Técnicas enBioquímica

• Univ. Ismar Romero.• Univ. José Rojas.• Univ. Kelvin Rojas.• Univ. Victor Rojas.

Grupo #03

Universidad de CaraboboFacultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba”Campus La Morita

Profa. Fabiola Sarco Lira.

Abril, 2013

ElectroforesisEs una técnica para la separación de moléculas que se basa en la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo, en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.

Afecta la estructura de las proteínas por lo tanto, también afecta a la función de la misma.

Separación, visualización y cuantificación del numero de proteínas de una solución.

Ventajas

Desventajas

Movimiento iónico en un campo eléctrico

Durante el proceso de migración de una partícula cargada en un campo eléctrico, dependiendo de la carga neta ocurrirá lo siguiente:a. Si la partícula posee carga + se moverá hacia el cátodo.b. Si la partícula posee carga – se moverá hacia el ánodo.c. Si la partícula no posee carga no se moverá

Electroquímica moderna, Volumen 1.  John O'Mara Bockris

En la electroforesis, la fuerza que mueve la macromolécula es el potencial eléctrico, E, expresada en voltios/cm.

Principios de Bioquímica Lehninger

La movilidad electroforética de la molécula, μ, es el cociente entre la velocidad de la partícula, V, expresada en cm/seg, y el potencial eléctrico.

La movilidad electroforética esta expresada en cm2 /(V)(s)

La movilidad depende de la carga de la partícula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre.

Proceso Electroforético

Electroforesis libre:Electrodos

Proteínas disueltas en

el buffer

Buffer

Una disolución tamponada de la mezcla de proteínas se coloca en una célula de observación en forma de U.

http://pt7mdv.ceingebi.unam.mx/computo/pdfs/met/Electroforesis/Electroforesis/Introduccion/BoundaryElectr.jpg

Electroforesis de zona :

La disolución a tratar se aplica como una mancha , o como una banda, y las partículas migran a través del disolvente, utilizando además un medio de soporte inerte y homogéneo, tal como el papel o ciertos tipos de geles.

Bioquímica Christopher K.

Mathews

Cámaras Electroforéticas

Cámaras horizontales

En la electroforesis de tipo horizontal generalmente, se trabaja con ADN o ARN. 

Cámaras verticalesEn la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas. 

Medios de Soporte

Papel

Método sencillo y rápido

Separación de:

•Proteínas•Oligonucleótidos•Carbohidratos•Lípidos

Desventajas

•Se desgarra fácilmente•Distorsiona las bandas•Se produce interacción entre las proteínas y los grupos hidroxilo de la celulosa, por lo tanto la migración se frena

Acetato de Celulosa

Se usa en el análisis de fluidos biológicos

Tiempo de análisis corto

Sencillez de la técnica

Desventaja: Su débil resolución

Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se han esterificado por acetilación, por lo que no hay interacción con las proteínas.

Gel

Almidón Técnica barata, fácil y rápida

Poliacrilamida

Agarosa

Soporte mas usado en electroforesisDe alta resoluciónSus componentes son tóxicos

Buena resoluciónSeparación de moléculas grandes con radio mayor a 5-10nm (virus, ácidos nucleicos)

Factores que afectan la Electroforesis

Carga neta Tamaño Intensidad del campo eléctrica Temperatura Medio de soporte Buffer

Electroforesis en gel de

poliacrilamida

¿Qué es la poliacrilamida?

Polímero generado a partir de acrilamida y bisacrilamida. Forma un gel con poros y se usa para realizar electroforesis de macromoléculas, en especial proteínas y fragmentos de ácidos nucleicos.

http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/electro_def.html

¿Como se realiza la electroforesis en gel de poliacrilamida?

• Primeramente se necesita el gel de poliacrilamida, quien funciona como filtro gracias a su estructura porosa.

http://www.esacademic.com/dic.nsf/eswiki/943905 http://clinicalmedicine.blogfa.com/post-544.aspx

¿Como se realiza la electroforesis en gel de

poliacrilamida?• Colocar las muestras en los

pocillos.

• Se aplican cargas eléctricashttp://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof.html

http://preguntassobrecienciaymas.blogspot.com/2012/03/electroforesis-monografia.html

¿Como se realiza la electroforesis en gel de

poliacrilamida?

• Aplicar un colorante tal como el azul de Coomassie.

http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo14.htm

Electroforesis en gel de poliacrilamida en SDSEs otra técnica electroforética también aplicada en

proteínas en la que las mismas sufren desnaturalización.

¿SDS?¿De que habla?

El SDS (Dodecilsulfato sódico) es un compuesto desnaturalizante con una carga fuertemente negativo.

¿Como se realiza la electroforesis en gel de

poliacrilamida SDS?• Primero deben

desnaturalizarse las proteínas.

• En presencia de SDS la proteína:

http://ahorrarnoshacebien.com/articulos/agua-mito-realidad.html

http://mariajosevegamiranda.blogspot.com/2012/11/proteinas.html

http://cvclavoz.com/blog/paralelo/page/6/

http://bioquimica6ce.wikispaces.com/Proteinas

¿Como se realiza la electroforesis en gel de

poliacrilamida SDS?• Se colocan las

muestras en los pocillos y se aplican las cargas eléctricas.

• Se visualizan añadiendo un colorante como el azul de Coomassie

http://farmacologiabasica.blogspot.com/2008/08/electroforesis-en-gel.html

http://coleccion.educ.ar/coleccion/CD17/contenidos/mt/biologia/tecnologiaadn/estudiar_expresion_gen.html

Electroforesis bidimensional

¿Qué es?

Es una técnica para la separación de mezclas complejas de proteínas, ya que la misma permite la separación y visualización de hasta 1.000 proteínas diferentes en un solo gel.

Lehninger 5ta edición

Se incorpora una mezcla de

anfolitos.

¿Cuál es el procedimiento para la

electroforesis bidimensional?• Punto Isoelectrico• Se establece un gradiente de pH.

¿Cuál es el procedimiento para la electroforesis bidimensional?

Primera dimensión . pI decreciente

El gel se coloca sobre un gel de

poliacrilamida SDS

Segunda dimensión

Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS

Peso molecular decreciente

pI decrecient

e

Lehninger 5ta edición

Electroforesis en gel de agarosa

o Es una técnica utilizada para fragmentos grandesde ADN.

¿Agarosa?La agarosa es un polímero de galactosa

http://www.ecogen.com/producto.asp?id=196

¿Cómo se lleva a cabo la electroforesis en gel de

agarosa?• Primero se debe mezclar el polvo de agarosa con

un buffer.

http://www.ugr.es/~mgarrido/Protocolos.html

¿Cómo se lleva a cabo la electroforesis en gel de

agarosa?

http://html.rincondelvago.com/electroforesis-de-acidos-nucleicos.html

¿Cómo se lleva a cabo la electroforesis en gel de

agarosa?

http://oldearth.wordpress.com/2008/10/16/experimentos-de-biologia-molecular-1-electroforesis/

La Espectrofotometría Es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoleculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas)

Principios de la Espectrofotometría

• Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

• La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. En el proceso de absorción de la radiación, un fotón incidente cede su energía a una molécula, lo que da lugar a la excitación de la misma que pasa a un nivel de energía superior.

• Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. La frecuencia de la radiación absorbida es proporcional a la diferencia de energía entre ambos niveles.

• El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

• La espectrofotometría se basa en dos leyes que relacionan la absorción de luz a una determinada longitud de onda con la concentración del material absorbente y la longitud del camino que debe atravesar. Estas dos leyes, que combinadas resultan en la ley de Lambert-Beer

Espectro de absorción• Representación gráfica de la absorbancia de un

analito (o de otra magnitud equivalente) en función de la longitud de onda de la radiación, l, (o de otro parámetro relacionado con la energía de la radiación utilizada).

Ley de Lambert BeerASPECTOS TEÓRICOS

La fotometría

La colorimetría

La espectrofotometría

Medición de luz

Leyes de Lambert y

Beer

Luz monocromáti

ca

Lambert y Beer

relacionan

observando

La medida de la absorción

El espesor de la sustancia absorbente

La cantidad de sustancia que absorbe

crecimiento exponencial de la absorción de radiación

espesor de la región absorbente

En Función de

la cantidad de esa especie

Ley de Lambert:

Medio absorbente

Intensidad transm.

Ley de Lambert Beer«la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución»

1. Agua con azúcar disuelta.2. Agua con mayor cantidad de azúcar.

Ley de Beer:

Sustancia absorbente

Intensidad trans.

Ley de Lambert Beer«La cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz»

1. Agua con azúcar disuelta.

2. Agua con azúcar disuelta en un vaso con mayor diámetro.

Ley de Lambert BeerEstas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer:

«Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado, relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción»

http://absorcion-atomica.blogspot.com/2009/08/la-absorbancia-de-radiacion_11.html

Ley de Lambert Beer

• Transmitancia (T)Es la fracción de radiación incidente transmitida por la solución

Si T se expresa en %,T % = 100 I/I0

T: I/I0

• Absorbancia (A)Es la fracción de radiación incidente absorbida por la solución, expresada como

A = -log T = -log (I/I0) = log (P0/P) = log 1/T

Si T se expresa en % A = log100/T% = 2 -logT%

La ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia está directamente relacionada con las propiedades intrínsecas del analito, con su concentración y con la longitud de la trayectoria del haz de radiación al atravesar la muestra

Ley de Lambert Beer

A = C . ξ  . L

• ξ: Absortividad molarEs una propiedad de la materia relacionada únicamente con la naturaleza de la misma.

a cuando la concentración está en mg/Lξ cuando la concentración está en mol/L

• L: Trayectoria de la radiación a través de la muestra (cm)

• C: Concentración (mg/L ó mol/L)

expbasquimica-g1-zb-09-10.wikispaces.com

Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Crouch, S. R. FUNDAMENTOS DE QUÍMICA ANALÍTICA. Absorción de la luz. MacGraw Hill: México.

Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Crouch, S. R. FUNDAMENTOS DE QUÍMICA ANALÍTICA. Absorción de la luz. MacGraw Hill: México.

Ley de Lambert Beer1) Una disolución 100 µM de un determinado cromóforo tuvo una

transmitancia a 525 nm de 0.5 cuando se midió en una celda 1.5 cm de longitud. Calcular: a) la absorbancia de la disolución; b) la absorptividad molar del cromóforo.

a) A = -log T = - log 0.5 = 0.301

b) A = C . ξ  . L Reordenando la ecuación obtendremos: ξ  = A/(C . L) = 0.301 /(10-4 M x 1.5 cm) = 2 x 103 M-1 cm-1

0,5

0,01% Concentración

% T

ran

smit

an

cia

Nadie puede volver atrás y comenzar de nuevo. Pero cualquiera puede comenzar hoy mismo y hacer un nuevo final, no te rindas.

Anónimo