PRACTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE TLAXCALA FACULTAD DE ODONTOLOGIA MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL FACULTAD DE ODONTOLOGIA Página 1 NOMBRE DEL ALUMNO: _____________________________________ _____________________________________ ______________ GRUPO: ELABORÓ: M.en C. Gabriela Vargas Oliver
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE TLAXCALAFACULTAD DE ODONTOLOGIA

MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL

ELABOR: M.en C. Gabriela Vargas Oliver

NOMBRE DEL ALUMNO: ____________________________________________ ____________________________________________

GRUPO: _____________________________________

Reglas de seguridad en el laboratorioFACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 1

EL ALUMNO: 1. Deber de lavarse las manos antes de entrar y de salir de laboratorio. 2. No debe de entrar con alimentos, ni dulces en la boca. 3. Deber usar bata blanca de manga larga perfectamente abotonada y planchada en cada prctica. 4. Deber portar guantes, cubrebocas u otros objetos si el profesor lo considera necesario. 5. Debe de entrar con el cabello perfectamente recogido, sin zapatos abiertos (sandalias, huaraches etc.) 6. Deber depositar la basura correctamente, como lo indicar el profesor en cada prctica. 7. Debe de traer su manual en cada prctica. 8. Conocer las medidas de accin para cualquier tipo de circunstancia que lo amerite. 9. Limpiar la mesa de laboratorio antes y despus de la prctica con alcohol etlico al 70% o con benzal.

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PRACTICAS DE MICROBIOLOGIAPractica 1: MORFOLOGA MICROBIANA Y TINCIN DE GRAM Practica 2: EXUDADO FARNGEO Practica 3: AISLAMIENTO Y CUANTIFICACION DE Streptococcus mutans Practica 4: CULTIVO ANAEROBIO DE UN ABSCESO PERIODONTAL

Practica No. 1FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 3

MORFOLOGA MICROBIANA Y TINCIN DE GRAMINTRODUCCION: Leeuwenhoek observ por primera vez las bacterias en el siglo XVII, y lo hizo con suspensiones de microorganismos sin teir y utilizando un microscopio simple. Hasta el ao de 1884 Christian Gram desarroll un mtodo de tincin que lleva su nombre y que es de enorme utilidad en cualquier laboratorio de bacteriologa. Ya que la tcnica de tincin revela detalles referentes a la forma y agrupacin bacteriana como cualquier otra tcnica de tincin proporciona informacin sobre propiedades estructurales de las bacterias que permiten separarlas en dos grandes grupos: gram positivas y gram negativas. Las bacterias pueden clasificarse morfolgicamente en: cocos (diplococos, estreptococos, estafilococos y sarcina) y bacilos.

Estreptococos o cadenas

diplococos

Estafilococos o grupos

Otro grupo de bacterias son las helicoidales, hay dos tipos de estas y son: rgidas y flexibles. Las especies helicoidales rgidas se presentan en varias familias de esquizomicetos, y las especies helicoidales flexibles suelen denominarse espiroquetas.

La presentacin de cocos en grupos, cadenas o en diplococos depender mucho del medio en donde se encuentre inmerso el cultivo ya que se puede observa mejor su FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 4

agrupacin en caldo( Tood Hewitt, BHI) que en medios slidos (agar sangre de carnero, sal y manitol, etc), en estos no tenemos buena visibilidad de la agrupacin de los cocos para definir si son estreptococos o estafilococos, sin embargo para este fin existe la prueba de la catalasa. La catalasa es una prueba bioqumica presuntiva donde nos indica si es estreptococo (da negativa) o estafilococo (da positiva).

OBJETIVO: El alumno realizar la tincin de gram para el conocimiento de las diferentes formas bacterianas.

MATERIAL: Colorante cristal violeta. Lugol Alcohol cetona Safranina Portaobjetos Mechero Haza bacteriolgica Agua destilada estril Cultivos puros de diferentes bacterias Aceite de inmersin Perxido de hidrgeno Hisopo estril Guantes estriles Abatelengua MATERIAL BIOLGICO:

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y y

Cultivos puros de bacterias Exudado farngeo.

METODO: 1. Preparar un extendido fino del material en estudio sobre el portaobjetos y dejarlo secar al aire. 2. Fijar el material al mechero. 3. Colocar en un soporte para tincin la laminilla. 4. Cubrir con cristal violeta un minuto. 5. Lavar con agua corriente 6. Cubrir con lugol un minuto. 7. Lavar con agua corriente 8. Decolorar con alcohol-cetona. 9. Lavar con agua corriente. 10. Cubrir con safranina 30 seg. 11. Lavar y dejar secar. 12. Montar con aceite de inmersin. 13. Observar al microscopio a 100 X. DETERMINACIN DE CATALASA: Se coloca una gotita de perxido de hidrgeno en el portaobjetos y poner con el aza en punta una pequea cantidad de colonia bacteriana, inmediatamente observar el burbujeo o ausencia de este. Control positivo: Staphylococcus aureus Control negativo: Streptococus spp

RESULTADOS: FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 6

Bacterias gram positivas se tien de azul y las bacterias gram negativas se tien de rojo. Catalasa (+): burbujeo Catalasa (-): ausencia de burbujas REPORTE: Cada alumno entregar su prctica con los dibujos correspondientes: dibujar el color y la forma de las bacterias (cocos, bacilos, espiroquetas, cocobacilos) y el resultado de la catalasa de la bacteria correspondiente. CUESTIONARIO: 1. Cul es el fundamento de la tincin de gram? 2. Qu hace el lugol en la tincin de gram? 3. Para qu sirve el aceite de inmersin? 4. fundamento de la prueba de catalasa? 5. Describe brevemente que diferencias encontraste entre las laminillas que observaste.

REFERENCIAS: y y .Ross P.W., Holbrook W.P. Microbiologa bucal y clnica. Ed. Cientfica Murray P.R., Rosentha K.S. Pfaller M.A. 2006. Microbiologia Mdica, Madrid Elsevier. y De la Rosa F., Prieto P.J. 2003. Microbiologa en Ciencias de la Salud: conceptos y aplicaciones. Madrid Elsevier.

Prctica No. 2FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 7

EXUDADO FARNGEOINTRODUCCION: Exudado farngeo Este cultivo es importante para el diagnstico de ciertos agentes infecciosos, sobre todo en encuestas epidemiolgicas que nos ayudan a definir el canal endmico de los microorganismos, entre los ms importantes patgenos causantes de procesos infecciosos o colonizantes del tracto respiratorio podemos citar a: Streptococcus pneumoniae, Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis,

Haemophilus influenzae, bordetella pertusis, Neisseria meningitidis, S. aureus, el aislamiento de estos microorganismos debe ser analizado en base a un estudio clnico muy preciso. Su utilidad es muy limitada, ya que la mayora de las infecciones en vas respiratorias bajas son de origen viral. La presencia de estas bacterias depender del tipo de pacientes y edad del mismo ya que patgenos como H. influenzae y Streptococos pneumoniae se pueden aislar en pacientes menores de 5 aos, provocando infecciones muy severas como meningitis o neumona. Cabe sealar que una tincin de gran en este sitio anatomico del cuerpo humano no es de importancia clnica ya que es una zona muy rica en flora bacteriana normal, no tenemos griteros para determinar si una muestra es indicativa de infeccin como la que si se tiene con un exudado cervicovaginal.

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OBJETIVO: 1.- El alumno aprender a tomar y sembrar, una muestra de exudado farngeo, para el conocimiento colonial de las bacterias de flora normal. MATERIAL: 1 placa de agar sangre de carnero (5%) 1 placa de agar sal y manitol 1 placa de gelosa chocolate 1 tubo con medio de transporte stuart. kit de tincin de gram 100 ml de solucin salina estril 1 propipeta 1 hisopo estril. 1 abatelenguas estril. 1 Haza bacteriolgica 1 mechero 1 portaobjetos Aceite de inmersin peroxido de hidrogeno. incubadora Centrifuga Agua destilada estril 1 microscopio

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METODO: TOMA DE MUESTRA 1. Presentarse en ayunas, sin lavarse los dientes. 2. Colocar al paciente en una silla con la cabeza hacia arriba, e indicndole que abra la boca y saque la lengua. 3. Con un abatelenguas estril se hace presin hacia abajo en la lengua y con un hisopo se talla la superficie de la faringe amgdalas y en caso de ulceracin del fondo del saco farngeo. 4. Se coloca el hisopo en el medio de transporte stuart. 5. Se inoculan las placas de agar sangre de carnero, sal y manitol en zona estril con el hisopo del medio de transporte. 6. Sembrar por estra cruzada. 7. Incubar a 35-37C por 24 hrs. 8. Revisar placas y hacer tincin de gram. 9. Revisa hemolisis de las colonias: y Colonias F-hemolticas, pequeas, blancas o grises son presuntivas de estreptococos. y Colonias F-hemolticas, grandes, blancas o amarillas son presuntivas de estafilococos.

REPORTE: El alumno entregar los resultados de la morfologa colonial de la bacterias que crecieron en el exudado farngeo, hemolisis, gram y catalasa de las colonias.

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CUESTIONARIO 1. Qu bacterias forman parte de la microflora bacteriana en farnge? 2. Cmo se observa la hemolisis beta en el agar sangre de carnero? 3. Por qu es importante identificar cocos gram positivos en la garganta? 4. Qu tipo de infecciones produce: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Neiserria meningitidis, klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae y Haemophillus influenzae? REFERENCIASy Thouraya Ben-Hamouda, Thierry Foulon, Afef Ben-Cheikh-Masmoudi,Che dlia Fendri, Omrane Belhadj and Kamel Ben-Mahrez. 2003. Molecular epidemiology of an outbreak of multiresistant Klebsiella pneumoniae in a Tunisian neonatal ward. J MED MICROBIOL 52: 427-433. y Tomoyo Ueyama, Yuichi Kurono, Komei Shirabe, Masazumi Takeshita, and Goro Mogi. 1995. High Incidence of Haemophilus influenzae in Nasopharyngeal Secretions and Middle Ear Effusions as Detected by PCR . J CLIN MICROBIOL 33: 18351838.

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Prctica No. 3AISLAMIENTO Y CUANTIFICACION DE Streptococcus mutansINTRODUCCION: La caries dental es una de las infecciones ms comunes en la cavidad oral de los humanos, siendo las bacterias orales como el grupo mutans, el ms implicado en la caries dental, formado por siete especies: S. mutans, S. sobrinus, S. downei, S. rattus, S. cricetus, S. ferus y S. macacae, siendo los dos primeros asociados a caries dental. El grupo mutans posee los antgenos a, b, c, d, f y g, denominados cariotipos donde S. mutans es el cariotipo c y S. sobrinus e , algunos cariotipos como el d no se ha aislado en humanos. En Estados Unidos el cariotipo c es el mas aislado seguido por el e , mientras que en Brasil el cariotipo c se presenta en el 65% y el e en el 35% de casos de caries dental, otros pases como en Europa se encuentra el 50% del c y del e . En Mxico no existen datos epidemiolgicos de que cariotipos sean los mas prevalentes. S. mutans ha mostrado ser ms prevalente que S. sobrinus en muestras de placa dental, sin embargo varios estudios epidemiolgicos han mostrado que la presencia de S. sobrinus es ms asociada con pacientes con un alto grado de caries dental. S. mutans ha mostrado ser ms prevalente que S. sobrinus en muestras de placa dental, sin embargo varios estudios epidemiolgicos han mostrado que la presencia de S. sobrinus es ms asociada en pacientes con un alto grado de caries dental. Estudios realizados usando mtodos como genotipificacion o fenotipificacin, sugieren que las mamas son la principal fuente de infeccin de S. mutans o S. sobrinus para los nios. OBJETIVOS: 1.- El alumno aislar y conocer el crecimiento caracterstico de S. mutans, en saliva. 2.- Cuantificar la cantidad de S. mutans en saliva. MATERIAL: 1 placa de agar mitis salivarius (1% bacitracina) kit de tincin de gram FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 12

1 tubo de vidrio 13X 100 mm estril con tapn de algodn. 1 jarra de anaerobiosis 100 ml de solucin salina estril 1 propipeta 1 sobre para producir anaerobiosis. 1 Haza bacteriolgica 1 mechero 1 portaobjetos Aceite de inmersin Perxido de hidrogeno. Incubadora Centrifuga clnica Agua destilada estril 3 tubos con tapn de rosca estriles o 3 microtubos estriles 3 pipetas estriles de 10 ml o 6 micropipetas estriles azules Micropipeta de 100 1000 Ql 1 microscopio METODOS: TOMA DE MUESTRA: La toma de muestra ser de un integrante del equipo, y este debe de presentarse con lavado de dientes dos horas antes, sin haber ingerido alimento durante este tiempo. CULTIVO DE S. mutans. 1. Se toma una muestra de saliva no estimulada, recolectando la mayor cantidad posible (no menor a 2 ml) en un tubo de ensaye previamente esterilizado y etiquetado para evitar la contaminacin de las muestras. 2. Clarificacin: Las muestras se clarificarlas. centrifugan a 2500 rpm por 5 min para

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3. Diluciones (10-1, 10-2 y 10-3) Se realizan diluciones de las muestras por duplicado con solucin salina estril y se siembran 20Ql de cada dilucin tambin por duplicado en Agar-Mitis-Salivarius-Bacitracina para el crecimiento de S. mutans. La siembra es por goteo no hacer estra.

Colocar 100 Ql de saliva

1

Tomar 100 Ql de esta muestra

2

3

Dilucin 10 -1 Poner 900 Ql de solucin salina estril + 100 Ql de saliva

Dilucin 10 -2 Poner 900 Ql de solucin salina estril + 100 Ql del tubo 1

Dilucin 10 -1 Poner 900 Ql de solucin salina estril + 100 Ql del tubo 2

Sembrar 20 Ql cada dilucin en una placa de agar mitis salivariusDilucin 10-1

Dilucin 10-3

Dilucin 10-2

4. Crecimiento y conteo de colonias. Las placas se incuban en un sistema de anaerobiosis (jarra Gas-Pack) a 37C por 48 horas, se cuentan las colonias presuntivas de S. mutans considerando las colonias adherentes, de color azulgrisceo, con bordes irregulares, apariencia de vidrio esmerilado, opacas a contraluz y de consistencia dura. Una vez identificadas las colonias presuntivas de S. mutans se conservaron en caldo Todd-Hewit a 4C. 5. Tomar una colonia presuntiva realizar tincin de gram y catalasa. CONTROL DE CALIDAD: Se usaran las cepas testigo de S. mutans GS5 y LM7. FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 14

RESULTADOS:

Las colonias de S. mutans aparecen de forma dura de color azul grisceo y con una gotita alrededor de ella que es la dextrana y son catalasa neagativos, cocos gran positivos. Las cuentas son por diluciones es decir se deben de multiplicar el resultado por 1000 que es el factor de dilucin

REPORTE:

El alumno entregar los resultados de la morfologa colonial de la bacterias y la cuenta de UFC de S. mutans.

CUESTIONARIO

1. Qu muestras puedes emplear para aislar S. mutans? 2. Qu caracterstica tienen las colonias de S. mutans en el agar mitis salivarius? 3. Menciona los factores de virulencia de S. mutans

REFERENCIAS

1.- Nogueira R.D., Alves A.C., Napimoga M.H., Smith D.J. y Mattos Graner R.O. 2005. Characterization of Salivary Inmunoglobulin A Responses in Children Heavily Exponed to the Oral Bacterium Streptococcus mutans: Influence of Specific Antigen Recognition in Infection. Infec and Inm. 73: 5675-5684.

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2.- Henrique N.M., Hofling J.F., Inez K.M., Umeko K.R. y Bruno G. R. 2005. Transmission, diversity and virulence factors of Streptococcus mutans genotypes.J Oral Scien. 47: 59-64. 3.- Tanzer J.M., Livingston J., Thompson M.A. 2001. The Microbiology of Primary Dental Caries in Humans.J dent Educ. 65: 1028-1036. 4.- Becker M.R., Paster B.J., Leys E.J., Moeschberger M.L., Kenyon S.G., Galvin J., Boches S.K., Dewhirst F. y Griffen A. 2002. Molecular Analysis of Bacterial Species Associated with Childhood Caries. J. Clin Microbiol. 40: 1001-1009. 5.- Kuramitsu H. y Wang B. 2006. Virulence properties of cariogenic bacteria. BMC oral Health. 6(supl): 511. 6.-Okada M., Soda Y., Hayashi F., Doi T., Suzuki J., Miura K. Y Kozai K. 2005.Longitudinal Study of dental caries incidente associated with Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in pre-school children. J Med Microbiol. 54:661665.

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Prctica No. 4CULTIVO ANAEROBIO DE UN ABSESO PERIODONTALINTRODUCCION: Para el estudio de las bacterias anaerobias, la seleccin de la muestra debe efectuarse estrictamente y solo se aceptaran para su estudio: secreciones bronquiales (obtenidas por puncin trans-traqueal), sangre, liquido cefalorraqudeo, abscesos (puncin), y biopsias de tejidos normalmente estriles. Existen algunos datos que nos indican la posible presencia de una bacteria anaerobia en la muestra: olor ftido, presencia de gas o grnulos en los tejidos, localizacin de la infeccin en la proximidad de una membrana mucosa, coloracin negra, etc. Teniendo en cuenta la tolerancia al oxigeno las bacterias anaerobias se clasifican en: Anaerobias estrictas: Crecen en atmsferas con una tensin de oxgeno inferior a 0.5%. Anaerobias aerotolerantes: Toleran el oxgeno hasta un 8% pero son incapaces de utilizarlo para su metabolismo. La tolerancia al oxgeno de stas bacterias est dada por la presencia de enzimas superoxido dismutasa (SOD), catalasa y peroxidasa que catalizan la conversin de radicales superxido a perxido de hidrgeno menos txico y a oxgeno molecular. Anaerobios Facultativos: No necesitan oxgeno para su desarrollo normal, pero si est presente lo pueden utilizar metabolicamente, es decir que crecen bajo condiciones tanto aerbicas como anaerbicas utilizando el oxgeno como aceptor final de electrones. Microaerofilicas: Crecen en presencia de tensiones de oxigeno mnimas y lo metabolizan utilizndolo como aceptor final de electrones. Necesitan atmsfera de CO2. FUENTES DE INFECCION Las Bacterias anaerobias estn ampliamente distribuidas en la naturaleza. Podemos diferenciar dos clases de fuentes:

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* FUENTES EXOGENAS: - El suelo, agua (Lagos, sedimento de ros, ocanos, aguas cloacales) Alimentos y Tracto gastrointestinal de animales. * FUENTES ENDOGENAS: Cuando se encuentran en el ser humano formando parte de la flora normal en piel y mucosas. En algunos lugares superan a los aerobios en una proporcin de 1:1000. Las fuentes ms importantes son: a) CAVIDAD ORAL: En la boca existe una flora polimicrobiana muy compleja ligada a la variabilidad de las condiciones existentes en el interior de la misma como son: 1.-El potencial redox en los diferentes espacios como pliegues bucales, superficie de la lengua, surcos gingivales, espacios periodontales. 2.- Presencia de placa bacteriana: Entre ms antigua es la placa mejores son las condiciones de anaerobiosis. 3.- Edad: A los pocos das del nacimiento hay temprana implantacin de Lactobacilos y Streptococcus, posteriormente Staphylococcus y Veillonelas. A los 6 meses de edad encontramos Actinomyces, Nocardias, los siguientes gneros: Peptostreptococcus, Veillonella, Propionibacterium, Clostridium, Actinomyces, Fusobacterias. Podemos mencionar como anaerobios componentes de la flora normal de cavidad oral y Tracto Respiratorio Superior

Eubacterium, Prevotella, Bacteroides, Fusobacterium.

MATERIAL: 1 jeringa estril de insulina Portaobjetos Placa de agar sangre hemina menadiona Medio tioglicolato Haza bacteriolgca

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Jarra gaspak Sobre de anaerobiosis Kit de tincin de gran

METODO:1. Tomar la muestra con una jeringa estril el exudado del absceso e inmediatamente tapar la jeringa y colocar parte de la muestra en el medio tioglicolato. 2. La otra parte del exudado sembrarlo inmediatamente en gelosa sangre de carnero con hemina menadiona en estra cruzada. 3. Incubar a 37 C en anaerobiosis el tubo y la placa durante 24 hrs. 4. Revisar el cultivo y morfologa colonial del crecimiento.

RESULTADOS Observar el crecimiento de las colonias, escribir las caractersticas de las colonias observadas (hemolisis ) y compararlas con los datos proporcionados por el profesor.

REFERENCIAS: y Neringa Sku ait , Vytaut Pe iulien 1, Vita Ma iulskien . 2009.Microbial

infection and its control in cases of symptomatic apical periodontitis: a review. Medicina (Kaunas), 45(5):343-350. y Christina O. Igboin, Ann L. Griffen, and Eugene J. LeysI. 2009. Porphyromonas gingivalis Strain Diversity. J Clin Microbiol. 47: 30733081. y D. Robertson1 and A. J. Smith. 2009. The abscess. J Med Microbiol (2009) 58:155162. microbiology of the acute dental

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y

Dorita Preza, Ingar Olsen, Tiril Willumsen, Bjrn Grinde, and Bruce J. Paster. 2009. Diversity and site-specificity of the oral microflora in the elderly. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 28(9): 1033. A.K.L. Wan, W.K. Seow, D.M. Purdie, P.S. Bird, L.J. Walsh and D.I. Tudehope A. 2003. Longitudinal Study of Streptococcus mutans Colonization in Infants after Tooth Eruption J Dent Res 82(7):504-508.

y

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PRACTICAS DE BIOQUIMICAPRACTICA 1: Bioelementos PRACTICA 2: Identificacin de carbohidratos PRACTICA 3: Determinacin de pH en saliva y otras sustancias. PRACTICA 4: Determinacin cualitativa de la amilasa salival. PRACTICA 5: Propiedades fsicas de los lpidos.

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BIOELEMENTOSINTRODUCCION: Los bioelementos son elementos qumicos que constituyen a los seres vivos. Se clasifican en: A. Bioelementos primarios: C,H,O,N, P y S, B. Bioelementos secundarios: Na, K, Ca, Mg y Cl C. Oligoelementos: a) indispensables: Mn, Fe, Co, Cu, Zn. b) variables: B, Al, V, Mo, I , Si. Los bioelementos primarios son abundantes en los seres vivos y esto se debe a que representan ciertas caractersticas que los hacen idneos para formar las molculas de los seres vivos. Los bioelementos se unen entre s para formar molculas que llamaremos: BIOMOLECULAS. Las biomolculas de los seres vivos son: INORGNICAS y y y Agua CO2 Sales minerales ORGNICAS o Carbohidratos o Lpidos o Protenas o cidos nuclecos

OBJETIVO: El alumno reconocer ciertos bioelementos en diferentes materiales organicos .

MATERIAL:

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Hojas frescas 5 gr Carne de pollo Uas Cabello Mechero bunsen Tubos de ensayo Trozos de carbn METODOS: EXPERIMENTO 1 1. En un tubo de ensaye coloca hojas frescas 2. Calienta el tubo en el mechero hasta el desprendimiento de vapores. 3. Observa y contesta: Qu observas? ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ Qu sustancia observas en las paredes del tubo de prueba? ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ Qu elementos constituyen dicha sustancia? __________________________________________________________________ Que estas demostrando con esta actividad? ___________________________________________________________________ EXPERIMENTO 2 1. En otro tubo pon el trozo de carne y calienta hasta que desprenda vapores. 2. Observa y contesta: Qu observas? ___________________________________________________________________ Qu sustancia esta en las paredes del tubo? ___________________________________________________________________ FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 23

Qu se est demostrando con este experimento?_________________________________________________________________________

EXPERIMENTO 3 1.- En un tubo de ensaye coloque la ua y somtalo al calor hasta el desprendimiento de calor. 2.- Abanique los vapores para percibir el olor (no oler directamente). Observe y conteste: a) A que se asemeja el olor de las uas quemadas __________________________________________________________________ b) Dicho olor es caracterstico de que elementos: ___________________________________________________________________ c) Que se demuestra con este experimento? ___________________________________________________________________ REALIZAR LO MISMO CON EL CABELLO

CONCLUSIONES: ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ______________________________

REFERENCIAS: FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 24

y y

Pacheco Leal D. Bioquimica: estructural y aplicada a la medicina. Ed. IPN. Hicks Gomez J. J., (2007), Bioquimica, Mxico: McGraw Hill.

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Prctica No 2IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOSINTRODUCCIN: Los carbohidratos, hidratos de carbono, glcidos o azcares nos aportan abundante energa y son muy abundantes en la naturaleza. Son aldehdos o cetonas polihidroxiladas en su conformacin qumica. Los carbohidratos se clasifican en monosacriso, disacridos, oligosacridos y polisacridos. Siendo los polisacridos y oligosacaridos hidrolizados para producir monosacridos. Los carbohidratos que dan resultados positivos con las soluciones de Tollens Benedict o Fehling se conocen como azucares reductores y todos los carbohidratos que contienen un grupo hemiacetal dan pruebas positivas y se les conoce como azcares no reductores.. Fundamento de la prueba de Fehling: si el carbohidrato es reductor se oxidar dando lugar a la reduccin del sulfato de cobre (II), de color azul a xido de cobre(I) de color rojo- ladrillo. Fundamento de la prueba de lugol: la coloracin producida por el lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molcula de almidn. No es por tanto una verdadera reaccin qumica sino que se forma un compuesto de inclusin que modifica las propiedades fsicas de esta molcula apareciendo la coloracin azul violeta. Este mtodo se usa para identificar polisacridos. El almidn en contacto con unas gotas de reactivo de lugol toma un color azul violeta caracterstico.

OBJETIVOS: y y Identificar azucares reductores con la reaccin de fehling . Identificar la presencia de un polisacrido por medio de la reaccin de lugol

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MATERIALES: Tubos de ensayo Gradilla Pinzas moss Vaso de precipitado Mechero o parrilla elctrica Tripie Tela de asbesto Parafilm REACTIVOS Glucosa Galactosa Maltosa Manosa Lactosa Sacarosa Almidon Reactivos de fehling A y B Lugol HCl diluido al 10% Bicarbonato Papa y /o arroz

METODO: Identificacin de azucares reductores 1.- Colocar 7 tubos de ensayo en una gradilla y numerarlos del 1 al 7. 2.- Medir 1 ml de solucin de glucosa y colocar en el tubo 1 hacer lo mismo con los dems carbohidratos y ponerlos en los tubos 2,3..respectivamente, como se observa en la tabla I: FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 27

Tabla 1No. de tubo Glucosa al 1% Manosa al 1% Galactosa al 1% Maltosa al 1% Lactosa al 1% Sacarosa al 1% 1 1 ml 1ml 1ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 3 4 5 6

7

Almidon al 1%Reactivo de fehling A Reactivode Fehling B 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas

1 ml3 gotas 3 gotas

3.- Cuando se le agregan las gotas del reactivo de Fehling (A y B) el liquido del tubo de ensayo adquirir un fuerte color azul, agitar. 4.- Calentar los tubos a bao maria o directamente en un mechero. 5.- La reaccin ser positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo6.- La reaccin ser negativa si la muestra queda azul o cambia a un tono azul-verdoso.

RESULTADOS: Observe el resultado y anote sus observaciones. Escriba en la tabla (+) si es positiva o negativo(-)Carbohidrato Glucosa Manosa Galactosa Maltosa Lactosa Sacarosa Almidn Prueba de Fehling Azcar reductor

Identificacin de polisacridos (reaccin del lugol) 1.- Colocar 7 tubos de ensayo en una gradilla y numerarlos del 1 al 9. FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 28

2.- Medir 3 ml de solucin de glucosa y colocar en el tubo No. 1 hacer lo mismo con la manosa y todas las soluciones de carbohidratos. 3.- Aadir dos gotas de lugol como se indica en la tabla 2.No. De tubo Glucosa al 1% Manosa al 1% Galactosa al 1% Maltosa al 1% Lactosa al 1% Sacarosa al 1% Almidon al 1% Solucin de papa Solucin de arroz Lugol 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 1 1ml 1 ml 1 ml 1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 gotas 2 3 4 5 6 7 8 9

RESULTADOS: Prueba positiva: la solucin se torna de color azul -violeta Escriba en la tabla de resultados (+) o (-)No. De tubo Glucosa al 1% Manosa al 1% Galactosa al 1% Maltosa al 1% Lactosa al 1% Sacarosa al 1% Almidon al 1% Solucin de papa Solucin de arroz Presencia de color azul violeta Es polisacrido Si o No

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CUESTIONARIO: 1. Escribe la formula de la sacarosa y maltosa, define si son azcares reductores o no 2. Qu diferencia hay entre el almidn lactosa y glucosa? 3. Da ejemplos de otros polisacridos 4. Porque la sacarosa se disuelve en agua y el almidn no?

REFERENCIAS: y y y Baynes J. W., 2006, Bioqumica Mdica, 2 Edicion,Madrid: Elsevier . Pacheco Leal D. Bioquimica: estructural y aplicada a la medicina. Ed. IPN. Hicks Gomez J. J., (2007), Bioquimica, Mxico: McGraw Hill.

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Prctica No. 3DETERMINACIN DE pH DE SALIVA Y OTRAS SUSTANCIASINTRODUCCION: ACIDO: es una sustancia o solucin donadora de iones hidrgeno, tienen una concentracin de iones hidrgeno mayor que el agua por lo tanto su pH ser menor que 7. BASE: es una sustancia o solucin receptora de iones hidrgeno, tienen una concentracin de iones hidrgeno menor que el agua por lo tanto su pH ser mayor que 7. pH: es la concentracin de iones hidrgeno(H+), y se dice que es la homeostasis del ion H+ en el organismo. El pH de algunos liquidos biolgicos se muestran en la tabla 1.Liquido Plasma sanguneo Liquido intersticial Liquido intracelular Jugo gstrico Leche humana Saliva Orina pH 7.4 7.4 5.5-6.9 1.5-4 7.4 6.4-7 5-8

La neutralidad del plasma y otros lquidos contribuyen al buen funcionamiento celular. Debe de hacer un equilibrio entre la produccin de iones H+ y OH-. Cambios mnimos de pH representan variaciones notables en la concentracin de iones Hidronio (ejemplo: de un pH 7.4 a pH 7.1), el equilibrio de pH es por medio de amortiguadores biolgicos como: 1. Sistema bicarbonato/acido carbnico que acta principalmente en el espacio extracelular. 2. El sistema de fosfatos, es importante en el espacio intracelular sobre todo en eritrocitos y clulas tubulares del rin. 3. Sistema de las protenas: actan predominantemente a nivel tisular aunque tambin lo hacen en el plasma. Desequilibrio acido-base: cuando por cualquier circunstancia otolgica el pH de la sangre sale del valor normal, se pueden producir acidosis (descenso de pH sanguneo ) o alcalosis

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(aumento de pH sanguneo). Estos cambios se deben a la concentracin plasmtica del bicarbonato y son de tipo metablico. Causas de acidosis: diarrea, insuficiencia tubular renal, obstruccin del tracto urinario, ayuno prolongado, ingestin de alcohol metlico, anestesia general, sobredosis de sedantes, paro cardiaco, neumona prolongada, etc. Causas de alcalosis: vmito, consumo de diurticos de mercurio, ingestin de etanol, ansiedad, histeria, fiebre, tumor, septicemia, etc. La saliva es un liquido biolgico que se encarga de mantenera el pH en la mucosa oral, ayuda a proteger al esmalte con la regulacin del pH, tambin neutraliza el medio cido producido tras las comidas, si se produce un pH pacido se provoca la desmineralizacin del esmalte, mientras que si se produce un pH bsico se acumula sarro.

OBJETIVOS: El alumno conocer dos mtodos de determinacin de pH en saliva y otras sustancias. Medir el pH de saliva y otras sustancias

MATERIAL: Potencimetro Vasos de precipitado Agitador de vidrio Pizetas Papel absorbente (sanitas) Tiras reactivas de pH

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REACTIVOS: Solucin buffer pH 7.0 Saliva plasma leche vinagre jugo de limn refresco de cola limpiador domestico METODO: 1. En un vaso de precipitado colocar el buffer pH 7.0 2. Colocar el electrodo en agua destilada concectar el potencimetro 3. Secar con papel absorbente el electrodo 4. Colocar el elecrtrodo dentro del vaso de precipitado con buffer pH 7.0 y ajustar a 7.0 5. Enjuagar el electrodo con agua destilada secar. 6. Colocar el electrodo seco en las diferentes soluciones y anotar la lectura. 7. Medir el pH de las soluciones con tiras reactivas de pH. 8. Comparar el color con la carta de colores y determinar el pH.MUESTRA Jugo de limn Vinagre Saliva Plasma Leche Refresco de cola Limpiador domstico pH MEDIDO CON pH CON TIRAS REACTIVAS POTENCIOMETRO

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CUESTIONARIO 1. Qu es el pH? 2. En todas las sustancias se puede medir el pH 3. Cmo est relacionada la acidez y la alcalinidad con el pH? 4. Cul es el pH de la sangre 5. Cules son los principales amortiguadores en el organismo para mantener el pH? 6. Qu es acidosis metabolice y respiratoria 7. Qu es alcalosis metablica y respiratoria 8. Cules son los mecanismos compensadores para la acidosis y alcalosis metabolica y respiratoria?

REFERENCIAS: y Pacheco Leal D. Bioquimica: estructural y aplicada a la medicina. Ed. IPN.

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Prctica No. 4PRUEBA CUALITATIVA DE AMILASA SALIVALINTRODUCCION: En la mayora de los laboratorios de diagnostico utilizan sangre para realizar los anlisis que nos proporcionarn el diagnostico del paciente, sin embargo, la saliva es un fluido que ofrece algunas ventajas como: el no necesitar procedimientos invasivos, no se necesita un equipo especializado para adquirirla. La saliva en otros pases como en Estados Unidos se utiliza para hacer diagnsticos en nios y adultos mayores. La saliva es un producto de las glndulas salivales y puede ser recolectada de las glndulas partidas mientras que en las glndulas submandibulares, sublingual y glndulas salivales menores, es difcil esta recoleccin. La saliva ha sido importante su anlisis para detectar algunas patologas en las glndulas (infeccin u obstruccin) y tambin algunos desordenes sistmicos. La saliva entera o saliva mezclada, es la que se encuentra en cavidad bucal y que al ser secretada por las glndulas se ha combinado con: secreciones nasales, secreciones bronquiales, restos de comida, fluido gingival crevicular, productos de microorganismos orales, suero y derivados de sangre, clulas epiteliales de descamacin. La saliva puede ser recolectada de dos formas: y y Estimulada: se usa un trozo de parafina o estimulo psicolgico. No estimulada: se recolecta la saliva que en ese momento tiene el paciente.

La saliva tiene diferentes funciones como: lubricacin, antimicrobiana, amortiguadora, limpieza, remineralizacin, digestin, sabor, etc. Los componentes de la saliva son: enzimas, agua, protenas, fosfatos, carbonatos, inmunoglobulinas, etc.

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OBJETIVO: Identificar la presencia de amilasa salival por medio de la hidrlisis del almidn.

MATERIAL: Tubos de ensaye REACTIVOS: Lugol Solucin de almidn al 2% METODO: A) Recoleccin de la saliva 1.- Enjuagarse perfectamente bien la boca 2.- Recolectar aproximadamente 4 ml de saliva en un tubo de ensaye. Tubo 1 4 ml de saliva 2 ml de almidn Esperar 10 minutos Tubo 2 2 ml de almidn Agregar 2 gotas de lugol Agregar 2 gotas de lugol

RESULTADO: Anotar el cambio de color e interpretar los resultados.

CUESTIONATIO: 1. Cul es la composicin de la saliva? 2. Qu glndulas secretan la saliva y donde estn localizadas? 3. Qu es la amilasa salival? 4. En que partes del sistema digestivo se hidrolizan los carbohidratos FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 36

5. Qu tipo de carbohidrato es el almidn? 6. Qu funcin tienen el hgado y el pncreas en la digestin?

REFERENCIAS: y Eliaz Kaufman and Ira B. Lamster. 2002. The diagnostic applications of saliva: a Review. Crit. Rev. Oral Biol. 13: 197-212. y M. Lenander-Lumikari and V. Loimaranta. 2000. Saliva and Dental Caries. Adv. Dent. Res. 14: 40-47. y W.M. Edgar and S.M. Higham 1995. Role of Saliva in Caries Models. Adv. Dent. Res. 9: 235-238.

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Prctica No. 5LPIDOS INTRODUCCIN:

Los lpidos son un grupo heterogneo de biomolculas los cuales tienen las siguientes propiedades: a) Solubilidad: son insolubles en agua y solubles en disolventes no polares (orgnicos) como el cloroformo, acetona, tetracloruro de carbono, hexano,etc. b) Estructura qumica: tiene funcin de un ester y al ser hidrolizados forman alcoholes y acidos grasos.(aunque hay algunas excepciones) c) Asimilacin: los lpidos son asimilados (digeridos) por los seres vivos, siendo la diferencia con respecto a los aceites minerales, los cuales no los pueden digerir los humanos.

Funciones de los lpidos: Forman parte de los componentes celulares, tambin son parte del tejido adiposo siendo amortiguadores y aislantes trmicos. Proporcionan energa al cuerpo humano en un 40% de las caloras son aportados por ellos. Sirven para transportar sustancias liposolubles en sangre.

Clasificacin de los lpidos: (tabla1)

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TABLA 1 1.- Lpidos simples 2.- Lpidos complejos 1.1 Acilgliceroles (estn formados por glicerol y acidos grasos) 1.2 Ceras 2.1Fosfolipidos 2.2 Glucolpidos 2.3 Sulfolpidos 2.4 Lipoprotenas 3.- Grupo miscelaneo 3.1Terpenos y terpenoides 3.2Esteroles y esteroides 3.3Eicosanoides

Los cidos grasos forman parte de los lpidos simples, estos pueden ser saturados e insaturados. Los cidos grasos esenciales son cidos grasos poliinsaturados (linoleido y linolnico), estos no pueden ser sintetizados por los organismos superiores y deben de ser administrados en la dieta, la carencia de estos puede producir alteraciones fisiolgicas que pueden llegar a provocar la muerte. Los cidos grasos al combinarse con sales (lcalis) forman jabones, y Se caracterizan estos jabones por ser potentes agentes tensoactivos. OBJETIVOS: 1. Realizar la saponificacin de una grasa para obtener jabon. 2. Observar la solubilidad de los lpidos.

MATERIAL: Tubos de ensayo gradilla Pgina 39

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pinzas moss Varillas de fidrio Mechero o parrilla elctrica Tripie Tela de asbesto Vasos de precipitados Pipetas Parafilm REACTIVOS Solucin de NaOH al 20% ter, cloroformo o acetona 4 ml Aceite de oliva(o cualquier aceite vegetal) METODOS: Saponificacin 1. Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de aceite y 2 ml de NaOH al 20%. 2. Agitar enrgicamente y colocar el tubo a bao mara de 20 a 30 min. 3. Pasado este tiempo se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene la solucin de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia semislida que es el jabn formado y una superior lipidica de aceite inalterado. Solubilidad 1. Poner 2 ml de aceite en dos tubos de ensayo. 2. Aadir a uno de ellos 2 ml de agua y al otro 2 ml de ter y otro disolvente orgnico, agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar. 3. Observar los resultados CONCLUSIONES ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ________________________________________ FACULTAD DE ODONTOLOGIA Pgina 40

CUESTIONARIO: 1. Cules son las diferencias entre un aceite y las grasas? 2. Escriba la reaccin de saponificacin 3. Qu enzima hidroliza las grasas en el aparato digestivo?} 4. Porque los lpidos son insolubles en agua? 5. Qu es una emulsin?

REFERENCIAS:y y y Baynes J. W., 2006, Bioqumica Mdica, 2 Edicion,Madrid: Elsevier . Pacheco Leal D. Bioquimica: estructural y aplicada a la medicina. Ed. IPN. Hicks Gomez J. J., (2007), Bioquimica, Mxico: McGraw Hill.

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