Practicas Introduccion Lab Microbiologia

PRACTICAS LABORATORIO MICROBIOLOGIA

Prof. BIBIANA DUARTE

UNIVERSIDAD DEL CAUCA

1.1. Aprender y aplicar normas de bioseguridad en el laboratorio de

microbiología 1.2. Aprender técnicas básicas de cultivo de microrganismos 1.3. Reconocer los materiales, instrumentos y equipos básicos de trabajo en el

laboratorio de microbiología

2.1. Normas de Bioseguridad. En las prácticas de laboratorio se manipulan organismos y métodos que requieren ciertas precauciones tanto para evitar contaminaciones en las muestras o pruebas que se estén realizando, como riesgos para el personal, la comunidad o el ambiente que se encuentre en inmediaciones del laboratorio de microbiología. De acuerdo a nivel de patogenicidad de los microrganismos presentes en las muestras procesadas en el laboratorio, el Centro de Control de Enfermedades (CDE) Y El Instituto Nacional de Salud han establecido 4 niveles de seguridad biológica, determinado normas específicas para el trabajo en cada uno de ellos. Nivel I. Se trabaja con microrganismos no patógenos bien conocidos o patógenos oportunistas, como los que vamos a estudiara en este curso Nivel II. Se trabaja con microrganismos y muestras con un potencial de riesgo que va de moderado a alto, como los estudiados en laboratorios de enseñanza de bacteriología o microbiología médica, en laboratorios de diagnóstico bacteriológico médico o microbiológico de tipo ambiental o de alimentos Nivel III. Con microrganismos y muestras de alto riesgo como lo estudiados en laboratorios diagnósticos especializado Nivel IV. Microrganismos de altísimo riesgo o que son exóticos en el país y requieren máxima seguridad, como lo laboratorios del Instituto Nacional de Salud. Como unos de los propósitos que se busca en los laboratorios de microbiología es cultivar y multiplicar muestras para obtener poblaciones mucho mayores a la muestra inicial, el microbiólogo o persona que procese o estudie estas muestras esta continuamente expuesto a graves contaminaciones sino cumple las normas de bioseguridad establecidas.

Fig 1.1. Símbolo Internacional de Peligro Biológico




Cuadro 1.1. NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA LABORATOR IOS DE NIVEL I 1 ☛ Es obligatorio utilizar la bata (siempre cerrada), como instrumento de protección de sustancias y compuestos y

como aislante de contaminantes que viajan en su ropa

☛ Mantenga el cabello recogido y un poco remangadas las mangas de la bata, para evitar contaminaciones o accidentes con el mechero

☛ Trabajar con las ventanas y puertas cerradas ☛ No comer, beber, masticar chicle, ni fumar, ni tampoco maquillarse o cambiarse lentes de contacto

☛ Mantener el puesto de trabajo solo el material necesario (dejar las maletas y otros artículos atrás) ☛ Trabajar con el mechero prendido ☛ No poner ningún elemento en contacto con el cuerpo

☛ Evitar al máximo transitar por el laboratorio

☛ Evitar la formación de aerosoles ☛ Descartar el material contaminado esterilizándolo primero, en bolsas y recipientes destinados para tal fin

☛ Pipetear aspirando con dispositivos adecuados, nunca con la boca

☛ Evitar el uso de joyas durante el trabajo ☛ Informar inmediatamente accidentes como cortaduras o quemaduras. En caso de que se rompa un recipiente con

cultivo de microrganismos cubrir el material con solución de hipoclorito al 2% o fenol al 5%, tapar con una hoja de papel periódico y dejar sedimentar los aerosoles durante media hora, luego recoger el material envolverlo en el papel y llevarlos esterilización antes de desecharlo.

☛ Lavar las manos ante de iniciar la práctica, si es necesario durante el procedimiento y al finalizar, con jabón y agua abundante cepillando las uñas.

☛ Limpiar el área de trabajo con solución desinfectante antes y después de la práctica

☛ No deambular con la bata fuera del laboratorio ☛ Lavar la bata y el gorro independientemente de otra ropa

☛ Trapear el piso con detergente e hipoclorito, no barrer en seco e inmediatamente antes de las prácticas, para evitar dispersar en el ambiente microrganismos sedimentados

2.2. Técnicas de Cultivo Aséptico. Uno de los principios de la microbiología es obtener cultivos puros donde todos los organismos presentes pertenezcan a un sólo grupo, para así poder estudiar sus características morfológicas y fisiológicas confiadamente. Además de tener precauciones de seguridad en cuanto a la manipulación y disposición de los materiales e instrumentos utilizados es necesario mantener las condiciones de mayor asepsia durante el manejo y siembra de las muestras y cultivos, trabajando permanentemente con el mechero encendido, las manos muy limpias, y la superficie del mesón desinfectada, procurando no hablar y retirar cualquier material que sea fuente de contaminación. En el momento de realizar los cultivos es necesario aprender técnicas de manipulación de las muestras, materiales y utensilios de manera que se evite cualquier contaminación externa o accidente y se logre así obtener cultivos con colonias características para su posterior identificación y purificación. A continuación se explican algunas de las técnicas más utilizadas: 2.2.1. Desinfección de los utensilios de siembra: Se debe remojar el utensilio (asa recta o redonda, agujas de disección, pinza o rastrillo) en agua limpia y luego en

1 Normas que deben ser tenidas en cuenta si excepción en todos las prácticas desarrolladas en la materia

Fig. 1.2. Esterilización del Asa




alcohol al 90% luego flamear todo el alambre hasta la base (se esteriliza por incineración). Para evitar posibles contaminaciones cuando se han realizado varios siembras con el mismo utensillo es necesario limpiarlo de partículas de inóculo o medio en exceso o quemadas, introduciéndolo en un frasco con piedritas (gravilla) que desprenden la partículas y luego se procede a esterilizar como se explico previamente. Para los rastrillos se tiene al agua y el alcohol en cajas de petri. 2.2.2. Siembra: Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, asa, hisopo (palillo con algodón) o pipeta estéril.

a. Cultivo en medio líquido: Habitualmente se realiza en tubos o en matraces, inoculando una asada o un volumen conocido de muestra (0.1-1 ml). El crecimiento se puede manifestar por enturbiamiento, por formación de velo o película, o por sedimento b. Cultivo en medio sólido: Puede ser en tubos o placas.

•••• Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar.

•••• Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. También se llama siembra por picadura.

•••• Siembra en placas o cajas de petri. Puede ser en

superficie o incorporada. En superficie: Existen 3 formas: Con Rastrillo: Se colocan 0.1 ml de la dilución de la muestra con pipeta estéril en el centro de la placa, y se distribuye con un rastrillo estéril. Con Asa o Hisopo: Se toma un asada de muestra o un frotis de superficie con un hisopo y se distribuye sobre el medio como se explica más adelante. Colocando un trozo de muestra: Con un bisturí o tijeras estériles se cortan pedazos de la muestra y con las pinzas estériles se colocan distribuidos sobre el agar. Incorporada: Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estéril vacía, en el centro de la misma. Sobre ella

Fig. 1.3. Manejo de Tubos de cultivo

Fig. 1.4. Manejo de las Cajas de Petri




se agregan 20 mL de medio de cultivo fundido y termostatizado a 45ºC; luego se agita la placa, moviéndola 4 veces en sentido de las manecillas del reloj y 4 en sentido contrario, una vez de arriba a abajo, una vez hacia los costados y una vez en sentido contrario. En todos los casos de siembra en placa, éstas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede provocar condensación durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento confluente. En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microrganismos, sino además para contar y aislar. En general cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir la muestra en tubos con suero fisiológico estéril. 2.2.3. Aislamiento. Es separar un tipo de microrganismo a partir de una población que los contiene de varios tipos. En hábitats naturales, raramente encontramos a los microrganismos en cultivo puro (un solo tipo de microrganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de microrganismos presentes. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microrganismos están en una proporción adecuada. Cuando el microrganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de microrganismo, se lleva a cabo un procedimiento llamado búsqueda que involucra una primera etapa de aumento del número de microrganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la población. Luego se aísla por el método de estrías o por dilución y se inicia el proceso de identificación. En el aislamiento por estrías con asa o hisopo existen tres técnicas:

Fig. 1.5. Técnicas de aislamiento en estría de colonias

•••• Aislamiento por dilución en medio sólido. Se emplean tanto el método de

siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se puede preparar las diluciones decimales en condiciones asépticas usando suero fisiológico o algún otro diluyente. La




siembra incorporada se realiza tal como se describió anteriormente. También se pueden preparar las diluciones directamente en tubos de agar fundido y termostatizado (20 mL) se agita por rotación entre las manos y se vierte en placas de Petri estériles.

2.2.4. Aislamiento de Microrganismos Anaerobios. Para aislar microrganismos anaerobios que son rápidamente destruidos por exposición al oxígeno, las placas o tubos pueden ser preparadas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas en recipientes cerrados en atmósfera sin oxígeno. 2. También se puede sembrar diluciones en tubos con agar fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina-parafina, para evitar el acceso de aire. Con anaerobios más sensibles al oxígeno, se trabaja en cámaras anaeróbicas, o también usando la técnica del "roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en las paredes al hacerlo girar mientras se enfría; se trabaja gaseando el tubo continuamente con gas libre de O2 mientras el tubo está destapado. 2.2.5. Cultivo Puro. A partir de colonias aisladas en medio no selectivo se realiza un examen microscópico que debe mostrar células razonablemente semejantes respecto al Gram y a la morfología. Las colonias deben describirse por examen macroscópico en función del tamaño, la forma, el borde, la elevación, la transparencia y el color. Esto resulta a veces muy útil en la identificación. En el caso de medios selectivos las colonias aisladas deben aislarse nuevamente en medio no selectivo por el método de estrías. Esto se conoce como re-aislamiento. 2.2.6. Búsqueda o Determinación. Cuando se desea saber si un determinado tipo de microrganismo está presente o ausente en una muestra, o también si se quiere identificar una tipo de colonia prevaleciente en una muestra, debe llevarse a cabo el procedimiento conocido como búsqueda que comienza por aumentar el número del microrganismo que se desea determinar. Una búsqueda implica los siguientes pasos: a) enriquecimiento b) aislamiento por estrías en medios selectivos y diferenciales c) reaislamiento (medio no selectivo) d) identificación o determinativa morfológica, bioquímica, serológica o genética La etapa de enriquecimiento puede subdividirse en dos: pre-enriquecimiento y enriquecimiento selectivo. El pre-enriquecimiento o enriquecimiento no selectivo suele hacerse solamente cuando los microrganismos buscados están debilitados o dañados y se usan siempre medios nutrientes líquidos, no selectivos. El enriquecimiento selectivo se realiza incubando la muestra en medios líquidos selectivos, ya sea en presencia de agentes químicos o biológicos que favorecen el desarrollo en particular del o de los microrganismos buscados. Luego de

2 Existen sistemas de anaerobiosis como el GasPak, que contienen 3 dispositivos: uno con hidrógeno que reacciona con el O2, uno generador de CO2 y uno que indica la anaerobiosis. En el laboratorio se puede fabricar "artesanalmente" un sistema parecido con un frasco grande de boca ancha donde se introducen los cultivos y se coloca una vela encendida en el interior, tapando herméticamente para consumir el oxígeno atrapado.




cumplida la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo la etapa de aislamiento, empleando la técnica de estrías en superficie y medios selectivos y diferenciales. El re-aislamiento en medios no selectivos para la obtención de cultivos puros y la identificación son las etapas finales de toda búsqueda. El informe de una búsqueda se hace siempre expresando PRESENCIA o AUSENCIA en los gr o ml de muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento (enriquecimiento). 2.2.7. Recomendaciones. Antes y durante las prácticas recuerde:

� Estudiar la técnica o procedimiento y su fundamento teórico antes de las prácticas

� No trate de abreviar o cambiar las técnica indicada sin consultar con el profesor previamente, pues los procesos presentados en cada práctica están basadas en métodos comprobados

� Llegar puntualmente, después de 10 minutos de la hora se cierra la puerta. Si no se asiste al laboratorio son 3 horas de falla y la nota correspondiente a ese informe quedará en cero.

� Cada grupo deberá contar en todas las prácticas con el siguiente material básico: - Tinción de Gram, Lugol, Azul de metileno, Azul de lactofenol - Gradilla con un tubo con agua y otro con alcohol a 90% - 3 láminas y 3 laminillas - Frasco de mayonesa o compota con gravilla - Frascos medianos tomamuestra (mermelada con tapa), Bolsas plásticas

tomamuestra de autosellado - Frasco grande de mayonesa (30 cms alto y 5 cms de ancho) - Botellas planas de 1/2 litro (canecas) - Asa redonda y recta, Pinzas con o sin garra, bisturí, Espátula, Rastrillo

bacteriológico - Vinipel, Papel absorbente, Cinta de enmascarar - Lápiz o marcador rotulador - Jabón de manos antibacterial

� Ubique los materiales y reactivos que va utilizar antes de iniciar las prácticas, consulte cualquier duda antes de proceder

� Rotule los recipientes utilizados para evitar confusiones, traiga siempre marcador de vidrio o cinta de enmascarar. Marque los materiales en un sitio donde permita visualizar el cultivo. Al final de la práctica retire siempre las cintas para facilitar la limpieza del material.

� Tome apuntes claros y anote todas sus observaciones, realice siempre un diagrama de flujo del procedimiento, llene los formatos de resultados y este concentrado siempre en le desarrollo de la práctica para que pueda relacionar efectivamente los resultados obtenidos con los fundamentos teóricos y sus conclusiones en los respectivos informes

� Nunca cambie los cultivos del sitio asignado, ni cambie las temperaturas de las incubadoras. Cualquier dificultad hable con el encargado

� Acuerde con tiempo el horario de lecturas de las muestras con los encargados del laboratorio




� Una vez realizadas las lecturas se deben anotar en la tabla correspondiente de la guía y también en el tablero o sitio acordado para que los otros grupos tengan los datos y puedan hacer los análisis de resultados y conclusiones respectivos. Sólo guarde en nevera los cultivos estrictamente necesarios que le haya indicado el profesor, el resto de los materiales deséchelos oportunamente para su limpieza y desinfección.

� El plazo para entregar los informes es de 8 días, en el siguiente laboratorio, en el cual se puede hacer una discusión en grupo o evaluación individual. Estos informes deben presentar la siguiente información:

1) Título del Laboratorio 2) Nombres de los integrantes del grupo 3) Objetivos de la práctica 4) Diagrama de flujo del procedimiento desarrollado 5) Resultados (tablas, dibujos, gráficos) 6) Análisis de resultados y otras observaciones 7) Cuestionario 8) Conclusiones (respecto a objetivos y resultados) 9) Bibliografía

� Informes sobre salidas (entregar 8 días máximo después de realizada la salida) 1) Descripción general del sitio visitado (Ubicación, Temperatura...) 2) Diagrama de flujo del proceso observado 3) Observaciones 4) Conclusiones 3.

3.1. Ubicar y reconocer en el laboratorio los lugares y fuentes posibles de contaminación

3.2. Conforme su grupo de laboratorio (máximo 3) ojalá con compañeros con intereses de investigación afines, ubique el área de trabajo de cada grupo y el sitio para colocar sus maletas y otros materiales fuera de dicha área.

3.3. Identificar materiales, instrumentos, equipos y reactivos de uso común en el laboratorio, señalando su utilidad, manejo y cuidados

4.1. Cuál es la utilidad de un cámara de flujo laminar en el laboratorio de microbiología, qué tipos existen, cómo funciona y cómo se utiliza?

4.2. Revise las principales partes y funciones del microscopio óptico 4.3. En qué consiste la coloración de Gram, que tipo de coloración es? Próximo Laboratorio. Acordar salida para toma de muestras de diverso origen, conseguir frascos y bolsas tomamuestra y materiales de aseo y uso común en el laboratorio.




1.1. Recordar y aplicar fundamentos de microscopia y técnicas de tinción 1.2. Establecer características macro y microscópicamente que indican la

presencia de diversos microrganismos en ecosistemas naturales o artificiales 1.3. Aplicar técnicas de cultivo aséptico para la siembra de

preenrequecimiento y aislamiento de muestras de diferentes ambienes

.

2.1 Microscopia. La invención y desarrollo del microscopio y sus diferentes tipos y aplicaciones ha permitido el desarrollo de la microbiología, siendo el principal instrumento de trabajo en el laboratorio es necesario conocer los principios básicos de la microscopia y las precauciones al hacer uso del mismo. El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño y nos permite observar objetos no perceptibles a simple vista. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio electrónico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magnético. Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces.

Cuadro 2.1. Precauciones con el Microscopio.

� No limpiar los lentes con etanol

� No limpiar los lentes con papel ordinario o con algodón. Use xilol si el aceite de inmersión se ha quedado adherido y seco

� No limpiar las lentes internamente con papel pues esto desprenderá la capa antirreflejante. Utilizar sólo pincel

� No guardar el microscopio en lugares húmedos y poco ventilados, pus se favorece el crecimiento de hongos

� No dejar aceite de inmersión en los lentes

� Nunca coger el microscopio por el brazo par transportarlo, cogerlo con una mano por la base y con la otra por el brazo

Cuadro 2.2. Técnicas de observación en el Microscopio Optico � Colocar una preparación. � Abrir el diafragma de la fuente de luz al máximo. � Abrir el diafragma del condensador al máximo y llevar el condensador al máximo de su trayectoria. � Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x. � Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable. � Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el microscopio lo permite. � Enfocar la preparación. � Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal. � Bajar el condensador hasta que los bordes del polígono se vean nítidos. � Ajustar el enfoque. � Si la imagen poligonal no está en el centro, centrarla utilizando los tornillos del condensador. � Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del campo, no tocarlo mas. No tocar mas la

altura del condensador. � Elegir el contraste óptimo ajustando el diafragma del condensador. � Verificar la iluminación quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos ajustar el diafragma a 2/3 abierto.

(2/3 del campo iluminado). � Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo modificar la intensidad de la fuente

luminosa o colocar filtros. � No cambiar la distancia del condensador. Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el

diafragma del condensador a la apertura del objetivo.




Las lentes de un microscopio óptico son el condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador. La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente como lupas y cristales de aumento. Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica. Como los microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de onda está fijada y es por lo que la resolución de un objeto es función de la apertura numérica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto será más pequeño. 2.2. Técnicas de Observación y Tinción de microrganismos . Los microrganismos están presentes en todos los medios naturales y en algunos artificiales, hacen parte del mundo como flora saprófita (inocua que no causa daño o enfermedad) o como flora patógena. Algunas veces es posible observar a simple vista características macroscópicas como presencia de crecimiento sobre las superficies y por lo tanto podemos describir dichas características en cuento a color, forma, textura, grosor, si es duro, pegajoso, polvoso, si es una costra, etc., pudiéndose también anotar otras características como el olor (teniendo cuidado de aspirar o acercarse mucho a la muestra) y los cambios físicos sobre la superficie donde estamos encontrando el microrganismo, cambios en el color, la forma, la continuidad, etc. En todos los casos cuando se quiere identificar dichos microrganismos además de la observación macroscópica inicial es necesario realizar frotis y coloraciones, para obtener una rápida información sobre otras características básicas que permitan identificar el tipo de microrganismo y el proceso posterior para su cultivo y caracterización taxonómica o bioquímica si fuera necesario. Para observar al microscopio es necesario realizar frotis o extensiones de la muestra seleccionada, estos frotis pueden observase en fresco y/o realizar coloraciones par aumentar




el contraste con la luz y facilitar la observación de las muestras, según el alcance de la identificación que se quiera realizar. Técnicas de tinción: En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación. a. Extensión: se realiza con el asa redonda y recta sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de agua limpia. La extensión se deja secar primero al aire antes de la fijación b. Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando con unas pinzas la muestra extendida repetidamente a 10 cm de la llama del mechero. c. Tinción: Las formas y estructuras microbianas se pueden observar más claramente por medio de las coloraciones ofreciendo un medio de contraste para los microrganismos que por lo general son incoloros, estos colorantes son absorbidos por las células ya que presentan características químicas al medio que las rodea. Se realizan añadiendo los colorantes sobre los microrganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios tipos según el tipo de colorantes empleados: Los colorantes son sales, clasificados en: a. Colorantes ácidos o aniónicos cuando el ión coloreado es el cargado

negativamente, como ocurre en el Eosinato de sodio (se ioniza como sodio + y esosinato - ), combinándose con las estructuras celulares con carga positiva y

b. Colorantes básicos o catiónicos cuando el ión coloreado es cargado positivamente como el Azul de Metileno(se ioniza en cloruro - y en azul de metileno +)., el Cristal Violeta y la Safranina. Ya que la las envolturas externas de las células están por lo general cargadas negativamente, estos colorantes son los más utilizados al combinarse con los componentes estructurales de la célula de tipo ácido como son los polisacáridos y ácido nucleicos.

De acuerdo a la complejidad y objetivo de la coloración se clasifican: a. Negativa: Los colorantes no tiñen el microrganismo, sino el entorno,

aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante. Ej. Nigrosina.

b. Simples (con un sólo colorante) Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células. Ej. Azul de metileno o Azul de lactofenol

c. Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura celular o tiñe diferencialmente a diferentes microrganismos. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose colorante de contraste, se utiliza además sustancias decolorantes y fijadoras. Ej: Coloración de Gram, Ziel Neelsen, donde las células se tiñen diferencialmente según su tipo,




d. Coloraciones especiales que se utilizan para evidenciar y observar algunas estructuras como pared celular, cápsulas, endosporas, flagelos y núcleos. Ej: Wayson (esporo), Leifson (flagelos) Rojo congo (Glicocalix, cápsula), Van Stoltembreg (gránulos metacromáticos)

Veamos un ejemplo con la técnica de Tinción de Gram Es la técnica de tinción diferencial más importante que se utiliza en bacterias. El primero en describirla fue el danés Christian Gram en 1884, con ésta técnica se logro separar las bacterias en dos grupos bacteriano: positivas y negativas. El procedimiento se basa en la habilidad que tienen algunos microrganismos para retener el cristal violeta después de un decoloración con alcohol. Se utiliza como mordiente o fijador el Lugol, que forma un complejo ente el cristal violeta no fijado, formando un precipitado que es fácilmente removido por el etanol de las bacterias Gram negativas pero no de las Gram positivas. Se considera que la naturaleza química de la pared celular de la Gram + impide la precipitación del complejo Cristal Violeta-Lugol al contener un porcentaje menor de lípidos que la pared de las Gram -. , también las paredes de éstas últimas son más delgadas y frente a la acción del alcohol liberan sus lípidos y permiten la salida del complejo CV-Yodo, en cambio las Gram + se deshidratan por sus bajo contenido de lípidos, los poros disminuyen y retienen el complejo CV-Yodo. Además se ha descubierto que existe mayor cantidad de peptidoglicano en la pared de las Gram + que en las Gram-, lo que hace que éstas últimas tengan poros mayores y más susceptibles de la acción del alcohol permitiendo la extacción del complejo. Una vez realizado el frotis, se va cubriendo completamente con las siguientes soluciones cubriendo el en orden y dejando los tiempos especificados con la mayor exactitud:

Cuadro 2.3.: Coloración de Gram Solución aplicada Tiempo Reacción y apariencia de las células

Gram positivas Gram negativas 1. Cristal violeta 1 min La célula se tiñe de violeta La célula se tiñe de violeta Lavar con agua para retirar el colorante no fijado

2 seg

2. Solución de Yodo yodurada (Lugol), actua como mordiente

3 min Se forma complejo CV-I dentro de la célula las bacterias permanecen violeta

Se forma complejo CV-I dentro de la célula las bacterias permanecen violeta

3. Etanol 96º , decolora las células que no fijaron el colorante

20 seg Las células permanecen violeta, se ha fijado el colorante. Las pared celulares se deshidratan , se cierran los porros , el complejo no puede salir

Se decoloran las células . Se ha n extraído los lípidos de las paredes se aumenta la porosidad y el complejo CV-I sale de la bacteria

4. Safranina , tinción de constraste

1-2 min Las bacterias no afectadas permanecen violetas

Las bacterias decoloradas toma este colorante y se tiñen de rojo

Luego de realizar la coloración se procede a realizar la observación teniendo en cuenta las técnicas de observación microscópica. Las técnicas de coloración y estudio microscópico son útiles para identificar forma, tamaño, agrupación,




comportamiento tintorial y la presencia de estructuras subcelulares dentro de lo que se ha denominado anatomía o citología microbiana. El estudio de la anatomía o citología microbiana además de ser una herramienta valiosa para caracterizar morfológicamente los microrganismos, nos permite integrar las propiedades estructurales y funcionales de la célula para llegar a entender la funcionalidad e importancia ecológica, biológica y de aplicación de dichas propiedades en el mundo actual. Existen también algunas técnicas de microscopia para contar y establecer poblaciones de microrganismos aunque no son muy exactas.

Figura 1. Formas bacterianas




Figura 2. Morfología Hongos Todos los microrganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios ópticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las técnicas más comúnmente usadas para realizar preparaciones para microscopios ópticos. Preparación en fresco: para poder observar la movilidad de un microrganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos y se observa al microscopio principalmente en el de fases Las formas microbianas dependen del tipo de microrganismo y del estado dentro de su ciclo biológico, como también de la edad del cultivo o de las condiciones medioambientales en la cuales se encuentra. El primer aspecto a identificar es si




en la muestra encontramos organismos procariontes, eucariontes o una mezcla de ellos, además de comparar el tamaño y la cantidad de cada organismo/campo observado y frotis. Luego es importante detallar las formas y algunas estructuras básicas como membrana, forma y posición del núcleo, etc. Recordemos que el tamaño de los microrganismos pude variar mucho pero en general se usa como medidas de referencia el micrométro o micra µm 10 -6 m (0.000001 m) y el nanómetro nm 10 -9 m (0.000000001 m).

� Muestras tomadas por los alumnos � Colorantes: Azul de Metileno, Gram, Azul de Lactofenol, � Aceite de inmersión � Asas bacteriologicas � Escobillones � Laminas y laminillas � Lápiz de cera o marcador � Tubos con CN3 y PDA4 � Mechero � Pinzas

4.1. Tomar muestra microbiológica con el asa del cultivo 4.2. Preparar frotis sobre una lámina con una gota de agua, observar sin fijar.

Realizar otro fijando con el mechero, colocar laminilla en todos lo casos 4.3. Observar al microscopio desde el menor aumento al mayor. (recuerde

utilizar aceite de inmersión en el 100X 4.4. Realizar descripción y dibujo de lo observado, tamaño, número, formas,

colores, clasificar en procariota o eucariota etc 4.5. Preparar nuevamente frotis, fijarlo y colorearlo según el tipo de muestra y

colorante 4.6. Observar al microscopio desde el menor aumento al mayor. (recuerde

utilizar aceite de inmersión en el 100 X )Realizar descripción y dibujo de lo observado, tamaño, número, formas, colores, clasificar en procariota o eucariota, diferencias con los otros frotis.

4.7. Intercambie láminas preparadas con su otros compañeros, comente en la clase los resaltados de las observaciones

4.8. Realice siembra de pre enriquecimiento sobre medios de cultivo, CN y PDA teniendo en cuenta las técnicas de cultivo aséptico aprendidas en la práctica anterior, rotule debidamente los tubos de ensayo, nombre de la muestra, grupo y fecha e incube a 25 ºC , realice observaciones a las 24-48-72 horas.

3 CN: Caldo Nutritivo, preenrequecimiento no selectivo, cada litro contiene: Extracto de carne 3 g, Peptona 5 g y Agua destilada 1000 ml

4 PDA: Papa Dextrosa Agar, cultivo selectivo para Hongos y Levaduras, cada litro contiene: Papa 200 g, destrosa 20 g, Agar 15 g y 1000 ml de Agua destilada , pH: 5.0 (ajustado con ácido láctico al 2.5%)




4.9. A las 48 horas realice aislamiento por estrías en cajas de petri de AN5 con los cultivos pre enriquecidos en CN e incube a 25ª C hasta el próximo laboratorio.

a. Dibuje en el cuadro correspondiente las diferentes formas bacterianas y de

hongos, reporte cuales encontró en las muestras b. Qué aspectos de las características macro y microscópicas le suministraron

información clave que luego le permitió caracterizar los microrganismos en sus láminas, que relación encontró con el tipo de muestra que había tomado

c. En qué aspectos fisicoquímicos y biológicos se basa el proceso de coloración celular

d. Investigue las técnicas de tinción de esporas, cápsulas y microrganismos ácido resistentes

e. Investigue las principales características, aplicaciones y alcances de los microscopios de luz, electrónico de transmisión, electrónico de barrido y de Fluorescencia

Anote y dibuje de esta manera sus observaciones:

5 AN: Agar Nutritivo, aislamiento no selectivo, cada litro contiene: Extracto de Carne 3g, Peptona 5 g, Agar 15 g, Agua destilada 1000 ml

Morfología Macroscópica: _________________________ Morfología Microscópica:__________________________ Coloración utilizada:_______________________________ Otras observaciones:_______________________________




MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO La primera etapa del análisis microbiológico es la extracción de la o las muestras de un lote y cualquier resultado carece de significado si la muestra no ha sido apropiadamente tomada. Es responsabilidad del laboratorio de control constatar que la muestra que se analizará es representativa del lote y rechazarla antes de realizar el análisis si se tiene indicios de que no lo es. Generalmente en los textos especializados se describen los protocolos para el muestreo en las áreas clínicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos en primera instancia. Aquí señalaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tres últimas áreas. El lote es el número de unidades o la cantidad de un producto que ha sido sometido a las mismas condiciones durante un proceso determinado. Esta es una consideración teórica puesto que es difícil asegurar la uniformidad durante la mayoría de los procesos conocidos. Por ej. en una esterilización por vapor no todas las zonas del autoclave alcanzan la misma temperatura, sin embargo se considera que todos los recipientes sometidos a ese proceso en esa instancia constituyen un lote. Se considera que una muestra o un conjunto de muestras son representativas de un lote cuando reflejan, tanto como sea posible, la

AN

PDA

Características Macroscópicas del Cultivo: __________________________ _________________________________ Observaciones: 24 h: _____________________________ 48 h: _____________________________ 72 h:_____________________________

Características Macroscópicas del Cultivo: __________________________ _________________________________ Observaciones: 24 h: _____________________________ 48 h: _____________________________ 72 h:_____________________________ 8 días:____________________________




totalidad del lote. Para determinar que la muestra es representativa y que no se ha alterado después de la extracción deben tenerse en cuenta las etapas de: recolección, transporte y preparación para el análisis propiamente dicho. a. Recolección. Los planes de muestreo determinan el número, tamaño y zonas de recolección de la muestra. Se diseñan por criterios estadísticos teniendo en cuenta además algunas características del producto tales como: • Riesgo potencial para el consumidor, si el riesgo es alto se aumentar el número de muestras para disminuir la probabilidad de que llegue al consumidor una muestra contaminada • Facilidad de homogeneizar el lote. Si la producción es en batch (tandada) y el producto es fácilmente mezclable, como un líquido, se requiere menor número de muestras que si no lo es; si el lote es un conjunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se extraerán muestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntos críticos (en el ejemplo del autoclave éstos serían las zonas donde se alcanza menor temperatura). A su vez deber considerarse la homogeneidad dentro de la unidad o envase, por ej. en un alimento congelado hay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera que la zona central es la que tarda mas tiempo en alcanzar la temperatura de congelamiento. • Posibilidad de controlar y registrar el tratamiento al cual ha sido sometido el producto; cuanto mayor sea la seguridad de que el tratamiento ha sido correcto para la totalidad del lote, se requiere menor número de muestras. Debe tenerse en cuenta que el aumento del número de muestras está restringido por el costo del análisis y porque existe un límite por encima del cual no hay un aumento significativo de los intervalos de confianza. La muestra se extrae de unidades cuyo envase externo esté inalterado. La extracción se realiza en forma aséptica para evitar la contaminación de la muestra y del resto del contenido del envase. La muestra debe identificarse con un número, fecha, origen, contenido e iniciales del extractor. b. Transporte. Para un producto almacenado en batch la muestra se toma y transporta en recipientes previamente esterilizados y herméticos. El transporte se realiza de acuerdo a las condiciones de almacenamiento. Si es un producto alterable debe transportarse refrigerado (0º-4ºC) por no más de 24hs. Si se trata de un alimento congelado debe conservarse a la temperatura de congelamiento. El recipiente de transporte no debe llenarse completamente (hasta un 75% de su capacidad) para permitir su homogenización antes del análisis. c. Preparación para el análisis. Se debe realizar la observación macroscópica de la muestra y del envase de transporte y registrar cualquier particularidad. Se procede a la homogeneización de la muestra mediante manipulación aséptica. Si es un sólido o una pasta se diluye en buffer con el mismos pH de la muestra o agua peptonada estériles y se mezcla en una licuadora o en bolsas de plástico previamente esterilizados. Si es un producto oleoso (p.ej. una pomada) se termostatiza en el diluyente a 35ºC para lograr una emulsión. Si el análisis se realizará por filtración es necesario disolver el producto en un solvente orgánico




inocuo para los microrganismos (p.ej.miristato de isopropilo). Para alimentos se recomienda que la toma no sea inferior a 10 g y que la relación con el diluyente sea 1:10. Esta dilución debe prepararse inmediatamente antes del análisis. APLICACIONES. a. Muestreo de equipos y utensilios. Se puede realizar por varios métodos: • Enjuagado: Consiste en enjuagar el equipo con un volumen medido de medio de cultivo o de buffer, el cual es sometido al análisis microbiológico. • Contacto de superficie: Consiste en pasar un hisopo embebido en buffer por un área determinada del equipo y posteriormente descargar el hisopo en un volumen medido de diluyente el cual es analizado. Este método es recomendado para zonas de difícil acceso, en cambio para áreas planas se recomienda el contacto directo de la superficie a analizar con un cilindro de agar del diámetro de una placa de Petri el cual se corta asépticamente, y se expresa el resultado por área de contacto (Replicate Organism Direct Agar Contact Plates). • Inmersión: Los utensilios se sumergen en un volumen determinado de diluyente y se determina el número de microrganismos por unidad. b. Muestreo de aire. • Sedimentación: Se exponen placas de agar durante 15' a 2h dependiendo de la contaminación del área a analizar. Se detectan sólo los microrganismos que están adheridos a partículas sedimentables. • Impacto: Se hace pasar un volumen determinado de aire mediante aplicación de vacío a través de una serie de tamices que retienen distinto tamaño de partícula. Los tamices son incubados sobre agar y se puede determinar el número de microrganismos asociados a partículas de distinto tamaño. • Impregnación de líquidos: Consiste en hacer burbujear un volumen determinado de aire a través de un diluyente estéril el cual retiene los microrganismos presentes.

Practicas Introduccion Lab Microbiologia

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