86305420 Manual de Practicas de Microbiologia Ambiental

MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AMBIENTAL

2011

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

FACULTAD DE INGENIERA

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE

INGENIERA AMBIENTAL

ESTUDIANTE: Carlos Alberto Casiano Inga

PROFESORA: Dra. Flor Garca Huamn

CURSO: Microbiologa Ambiental

TEMA: Prcticas de Microbiologa Ambiental

CHACHAPOYAS 2011


2011


MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCIN:

Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad microbiana.

Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia. Abordar el

tema de la microbiologa ambiental resulta largo y complejo, pero seleccionando

algunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de conocer la

interaccin entre los parmetros ambientales y los microorganismos.

Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razn

por la cual es difcil aislarlas. Pero debemos estar preparados para aislar, cultivar e

identificar a la misma. Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales

preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los

microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el

Cultivo.

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los

microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que

permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica

de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin

lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.

Las condiciones que rene un medio de cultivo artificial para que los microorganismos

crezcan son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as

como un grado correcto de acidez o alcalinidad.

El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es

fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe

reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el

que se desarrollan.

La utilizacin de los medios de cultivo son necesarios para:

- Separacin y aislamiento de las distintas especies microbiales presentes en una

muestra.

- Estudio de identificacin de un microorganismo problema.

- Estudios macroscpicos. Visualizar las caractersticas de las colonias en medios

slidos.

- Para la conservacin de especies microbiales o muestras, etc.


2011


Clasificacin de los medios de cultivo:

1.- Segn su naturaleza:

Medios naturales o complejos: constituido por sustancias complejas de origen

animal o vegetal, as como minerales y otras sustancias.

Medios definidos o sintticos: Composicin qumica definida cualitativamente

y cuantitativamente.

2.- Segn su uso:

Medios de enriquecimiento: Son medios lquidos, favorecen el crecimiento de

un tipo de microorganismo en particular

Medios Selectivos: Parecidos a los de enriquecimiento, con la diferencia de ser

slidos, diseados para el aislamiento de microorganismos especficos.

Medios Diferenciales: Contiene indicadores de productos derivados de la

actividad microbiana. Permite revelar caractersticas fisiolgicas de los

microorganismos.

Almacenamiento de los medios de cultivo:

Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25), con poca humedad y

protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves,

hornos ni otra fuente de calor o vapor. Una vez que el medio de cultivo ha sido

preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo

mximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15C. Sin

embargo, almacenados bajo refrigeracin entre 2 y 8C se prolonga la vida til de los

mismos, (nunca por debajo de 0C porque se destruye la estructura del gel). Los

medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su

deshidratacin.

Caractersticas de los microorganismos al momento de preparar un medio de cultivo:

1.- Trfico: requerimientos de carbono y energa, segn los cuales se clasifica en

auttrofos, hetertrofos, quimitrofos (littrofos u organtrofos) y fottrofos.

2.- Respiratorio: Aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerfilos.

3.- Temperatura ptima de Crecimiento: segn el rango de temperatura al cual el

microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en sicrfilos, mesfilos

y termfilos.

4.- Rango de pH: El rango ptimo de pH para la mayora de bacterias oscila entre 6,6 y

7,2.

En el laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma lquida, en cuyo caso se los denomina caldos, o en forma slida si se le agrega agar al caldo.


2011


Constituyentes habituales de los medio de cultivo: Los siguientes elementos son

frecuentemente utilizados en la preparacin de los medios de cultivo.

1.- Agua destilada o desionizada: Libre de inhibidores del crecimiento.

2.- Agar: Utilizado como agente gelificante, para dar solidez a los medios de cultivo. El

componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan algunas

impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se

solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los 98C) y al enfriarse forma un gel

inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los 42C), dependiendo de su grado de

pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura de incubacin. Con la

excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como

nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea

visualizar movilidad se usa agar blando y se le agrega agar al 3 %.

3.- Extractos: Para su preparacin, se utilizan ciertos rganos, tejidos animales o

vegetales (por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.). Son extrados con agua y calor, y

posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados

deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de medios de cultivo.

Por ejemplo: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de

carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas,

mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrgeno y

carbono.

4.- Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales

minerales, carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin

enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, casena,

etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero pueden ser

deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas, peptonas,

polipptidos y aminocidos.

5.- Fluidos Corporales: Sangre completa, plasma o suero sanguneo son

frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos

patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en

condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no

solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin con sustancias que

neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.

6.- Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de

cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Los

microorganismos ms comunes son los neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento

est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o

sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH.

7.- Indicadores de pH: Los indicadores cido base se aaden a menudo a los medios

de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.


2011


8.- Agentes selectivos: La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo

puede convertirlo en selectivo, por ejemplo: cristal violeta, sales biliares, azida sdica,

telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como agentes

selectivos frente a determinados microorganismos.

II. MATERIALES: Adems de un ambiente apto para el trabajo microbiolgico, el laboratorio de microbiologa requiere de una instrumentacin bsica de uso corriente en microbiologa, y para la prctica de Medios de cultivo se utilizaron los siguientes instrumentos:

Tubos de ensayo: Destinados a conservar medios de cultivo en pequeos volmenes. Se utilizan tubos de diversos tamaos. El vidrio debe ser de buena calidad, neutro, transparente e inalterable a los tratamientos.

Placas Petri: Cajas de vidrio de seccin circular, con tapa. Existen de diferentes tamaos segn su uso, aunque las ms frecuentemente utilizadas tienen 10 cm de dimetro.

Pipetas graduadas: Para su uso en el laboratorio de microbiologa se les coloca un tapn de algodn en el extremo superior, con la finalidad de que el operador no aspire los lquidos potencialmente contaminados, o que contamine el medio de cultivo al aspirarlo. Se utiliza para realizar inoculaciones y diluciones.

Matraz de Erlenmeyer: Utilizado para la preparacin de los medios de cultivo, o para el desarrollo de microorganismos en medio lquido con agitacin o aireacin.


2011


Mechero de alcohol: Destinado a proporcionar calor por combustin.

Balanza: Diseados para la determinacin de masas de diversas sustancias.

Fsforo y Cucharita: para tomar muestras de ciertas sustancias.

Varillas de vidrio: Llamados agitadores o baguetas.

Gradillas para tubos de prueba: de metal o de madera para portar los tubos de prueba durante el trabajo.

Cocinas elctricas: utilizadas para fundir ciertas sustancias.


2011


TSI: Agar de tres azcares (lactosa, sacarosa y glucosa) e hierro (citrato frrico), tiosulfato

de sodio, elevada concentracin de aminocidos y rojo fenol como indicador.

LIA:

Citrato: Esta prueba es muy utilizada para la investigacin de bacilos Gram -.

Mc. Conkey: Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que vara hacia rojo a pH

cido cuando la lactosa es fermentada.

Caldo Brila: Caldo verde brillante.

Extracto de levadura:

III. MTODOS: Empezar por explicar la preparacin del caldo brila, el cual nos permitir tener una idea de la elaboracin de los otros medios de cultivo que ya lo tenamos preparados en diferentes matraces. III.I) Caldo Brila Leer las indicaciones del recipiente de Caldo Brila, ste nos permite manejar las cantidades apropiadas, para el Caldo Brila utilizar 40 g. con 100 ml de agua; nosotros deseamos utilizar 400 ml de agua, Qu hacemos? Mediante una regla de tres simple calculamos la cantidad de Caldo Brila a utilizar; de la siguiente manera:

Una vez calculada la cantidad requerida de Caldo Brila procedemos a pesarla. Estos 16 g de Caldo Brila los vertimos en una fiola. Haciendo uso de una pipeta adicionamos agua destilada a la misma. Con leves movimientos circulatorios diluimos la solucin.

Luego haciendo uso de una cocina elctrica se calienta la solucin hasta que sta adquiera el color verde (color caracterstico del Caldo Brila). Se deja enfriar por unos minutos; luego se hace uso de una pipeta para verter la solucin a los tubos de ensayo, aproximadamente hasta la parte superior de un tubo o campana Durham que se encuentran dentro de estos. Estos microtubos deben de ser llenados, para esto se inclina levemente los tubos de ensayos. Hay que recordar que mientras realizamos todo este trabajo, hacemos uso del calor de un mechero para mantener estril nuestros instrumentos de trabajo.


2011


Por ltimo se tapan los tubos de ensayo con porciones de algodn para mantener estril nuestro preparado de Caldo Brila. Colocamos los tubos de ensayo en un depsito forrado con papel blanco, el depsito contiene algodn en el interior para no

causar daos. Se rotula y se coloca en la autoclave (121 x - 1 atm). Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtencin de medios de cultivo tiles. Debe tenerse en mente que la presin vara de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante. De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parmetros que deben tomarse en consideracin en el proceso de autoclavado.

III.II) TSI Ahora cogemos el TSI, el cual est contenido en un matraz y se encuentra solidificado. Para que esta sustancia se encuentre como est ha tenido que seguir los pasos de la elaboracin del Caldo Brila. Para fundirlo utilizaremos una cocina elctrica. Con la ayuda de una pinza se coge el matraz con TSI, se coloca y se retira de la cocina sin dejar de agitarlo levemente, con la finalidad de que el material no se sobrecaliente y cause prejuicios. Al cabo de unos minutos se tendr el TSI lquido. Se deja enfriar el matraz por unos minutos, mientras eso se prepara los tubos de ensayo en los cuales se depositar el TSI, tambin el mechero con alcohol. Una vez que el matraz se encuentra relativamente fro se procede a depositar el TSI en los tubos de ensayo, pero para mantener nuestros materiales esterilizados y mientras se realiza el intercambio de depsito del TSI se hace uso del calor del mechero (calor


2011


seco-fuego directo). Luego raudamente se tapan los tubos de ensayo con algodn de igual forma con el matraz, y se titulan los tubos de ensayo. Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve inclinacin. Una vez que estos se solidifican se colocan en la gradilla. Los pasos realizados con el TSI tambin son aplicados al LIA y al Citrato Tambin tenemos las siguientes sustancias solidificadas en los matraces con procedimientos de preparacin muy parecidos a los del caldo brila: Mc. Conkey y extracto de levadura, pero con la nica diferencia de que estos sern depositados en placas Petri. El procedimiento es el mismo, se funde las sustancias Mc. Conkey y el extracto de levadura, se deja enfriar, luego se vierte en las placas Petri (1/3), se esparce de forma uniforme en toda la placa petri, se tapa y se rotula. Para la esterilizacin de los materiales al verter se utiliza el calor del mechero (calor seco-fuego directo).

IV. RESULTADOS:

Los procedimientos anteriores nos permiten elaborar medios de cultivo, conociendo su tremenda diversidad, para bacterias que sern analizadas y estudiadas en nuestro proceso de aprendizaje. Las diversas sustancias que se utilizan para la elaboracin de un medio de cultivo nos permiten predecir el inmenso nmero de microorganismo que podemos encontrar. Hemos elaborado dos medios de cultivo segn su presentacin:

Medios slidos en placas Petri: estos ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas. El sistema en placa es uno de los medios que permite mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en l. Estos medios de cultivo fueron: Mc. Conkey (color rojizo) y Extracto de Levadura (color marrn).


2011


Medios slidos en tubos: que corresponden a tubos con agar inclinado y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. Estos fueron los siguientes: TSI (color anaranjado), LIA (color purpura claro), Citrato (color verde) y Brila (verde brillante).

V. DISCUSIN:

Qu es un medio de cultivo? Qu tipos de cultivos se ajustan ms a las condiciones naturales? Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estril y que no contenga sustancias inhibidoras.

Caldo Brila Citrato

|

TSI Mc. Conkey

LIA Extracto de Levadura


2011


Por ejemplo el TSI (Triple Sugar Iron) contiene tres azcares (lactosa, sacarosa y glucosa), citrato frrico y tiosulfato de sodio, elevada concentracin de aminocidos y rojo fenol como indicador. Este medio de cultivo en clases futuras nos permitir determinar variedad de bacterias, su composicin, etc. Y continuando con este ejemplo podemos citar que las bacterias cultivadas se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensin superficial. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificacin y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificacin). Las bacterias sulfito-reductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaerbica. Por qu es importante el conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos? Es importante porque nos permite seleccionar el medio de cultivo ms adecuado del mismo. As un medio de cultivo rene los requisitos de los microorganismos y reproduce el ambiente natural en el que se desarrollan. Cul es el principio del TSI? En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de carbono glucosa, lactosa y/o sacarosa, con produccin o no de gases (CO2 y H2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S).

VI. REFERENCIA BIBLIOGRFICA: Manacorda, Ana M., Cuadros, Daniela P. y lvarez, Anah. Manual Prctico de

Microbiologa Ambiental. edicin: 2007. Granados Prez, R. y Villaverde Peris C. Microbiologa: Bacteriologa, medios

de cultivo y pruebas bioqumicas. Editorial Paraninfo.Espaa, 1998. httpwww.microinmuno.qb.fcen.uba.arguia.pdf http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm

Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiolgicos. Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos

Generales (2da edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.

Madigan, M. T.; Martinko G. M.; Parker J. Brock, Biologa de los Microorganismos. Ed. Pretice Hall. 8 edicin. 2004.

Koneman Elmer W. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. 5. Edicin, Washington Square: Lippincott Raven Publishers, 1997: 173- 203


2011


PREPARACIN DE TINCIONES BACTERIANAS

I. INTRODUCCIN:

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver

con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula

y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la

utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos

diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes

celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, etc.

Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas,

proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente,

aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y

alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores

cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en

clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el

agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce

habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las

clulas aparezcan mayores de lo que son realmente, de manera que las medidas de las

clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad

especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia

son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los

constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los

polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el

cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente

(aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente,

tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el

rojo Congo. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con

otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se

denomina mordiente; un mordiente habitual es el lugol. El mordiente se combina con

un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa,

son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen

colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no

produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente

til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la

mayor parte del material no celular no se tie.


2011


II. MATERIALES Y MTODOS

- Muestra de agua con bacterias

- Mechero con alcohol

- Lamina portaobjetos

- Asa bacteriolgica

- Azul de Metileno

- Cristal Violeta

- Lugol (Mordiente)

- Alcohol Cetona (Descolorante)

- Safranina (Colorante de contraste)

En la preparacin de tinciones bacterianas hemos trabajado las de coloracin simple y

las de coloracin Gram.

Coloracin Simple:

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la

misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).

Cogemos nuestra muestra y con ayuda de un asa bacteriolgica extendemos y fijamos

la muestra a un portaobjetos, mientras mantenemos un mechero para mantener

esterilizado la muestra y los materiales. Luego se agrega el colorante azul de metileno;

se lava para quitar el exceso de colorante de modo, que el agua no golpee

directamente la muestra y se lave todo. Luego se deja secar, y nuestra coloracin

simple est lista para observar al microscopio a un aumento de 100x.


2011


Coloracin Gram:

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la

desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias

pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los

trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino

simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).

Contamos con nuestra muestra, la extendemos y la fijamos a una lmina portaobjetos

con ayuda de un asa bacteriolgica; siempre contando con nuestro mechero para la

esterilizacin. Se agrega Cristal violeta por lo tanto nuestra muestra se colorea de azul,

se deja reposar de 3-5 minutos. Luego se lava como se muestra en el dibujo. Se

procede a agregar lugol (mordiente), en este proceso unas se fijan con mayor

intensidad; se deja reposar de 3-5 minutos y se lava nuevamente. Se agrega el alcohol

cetona (descolorante), en este procedimiento las bacterias que no se han fijado bien

se despintan, se deja reposar de 3-5 minutos y se lava. Por ltimo agregamos safranina

(colorante de contraste) que es la que tie a las bacterias que no se han fijado en el

procedimiento anterior, se lava y se deja secar a temperatura ambiente para luego

observar al microscopio con un aumento de 100x.


2011


III. RESULTADOS

Coloracin Simple: Se entiende por tincin (o coloracin) simple al teido de los

microorganismos aplicando slo una solucin colorante (azul de metileno).

Coloracin gram:

ETAPAS EN LA TINCIN

Pasos Mtodo Gram positivas Gram negativas

Colorante Bsico Cristal Violeta

(luego de unos minutos se lava con agua el

exceso de colorante)

Se tie de violeta Se tie de violeta

Mordiente Lugol (pasado unos min. se lava con agua el

exceso de lugol)

Permanece violeta Permanece violeta

Descoloracin

Alcohol-acetona (luego de unos minutos

lavar con agua para

eliminar el resto de disolvente)

Permanece violeta Se descolora

Contraste Fucsina o Safranina

(luego de unos minutos se lava con agua el

exceso de colorante)

Permanece violeta Se tie de rosa

Observar al microscopio Colocar sobre el

frotis una gota de aceite de inmersin.

Violeta Rosa


2011



2011


IV. DISCUSIN

Por qu teir una muestra?

Porque nos permite distinguir a cada una de ellas, diferenciarlas por sus caractersticas

morfolgicas, taxonmicas, etc.

Cmo debe de ser la descoloracin de una muestra?

La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las

clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un

clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.

Qu se hace en la coloracin simple?

Se cubre el frotis, despus de fijado, con la solucin colorante y se deja actuar el

tiempo preciso. Se cubre el preparado con la solucin de uso (azul de metileno

alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.

Se puede agregar un lcali a la solucin de azul de metileno de uso? Por qu si? Por

qu no?

Si se puede agregar un lcali (KOH) como intensificante, que acta haciendo ms

rpida e intensa la reaccin de coloracin.

V. BIBLIOGRAFA

Manual Prctico de Microbiologa. R. Daz, y colaboradores, 2a edicin. Ed. Masson, Barcelona, 1999

Forbes, B. A.- Sahm D. F. Weissfeld A. S. Bailey y Scott, Diagnstico Microbiolgico, 11 Edicin. Editorial Mdico Panamericana. 2004


2011


OBSERVACIN DE LA DIFERENTES FORMAS Y AGRUPACCIONES BACTERIANAS

I. INTRODUCCIN:

Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo

humano, y para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es

indispensable en el Laboratorio de Microbiologa para el estudio de agrupaciones,

morfologa y estructura de los microorganismos, as como su reaccin a diferentes

colorantes, lo cual junto con otros criterios, permitir su identificacin, por lo tanto, es

importante conocer su adecuado manejo.

Para contrastar o realzar de forma especfica distintas caractersticas morfolgicas o

estructurales se emplean tinciones diferenciales. Estas tcnicas tienen un gran inters

en la identificacin y clasificacin de las bacterias. La tincin diferencial ms utilizada

es la tincin de Gram. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian

bacterias cido- alcohol resistentes, las que diferencian estructuras significativas

como las esporas o la tincin negativa de cpsulas.


Aceite de inmersin

Microscopio

Muestra de lactobacilos


2011


A continuacin damos algunos detalles de un microscopio compuesto, con la finalidad

de conocer mejor los instrumentos a utilizar.

Un microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o ms lentes de aumento. Un

microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema ptico.

1) SOPORTE: Es la pieza fija en la que slo la platina y el condensador tienen un

cierto movimiento. Sus principales partes son:

a) Base: Normalmente alberga la fuente de iluminacin, en determinados modelos

incorpora adems, un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de

campo luminoso.

b) Brazo: Soporta todo el sistema ptico, el cabezal porta oculares y el revlver porta

objetivos. En l se dispone tambin un sistema de anclaje de la platina (movimiento de

enfocado de la preparacin).

c) Platina. Es la pieza donde se coloca la preparacin microscpica para su

observacin.

d) El Macromtrico y el Micromtrico: Ambos permiten enfocar la preparacin. El

primero se emplea para un enfoque rpido cuando se trabaja con objetivo de menos

18 de aumento (x10), mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se

utilizan los objetivos de mayor aumento (x40, x100).

2) SISTEMA PTICO: Est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las

lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.

Para poder realizar las observaciones y agrupaciones bacterianas es indispensable

conocer las partes de un microscopio y su manejo; en la parte inferior se muestra las

partes de un microscopio.

Lo primero en esta prctica fue contar con una muestra (preparada en una lmina

portaobjetos), se procede a enfocar las lminas con objetivo de 100x y se pone una

gotita de aceite de inmersin para visualizar.

III. RESULTADOS

Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son caractersticos de especies

definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificacin. Cuando las clulas

microbianas como los cocos se dividen, pueden permanecer unidas unas con otras,

formando arreglos caractersticos.

Los bacilos se dividen nicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden

encontrarse clulas unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del

desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. Las bacterias en

espiral generalmente no se agrupan, crecen individuales y aisladas.

A continuacin algunas de nuestras observaciones como: estructuras de cocos, bacilos

y de estos algunas agrupaciones como diplococos, estafilococos y estreptococos.


2011


Forma Agrupacin Representacin

Coco (esfrico)

Coco nico o micrococo Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical, se separan y conservan su individualidad.

Diplococo cuando las clulas hijas se presentan en parejas

Estreptococo en cadena Cuando las clulas hijas forman cadenas

Estafilococo las clulas permanecen unidas pero despus de una divisin celular en dos o ms planos y los cocos forman grupos irregulares en ocasiones de gran volumen similares a racimos de uvas.

Bacilos En forma de bastn

IV. DISCUSIN

Por qu es importante un microscopio en la observacin de microorganismos?

Porque es la nica manera en que las puedes observar a travs de un instrumento con

lentes de aumento y as identificarlas.

Qu tipo de formas y agrupaciones bacterianas podemos encontrar en una muestra

tomada de un agua contaminada?

Para la muestra que hemos tomado encontramos: Cocos y bacilos y agrupaciones de

diplococos, estreptococos y estafilococos. Pero tambin podemos encontrar espirilos y

agrupaciones de sarcinas, ttradas, etc.

V. BIBLIOGRAFA

Manual Prctico de Microbiologa. R. Daz, y colaboradores, 2a edicin. Ed.

Masson, Barcelona, 1999

Manual de Laboratorio, MICROBIOLOGIA APLICADA. Universidad Autnoma

Metropolitana. www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia

http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bac

t_clasif.htm


2011


TCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

I. INTRODUCCIN:

En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades ms o menos complejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que dependern del tipo de microorganismo y del perodo de tiempo de conservacin que se requiera. Para ello existen tcnicas de siembra, conservacin y mantenimiento de los cultivos microbianos. Una tcnica esencial en Microbiologa es la de obtencin de cultivos puros, a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las tcnicas conocidas como aislamiento. Sembrar: una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicacin, si se incuba en condiciones adecuadas, un tiempo conveniente. Tcnicas para medio slido: Cuando el medio de cultivo a sembrar es slido, se puede sembrar en superficie, en profundidad o en profundidad y superficie.

1.- En superficie:

a). Por estra: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el

fondo diluyendo el inculo en el agua de condensacin que se acumula en esa parte,

luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en

zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.

2.- En profundidad:

a). Por Puntura: El medio de cultivo que se emplea est solidificado en tubo en forma

vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inculo

rpidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La puncin se realiza

en el centro del medio o excntricamente.

3). En profundidad y superficie:

a). Por puntura y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con

mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se

retira y se realiza un trazo o estra en el pico de flauta.


2011



Mechero

Placas Petri

Mac Conkey

TSI

CITRATO

LIA

Asa bacteriolgica

Muestra de leche contaminada

Esptula o hisopo

Tcnicas de siembra:

1.- Por estra: para la elaboracin de esta tcnica de siembra se utiliz agar Mac

Conkey, muestras de: agua estancada y leche contaminada. Este tipo de siembra se

utiliza para un aislamiento primario; se necesita una placa Petri con medio de cultivo

Mac Conkey. Con un asa bacteriolgica cogemos la muestra a utilizar y la estriamos, se

protege la siembra y se rotula. No hay que olvidar que para la esterilidad de nuestro

trabajo se utiliza un mechero.

2.- Por puntura: se esteriliza el asa bacteriolgica, con esta misma se toma una

porcin de nuestra muestra a utilizar y se somete en los tubos de ensayo (TSI, LIA y

CITRATO), aproximadamente hasta los , se retira por el mismo lugar y se estra en el

pico de flauta, luego se tapa el tubo de ensayo y se rotula. Este tipo de tcnica de

siembra nos permite estudiar la bioqumica de los microorganismos.

3.- Por diseminacin: se cuenta con el agar nutritivo solidificado, entonces se funde y

se agrega en una placa Petri entre unos 15 y 18 mL. Se deja enfriar nuevamente, pero

esta vez en la placa Petri, se agrega la muestra (0,1 mL) y se hace la extensin de la

muestra, se protege el material y se rotula.

4.- Por incorporacin: se agrega 1 mL de muestra en la placa Petri estril vaca; se

funde el agar, se deja enfriar y se agrega sobre la muestra aproximadamente 15 a 18

mL y se realiza movimientos giratorios arriba y abajo para homogenizar tanto la

muestra como el agar, se protege y se rotula.


2011


III. RESULTADOS

IV. DISCUSIN

Cul es la finalidad de una siembra?

Puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. La primera se efecta con

cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya sea con el objeto de renovar el medio

de cultivo para perpetuar la especie, o bien para conocer alguna de sus propiedades

culturales o bioqumicas. El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un material

que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para

obtener cultivos puros.

Cul es la finalidad de siembra por incorporacin?

La principal funcin es la de homogenizar tanto la muestra como el medio de cultivo

para el recuento bacteriano. Es muy importante la distribucin de las bacterias.

Cul es la finalidad de la tcnica de siembra por diseminacin?

Con este tipo de siembra lo que se obtendr es la biomasa de los microorganismos

cultivados.

Cul es la diferencia entre los diferentes tipos de siembra?

Todos los tipos de siembra son muy diferentes, los pasos a seguir nos lo demuestran,

por ejemplo en la tcnica de siembra por puntura tenemos los tubos de ensayo con

pico de flauta, la finalidad de esta inclinacin es la utilizacin de la densidad de las

sustancias nutritivas que componen el agar utilizado.

V. BIBLIOGRAFA

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

Gamazo, C., Lpez-Goi, I., y R. Daz. 2005. Manual prctico de microbiologa.

Ed. Masson. S.A. Barcelona. Espaa


2011


RECONOCIMIENTO DE PROTOZOARIOS Y HELMINTOS

I. INTRODUCCIN:

La parasitologa es una ciencia que comprende aquellos seres vivos que de manera

permanente o temporal viven a expensas de otros organismos. El termino parsito es

aplicado a los protozoos, platelmintos y nematelmintos. Estos son excretados por las

heces de modo que pueden ser transmitidos al hombre a travs del agua y suelo.

Algunos parasitarios pueden ser objeto de investigacin en aguas de consumo y agua

utilizada en diferentes actividades; protozoarios como: Entamoeba histolytica, Giardia

lamblia, Cryptosporidium spp. Y algunos Helmintos como: Ascaris lumbricoides,

Trichiuris trichiura, Taenia solium, Enterobius vermicularis, etc. En aguas estancadas

(naturales, piscinas, sistemas de calefaccin y refrigeracin, etc.), pueden vivir

facultativamente en forma parsita: Amibas de vida libre como Acanthamoeba sp. y

Naegleria sp. que suelen provocar inflamaciones de mucosas. Las tcnicas de

investigacin de protozoos parsitos intestinales estn basadas en la deteccin del

parsito tras la filtracin de volmenes de agua.

Protozoarios:

Son seres unicelulares, constituidos por una masa de protoplasma; en su mayora

microscpicos. Se encuentran en todos los ambientes; unos de vida libre, otros

parsitos y soprofitas, algunos poseen estructura relativamente compleja.

El phylum protozoarios incluye ms de 30 especies que pueden atacar al hombre. De

estos, doce son patgenos verdaderos, diez son transmitidos por insectos y el resto

(Giardia lamblia y Entamoeba histoltica) pueden ser transmitidos por moscas o por el

agua.

Helmintos:

Los platelmintos se caracterizan por ser gusanos aplanados, cuyo grupo originario est

constituido por los turbelarios. Los gusanos chupadores (trematodos) y los acintados

(cestodos), viven exclusivamente de modo parasitario.


Microscopio

Muestras de agua

Algunas variedades de helmintos

Aceite de inmersin


2011


III. RESULTADOS

Protozoarios:

Se observaron amebas (Las amebas son protistas unicelulares. Son clulas eucariotas,

que se caracterizan por su forma cambiante, puesto que carecen de pared celular, y

por su movimiento ameboide a base de seudpodos (prolongacin del citoplasma),

que tambin usan para capturar alimentos (a travs del proceso llamado fagocitosis).

Las amebas pueden vivir libres en agua o tierra o parasitando el intestino del hombre

o de los animales.

Helmintos:

El trmino "helminto" se utiliza en referencia a una variedad de gusanos que parasitan

el intestino del ser humano. La infeccin por helmintos es el resultado de la

penetracin de un gusano al interior del cuerpo donde maduran, depositan huevos y

obtienen nutricin del husped. Estas infecciones pueden ser provocadas por

nematodos intestinales presentes en el suelo tales como la lombriz intestinal (Ascaris

lumbricoides) el gusano flageliforme (Trichuris trichiura), la tenia y especies que

habitan en el agua como el Schistosomahaematobiumy S. mansoni.


2011


Trichuris trichiura: Es un parsito que puede ser considerado cosmopolita, al

igual que el Ascarislumbricoides, de localizacin intestinal baja (intestino

grueso) y ciego. El gusano adulto sexualmente maduro mide 5 cinsde longitud

y se presenta en forma de %tigo%la hembra parasitaria estenrollada en un

extremo en forma de mazo de reloj. La infeccin se produce por ingerir las

larvas contenidas en el huevo y cuyo desarrollo se produce entre 1 a 3 meses.

Slo si la infeccin es masiva se produce (6) : diarrea, muco-sanguinolenta,

anemia y en casos extremos por el continuo pujo y tenesmo rectal, que

debilitan los msculos elevadores del ano, se produce el '1elescopaje" rectal,

de tal manera que la mucosa rectal protuyehacia fuera, inclusive aprecindose

los gusanos adultos adheridos a la mucosa. La profilaxis consiste en no ingerir

agua y principalmente verduras crudas.

Ascaris Lumbricoides (las lombrices): El Ascaris lumbricoides es un nematodo

que produce una de las parasitoide mayor difusin en el mundo: la ascariasis.

Esta enfermedad cursa con una sintomatologa muy variable; generalmente es

asintomtica en el adulto, y es en el nio donde vemos la ms florida signo

sintomatologa y las complicaciones de esta enfermedad. Como la mayora de

las enteroparasitosis, la ascariasis prevalece y es endmica en reas

desprovistas de infraestructura sanitaria, con viviendas precarias, pobreza e

ignorancia.


2011


Fasciola

Huevo de heminolepsis nana

IV. DISCUSION

La mayor parte de estos helmintos actan como parsitos por no decir todos, estos

viven parasitando los diversos medios donde se desarrollan. Algunos de ellos causan la

muerte o lesiones graves. Los citados en la parte inferior tienen sntomas muy

variables. Es muy importante su estudio porque le causan dao a los seres humanos,

su estudio sera una de las llaves para conocer ms acerca de este mundo y prevenir

ciertas acciones.

V. BIBLIOGRAFIA

http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p24.pdf

Villegas, Elsi. 2005. Parasitologa. Editorial sombra. Guadalajara. Mexico.

PIEKKARSKI, Gerhard. Tratado de parasitologa. Madrid, Aguilar, 1959

86305420 Manual de Practicas de Microbiologia Ambiental

Documents

Transcript of 86305420 Manual de Practicas de Microbiologia Ambiental