo del ratón de

la computadora y desplazando el

cursor hacia abajo y a la derecha

se reducen las dimensiones de

los picos, mientras que de

derecha a izquierda y hacia

arriba se magnifica la altura de

los picos, más no la intensidad

de la señal fluorescente.

13. El tamaño de los alelos se registra con decimales y posteriormente se construye

una curva de distribución del tamaño de los alelos para identificar las unidades

de repetición que corresponden a cada uno de ellos.

14. Revisen varios de los archivos, asignen el genotipo a varias muestras y discutan

sus registros para evaluar si existe consenso en la forma en la que decidieron

asignar el nombre a cada alelo y en el genotipo multilocus.


105


5.3.4.3. Estimación de los índices de diversidad y coeficientes de diferenciación

genética a partir de datos haploides (secuencias de ADN mitocondrial) y

datos diploides codominantes (microsatélites).

1. Utilizarán el programa Arlequin v3.11, uno de los programas más poderosos y

versátiles para el análisis de cantidades considerables de datos para el estudio

de la dinámica de genes y la inferencia de escenarios demográficos a partir de

una serie de muestras agrupadas en poblaciones.

2. Su interfase gráfica es sumamente amigable, lo que permite que el usuario

realice de forma rápida y relativamente sencilla, una amplia gama de análisis

sobre un mismo juego de datos.

3. Como primer paso localizarán el ícono del programa Arlequin en el menú de

inicio (es un rombo de varios colores) y los archivos que hemos preparado

para que realicen los ejercicios. Los archivos se encuentran en la carpeta

“Ejemplos Curso GA” y se han etiquetado como “GAmtDNA.arp” y

“GAmsats.arp”.

4. Abran ambos archivos *.arp con el block de notas (NOTEPAD) y tómense un

tiempo para identificar las líneas de comando, el formato y la naturaleza de los

datos moleculares contenidos en ellos.

5. Abran el programa dando doble toque

sobre el ícono del Arlequin. En el menú

principal de la ventana del programa,

utilicen el comando Open Project (Abrir

Proyecto) para cargar el archivo de

entrada.


106


6. Abran el archivo “GAmtDNA.arp”. El

programa desplegará una lista de las

muestras y de los grupos en los se han

organizado esas muestras. Desde esta

ventana, activarán la pestaña Settings

(Especificaciones) y seleccionaran el

tipo de análisis que van a realizar.

7. Seleccionen las rutinas Molecular

Diversity Indices (Índices de Diversidad

Molecular), AMOVA (Análisis de

Varianza Molecular) y Population

differentiation (Diferenciación entre

Poblaciones). Para ello deberán dar un

toque sobre la rutina deseada y marcar

los cuadros de la ventana de la

derecha. Los análisis quedarán

activados si el cuadro esta palomeado y

la rutina de la ventana izquierda queda

marcada con un punto rojo.

8. El programa despliega los resultado del análisis en formato *.htlm, por lo que

se requiere de alguna de las plataformas de navegación por la Internet

(FireFox, Internet Explorer, Chrome, etc.).

9. Los archivos de salida son muy extensos, pero ocupan muy poca memoria.

Salven el archivo de salida en formato *.htlm o copiando/pegando todo el

texto en un archivo de WORD (*.doc o *.docx).

10. Repitan todo el protocolo pero ahora con el archivo “GAmsats.arp”. Para este

archivo seleccionen, además de las rutinas Molecular Diversity Indices,

AMOVA y Population differentiation, la rutina Linkage Disequilibrium/Hardy-

Weinberg.

11. Finalmente, con base en los conocimientos que adquirieron durante las

sesiones de la parte teórica, interpretarán los resultados con ayuda del

docente.


107


5.3.4.4. Análisis de asignación poblacional con base en el genotipado con

microsatélites.

1. Utilizarán el macro de Excel GenAlEx v6.41 (Genetic Analysis in Excel) para

analizar de forma gráfica las frecuencias alélicas y calcular las probabilidad de

asignación de los individuos a diferentes familias o poblaciones. Para iniciar el

complemento (macro) deberán localizar el ícono GenAlEx v6.41, que es casi

idéntico al del Excel pero tiene un pequeño cubo de color rojo en la esquina

superior derecha.

2. Al iniciar el programa se despliega una ventana que solicita autorización para

habilitar los complementos o macros. Seleccionen la opción Enable Macros.

Después de desplegar la presentación del programa, se trabaja en la hoja de

cálculo como normalmente se hace en Excel.

3. En el menú de comandos usen File/Open (Abrir archivo) y busquen el archivo

“GenAlex GA.xls” en la carpeta “Ejemplos Curso GA”. El archivo contiene la

base de datos en el formato necesario para trabajar en el Genalex, por lo que

no deberán hacerle cambios. Exploren brevemente el formato del archivo e

identifiquen la información que contiene.

4. En el ménu de comandos del programa aparece, además de los comandos

clásicos del Excel, el comando GenAlex. Dentro de ese comando están todos

los subcomandos para el análisis de datos genéticos. Aunque hay una gran

variedad de análisis disponibles, solo emplearemos algunos de ellos.


108


Principal Coordinates

Coord. 1

Co

ord

. 2

RR

RN

AA

AN

VV

5. Seleccionen el subcomando Distance/Genetic (Distancia Genética) para

calcular la similitud entre los individuos genotipados. Procedan al análisis

dando un toque el recuadro OK (se usarán todos las opciones

predeterminadas). El resultado de este análisis se despliega en forma de una

matriz de distancias pareadas.

6. Estando en la pestaña donde se encuentra la matriz, seleccionen ahora el

subcomando PCA (Principal Components Analyisis). En términos de la

variabilidad genética, el PCA analiza la distribución espacial multidimensional

entre todos los individuos de cada una de las poblaciones analizadas, usando

como base las distancias genéticas calculadas a partir de los genotipos

multilocus.

7. Seleccionen las opciones Tri Distance Matrix (Matriz cuadrada de distancias),

Distance-Standarized (Distancia estandarizada) y Color Code Pops (Códigos

Coloreados para las Poblaciones) tridimensional.


109


8. Procederán ahora al realizar el análisis de

asignación poblacional. Para ello, estando en

la pestaña donde se encuentra la base de

datos original, seleccionen el subcomando

Assignment/Pop Assign (Population

Assignment). En términos de la similitud

genética de los individuos dentro y entre las

poblaciones, el programa arroja como

resultado la probabilidad de que cada

individuo se encuentre correctamente

clasificado en su población de origen y la

probabilidad de que se encuentre mal

clasificado por tener mayor afinidad con otra

población.

9. Usen las opciones predeterminadas y procedan al análisis presionando OK. El

resultado se despliega como una serie de columnas en las que podemos

observar la población de origen y la población a la que fue asignada cada

muestra después del análisis.

10. Finalmente, discutirán los resultados con sus compañeros y el docente.


110



111




un archivo de WORD (*.doc o *.docx). Se les recomienda que al terminar la sesión, o

más tarde ese mismo día, ingresen a su cuenta de correo electrónico y manden este

archivo a la cuenta de correo que el docente les indique. El archivo con las actividades

realizadas en el taller corresponderá al reporte del taller, por lo que no tendrán derecho

a realizar el siguiente taller si no hacen llegar al docente el archivo electrónico a más



1. Excoffier, L. y H.E. L. Lischer (2010) Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources 10: 564-567.

2. Peakall, R. y P.E. Smouse. 2006. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population

genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6: 288-295.

3. Tamura, K, D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei y S. Kumar. 2011. MEGA5:

Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739.

4. SoftGenetics, LLC. 2005. GeneMarker: AFLP/Genotyping Software. State College. 61

pp.


112


Anexo 1

Lineamientos y recomendaciones para la elaboración de los

reportes de laboratorio y trabajos finales

Resumen (hasta 1 punto): No es indispensable, pero de incluirse, éste no debe ser

extenso y debe justificar la importancia del estudio, los aspectos más relevantes de la

metodología y las principales conclusiones. Para el caso de un reporte de práctica de

laboratorio, se les recomienda usar no más de 100 palabras. Un resumen debe

presentarse en un solo párrafo, deben evitarse las referencias y no debe contener un

exceso de valores numéricos correspondientes a los resultados. Podrán obtener hasta

una décima de punto extra cuando el resumen cumpla con los requisitos antes

mencionados.

Introducción y Antecedentes (10 puntos): Deben destacar la problemática que se

abordará, señalar claramente la importancia del estudio y los antecedentes con los que

se cuentan. La manera más adecuada de finalizar la sección de

introducción/antecedentes es justificando la investigación. La introducción y

antecedentes para el reporte de laboratorio no deben exceder de dos cuartillas.

Una buena estrategia para redactar la introducción es contestando las siguientes

preguntas:

¿Qué o quién se va a estudiar?

¿Qué se sabe al respecto y/o qué se desconoce al respecto?

¿Qué aspecto en particular se tratará y de qué forma se abordará?

¿Qué importancia, ventaja o beneficio aporta el estudio?

Objetivo (5 puntos): El objetivo debe definir que es lo que se pretende como producto

del estudio. Debe ser claramente redactado, medible y alcanzable. Se recomienda

redactarlo con un verbo en infinitivo que haga referencia a la búsqueda de un

conocimiento (p.e. evaluar, analizar, aplicar, estudiar, elaborar, etc.)


113


Materiales y Métodos (15 puntos): En esta sección se deben describir los materiales,

procedimientos o métodos experimentales usados en el estudio. No debe presentarse

una lista de materiales y reactivos. Los materiales y métodos empleados deben ser

congruentes con el objetivo planteado. Los métodos de laboratorio deberán detallarse

con el objeto de que puedan ser reproducidos. En caso de que los métodos sean

relativamente comunes, pueden sólo indicarse la(s) referencia(s) bibliográfica(s).

Resultados (20 puntos): Presentación clara y descriptiva de los resultados obtenidos

en la investigación. El uso de cuadros, tablas y figuras deberá ayudar a resumir o resaltar

los resultados y no sólo duplicar la información presentada en los párrafos

correspondientes. Interpretar un resultado no implica que se este discutiendo el mismo,

razón por la que esta sección debe de incluir una interpretación del resultado obtenido*.

* Por ejemplo, al registrar la temperatura del agua en un estanque, las variaciones entre la madrugada, medio

día y noche generan un patrón de ascenso, estabilidad y descenso en los registros. Es obvio que este

resultado se debe al calentamiento natural por efecto de la luz solar, pero el hacerlo notar no implica

discusión alguna, sino una observación. Si la variación de la temperatura es mayor a la que normalmente se

presenta o si existe alguna evidencia de que esta afectando de forma importante la tasa de eclosión,

crecimiento o sobrevivencia, entonces la discusión deberá enfocarse a demostrar dichos efectos.

Discusión (40 puntos): Los resultados obtenidos se compararán con los de otros

estudios, otros investigadores o, para el caso del reporte de laboratorio, con los de sus

compañeros. Deberán resaltarse las diferencias y/o las semejanzas, así como una posible

explicación sobre las mismas.

Conclusiones y/o Recomendaciones (5 puntos): Las conclusiones que se presenten

deben acotarse a aquellas correspondientes con el o los objetivos planteados. Una forma

muy práctica de redactar las conclusiones es considerando que el objetivo es una

pregunta y la conclusión la respuesta. En caso de que se consideren pertinentes, pueden

incluirse recomendaciones para futuros estudios.


114


Citas y Bibliografía (5 puntos): Deberán incluir la lista de las referencias consultadas

que deberán citarse correctamente en el reporte. Las páginas de la Internet que hayan

consultado también deben de incluirse como parte de la bibliografía. Para ello deberán

apegarse a alguno de los formatos que se indican a continuación.

Citas en el cuerpo del documento

Al final de una frase/párrafo:

a) Cuando se trate a un autor, se deberá citar el apellido paterno y el año: (Fernández, 2007) ó (Fernández 2007).

b) Cuando se trate de dos autores, se citarán los apellidos paternos de cada uno de éstos y el año: (Fernández y Vilanova, 2002) ó (Fernández y Vilanova 2002).

c) Cuando se trate de tres o más autores se citará el apellido principal del primer autor seguido de et al. y el año: (Ceballos et al., 2007) ó (Ceballos et al. 2007).

d) Cuando sean más de una, se colocarán en orden cronológico y separado por coma, o bien, por punto y coma dependiendo del formato que se este siguiendo (Gómez, 1999; Farfán, 2001; Ramírez, 2005) ó (Gómez 1999, Farfán 2001, Ramírez 2005).

e) Cuando el autor tiene varias publicaciones para un año, se deben añadir a éste una letra minúscula (a, b, c, etc.): (Nuñez, 1984a; Nuñez, 1984b) ó (Nuñez 1984a, Nuñez 1984b).

f) Las comunicaciones personales se citan sólo en el texto: (Márquez, 1997. Comunicación personal) ó (Márquez 1997, com. pers.). Es recomendable que a manera de nota al pie de página se detalle la adscripción y el correo electrónico de la persona a la que se hace referencia.

Cuando el nombre del autor(es) forma(n) parte de la oración:

a) Se colocará el apellido paterno seguido del año entre paréntesis: León (2007); Columbo (2008) y Vásquez (2007); Ceballos et al. (2011) ó Ceballos y colaboradores (2011)


115


Literatura citada

a) Artículos en revistas:

HOOGLAND, J.L. y P.W. SHERMAN. 1976. Advantages and disadvantages of Bank Swallow (Riparia riparia) coloniality. Ecological Monographs 46:33–58.

MORET, A. Y., A. G. ORTIZ, Y. PÉREZ, M. QUIJADA y M. JEREZ. 2007. Ecuaciones de

volumen para árboles de Samán (Samanea saman (Jacq.) Merr.), provenientes de

potreros en el municipio Machiques de Perijá, estado Zulia, Venezuela. Revista

Forestal Venezolana 51(1): 87-96.

b) Capítulos en libros:

LÓPEZ, R. y F. DELGADO. 2003. Degradación de suelos llaneros venezolanos. In: Tierras

llaneras de Venezuela. J. M. Hétier y R. López (eds.). CIDIAT, Universidad de Los

Andes. Mérida, Venezuela. 183-218 pp.

ROGERS, C.A., R.J. ROBERTSON y B. J. STUTCHBURY. 1991. Patterns and effects of parasitism by Protocalliphora sialia on Tree Swallow nestlings. In: Bird-parasite interactions: ecology, evolution and behaviour (J. E. Loye and M. Zuk, eds.), pp. 123–139. Oxford University Press, Oxford, UK.

c) Libros:

PLONCZAK, M. 1993. Estructura y dinámica de desarrollo de bosques naturales manejados

bajo la modalidad de concesiones en los Llanos occidentales de Venezuela. Instituto

Forestal Latinoamericano. Mérida, Venezuela. 139 p.

SHARPE, R.S., W.R. SILCOCK y J. G. JORGENSEN. 2001. Birds of Nebraska: their distribution

and temporal occurrence. University of Nebraska Press, Lincoln, NE.

d) Tesis:

BROWN, C.R. 1985. The costs and benefits of coloniality in the Cliff Swallow. Tesis de Doctorado. Princeton University, Princeton, NJ.

e) Recursos de Internet:

Los recursos de la Internet pueden citarse siempre y cuando sean importantes,

razonablemente permanentes y cuando no hayan sido impresos en cualquier formato.

Debe incluirse al final de la referencia la fecha en la que se realizó el acceso al recurso.

ORDERS, L.B. [online]. 2004. The Breeding Bird Survey database project.

<http://www.bbs.gov/borders/bbs.html> (29 octubre 2003).


116


Actividad Evaluada Autoevaluación Evaluación por el docente Evaluación Global

Limpieza del área de trabajo antes de

empezar y al concluir la sesión.

Uso adecuado de equipo de seguridad

(guantes/bata).

Uso adecuado y limpieza de los

equipos.

Limpieza del material que regresarán

al almacén.

Anexo 2

Formato de autoevaluación sobre el seguimiento de buenas prácticas

dentro del laboratorio


117


Anexo 3

Normas Generales y Recomendaciones de Seguridad e Higiene

a) Reglamento de los Laboratorios

1. El uso de bata es obligatorio.

2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos de

seguridad disponibles.

3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el caso de una

evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como conocer la localización exacta de

extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.

4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se esté en el laboratorio.

5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las salpicaduras de

productos químicos o sus vapores pueden pasar detrás de las lentes y provocar lesiones en los ojos

antes de poder retirar las lentes. En estos casos es recomendable el uso de gafas graduadas o de

gafas de seguridad cerradas.

6. Sí un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de ojos y lava

completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción. Actúa siempre con urgencia, en

menos de 10 segundos. No dirijas una corriente de alta presión de agua de un grifo directamente al

ojo porque podrías lesionarlo. Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es

necesario pide asistencia médica.

7. 7. El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho cuidado que se

tenga al trabajar, las salpicaduras de productos químicos son inevitables.

8. 8. Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.

9. 9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los alimentos o bebidas se

hayan contaminado con productos químicos.

10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservación de alimentos

y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios.

11. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir del laboratorio.

12. Quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.

13. No inhales, pruebes o huelas productos químicos si no estás debidamente informado.

14. Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de utilizarlos.

15. Para pipetear los líquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, no absorber directamente con

la boca.

16. Cuando calienten tubos de ensayo háganlo siempre en la parte superior del líquido y con agitación

suave (nunca por el fondo), inclinando el tubo y dirigiendo la boca del mismo en una dirección en la

que no se encuentre ninguna persona.


118


17. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro del laboratorio. Sí

hubiese la necesidad, háganlo con precaución. Las botellas siempre deben tomarse por el fondo

(nunca por la boca) y trasportarse en una charola para evitar derrames.

18. El área de trabajo debe mantenerse, despejada, limpia y ordenada en todo momento. Los libros,

chamarras, bolsos y computadoras deberán colocarse en los estantes correspondientes.

19. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar, etc.

20. No se puede hacer ningún experimento no autorizado.

21. No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.

22. No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes.

23. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto estado de uso.

24. Todos los productos químicos tienen que ser manejados con mucho cuidado de acuerdo con las

especificaciones contenidas en las hojas de seguridad de cada una de las sustancias. Esta

información se encuentra a la vista en la etiqueta del rombo de seguridad que deberá tener todo

reactivo (Fig.1).

25. Infórmate del lugar donde se encuentran almacenados los reactivos y de la incompatibilidad de los

mismos para evitar accidentes (Fig. 2)

26. No inhales los vapores de productos químicos. Deberás trabajar en la campana extractora cuando

manipules productos tóxicos, irritantes, corrosivos o lacrimógenos.

Figura 1. Rombo de seguridad empleado para indicar el nivel de riesgo y peligrosidad de cada reactivo, solución o mezcla empleada en el laboratorio.


119


Figura 2. Tabla de incompatibilidad de reactivos y mezclas químicas.


120


b) Medidas de Seguridad Generales en Caso de Accidente

Plan general de emergencia

Dar aviso y activar la alarma.

Ponerse a salvo.

Ayudar a las personas.

Luchar contra el fuego.

Avisar al responsable del departamento.

Evacuación del edificio en caso necesario.

Avisar a ambulancias, bomberos.

Fuego en el laboratorio

Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por la salida principal o por la salida de

emergencia, sí la principal está bloqueada.

Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y conservando siempre la

calma.

Sí el fuego es pequeño y localizado, apagarlo utilizando un extintor adecuado, arena cubriendo el

fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue.

Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilices nunca agua para

extinguir un fuego provocado por la inflamación de un disolvente.

Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, sí el fuego no se puede

controlar rápidamente accionar la alarma de fuego, avisar al servicio de extinción de incendios y

evacuar el edificio.

Fuego en el cuerpo

Sí se te incendia la ropa, pide inmediatamente ayuda.

Estírate en el suelo y rueda sobre ti mismo para apagar las llamas.

No corras ni intentes llegar a la ducha de seguridad si no es que está muy cerca de ti.

Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se está quemando, cúbrele con una manta antifuego,

condúcele hasta la ducha de seguridad, si está cerca, hazle rodar por el suelo, no utilices nunca un

extintor sobre una persona.

Una vez apagado el fuego, mantén a la persona tendida, procurando que no coja frío y

proporciónale asistencia médica.


121


Quemaduras

Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se tratarán lavando

la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.

Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata.

No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves.

Cortes

Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el laboratorio.

Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como

mínimo.

Sí la cortada es pequeña y deja de sangrar en poco tiempo, lávala con agua y jabón y tápala con una

venda.

Sí la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia médica inmediata.

Derrame de productos químicos sobre la piel

Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con

agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15 minutos.

Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la

zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en una pila.

Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo antes posible mientras esté

bajo la ducha.

Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensión de

la herida.

Proporcionar asistencia médica a la persona afectada.

Corrosiones en la piel por ácidos y álcalis

Cuando ocurre una corrosión por ácidos, corta lo más rápidamente posible la ropa, lave con agua

abundantemente la zona afectada, neutralice la acidez con bicarbonato de sodio durante 15-20

minutos, sacar el exceso de pasta formada, seca y cubra la parte afectada con linimento óleo-

calcáreo o parecido.

Cuando se produce una corrosión por álcalis, lave la zona afectada abundantemente con agua

corriente y aclárala con una disolución de ácido acético al 1%, seca y cubre la zona afectada con una

pomada de ácido tánico.


122


Corrosiones en los ojos

En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes se lave el ojo, menos grave

será el daño producido.

Lava los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos como mínimo en una

ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar los ojos.

Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de

los párpados.

Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión.

Ingestión de productos químicos

Antes de cualquier actuación pide asistencia médica.

Sí el paciente está inconsciente, ponerlo en posición lateral de seguridad, con la cabeza de lado, y

estirarle la lengua hacia fuera.


123


Anexo 4

Equivalencias entre las unidades en revoluciones por minuto (RPM) y

fuerza centrífuga relativa (RCF) en función del diámetro del rotor.


124


Anexo 5

Boletín técnico sobre las razones de longitud de onda para la

cuantificación de ácidos nucléicos en el espectrofotómetro

NanoDrop N-1000.


125



126


Anexo 6

Cuantificación de proteínas: Electroforesis en geles discontinuos y

Ensayo Bradford.

Tabla I. Volumen de los componentes requeridos para preparar un gel discontinuo de

poliacrilamida para la electroforesis con Tris-Glicina-SDS (SDS-PAGE)

Gel Apilador al 5% (Stacking Gel)

1 mL de gel 2 mL de gel 3 mL de gel

H2O 0.680 1.400 2.100

Solución de Acrilamida al 30% 0.170 0.330 0.500

1.0 M Tris (pH 6.8) 0.130 0.250 0.380

10% SDS 0.010 0.020 0.030

10% Pesulfato de amonio 0.010 0.020 0.030

TEMED 0.001 0.002 0.003

Gel Separador al 10% (Resolving Gel)

5 mL de gel 10 mL de gel 15 mL de gel

H2O 1.9 4.0 5.9

Solución de Acrilamida al 30% 1.7 3.3 5.0

1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8

10% SDS 0.05 0.1 0.15

10% Pesulfato de amonio 0.05 0.1 0.15

TEMED 0.002 0.004 0.006


127


Tabla II. Intervalo efectivo de separación en geles de poliacrilamida discontinuos

desnaturalizantes (SDS-PAGE) en los que se use una relación molar de 29:1

acrilamida:bisacrilamida

Concentración de Acrilamida (%) Intervalo lineal de separación (kD)

15 10-43

12 12-60

10 20-80

7.5 36-94

5.0 57-212

Ensayo Bradford para la cuantificación de proteínas

El reactivo de Bradford es un colorante que se emplea para la cuantificación de proteínas. El cambio en la coloración del reactivo se relaciona directamente con la concentración de proteína debido a que este se une principalmente a los residuos básicos y aromáticos de los aminoácidos (particularmente a la arginina). La absorbancia máxima de un solución ácida de Coomassie® Brilliant Blue G-250 cambia de 465nm a 595 nm cuando se une a proteína.

1. Prepara el reactivo de trabajo diluyendo 1 parte del reactivo de Bradford con 4 partes de agua destilada y desionizada. Es recomendable que filtres la mezcla con papel Whatman 1 o algún equivalente para remover partículas contaminantes que puedan afectar la precisión de la lectura en el espectrofotómetro. Esta solución de trabajo se puede utilizar hasta dos semanas después de su preparación cuando se almacena a temperatura ambiente.

2. Prepara de tres a cinco diluciones del estándar de proteína (BSA), que representen el intervalo de la solución de proteína que se esta cuantificando (0.05 mg/mL a 0.5 mg/mL). Comúnmente, las soluciones de proteína se evalúan por duplicado o triplicado.


128


3. Agrega 10 μL de cada estándar o muestra por pozo.

4. Agrega a cada pozo 200 μl del reactivo de trabajo. Mezclar perfectamente con ayuda de un mezclador de placas. Otra alternativa es mezclar con pipeta multicanal mediante pipeteo repetitivo. Asegúrate de reemplaza las puntas de la pipeta con el siguiente juego de muestras.

5. Incuba a temperatura ambiente por 5 minutos. La absorbancia se incrementará con el tiempo, el tiempo de incubación no debe ser mayor a 1 hr.

6. Mide la absorbancia a 595 nm y grafica los resultados (Fig. 3).

Figura 3. Curva estándar típica para el ensayo con el reactivo Bio-Rad Protein Assay, gama globulina bovina (estándar I), albúmina de suero bovino (estándar II).O.D. 595 corregida para blanco - 200 – 1, 400 ug/ ml x 0.1 ml = 20-140 ug de proteína.

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