Practicas de Microbiologia General

Prácticas Ecología Microbiana 2008

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EXPERIENCIA 1:

Estudio Fisicoquímico y Microbiológico de un microcosmos acuático.



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Experiencia 1A: Determinación de las características físico-químicas del medio acuático

El laboratorio está distribuido en puestos independientes, con los reactivos necesarios y las instrucciones detalladas, para la determinación de Nitratos, Nitritos, Amonio, Sulfuros, Fosfatos, Dureza Total, Alcalinidad de Carbonato, pH, Tª , Oxígeno disuelto y Hierro.

1º) Cada pareja filtrará 50 mL del agua problema (contenida en el acuario) sobre un tubo limpio (de 50 mL con faldón y tapón azul) con ayuda de Jeringa de 60 mL y Filtro GF/C Whatman® alojado en portafiltros del mismo fabricante y luego por filtro de 0,22 µm (Serum Acrodisc Pall Gelman Laboratory prod. nº 4525, o similar). Marcará convenientemente el tubo con nombre, contenido y fecha.

2º) A continuación preparará 5 tubos (Tapón verde) conteniendo cada un o 5 mL del agua filtrada; uno más conteniendo 5 mL del control positivo y otro más con 5 mL de agua destilada o control negativo. Posteriormente irá rotando por los diferentes puestos hasta que complete todas las determinaciones. Para hacer las lecturas frente a las cartulinas indicadoras empleará los tubos de vidrio roscado suministrados con el kit.

3º) Todos los resultados se recogerán en el encerado en una tabla y se utilizarán para los

cálculos finales promediándolos y calculando la desviación estandar. 4º) Cada pareja elaborará un informe en el que se recojan los resultados de todas las

determinaciones realizadas y su interpretación. Para ello se les suministrará una tabla con valores guía de diferentes tipos de aguas. El significado de los resultados se discutirá en una sesión posterior (Explicar el procedimiento para las determinaciones, tanto del problema como del control, y para realizar los cálculos y la no necesidad de condiciones estériles. Advertir acerca de las precauciones de seguridad con las muestras y los reactivos y el uso de guantes)



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Material necesario para la Práctica: (General)

Etiquetas para los puestos especificando cada determinación. Maletín de análisis Visocolor® ECO Analysenkoffer Art, nº 931 001 [Macherey-Nagel

(http://www.macherey-nagel.com), distribuido en España por Panreac Química S.A. (http://www.Panreac.es)]

Contiene: Visocolor Eco test Amonio: 0,2 – 3 mg/L NH4

+ ;Art. Nº 931 008 (Refill 931 208) Visocolor Eco test Nitrito: 0,02 – 0,5 mg/L NO2

- ;Art. Nº 931 044 Visocolor Eco test Nitrato: 4 – 120 mg/L NO3

- ;Art. Nº 931 041 Visocolor Eco test Fosfato: 0,2 – 5 mg/L P-PO4

- ;Art. Nº 931 084 Visocolor Eco test Alcalinidad de Carbonato: 1 gota = 1 dº ;Art. Nº 931 014 Visocolor Eco test Dureza Total: 1 gota = 1 dº ;Art. Nº 931 029 Visocolor Eco test pH: 4.0 – 9.0 ;Art. Nº 931 066

Visocolor® ECO Sauerstoff Test Oxígeno disuelto Art, nº 931 088 Botella Visocolor® para determinación de Oxígeno disuelto Art, nº 915 498 Visocolor HE test Hierro: 0,01 – 0,20 mg/L Fe ; Art. Nº 920 040 Guantes varios tamaños 1 Termómetro

(Por cada pareja)

2 folletos de Instrucciones Visocolor® 2 Hojas con valores guía de diferentes tipos de agua (ver apéndices) 1 Tubo de 50 mL (tapón azul con faldón) para muestra filtrada. 7 Tubos de 1º mL (Tapón verde) 1 jeringa de 60 mL + 1 portafiltros+ 1 filtro GF/C Whatman® y 1 filtro de 0,22 µm

(Serum Acrodisc ,Pall Gelman Laboratory o similar). para filtrado de las muestras. 1 jeringa de 5 mL para las diferentes determinaciones 1 tubos 50 ml Control+ (1mg/L N-NH4

+, 0,1 mg/L N-NO2-, 10 mg/L N-NO3

-, 1mg/L P-PO4

-) Papel absorbente 1 pinzas metalicas

Duración:

2 horas aproximadamente.



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Experiencia 1B-1: Recuento en placa y observación de Heterótrofos quimiorganotrofos del agua (((PREVENIR ACERCA DE ESTERILIDAD Y PRECAUCIONES CON LOS MECHEROS!!! 11) Realizar diluciones en agua estéril (tubos Eppendorf) del agua problema: Original, 1/10, 1/100 y 1/1000. Cada pareja hace las cuatro diluciones. (Recordar marcaje de tubos, esterilidad y diluciones) 21) Siembra por extensión, con asa de Digralsky, en 4 placas diferentes (marcadas con la dilución, nombre y fecha) de Agar nutritivo (medio para heterótrofos, composición en Apéndices) de 100 μl de cada una de las diluciones respectivas. (Recordar esterilización con alcohol y extensión según esquema en página siguiente) 3º) Incubación durante 5-7 días a 221C (en nuestro caso T0 ambiente) en la poyata superior del laboratorio. 4º) En una sesión posterior se realizará el recuento y la observación del aspecto y la morfología de las colonias a simple vista y con lupa binocular.



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Material necesario para la Práctica: (Por cada Pareja)

1 tubo con agua estéril en una gradilla 1 Micro Pipeta Automática P1000 1 caja puntas azules estériles 1 bote de vidrio con Eppendorfs estériles y una gradilla 1 asa Digralsky + 1 Bote alcohol 1 mechero de alcohol 4 placas Agar Nutritivo (secas en campana) Muestra problema

Duración:

1 hora aproximadamente.



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Experiencia 1B-2: Diferenciación de colonias de microorganismos mediante microscopía con luz oblicua. Recuento de Heterótrofos Quimioorganotrofos del agua. (ufc/ml) 1º) Tras una minuciosa observación de las colonias crecidas en AN, se realizará el recuento y se seleccionarán 4 colonias por pareja para proceder a su aislamiento y caracterización. Las colonias de diferentes especies de bacterias y otros m.o. pueden diferenciarse más fácilmente si empleamos un Estereomicroscopio con bajo poder de magnificación (Lupa o microscopio de disección) y una iluminación oblicua. Mediante una fuente de luz externa, o la incluida en el estereomicroscopio, podemos utilizar Iluminación oblicua reflejada o Iluminación oblicua transmitida en conjunción con una magnificación de 6 a 60x. La luz oblícua reflejada destaca características de las superficies y los bordes de las colonias que

escaparían a la observación visual directa o con luz recta. Esta método es especialmente recomendable para examinar las colonias que crecen en la superficie de un medio opaco (e.j. Agar-sangre) y también para diferenciar colonias de especies y cepas relacionadas (ej. estreptococos) que de otra forma parecerían iguales.

La luz oblicua transmitida se aconseja para examinar colonias que crecen sobre agar transparente o semi-transparente (técnica de Henry). En ambas técnicas, las placas de cultivo (a ser posible sin tapas) se observan primero a 6x y luego pueden incrementarse los aumentos dependiendo del tamaño de la colonia en cuestión. La iluminación debe ajustarse de tal manera que permita una diferenciación óptima del colorido (más fácilmente visible hacia el centro del campo). La diferenciación de las colonias se basa en el tamaño, tipo de borde, topografía, grado de opacidad y color intrínseco. Adicionalmente, la luz oblicua transmitida es reflejada y refractada por las colonias de tal manera que destaca diferencias en color, refracción y estructuras internas que no son aparentes con la luz vertical normal. De hecho, lo que se produce es un efecto similar al del campo oscuro. Las colonias de cocos o cocobacilos poseen por lo general una estructura interna homogénea y finamente granular mientras que las de bacilos de longitud variable suelen presentar patrones de estrías suaves a muy marcadas. Los bacilos más largos y formadores de cadenas exhiben estructuras prismáticas sorprendentes que están aparentemente relacionadas con la capacidad de refracción de las filas paralelas de bacilos dentro de la colonia. La técnica de Henry de luz oblicua transmitida es de extraordinaria utilidad para detectar colonias con cuya forma estamos familiarizados entre incluso cientos de colonias diferentes. Dado que en una mezcla compleja pueden distinguirse colonias de diferentes géneros y especies, resulta fácil tomar una porción de una de ellas y transferirla a cultivo puro para pruebas de confirmación. Este método también es muy útil para el reconocimiento y selección de colonias mutantes de un determinado organismo. Aunque no guarda relación, esta técnica también se usa para el examen de resultados de tests de aglutinación, hemaglutinación, etc.

Luz



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Fig. Superior: Ejemplo de aspecto de colonias con diferente iluminación, observadas con un Esteromicroscopio (lupa binocular) Zeiss modelo Stemi SV11. Fotografía mediante cámara digital Canon PowerShot G3

Fig. Inferior: Terminología más usual empleada en la descripción de la morfología de las colonias

Duración: 1 Hora aproximadamente

Luz Reflejada Oblicua

Luz Transmitida Recta (campo claro)

Luz Transmitida Oblicua (campo oscuro)



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Experiencia 1B-3: Aislamiento y caracterización de Heterótrofos Quimioorganotrofos del agua. 1º) Se asignará una denominación específica a cada una de las 4 colonias seleccionadas por la pareja respectiva que contendrá: Medio de Cultivo/Año_Pareja/letra de aislado_nº estría (por ejemplo AN08_A1C_1). Además en la placa correspondiente se consignará la fecha de siembra. Esta nomenclatura permitirá en todo momento la identificación inequívoca de las muestras así como su comparación con la base de datos de imágenes que se ira construyendo en la Página WEB de la asignatura. 2º) Se procederá al aislamiento por estría (o agotamiento), en medio Agar Nutritivo (AN), de cada una de las 4 colonias seleccionadas por la pareja e incubación a la temperatura adecuada 5 a 7 días.

3º) El aislamiento se repetirá tantas veces (nunca menos de dos) como sea necesario, hasta obtener un único tipo de colonias idénticas a aquella que se seleccionó en la placa original. 4º) Se fotografiará tanto la placa con el aislamiento definitivo como las colonias aisladas con las iluminaciones que pongan de manifiesto sus características más distintivas. 5º) Se procederá a conservar un stock del aislado en 20% glicerol a -70º C para su conservación.

Dos aislamientos simultáneos en una misma placa



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6º) La caracterización del aislado se llevará a cabo mediante: • Descripción detallada de características de crecimiento colonial en medio sólido. • Observación de la capacidad de movimiento en una gota de agua o 5% glicerol. • Tipo de Tinción de Gram (ver apéndices) y morfología celular.(ej. Bacilos G+) • Existencia y características de formas de resistencia (esporas). • Presencia o ausencia de Catalasa y Oxidasa (ver apéndices).

7º) Posteriormente y si fuera necesario se procedería a la identificación molecular. Material necesario para la Práctica: (Por pareja)

4 placas de Agar Nutritivo bien secas. 2 asas de siembra Mechero de alcohol Papel absorbente Rotulador de Vidrio Agua Oxigenada 30% Tetrametil-1,4-fenilendiamina diclorhidrato (10 mg/mL) Glicerol 5% y 20% estéril Viales de congelación con gradilla

Duración: (La experiencia se prolonga a lo largo de varias sesiones) 1/4 hora aproximadamente cada estría 1/4 hora aproximadamente la preparación de Stocks en glicerol 20% para conservación. 1/4 hora aproximadamente la observación de la movilidad 1/4 hora aproximadamente las pruebas de Catalasa y Oxidasa 1/2 hora aproximadamente la Tinción de Gram, incluida observación microscópica) 1/2 hora aproximadamente la descripción del crecimiento colonial (si no se hizo en su día)



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Experiencia 1B-4: Extracción a pequeña escala de DNA de los HQOs aislados del agua para PCR e identificación molecular.

El protocolo que se explica a continuación es una lisis alcalína sencilla y rápida y funciona muy bien con bacterias Gram negativas, que son las que mas frecuentemente aparecen en medios naturales. En el caso de no obtener buenos resultados, o para otros microorganismos más resistentes (Gram +, Hongos, Levaduras y Algas) se puede aplicar el protocolo alternativo que se proporciona en el apéndice correspondiente. Se realizará la extracción individualmente sobre cada uno de los aislamientos realizados en etapas anteriores de la experiencia 1B, manteniendo rigurosamente la nomenclatura establecida para marcar los diferentes tubos en los que se lleva a cabo la extracción. 1º) Coger el cultivo de placa* (aprox. 1-2 granos de arroz) y resuspender en 500 μL de agua MQ estéril en un tubo Eppendorf. Centrifugar a 10.000xg /4 min. Retirar el sobrenadante y congelar las células sedimentadas durante 1-2 horas (-70ºC, importante para Gram+) 2º) Añadir 200μL de Sarcosyl (0,1% en agua MQ, estéril) a las células congeladas. Resuspender por pipeteo suave y centrifugar a 10.000xg /4 min. 3º) Retirar el sobrenadante y añadir a las células sedimentadas 100 μL de NaOH (0,05M, estéril) 4º) Resuspender las células por pipeteo suave y calentar en un termobloc (previamente calentado) a 100ºC. (4 min. Para Gram- y 10 min. Para Gram+) 5º) Después de la incubación, poner en baño de hielo (2-5 min.) 6º) Añadir 600 μL de agua MQ estéril a la mezcla células-NaOH y resupender por pipeteo suave** 7º) Centrifugar a 4ºC, 5.000xg /4 min. 8º) Recoger 400 μL del sobrenadante (que contiene el DNA) y guardar en alícuotas de 100 μL a –20ºC ó-70ºC. (*) Puede partirse de unos 2 ml de cultivo en medio líquido en fase exponencial tardía (**) Aunque la solución queda alcalina, el bajo volumen empleado para las reacciones de PCR no interferirá posteriormente con éstas Bibliografía: Rivas, R., Velázquez, E., Valverde, A., Mateos, P.F., Martínez-Molina. E. (2001). "A two primers random amplified polymorphic DNA procedure to obtain polymerase chain reaction fingerprints of bacterial species". Electrophoresis 22, 1086–1089.



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Material necesario para la Práctica: (Por pareja)

Placas con los aislamientos previos. 2 asas de siembra Mechero de alcohol Tubo 10 mL con agua MQ estéril Tubos Eppendorf estériles Micropipetas automáticas P1000 y P200 Puntas estériles para micropipetas 1 Eppendorf con 0,1% Sarkosyl estéril 1Eppendorf con 0.05M NaOH estéril Gradilla Eppendorf Microcentrífuga Termobloc Papel absorbente

Duración: Explicación y congelación de las células del punto 1º) aproximadamente 1 h. Extracción y almacenamiento 1 h.



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Experiencia 1C-1: Desarrollo de Biofilms sobre portas de vidrio en medio acuatico 1º) Cada pareja debe montar (usando guantes) un soporte constituido por dos encuadernadores de plástico con 6 portas bien limpios asegurados por gomas elásticas que se introducirán en el acuario para seguir el desarrollo de la formación de Biofilms sobre ellos con el paso del tiempo. Pueden ayudarse de unas pinzas para evitar cortes con el vidrio. (Recordar marcar con Tipex los encuadernadores con nombre y fecha) Se podrían montar alternativas como las mostradas en las figuras de la derecha. En el caso de los portas multipocillo puede después analizarse cada pocillo con una técnica diferente. 2º) En sesiones posteriores y una vez desarrollado el Biofilm se procederá a su observación y análisis por diferentes técnicas. Material necesario para la Práctica: (Por pareja)

2 encuadernadores de plástico 2 gomas elásticas 6 portas normales 1 pinzas metalicas Papel absorbente Etanol común para el laboratorio Tipex7 para marcaje de los encuadernadores Guantes

Duración:

1/2 hora aproximadamente.



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Experiencia 1C-2: Observación y caracterización de los Biofilms desarrollados sobre portas de vidrio en medio acuático A) Tinción de Gram: (más apropiada para procariotas y eucariotas de pequeño tamaño) - Sacar un porta del acuario con ayuda de unas pinzas, eliminar el exceso de agua y limpiar una de las partes con papel absorbente. - Secar al aire con movimientos rápidos - Fijar a la llama del mechero de alcohol (sin que nos queme el porta) - Colocar el porta en soporte de vidrio sobre el cristalizador y proceder a la tinción de Gram (ver Apéndices). Puede hacerse individualmente o buen colectivamente en cubetas. - Anotar y dibujar todas las observaciones realizadas.

B) Montaje húmedo: (mas apropiado para formas de mayor tamaño y observación vital) - Sacar un porta del acuario con ayuda de unas pinzas, eliminar el exceso de agua y limpiar una de las partes con papel absorbente. - Colocar cuidadosamente dos gotas separadas de 5% Glicerol (para evitar la desecación rápida) sobre la cara húmeda. - Añadir a una de las gotas otra gotita de Lugol (I/IK) para aumentar el contraste. - Colocar sobre cada gota un cubre con cuidado de no atrapar burbujas de aire. (Puede sellarse) - Observar al microscopio, con objetivos 10x (enfoque), 40x y 100x (aceite de inmersión). - Anotar y dibujar todas las observaciones realizadas.

TTiinncciioonneess ccoonn LLuuggooll

TTiinncciioonneess GG++ yy GG--



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C) Tinción con DAPI: (más apropiado para recuento total de microorganismos) - Sacar un porta del acuario con ayuda de unas pinzas, eliminar el exceso de agua y limpiar una de las partes con papel absorbente. - Secar al aire con movimientos rápidos - Fijar a la llama del mechero de alcohol (sin que nos queme el porta) - Proceder a la tinción con DAPI (ver Apéndices) - Observar con luz U.V. en Microscopio de Epifluorescencia Material necesario para la Práctica: (por pareja)

Cristalizador o, en su caso, cubetas para tinciones Colorantes de la Tinción de Gram Lugol (I2 +IK) DAPI 5% Glicerol Cubreobjetos Mechero de alcohol Papel absorbente Microscopios óptico y de Epifluorescencia Aceite de inmersión Laca de uñas incolora

Duración aproximada: 1 hora para Gram y Montaje húmedo, incluidas observaciones 1/2 hora para DAPI, incluida observación

Tinción con DAPI



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Experiencia 1D-1: Recuento en placa y observación de Autótrofos fotolitotrofos del agua (((PREVENIR ACERCA DE ESTERILIDAD Y PRECAUCIONES CON LOS MECHEROS!!! 11) Realizar diluciones en agua estéril (tubos Eppendorf) del agua problema: Original, 1/10, y 1/100. Cada pareja hace las tres diluciones. (Recordar marcaje de tubos, esterilidad y diluciones) 2º) Cada pareja prepara 2 series de 3 placas de Agar Blue Green 11 (BG11, composición en apéndices). A una de las series se le añaden 100 μl de una solución de Antibacterianos que se extiende con asa de Digralsky. 31) Siembra por extensión, con asa de Digralsky, en las 2 series de 3 placas diferentes (marcadas con dilución, nombre fecha y tipo de luz) de 100 μl de cada una de las diluciones respectivas. (Recordar esterilización con alcohol y extensión según esquema en página siguiente)

3º)Incubación durante 1 a 2 semanas a 221C (en nuestro caso T0 ambiente) en la ventana (luz solar) o en la poyata superior del laboratorio (luz de tungsteno). 4º) En una sesión posterior se realizará el recuento y la observación del aspecto y la morfología de las colonias a simple vista y con lupa binocular.



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1 tubo con agua estéril en una gradilla 1 Micro Pipeta Automática P1000 1 caja puntas azules estériles 1 bote de vidrio con Eppendorfs estériles y una gradilla 1 asa Digralsky + 1 Bote alcohol 1 mechero de alcohol 4 placas BG11 (secas en campana o estufa) Solución de Antibióticos (Streptomicina y Penicilina) Muestra problema

Duración:

1 hora aproximadamente.



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Experiencia 1D-2: Aislamiento y caracterización de Autótrofos Fotolitotrofos del agua. 1º) Se asignará una denominación específica a cada una de las 4 colonias seleccionadas por la pareja respectiva que contendrá: Medio de Cultivo/Año_Pareja/letra de aislado_nº estría (por ejemplo BG1108_A1C_1). Además en la placa correspondiente se consignará la fecha de siembra. Esta nomenclatura permitirá en todo momento la identificación inequívoca de las muestras así como su comparación con la base de datos de imágenes que se ira construyendo en la Página WEB de la asignatura. 2º) Se procederá al aislamiento por estría (o agotamiento), en medio BG11, de cada una de las 4 colonias seleccionadas por la pareja e incubación con la iluminación y la temperatura adecuada 1 a 2 semanas . 3º) El aislamiento se repetirá tantas veces (nunca menos de dos) como sea necesario, hasta obtener un único tipo de colonias idénticas a aquella que se seleccionó en la placa original. 4º) Se fotografiará tanto la placa con el aislamiento definitivo como las colonias aisladas con las iluminaciones que pongan de manifiesto sus características más distintivas. 5º) Se procederá a conservar un stock del aislado en 20% glicerol a -70º C para su conservación. 6º) La determinación del aislado se llevará a cabo mediante Microscopia óptica con las guías adecuadas. : 7º) Posteriormente y si fuera necesario se procedería a la identificación molecular.



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Material necesario para la Práctica: (Por pareja)

4 placas de BG11 bien secas. 2 asas de siembra Mechero de alcohol Papel absorbente Rotulador de Vidrio Glicerol 5% Viales de congelación con gradilla

Duración: (La experiencia se prolonga a lo largo de varias sesiones) 1/4 hora aproximadamente cada estría 1/4 hora aproximadamente la preparación de Stocks en glicerol 20% para conservación. 1/2 hora aproximadamente la determinación de cada aislado (incluida observación microscópica)



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Experiencia 2:

Estudio de los procesos de descomposición de la materia orgánica en los ciclos BGQs.



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Experiencia 2A-1 Detección de microorganismos productores de enzimas hidrolíticas extracelulares: Inoculación e incubación de placas con sustratos específicos

Debido probablemente a la adaptación a sus hábitats naturales, muchos y variados microorganismos han desarrollado la capacidad de producir y secretar enzimas hidrolíticas al exterior celular. Esto les permite degradar la materia orgánica que les rodea y obtener nutrientes asimilables para su crecimiento. Entre las enzimas producidas están agarasas, celulasas, xilanasas, amilasas, proteasas, peptidasas, β-galactosidasas, nucleasas, fosfatasas, lipasas, pectinasas, queratinasas, quitinasas, etc.

A continuación se explica el protocolo por el cual pueden detectarse microorganismos productores de diferentes actividades hidrolíticas mediante un simple ensayo de crecimiento en placa con diferentes sustratos y posterior tinción para observar los halos de lisis producidos en los diferentes sustratos. Se han escogido algunas actividades hidrolíticas más frecuentes: celulásica o celulolítica, capaz de hidrolizar celulosa o derivados (polímeros lineales de D-glucosa unidos por enlace β(1,4)); amilásica o amilolítica: capaz de hidrolizar almidón (polímero de glucosa con enlaces α(1,4) y α(1,6)); y proteasica o proteolítica: capaz de hidrolizar los enlaces peptídicos de las proteínas.

Se realizará el experimento con un muestra de suelo de jardín diluida a una concentración apropiada para la obtención de microorganismos aislados. También se ensayarán las posibles actividades hidrolíticas de los diferentes aislamientos de HQOs obtenidos en la experiencia 1B-3.

Entre los microorganismos productores, uno de los más representativos es el género Streptomyces, tres de cuyas especies utilizaremos como control positivo. Estas especies son S. halstedii JM8 (JM8), Streptomyces sp.PROTEASA9 (P9) y Streptomyces sp. SF (SF). 1º) Cada grupo tiene 2 placas de medio agar nutritivo (AN) con cada sustrato a utilizar: carboximetilcelulosa (CMC)- actividad célulasica; almidón (ALM)-actividad amilásica; leche -actividad proteolítica. Marcarlas adecuadamente. 2º) Sembrar por extensión una de las placas de cada medio de cultivo con 0,2 ml de una dilución 10-3 de una muestra de suelo de jardín preparada previamente. (10 g de tierra de jardín se agitaron con 100 ml de agua estéril durante al menos 1 hora y del sobrenadante se realizaron diluciones seriadas 1/10 (10-1, 10-2, 10-3) en agua estéril. A continuación se sembraron 0,2 ml de cada dilución en AN para determinar la dilución en la que se obtienen colonias aisladas tras incubación a Tª ambiente ) 3º) Inocular la otra placa de cada sustrato, con la ayuda de palillos estériles, con las tres cepas control de Streptomyces (JM8, P9 y SF) y los correspondientes aislamientos de HQOs que se realizaron con anterioridad. 4º) Incubar las placas a temperatura ambiente durante 3-4 días.



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Material necesario para la práctica: (Por pareja)

2x3 placas AN con cada sustrato (CMC, ALM, y leche)* Micropipetas P200 Puntas amarillas estériles Asas de Digralsky y alcohol de quemar Palillos estériles 1 tubo con 1,5 ml de la dilución del suelo apropiada (10-3) Placa con los microorganismos control (Streptomyces P9, JM8 y SF) Placas con los aislamientos de HQOs de la experiencia 1B-3

(*) Para la preparación de las placas de AN con los sustratos se utilizan soluciones stock previamente esterilizadas de cada uno de ellos a unas concentraciones de 5% (CMC y ALM) o del 10 % (leche). Tras autoclavar el medio AN, se deja enfriar a 55 ºC y se añaden los sustratos para que queden a una concentración final de 0,5 %. Duración: 1 hora aproximadamente



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Experiencia 2A-2. Detección de microorganismos productores de enzimas hidrolíticas extracelulares: Revelado de las actividades hidrolíticas mediante métodos específicos.

Cada una de las actividades hidrolíticas que estamos estudiando se detecta de una manera diferente: 1º) Actividad célulasica Tinción con Rojo Congo de las placas con CMC

- añadir 10 ml de Rojo Congo 0,1 % a cada placa - dejar unos 20-30 minutos - desteñir con 10 ml de ClNa 1M durante otros

20 minutos Tras la tinción las colonias productoras se detectan por presentar un halo amarillento a su alrededor correspondiente a la hidrólisis de la celulosa. El resto de la placa se observa de un color rojo intenso.

2º) Actividad amilásica Tinción de la placa que contiene almidón con lugol (I2/IK)

- añadir unas gotas de lugol a la placa hasta cubrirla y dejar que penetre en el agar.

El almidón de la placa se tiñe de color violeta, apareciendo halos claros alrededor de las colonias productoras, correspondientes a la degradación del almidón. (Con el paso del tiempo la oxidación hace que se produzca una decoloración progresiva)

3º) Actividad proteolítica Observación directa en las placas con leche de la aparición de un halo transparente alrededor de las colonias productoras de proteasas, correspondiente a la degradación de proteínas de la leche. (La definición del halo puede mejorarse mediante la adición de ácido tricloacético (TCA) al 10%)



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Material necesario para la práctica: (Por pareja)

Rojo Congo 0,1 % (25 ml) ClNa 1 M (25 ml) Lugol

Duración: 1 hora aproximadamente



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Experiencia 3:

Estudio Fisicoquímico y Microbiológico del ecosistema de un sedimento lacustre mediante el desarrollo de columnas de Winogradsky.



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Introducción : La Columna de Winogradsky

La columna de Winogradsky, ideada por el microbiólogo ruso Sergei Winogradsky, es un ecosistema modelo que se usa en el estudio de los microrganismos acuáticos y sedimentarios (Eveleigh and Davies 1996). En este sistema se promueve el crecimiento de poblaciones fotosintéticas bacterianas que usan SH2 como donador de electrones en su metabolismo autótrofo fotolitotrofo (fotoautótrofo). La columna consiste en una capa de fango o sedimento colocada en un cilindro alargado de vidrio o plástico. La altura de la columna permite el desarrollo de una zona aerobia en la superficie y zonas sucesivas microaerófila y anaerobias ( anóxicas) bajo la superficie. La columna se expone a la luz para que se desarrollen varias poblaciones fotosintéticas a diferentes profundidades. El fango o sedimento contiene per se, o es suplementado con sustratos de carbono orgánico de utilización lenta, sulfatos y sulfuros. Estas condiciones permiten el crecimiento de numerosas poblaciones tanto heterotrofas como fotoautotrofas, incluyendo las bacterias fotosintéticas anaerobias del azufre. Aunque pueden aplicarse numerosas variaciones, un montaje adecuado consiste en colocar fango, un sustrato carbonado como papel de filtro en trocitos y un poco de CaSO4 y CaCO3 en el fondo de la columna y cubrirlo con capas de arena de color claro y agua (a ser posible del mismo origen que el fango). Estas condiciones favorecen el establecimiento de gradientes de potencial redox y la fácil observación de los microorganismos pigmentados por su contraste con la arena.

La zona superior de la columna suele volverse de color verde debido a que las poblaciones de algas y cianobacterias (capaces de realizar fotosíntesis oxigénica) crecen en esta zona aerobia. El oxígeno producido por estos m.o. ayuda a mantener las condiciones de aerobiosis y permite el desarrollo de poblaciones de hongos y bacterias heterótrofas aerobios. La capa de agua situada en contacto con el sedimento contiene una concentración de oxígeno más reducida y además recibe algo de SH2 que difunde desde las zonas profundas del sedimento. Esta zona es ideal para el crecimiento de los oxidadores de sulfuro microaerófilos Beggiatoa y Thiotrix, organismos del gradiente con crecimiento filamentoso blanco-grisáceo. También se encuentran en esta zona tiobacilos no ácido-tolerantes como Thiobacillus thioparus. La parte superior de la columna de arena es de color marrón-rojizo debido al crecimiento de principalmente fotoheterótrofos anaerobios (Rhodospirillaceae). Bajo ellos, una zona rojo-púrpura es indicativa del crecimiento de las bacterias púrpuras del azufre (Chromatiaceae y Ectothiorhodospiraceae). Aún más abajo, una zona verdosa indica el crecimiento de bacterias verdes del azufre (Chlorobiaceae). La zona de color negro intenso que se extiende hacia arriba desde el fondo del sedimento es resultado de la actividad de los reductores de sulfato (Desulfovibrio, Desulfotomaculum, etc). El color negro se debe a la formación de sulfuros metálicos, principalmente sulfuro ferroso (FeS).

Los sulfuros que se producen por el metabolismo de los reductores de sulfato son aprovechados por las bacterias fotosintéticas anaerobias, verdes y púrpuras, del azufre. Las bacterias verdes del azufre son anaerobias estrictas capaces de desarrollar metabolismo tanto fotoautótrofo como fotoheterótrofo usando sulfuros o azufre como donador de electrones. La oxidación de los sulfuros conduce al depósito de azufre elemental en el exterior celular. La familia Chlorobiaceae con el género Chlorobium son representantes típicos. Las bacterias púrpuras del azufre forman una banda por encima de las verdes. Aunque también son anaeróbicas son en cierta medida menos sensibles al oxígeno y más sensibles al SH2 que las Chlorobiaceae. Entre las bacterias púrpuras del azufre se incluye la familia Chromatiaceae con su género



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representativo Chromatium. Cuando los sulfuros son oxidados por Chromatium, se producen acúmulos de azufre elemental en el interior celular. La familia Ectothiorhodospiraceae deposita azufre fuera de las células. La familia Rhodispirillaceae utiliza compuestos orgánicos reducidos en lugar de sulfuros como donadores de electrones, son por lo tanto fotoheterótrofos.

La columna de Winogradsky es un ecosistema modelo que mimetiza la situación existente en una columna de agua anaeróbica que recibe luz. Una zonación similar puede producirse en sedimentos naturales a escala milimétrica, ya que la luz es incapaz de penetrar en el sedimento. La C.W. es un ecosistema artificial que permite la iluminación a través de la pared transparente. En teoría es posible preparar C.W. mayoritariamente acuáticas, conteniendo una cantidad de sedimento mínima en su parte inferior, lo que sería más cercano a las situaciones naturales. Sin embargo, debido a las corrientes de convección térmicas, se producen mezclas de las capas de agua que dificultan el establecimiento de gradientes redox estables, esenciales para lograr C.W. funcionales.

Una forma de examinar la biota de una C.W. completamente desarrollada consiste en desmontarla capa por capa y examinar por microscopía o aislar y cultivar las algas, protozoos, cianobacterias, Beggiatoa y demás m.o. asociados a cada capa. Otra alternativa consiste en congelar el sedimento y cortarlo en rodajas con una sierra separando las zonas coloreadas. Pueden analizarse las bacterias presentes, o extraerse los diferentes pigmentos fotosintéticos y separarlo e identificarlos por cromatografía. Bibliografía: Eveleigh, D. and Davis, D. (1996) Whimsical wrinkles with Winogradsky´s wonder. SGM Quarterly (UK) 23:106-107 Atlas, R.M. y Bartha, R. (2002) Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental (4ª Ed.) Pearson Education S.A. Madrid.



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Experiencia 3A: Montaje de la columna de Winogradsky Se describe a continuación el montaje de una columna estandar completa sobre la que pueden introducirse las variaciones que se consideren oportunas en función del número de alumnos y la disponibilidad de espacio y tiempo. 1º) Lavar perfectamente una botella de 1,5-2 L de plástico transparente y eliminar las etiquetas. A continuación cortar cuidadósamente con unas tijeras el cuello de la botella para usarlo después como embudo. 2º) Marcar en la parte superior de la columna el nombre de la pareja y las condiciones de la columna. Esta inscripción servirá como referencia para su orientación a la luz. 3º) Pegar, con un poco de cinta adhesiva, en el interior de la botella un electrodo que llegue hasta al fondo y sobresalga al menos 10 cm del borde superior. Pegar el extremo sobresaliente. 4º) Pesar:

5-10 gramos de fuente de Carbono de utilización lenta (papel de filtro cortado en trocitos, serrín, papel de periódico, restos vegetales secos, etc) 5 gramos de Sulfato Cálcico 5 gramos de Carbonato cálcico 4º) En un vaso de precipitados de plástico añadir unos 750 mL de fango, quitando los restos vegetales o piedras que puedan existir (USAR GUANTES). Añadir poco a poco agua (del mismo origen que el fango), si es necesario, a la vez que se remueve con un trozo de madera hasta lograr una crema espesa. (¡Cuidado no añadir demasiada agua!) 5º) Añadir la fuente de carbono, el sulfato y el carbonato, removiendo bien para su perfecta distribución. Asegurarse de que queda una crema fluida que pueda discurrir a través del embudo. 6º) Colocar el embudo en la parte superior de la botella y asegurarlo con cinta adhesiva o con la ayuda de un compañero. Añadir con cuidado una pequeña parte de la mezcla a la base de la botella. 7º) Sujetando la parte superior de la botella golpear unas cuantas veces el fondo sobre la mesa para que se distribuya uniformemente y se elimine el oxigeno atrapado. 8º) Repetir los pasos 6 y 7 varias veces hasta que hayas añadido todo el fango (aprox. 50% del volumen). 9º) Añadir ahora a través del embudo arena de color claro, previamente empapada con agua del mismo origen que el fango, hasta completar el 75% del volumen. 10º) Rellenar cuidadosamente con agua hasta casi el borde y tapar la columna con film transparente asegurándolo con una banda elástica. 11º) Colocar la columna en una ventana en la que no de el sol directo (orientada al norte o cubierta con papel de filtro o a unos 60 cm de una bombilla de unos 40 0 60 W). El nombre de la pareja deberá estar orientado hacia el interior del laboratorio de forma que sea visible. 12º) Observar semanalmente dibujando con detalle o fotografiando los cambios que se vayan produciendo.



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Material necesario para la Práctica: (por pareja)

Vaso de precipitados de 2 a 5 litros Removedores de madera 2 Botellas de plástico transparente 2 electrodos Cinta adhesiva, Film transparente y Bandas elásticas Papel de filtro, Sulfato cálcico y Carbonato cálcico Balanza de precisión, papel de aluminio.y espátulas de pesada Guantes de latex Tijeras Fango de charca de agua dulce, marisma o marino. (Zona con materia vegetal abundante) Agua del mismo origen Arena de color claro Celofán de colores Bolsas de basura grandes para protección de zona de trabajo

Duración aproximada: 1 hora discusión previa de condiciones 1 hora el montaje propiamente dicho



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Experiencia 3B-1: Enriquecimiento en placa y medio líquido de Heterótrofos FotoOrganotrofos (HFOs) de la Columna de Winogradsky, [Bacterias rojas (α- y β-proteobacterias) y verdes (Chloroflexus) no del azufre]. Constituyen estos m.o. un grupo fisiológico muy importante desde el punto de vista ecológico. Algunas bacterias rojas y verdes no del azufre son fotosintéticas anoxigénicas y utilizan materia orgánica como donador de electrones y fuente de carbono. Estos m.o. Heterótrofos fotoorganotrofos (fotoorganoheterótrofos) habitan comunmente lagos y arroyos contaminados. Algunas de estas bacterias pueden crecer también como Autótrofos fotolitotrofos teniendo como donador de electrones al hidrógeno molecular o compuestos reducidos del azufre. Cuando utilizan la luz como fuente de energía lo hacen en anaerobiosis pero muchos pueden crecer en presencia de oxígeno y oscuridad, siendo entonces heterótrofos quimioorganotrofos y perdiendo la pigmentación casi por completo. (((PREVENIR ACERCA DE ESTERILIDAD Y PRECAUCIONES CON LOS MECHEROS!!! 1º) Tomar muestras, con pipeta Pasteur estéril, de las zonas con coloración marrón o rojiza de columnas de Winogradsky incubadas al menos 30 días. Reunir en un tubo estéril de 10 ml (tapón verde). Agitar bien y tomar 1-2 mL para inocular una botellita de vidrio de 50 mL con medio MER. Asegurar que sólo queda una mínima burbuja de aire para permitir expansión y cerrar herméticamente. 2º) Dejar sedimentar las partículas en el tubo y, a partir del sobrenadante, realizar diluciones en agua estéril (tubos Eppendorf) Original, 1/10, 1/100 y 1/1000. Cada pareja hace las cuatro diluciones. (Recordar marcaje de tubos, esterilidad y diluciones. En cualquier momento se puede proceder a la observación microscópica rápida del sobrenadante original) 3º) Cada pareja prepara una serie de 4 placas de Medio de Enriquecimiento de Rhodospirillaceae (MER), (composición en apéndices). Sembrando por extensión, con asa de Digralsky, (marcadas con dilución, nombre fecha y tipo de luz) 100 μl de cada una de las diluciones respectivas. 4º) Introducir las placas inoculadas en una jarra de anaerobios (poner una sin sembrar en la parte inferior) y crear la atmósfera sin oxígeno y con CO2 por medio de un sobre BBL GasPak Plus (Becton Dickinson®). Para ello se introduce un indicador de anaerobiosis en el receptáculo destinado al efecto. A continuación se coloca el sobre con catalizador en la ranura de la rejilla (con la cara impresa hacia dentro) se corta una esquina y se añaden suavemente 10 ml de agua para comenzar la reacción de generación de Hidrógeno y CO2. Se cierra herméticamente con el tornillo excéntrico sin forzar. Cuando el indicador vira a blanco quiere decir que el H2 , en presencia del catalizador de Paladio, se ha combinado con el O2 para formar H20 y se ha generado el CO2, y por tanto se han conseguido las condiciones requeridas.



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5º)Incubación tanto de las botellas como de las Jarras de Anaerobios, durante al menos una semana a T0 ambiente en la poyata superior del laboratorio (luz de tungsteno de 40-60 W a unos 30-50 cm). 6º) En una sesión posterior se realizará el recuento y la observación del aspecto de las botellas y placas y de la morfología de las colonias a simple vista y con lupa binocular. Material necesario para la Práctica: (Por cada Pareja)

1 tubo con agua estéril en una gradilla Micro Pipetas Automáticas P1000 y P200 1 caja puntas azules y otra de puntas amarillas estériles 1 bote de vidrio con Eppendorfs estériles y una gradilla 1 asa Digralsky + 1 Bote alcohol Un paquete con pipetas Pasteur estériles y un chupete 1 mechero de alcohol 4 placas de medio MER (secas en campana o estufa) 1 Botellita de 50 mL con medio MER 1 tubo esteril de 10 mL para Muestra problema Jarra de Anaerobios con sobre BBL GasPak Plus® e indicador de anaerobiosis

Duración:

1 hora y media aproximadamente.



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Experiencia 3B-2: Aislamiento de Heterótrofos FotoOrganotrofos (HFOs) de la Columna de Winogradsky (Bacterias rojas no del azufre, Rhodospirillaceae). 1º) Se asignará una denominación específica a cada una de las 3 colonias seleccionadas por la pareja respectiva que contendrá: Medio de Cultivo/Año_Pareja/letra de aislado_nº estría (por ejemplo MER08_A1C_1). Además en la placa correspondiente se consignará la fecha de siembra. Esta nomenclatura permitirá en todo momento la identificación inequívoca de las muestras así como su comparación con la base de datos de imágenes que se ira construyendo en la Página WEB de la asignatura. 2º) Se procederá al aislamiento por estría (o agotamiento), en medio MER, de cada una de las 3 colonias seleccionadas por la pareja e incubación con la iluminación y la temperatura adecuada 5-7 días . Otra placa se sembrará por agotamiento con 10 µL del cultivo crecido en MER líquido. La incubación se llevará a cabo en jarra de Anaerobios como se describió previamente y con iluminación de tungsteno. 3º) El aislamiento se repetirá tantas veces (nunca menos de dos) como sea necesario, hasta obtener un único tipo de colonias idénticas a aquella que se seleccionó en la placa original. 4º) Se fotografiará tanto la placa con el aislamiento definitivo como las colonias aisladas con las iluminaciones que pongan de manifiesto sus características más distintivas. 5º) Se procederá a conservar un stock del aislado en 20% glicerol a -70º C para su conservación.



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Micro Pipeta Automática P200 1 caja puntas amarillas estériles 1 bote de vidrio con Eppendorfs estériles y una gradilla Un paquete con pipetas Pasteur estériles y un chupete 1 mechero de alcohol 4 placas de medio MER (secas en campana o estufa) Jarra de Anaerobios con sobre BBL GasPak Plus® e indicador de anaerobiosis 2 asas de siembra Glicerol 5% Viales de congelación con gradilla



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Experiencia 3B-3: Caracterización e Identificación tentativa de Heterótrofos FotoOrganotrofos (HFOs) de la Columna de Winogradsky (Bacterias rojas no del azufre, Rhodospirillaceae). 1º) A partir de cada aislamiento hacer una suspensión en agua destilada hasta que ésta adquiera coloración visible. Alternativamente podría disponerse de un cultivo líquido del aislamiento correspondiente en medio MER. 2º) Pesar 5 g de Sacarosa en varios tubos de tapón verde y añadir a cada uno 3,5 mL respectivamente de las suspensiones anteriores. Mezclar por inversión repetida hasta total disolución de la sacarosa. Preparar de idéntica forma un blanco con agua destilada y sacarosa. 3º) La determinación del aislado se llevará a cabo mediante Microscopía óptica (puede hacerse un Gram), estudio del espectro de absorción entre 350-1000 nm y capacidad de crecimiento en aerobiosis y oscuridad. Para ello basta con incubar los aislados en paralelo en luz y anaerobiosis y oscuridad y aerobiosis y comparar luego los crecimientos.

Se utilizará como guía el Capítulo 18 del texto The Prokaryotes: A handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria. Vol I; Ed by Starr, Stolp, Trüper, Balows and Schlegel. Springer-Verlag Heidelberg, (1981) 4º) Posteriormente y si fuera necesario se procedería a la identificación molecular.



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Apéndices



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Medios de Cultivo Agar Nutritivo (Nutrient agar)

Caldo Nutritivo (Nutrient broth)

Extracto de carne 1,0 g/L Extracto de carne 1,0 g/LExtracto de levadura 2,0 g/L Extracto de levadura 2,0 g/LPeptona 5,0 g/L Peptona 5,0 g/LNaCl 5,0 g/L NaCl 5,0 g/LAgar 15,0 g/L Agar - Ajustar a pH 7,4 y esterilizar 15 min a 121ºC en autoclave. Para extender las placas de AN dejar enfriar en baño hasta 47ºC. Usamos habitualmente un preparado comercial de la casa Scharlaü con todos los componentes premezclados que se prepara de acuerdo a las instrucciones del envase (28 g/L en el caso del Agar nutritivo y 13 g/L para el Caldo nutritivo) Medio BG 11 para Enriquecimiento de Cianobacterias

Solución de Elementos Traza A-5

Añadir los componentes en orden a 900 mL de agua Milli-Q (destilada/desionizada) y mezclar concienzudamente. Llevar el volumen a 1 L (¡no utilizar espátulas metálicas!)

H3BO3 (Ac. Bórico) 2.86 g

MnCl2.4H20 (Cloruro manganoso tetrahidrato) 1.81 g

Na2MoO4.2H2O (Molibdato sódico dihidrato) 0.39 g

ZnSO4 .7H2O (Sulfato de Zinc heptahidrato) 0.222 g

CuSO4.5H2O (Sulfato de cobre pentahidrato) 0.079 g

Co(NO3)2.6H20 (Nitrato de cobalto hexahidrato)) 0.049 g

Preparación del medio BG 11 Final ( por Litro) Disolver los componentes en orden en 900 ml de agua Milli-Rho (destilada/desionizada) calentando suavemente hasta ebullición y llevar a 1L. Esterilizar en autoclave 15 min a 15 psi y 1211C. (Puede distribuirse antes en tubos o frascos)

NaNO3 (Nitrato sódico) 1.5 g

MgSO4.7H2O (Sulfato magnésico heptahidrato) 0.075 g

K2HPO4 (Fosfato hidrógeno dipotásico) 0.04 g

CaCl2.2H2O (Cloruro cálcico dihidrato) 0.036 g

Na2CO3 (Carbonato sódico) 0.02 g

Ácido cítrico 6.0 mg

Citrato Férrico Amónico 6.0 mg

EDTA sal disódica (Titriplex) 1.0 mg

Solución de elementos traza A-5 1.0 mL pH 7.1 ± 0.2 a 251C Para preparación de medio sólido añadir 10 g/L de Agar Para Cianobacterias marinas añadir 10 g/L NaCl y 50 μl/L de solución de Vitamina B12 (0,02 mg/mL) en condiciones esteriles después de autoclavar.



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Análisis microscópico de comunidades microbianas naturales Los primitivos microscopios pusieron en evidencia un mundo minúsculo, desconocido hasta entonces, por el simple hecho de magnificar cualquier organismo que estuviera presente en el especimen analizado. Ello permitió la observación y análisis de muestras naturales como infusiones, biofilms, aguas de charcas, etc.. en las que se puso de manifiesto la presencia de complejas comunidades microbianas y que hoy en día todavía nos asombran por su diversidad biológica. El examen microscópico de estas comunidades es a la vez fascinante y frustrante. Fascina la variedad de formas, tamaños y estructuras que pueden observarse y frustra la incapacidad para identificar, por la simple observación, las especies presentes (a diferencia de lo que puede hacerse en estudios zoológicos o botánicos) y para discernir en muchas ocasiones lo que son formas vivas o materiales inertes. Este último problema es muy frecuente ya que en numerosas ocasiones la “porquería visual” en el fondo de la preparación oculta, o al menos dificulta, la presencia de microbios. Un ejemplo lo constituye la observación de bacterias oxidantes del hierro ya que la aparición de formas cristalinas del metal, a las que se adhieren las bacterias, crean patrones visuales en los que los microbios no son distinguibles. Lo mismo sucede con los acúmulos de materia orgánica de sedimentos, tapetes microbianos o biofilms. Estos inconvenientes han podido aliviarse, al menos en parte, con el desarrollo de diferentes técnicas microscópicas. Para entender cómo las nuevas capacidades de los microscopios nos pueden proporcionar información importante acerca de los microbios presentes en una muestra, vamos a considerar las diferentes formas de observación empleadas hoy en día y la información que nos proporciona cada una de ellas. La forma mas simple de microscopía (la microscopía óptica de campo claro) consiste en iluminar directamente la preparación (montaje húmedo) con luz. El problema con esta iluminación directa es que en muchas ocasiones las bacterias no son visibles o no lo son muy claramente, ya que la luz las atraviesa sin encontrar obstáculos. Este problema se disminuye haciendo uso del diafragma de campo, o tiñendo las células con diferentes tipos de colorantes. La tinción de Gram es la más utilizada aunque desgraciadamente no es tan fiable, cuando se aplica a muestras ambientales, como lo es en la microbiología clínica o con cultivos puros. No obstante sirve suficientemente bien para discernir lo animado (aunque haya muerto) de lo inerte. La adición de Lugol (I/KI) nos permite incrementar el contraste de algas y protozoos. También podemos emplear tinciones específicas para el material inerte (por ejemplo, azul de Prusia para el hierro o bencidina para el manganeso). Los microscopios modernos poseen capacidades nuevas como mayor poder de resolución o la posibilidad de utilizar diversas longitudes de ondas de luz incidente. La microscopía de contraste de fases se usa para la observación de montajes húmedos. Este tipo de análisis nos proporciona información no sólo acerca de la forma del microbio, sino también de su posible movilidad y de si ésta es debida al deslizamiento o a la presencia de flagelos. Un organismo que nada rápidamente a través del medio, probablemente lo hace mediante el uso de flagelos, mientras que si resbala lentamente, es deslizante. Aseverar la movilidad es a veces difícil para el principiante debido a que el movimiento Browniano (que se origina al moverse el líquido cuando se comprime la preparación con el objetivo) puede dar la impresión de movimiento real. También es importante conocer la fisiología de los organismos observados. Por ejemplo si se observan bacterias marinas en un montaje en agua destilada, aquellas se lisarán. Otro efecto más sutil es el de la concentración de oxígeno en líquido que hay bajo el porta. Con el tiempo, el medio se vuelve anóxico y bacterias o protozoos, que en principio son móviles y aerobias, se moverán más lentamente o no lo harán en absoluto. Una prueba de que esto está sucediendo es la acumulación de las



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formas móviles en los bordes del cubre o alrededor de posibles burbujas de aire atrapadas en la preparación. La presencia de gránulos de azufre o vacuolas de gas que reflejan la luz, da una apariencia, en contraste de fases, como de luces de un árbol de Navidad. Algo similar sucede con la presencia de esporas, que también refractan la luz de forma muy característica. La microscopía de fluorescencia se emplea para poner de manifiesto microorganismos que contienen moléculas que pueden excitarse con luz de una longitud de onda, para posteriormente emitir luz de una longitud de onda superior. Este tipo de fluorescencia nos muestra a los microorganismos que contienen compuestos fluorescentes como formas brillantes en un fondo oscuro. Por otra parte, en el caso de preparaciones con mucha “porquería”, podemos visualizar mucho más claramente los microorganismos, así como distinguirlos de lo inerte, tiñéndolos con colorantes capaces de intercalarse entre las bases del DNA y volverse fluorescentes exclusivamente en esas condiciones. Primeramente se usaba el Naranja de acridina, pero actualmente se usa más el DAPI (4´,6-diamino-2-diphenylindol) que proporciona una fluorescencia azul una vez intercalado. Esta técnica es especialmente útil si se quieren hacer recuentos de microorganismos totales presentes en una muestra, ya que no dependemos de la capacidad de que crezcan en cultivo, por lo que los números que se obtienen suelen ser varios órdenes de magnitud superiores a los obtenidos por recuento en placa. También es muy util para distinguir microorganismos eucarióticos (la tinción está concentrada y más brillante en el nucleo) de procarióticos (la tinción está dispersa por toda la célula y es más difusa). Los microorganismos fotosintéticos contienen pigmentos que, por si mismos, son fluorescentes y pueden excitarse con luz de diferentes longitudes de onda (autofluorescencia), mientras que los no fotosintéticos permanecen oscuros. Esta propiedad nos puede servir para distinguir, en una misma muestra algas (absorben luz azul-verdosa y la emiten roja) de cianobacterias (absorben luz verde y la emiten roja-naranja) y de bacterias no fotosintéticas teñidas con DAPI (absorben en UV y emiten luz azul). Las Archeas metanogénicas también poseen un conjunto de cofactores enzimáticos que permiten que emitan autofluorescencia azul cuando se iluminan con luz de la longitud de onda adecuada. Aunque todas estas técnicas microscópicas son útiles, no nos sirven para identificar más exactamente los microbios presentes en una comunidad natural determinada. Una técnica más reciente, la hibridación fluorescente in situ (FISH) permite aseverar la identidad de los microorganismos que se visualizan en el microscopio y extraer conclusiones acerca de su distribución espacial y su relación con otros m.o. El empleo de diferentes sondas de DNA, marcadas con colorantes fluorescentes, capaces de hibridar específicamente con las secuencias correspondientes del rRNA contenido en las diferentes especies o dominios nos permite llevar a cabo la identificación deseada. Bibliografía empleada en la elaboración del tema: Saylers, A.A. and Whitt, D.D. (2001) Microbiology: diversity, disease and the environment. Fitzgerald Science press. Bethesda, Maryland. USA. ISBN 1-891786-01-6



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Tinción de Gram sobre muestras fijadas previamente.

Cubrir con Cristal violeta (colorante primario) y mantener 1 minuto - Eliminar el exceso de cristal violeta y lavar cuidadosamente con agua eliminando exceso - Cubrir con Lugol (I/IK, actúa como mordiente) y mantener 1 minuto - Eliminar el exceso de Lugol y lavar cuidadosamente con agua eliminando exceso - Decolorar con etanol-acetona y lavar cuidadosamente con agua eliminando exceso - Cubrir con Safranina (colorante de contraste) y mantener 1 minuto - Eliminar el exceso de Safranina y lavar cuidadosamente con agua eliminando exceso - Dejar secar al aire sobre papel absorbente. - Observar al microscopio, sin cubre, con objetivos 10x (enfoque), 40x y 100x (aceite de inmersión).

Tinción de DNA con DAPI (4´,6-diamino-2-diphenylindol)

Secar al aire la preparación* y fijar a la llama. Añadir 5 a 10 μL de DAPI a un cubre, invertirlo y depositarlo cuidadosamente sobre el porta para no dejar burbujas. Teñir 5 min. Sellar la preparación con laca de uñas. Puede guardarse a 4ºC durante semanas. Observar en microscopio de Epifluorescencia. Preparación del DAPI (1x, guardar a –20ºC en alícuotas de 100 μL):

1 μL de DAPI 1000x (1mg/mL en agua) 10 μL de Antifading 100x (100 mg/mL de p-Phenylendiamine en agua) 500 μL de Glicerol 100% 489 μL H2O

(*) La preparación puede ser una gota de agua, un poco de biofilm o cualquier muestra natural, aunque se haya fijado previamente (con formaldehído o etanol por ejemplo). También puede ponerse en un poco de agua material tomado de una colonia aislada de un cultivo puro o una gota de cultivo crecido en medio líquido.



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Tinción de bacterias del Hierro y Manganeso

Azul de Prusia para tinción del Fe ferrico: Secar al aire la preparación y añadir unas gotas (10-20 μL) de Azul de Prusia (70 mL de 0,1% HCl + 30 gotas de 2% K4[Fe(CN)6]). Teñir durante 10 minutos, preferentemente en cubeta. Luego puede observarse o lavarse con agua y teñir las células con Ziehl-Nielsen Carbolfuchsin (no calentada) preferentemente en cubeta. Alternativamente puede teñirse con DAPI y observar en microscopio de fluorescencia. La tinción proporciona un color azul intenso en los depósitos de hierro férrico. En la práctica: 7 mL H2O MQ + 300 μL de HCl 1N + 700 μL de 2% K4[Fe(CN)6] Bencidina para tinción de Manganeso: Humedecer el material a teñir con un poco de benceno y añadir luego unas gotas (10-20 μL) de 0,5% Bencidina clorhidrato en acético al 50%, dejar unos segundos y retirar la bencidina con papel de filtro. Observar. La tinción proporciona un color verdoso en los depósitos de manganeso. ( Se puede añadir agua o 5% glicerol antes de observar) 5 mL CH3COOH + 5 mL H2O MQ + 0,05 g Bencidina clorhidrato Bibliografía: Hanert, H.H. (1981) AThe genus Siderocapsa (and other Iron- or Manganese- oxidizing Eubacteria)@ en The Prokaryotes Vol I. Edited by M.P. Starr, H. Stolp, H.G. Trüper, A. Balows y H.G. Schlegel. Springer-Verlag New York ISBN 3-540-08871-7



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Tinciones y pruebas bioquímicas para la caracterización de los aislamientos microbianos Tinción de Gram La tinción de la pared celular se realiza mediante Gram por inmersión, para ello se toma una muestra de un cultivo joven en una gotita de agua estéril y se fija en un portaobjetos mediante calor. El porta fijado se sumerge durante 1 minuto en cristal violeta, posteriormente se pasa a una solución de lugol (mordiente) durante 1 minuto, se lava con etanol-acetona (50%) durante 30 segundos y finalmente se sumerge en safranina durante 1 minuto. Entre cada uno de los pasos los portas se lavan con agua destilada (por inmersión). Finalmente las muestras se dejan secar a temperatura ambiente y se observan al microscopio 10x, 40x y 100x (aceite de inmersión). Tinción de esporas Para la tinción de esporas (en los casos en que fue necesario) se utiliza como reactivo el Verde Malaquita. Para ello se toma una muestra de un cultivo maduro en una gotita de agua estéril y se fija mediante calor en un portaobjetos. A continuación se coloca un papel de filtro sobre la muestra y se impregna con verde malaquita, sujetándolo con unas pinzas. El portaobjetos se pasa por encima de una llama hasta que se produce emisión de vapores, se retira y, cuando deja de emitirlos, se vuelve a pasar por la llama (el proceso se repite durante 5 minutos). Posteriormente se elimina el papel de filtro, se lava con agua destilada, y se tiñe con safranina durante 1 minuto. Se vuelve a lavar para eliminar el exceso de colorante y, como último paso, se deja secar sobre un papel de filtro. y se observan al microscopio 10x, 40x y 100x (aceite de inmersión). Prueba de la catalasa Esta técnica se basa en la ruptura del peróxido de hidrógeno formando agua y oxígeno gas todo ello catalizado por la enzima catalasa, la formación de burbujas será indicativo de la presencia de la enzima. Para determinar su presencia se utiliza peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30 %, (éste se conserva en oscuridad a 4 ºC). Cada uno de los aislamientos se crece en placa durante 48 horas a temperatura ambiente, se toma una muestra y se coloca sobre un porta al cual se le ha añadido previamente una gota de peróxido de hidrogeno. La formación o no de burbujas de oxígeno confirma la presencia o ausencia de la enzima. Prueba de la oxidasa En este ensayo se utiliza como reactivo el N,N,N´,N´-tetrametil-1,4-fenilendiamina, diclorhidrato a una concentración de 10 mg/ml. El reactivo se prepara con agua milliQ en el mismo instante de su utilización ya que se degrada con el aire y la luz. El fundamento de la técnica se basa en la utilización de este N,N,N´,N´-tetrametil-1,4-fenilendiamina, diclorhidrato como un donador artificial de electrones para reducir el citocromo c (oxidasa positivo). En este caso el reactivo vira hacia un color azul violaceo oscuro. Si la citocromo oxidasa no está presente el reactivo se mantiene incoloro en su forma reducida y el microorganismo es identificado como oxidasa negativo. La aparición del color ha de producirse antes de un minuto.



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Practicas de Microbiologia General

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