Manual de Practicas de Microbiologia

UNIVERSIDAD NACIONAL

HERMILIO VALDIZÁNFACULTAD DE CIENCIAS

AGRARIAS

2012

DOCENTE: Dra. Ana MATOS RAMÍREZ

MANUAL DE PRACTICAS DE

MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

UNIVERSIDAD NACIONAL HERMILIO VALDIZAN DE HUANUCOE.A.P. DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

MANUAL DE PRACTICAS: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

NORMAS DE CUMPLIMIENTO EN LAS PRACTICAS DE LABORATORIO

1. Las prácticas de laboratorio son obligatorias y solo se pueden recuperar prácticas por enfermedad o causa mayor, debidamente justificada con certificado médico.

2. Para recuperar una práctica por los motivos indicados en el punto 1, se debe coordinar previa y oportunamente con elprofesor.

3. Las prácticas se inician a la hora establecida en el horario aprobado por la Dirección de la EAPIA. No se permitirá el ingreso a la práctica si se llega tarde.

4. El uso del mandil en el laboratorio es obligatorio desde el inicio hasta el fin de la práctica.Alumno que durante la práctica se saque el mandil tendrá 5 puntos menos en el informe respectivo. registrándose su falta para el descuento de puntos respectivos.

5. Debe cuidar el material a su cargo; la ruptura o la pérdida de cualquier material de Laboratorio será responsabilidad del alumno. Si algún alumno rompe material de vidrio, debe reponerlo en un plazo máximo de un mes, en caso contrario se informará a Registro para la retención de su Ficha de Matrícula.

6. Las prácticas respectivas serán revisadas con anterioridad en el manual, antes del inicio de la misma. Cualquier consulta al respecto será atendida con anticipación de por lo menos un día antes de la ejecución de la práctica.

7. Los materialesque se requieran debe traerla el alumno. Si al momento de iniciar la práctica no se tiene la muestra alimenticia, se le bajará, 5 puntos en su Informe respectivo. Los grupos de práctica máximo serán de 5 alumnos.

8. Cada práctica realizada será reportada en un informe que se debe presentar al inicio de la práctica siguiente, dicho informe servirá de base para el examen escrito.

9. El informe tendrá la siguiente estructura:

I. Introducción.II. Marco Teórico.III. Materiales y Métodos.IV. Resultados y Discusión.V. Conclusiones y Recomendaciones.VI. Bibliografía.

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PROGRAMA DE ACTIVIDADES

1. Introducción2. Practica N° 1: Reconocimiento de Materiales y equipos de Laboratorio3. Practica N°2: Deterioro de Alimentos4. Practica N° 3: Preparación de materiales y medios para el análisis microbiológico5. Practica N°4: Análisis microbiológico de un medio liquido6. Practica N°5:Análisis microbiológico de un medio solido7. Practica N° 6: Reconocimiento de Hongos 8. Practica N°7: Determinación de Hongos y Levaduras9. Practica N°8: Determinación de Staphylococcus aureus10. Practica N°9:Determinación de Coliformes y E. coli11. Practica N°10: Hisopados de Manipuladores, superficie y ambiente12. Practica N° 11: Evaluación del crecimiento microbiano de microorganismos industriales 13. Exposición de trabajos de Investigación

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INSTRUCCIONES PARA LA PRESENTACIÓN DEL INFORME I. INTRODUCCIÓN.-

La introducción debe establecer la importancia y alcance de la práctica haciendo énfasis en su aplicación al desarrollo de la Agroindustria

II. MARCO TEORICO

Se debe limitar a la información más importante que se relacione directamente con el tema, dando énfasis a la más reciente. Esta información debe permitir interpretar, analizar, sustentar los resultados de la práctica para contrastar con los Fundamentos Teórico

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Se debe recordar con precisión la forma en que fue conducida la práctica, indicando solamente los materiales y métodos usados en el trabajo de Laboratorio.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se deben presentar todos los hechos, tanto positivos como negativos, pero únicamente en los que sean más importantes o que se hayan podido analizar correctamente. La presentación debe hacerse en orden lógico, agrupando convenientemente los diversos resultados. En esta sección se hará uso de cuadros, figuras e ilustraciones según las necesidades, para dar mayor claridad.

La discusión debe establecer las relaciones entre los resultados obtenidos y hechos o teorías establecidas sobre el tema y explicar la naturaleza de los resultados, si esto no concuerda con las conclusiones experimentales previamente establecidas.En ambos casos se debe citar las referencias de Literatura, indispensable.

V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONESLas conclusiones deben presentarse en orden siguiendo los resultados obtenidos y

pueden ser indicadas por letras o números, debe redactarse puntualmente en forma clara y precisa .Las recomendaciones deben seguir igual procedimiento

VI. BIBLIOGRAFÍASe seguirá el siguiente orden:

Libros: Autor, Año, Título, Número de edición, Editorial, Lugar de publicación (país). Revistas: Autor, Año, Título del artículo, Nombre de la Revista, Volumen (Número),

Página.

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PRACTICA N° 1

RECONOCIMIENTO DE MATERIALES DE LABORATORIO

I. OBJETIVOS

reconocimiento de los materiales de laboratorio en el análisis microbiológico.

obtener los conocimientos básicos acerca de los materiales, equipos, reactivos y medios de cultivo.

II. FUNDAMENTO

Algunos de los instrumentos más utilizados en los laboratorios, son elaborados devidrio resistente a altas temperaturas, por su alto contenido de dióxido de silicio, bajoálcali, óxido bórico y vestigios de otros óxidos, lo que condiciona su escaso coeficientede dilatación, teniendo una gran aplicación en la fabricación de materiales delaboratorio, uno de los más conocidos es .el vidrio PYREX. Así como los elaborados de distintos metales pesados como platino,' mercurio, aluminio, cobre que les otorgan características como buenos conductores del calor o porque al medio ambiente son muy manejables sin alterar su composición.Es importante tener en cuenta que los materiales para microbiología deberán ser todos de material higienizable y esterilizable.

Constituye una de las principales herramientas para los fines que se persigue en ellaboratorio. Los requisitos necesarios para que un material sea un "buen material”, son:

1. Ser debuena calidad; es decir que no sean fácil de quebrarse.

2. Ser de color neutro.

3. Poseer resistenciaa las acciones mecánicas a las variaciones de temperatura así como también a los álcali-libre (no se raje).

4 .Poseer bajo coeficiente de dilatación (que no pierda su forma).

Entre estos materiales tenemos: probeta, pipetas, tubo de ensayo, matraces y erlenmeyer de varias capacidades, vasos de precipitados, fiolas, vaguetas,placas Petri, asa de Kolle, mechero Bunsen, etc.

También se requiere tener en el Laboratorio de microbiología algunos equipos específicos para el control y crecimiento microbiano. Entre ellos tenemos :

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La incubadora, Baño María, estufa, microscopio, cuenta colonia, balanza analítica, autoclave, entre otros.

III . MATERIALES Y MÉTODO

3.1 Materiales de vidrio

3.2 Equipos de laboratorio de microbiologia


V. CONCLUSIONES

VI. BIBLIOGRAFIA

Bourge ois, C.M.; Mescle, J.F.; Zucca, J. “Microbiología alimentaria”. Tomo 1: “Aspectos microbiológicos de la seguridad y calidad alimentaria”. Ed. Acribia. 1994. Zaragoza.

Frazier, W.C.; Westhhoff, D.C. “Microbiología de los alimentos”. Ed Acribia. 1994. Zaragoza.

Ingraham,J.; Ingraham, C.A. “Introducción a la microbiología”. Tomos 1 y 2. Ed. Reverté, S.A.. 1998. Barcelona.

ICMSF Microorganismos en los alimentos 1. Su significado y métodos de enumeración 2da. Ed. 1978

ICMSF Microorganismos en los alimentos 2. Muestreo para en ensayo microbiologico. Principios y Aplicaciones específicas. 1978.

ICMSF Ecología Microbiana de los Alimentos. Vol. I Factores que afectan la vida y muerte de los microorganismos. Vol II. Food commodities, Academic Press 1980.

Jay, J.M. “Modern food Microbiology”. Chapman Hall Ed. (5ª Ed) 1996. NY.

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PRACTICA N° 2

DETERIORO DE ALIMENTOS

I. OBJETIVOSIdentificar deterioro microbiano en diversas muestras alimenticias y establecer las

causas y factores externos e internos de origen.

II. FUNDAMENTOLa mayoría de los alimentos son susceptibles de alterarse, esto hace que su

distribución sea difícil y costosa. En general, proceso de descomposición de los alimentos comprenden tres etapas:

- Deterioro físico- Deterioro químico y bioquímico- Deterioro microbiológico

El deterioro de recursos y productos comprende las alteraciones internas y externas que sufren Estas alteraciones que lo hacen no sea apto para consumo Humano. Un producto alterado está modificado en sus características organolépticas (aspecto, consistencia, olor, sabor, textura, etc.) que pueden no ser admitidos por el consumidor, si se encuentran en la etapa de ser percibidos por los sentidos, lo cual no representa mucho peligro, si se considera el caso de consumo de alimentos alterados, cuyo estado no es posible detectarlo, ya que pueden producirse:

- Infecciones producidas por microorganimos.- Intoxicaciones por sustancias tóxicas producidas por bacterias, otros organismos

unicelulares, algas, mohos y vegetales.

Los productos pueden deteriorarse por:

Influencias externas: Contaminación por microorganismos, productos químicos, insectos, influencia atmosférica, oxígeno, luz temperatura, polvo, suciedad, olores, etc.

Influencias internas:

fisiológica, descomposición patológica, depredadores, parásitos.

Microbiológicas Bacterias, levaduras, mohos.

Deterioro microbiológico

El desarrollo de microorganismos se favorece en actividades de agua comprendidas entre 1,00 y 0,65. En los valores de 0,75 a 0,65 solo pueden crecer ciertos tipos de

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microorganismos especializados como levaduras Causas que radican en el mismo alimento, pueden ser:

Fisicas Olor, sabor, color, autólisis, factores tecnológicos.

Químicas Reacción enzimática, oxidación, producción de etileno, reacción de descomposición, desnaturalización de proteínas.

Biológicas Respiración, descomposición amófilas.

III. MATERIALES Y METODOS

3.1 Materiales

- Frutas y hortalizas recolectadas en mercados y supermercados.- Navajas- Lente de aumento- Agua destilada- Lámina porta objetos- Microscopio

3.2 ProcedimentoCada grupo de alumnos deberá recorrer un mercado de abasto y recolectar 5 muestras de

frutas y hortalizas, analizar posibles, signos de alteración y estudiarlos detalladamente para identificar las causas de su deterioro. En un supermercado realice el mismo tipo de muestreo y evaluación. Los resultados serán reportados en el cuadro 1.

Se seleccionarán las muestras con signos de deterioro microbiológico para inspeccionarlos visualmente haciendo uso de un lente de aumento o microscopio. Reportar cual sería el microorganismo en cuestión (Revisar Literatura).


CUADRO 1. FICHA PARA REPORTAR DETERIORO

PRODUCTO:NOMBRE

CIENTIFICO:

DETERIORO MICROBIANO

MECANISMO DE DETERIORO

MEDIDAS PREVENTIVAS

Factores externos:

Factores internos:

Discutir resultados y confrontar con la teoría

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V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

VI. BIBLIOGRAFIA


Frazier, W.C.; Westhhoff, D.C. “Microbiología de los alimentos”. Ed Acribia. 1994. Zaragoza.

Ingraham,J.; Ingraham, C.A. “Introducción a la microbiología”. Tomos 1 y 2. Ed. Reverté, S.A.. 1998. Barcelona.



ICMSF Ecología Microbiana de los Alimentos. Vol. I Factores que afectan la vida y muerte de los microorganismos. Vol II. Food commodities, Academic Press 1980.

Jay, J.M. “Modern food Microbiology”. Chapman Hall Ed. (5ª Ed) 1996. NY.

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PRACTICA N° 3

PREPARACION DE MATERIALES Y MEDIOS PARA ANALISIS MICROBIOLOGICOS

I. OBJETIVOSPreparación de materiales y medios para los diversos ensayos microbiológicos

II. FUNDAMENTOLos materiales que se usan para el análisis microbiológico, deberán ser

esterilizados por calor seco o calor húmedo según su aplicación. Los materiales de vidrio y de material quirúrgico se esterilizan en una estufa a temperaturas de 120-150°C . Los medios de cultivo se autoclavan a temperaturas de esterilización de 121°C a presión de 15 psi.


3.1 Materiales y Equipos

- Pipetas,placas Petri,Erlenmeyer, vaso de precipitados,otros.- Medios de cultivo : agar nutritivo, peptona- Agua destilada- Mechero de bunsen- Balanza analítica- Algodón, papel kraft- autoclave

3.3 ProcedimentoCada grupo de alumnos deberá esterilizar los materiales de vidrio previamente envueltos en

papel kraft a la temperatura correspondiente y tiempos correspondientes .Los medios de cultivo se prepararan según instructivos para el reconocimiento y recuento de bacterias. Todo el material será rotulado y guardado en los casilleros respectivos.


Discutir y confrontar con la teoría


VI. BIBLIOGRAFIA




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MENDO RUBIO, Manuel (2003). MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGÍA. Ediciones Laborales SRL. Lima – Perú.

PRACTICA N° 4

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ANALISIS MICROBIOLOGICOS DE MUESTRAS LIQUIDAS

III. OBJETIVOSProcedimiento para ensayos microbiológicos en muestras liquidas

IV. FUNDAMENTOLos materiales que se usan para el análisis microbiológico, deberán ser

esterilizados por calor seco o calor húmedo según su aplicación. Los materiales de vidrio y de material quirúrgico se esterilizan en una estufa a temperaturas de 120-150°C . Los medios de cultivo se autoclavan a temperaturas de esterilización de 121°C a presión de 15 psi.



Tubos de ensayo Matraces

Erlenmeyer Placas Petri Asa de Kolle Probetas Pipetas Pinzas

Lejía Detergente Papel kraf Algodón Mechero Autoclave Incubadora

Balanza eléctrica

Agitador Bortex Agua destilada Medio de cultivo

Agar nutritivo Agua

peptonada

3.4 Procedimento

1. Se coloca 90 ml de agua peptonada en un matraz Erlenmeyer con ayuda de la probeta, luego se agrega 10 ml de la muestra liquida (gaseosa). Seguidamente se agita por un lapso de tiempo. Así se obtiene la dilución 10-1.

2. Luego en dos tubos de ensayo se coloca 9 ml de agua peptonada, obteniéndose así la dilución 10-2 y la dilución 10-3.

3. Seguidamente se pipetea una porción de 1ml de la solución 10-1 al tubo de dilución 10-2.4. Luego se agita cuidadosamente en el agitador Bortex. 5. Después se transfiere con la misma pipeta 1 ml de la dilución 10-2, al tubo de dilución 10-3.6. Luego se agita cuidadosamente en el agitador Bortex. 7. Se agrega rápidamente a las 4 placas Petri unos 15 ml de agar nutritivo previamente licuado y

temperado y se realiza la siembra directa de la siguiente manera: -Placa I: Testigo (agua peptonada)-Placa II: dilución 10-1

-Placa III: dilución 10-2

- Placa IV: dilución 10-3

8. Una vezsolidificado el agar, se invierte las placas para incubarlas a 37 °C por 48 horas.12



9. Luego se realiza el recuento en placas.V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Reportar los resultados en el cuadro siguiente:

MUESTRA RESULTADOSPLAC

A I10-1

PLACA II

10-2

PLACA III

10-3



VI. BIBLIOGRAFIA





PRACTICA N° 5

ANALISIS MICROBIOLOGICOS DE MUESTRAS SOLIDAS

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VI. OBJETIVOSProcedimiento para ensayos microbiológicos en muestras liquidas

VII. FUNDAMENTO



Tubos de ensayo Matraces

Erlenmeyer Placas Petri Asa de Kolle Probetas Pipetas Pinzas

Lejía Detergente Papel kraf

Algodón Mechero Autoclave Incubadora Balanza

eléctrica Agitador Bortex Agua destilada Medio de cultivo

Agar nutritivo Agua

peptonada

3.5 Procedimento

1. Inicialmente se tara el matraz Erlenmeyer.2. Se coloca 90 ml de agua peptonada en un matraz Erlenmeyer con ayuda de la probeta, luego se

agrega 10 g de la muestra solida (queso fresco). Seguidamente se agita por un lapso de tiempo. Así se obtiene la dilución 10-1.

3. Luego en dos tubos de ensayo se coloca 9 ml de agua peptonada, obteniéndose así la dilución 10-2 y la dilución 10-3.

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4. Seguidamente se pipetea una porción de 1ml de la solución 10-1 al tubo de dilución 10-2.5. Luego se agita cuidadosamente en el agitador Bortex. 6. Después se transfiere con la misma pipeta 1 ml de la dilución 10-2, al tubo de dilución 10-3.7. Luego se agita cuidadosamente en el agitador Bortex. 8. Se agrega rápidamente a las 4 placas Petri unos 15 ml de agar nutritivo previamente licuado y

temperado y se realiza la siembra directa de la siguiente manera: -Placa I: Testigo (agua peptonada)-Placa II: dilución 10-1

-Placa III: dilución 10-2

- Placa IV: dilución 10-3

9. Una vezsolidificado el agar, se invierte las placas para incubarlas a 37 °C por 48 horas.10.Luego se realiza el recuento en placas.

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓNReportar los resultados en el cuadro siguiente.

MUESTRA RESULTADOSPLAC

A I10-1

PLACA II

10-2

PLACA III

10-3



VI. BIBLIOGRAFIA



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PRACTICA N° 6

RECONOCIMIENTO DE HONGOS

VIII. OBJETIVOS

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Procedimiento para ensayos microbiológicos en muestras liquidas

IX. FUNDAMENTO

La contaminación fúngica de un alimento tiene mucha importancia, no tan sólo por su acción deteriorante, que pudre y malogra materias primas y productos manufacturados, sino también por la capacidad de algunos hongos para sintetizar gran variedad de micotoxinas, para provocar infecciones , incluso, para provocar reacciones alérgicas en personas hipersensibles a los antígenos fúngicos. Por estos motivos, para conocer la calidad microbiológica de un producto, es pertinente realizar un recuento de hongos y levaduras.

En general, los hongos son microorganismos eucariotas pluricelulares filamentosos, no presentan pigmentos fotosintéticos y son quimioheterótrofos aerobios estrictos. A diferencia de las plantas, presentan un bajo grado de diferenciación en los tejidos.

Existe una variedad de hongos y levaduras que viven en los distintos tipos de alimentos dentro de los cuales se puede mencionar a los panes, pero que no constituyen la flora dominante ni representa algún riesgo para la salud. Sin embargo cuando la actividad de agua aumenta en estos productos, también aumenta la proliferación de microorganismos patógenos para el ser humano.

Entre estos se puede mencionar:

Aspergillus Penicillum Rhizopus Alternaría Mohos

A diferencia de las bacterias que son unicelulares, los hongos están compuestos de muchas células y a veces pueden verse a simple vista. Bajo el microscopio, éstos aparecen como setas delgadas. En muchos hongos, el cuerpo consiste de:

Raíces en forma de hilos que invaden los alimentos donde viven.Un talo que crece elevándose por encima del alimento y Esporas que se

forman al final del talo. Las esporas le dan el color que usted ve en el hongo. Cuando se expone al aire, las esporas dispersan el hongo de un lugar a otro, parecido a las semillas de dientes de león volando a través de la pradera.

IV. MATERIALES Y METODOS

Materiales: Pipeta Vaso de precipitado

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Lámina porta y cubre objeto Microscopio Lugol Agua destiladaMétodos:1. inspeccionar el hongo macroscópicamente (forma, tamaño, color, textura,

etc.), 2.Colocar en una lámina portaobjeto una gota de Lugol.3.Transferir al portaobjeto, con el asa de kolle una pequeña porción del hongo

de la muestra a analizar.4. extender cuidadosamente sobre la gota.5. cubrirla con una lámina cubreobjeto.6. observar al microscopio con el objetivo de 40X.

3.6 Procedimento

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X. RESULTADOS Y DISCUSIÓNReportar los resultados en el cuadro siguiente:

IMAGEN OBTENIDA EN LA MUESTRA

IMAGEN PATRON

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Características microscópicas.



VI. BIBLIOGRAFIA





PRACTICA N° 7

RECONOCIMIENTO DE HONGOS

I. OBJETIVOSProcedimiento para ensayos microbiológicos en muestras liquidas

II. FUNDAMENTO

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INTRODUCCION

Los microorganismos ya sean patógenos o no siempre están presentes en los alimentos tal es el caso del staphylococcus también de los mohos y levaduras estos si son ingeridos causan gran intoxicación en el ser humano, también animales por esta razón es importante saber determinar la presencia de estos mediante un análisis microbiológico o medios de cultivo selectivos con placas petri film

OBJETIVO

- conocer la presencia de staphylococus, mohos y levaduras en alimentos.

FUNDAMENTO TEORICO

Staphylococcus aureus es un microorganismo muy resistente a las condiciones ambientales y extremadamente difícil de erradicar. Pese a que no es esporulado (formas de resistencia elaboradas de forma natural por algunos microorganismos), soporta bien condiciones extremas aunque se inactiva a temperatura de congelación y puede eliminarse con una cocción correcta.

Se puede localizar en cualquier alimento y produce una intoxicación muy aguda. Ésta aparece entre las 2 y 12 horas después de la ingestión de la toxina que genera el patógeno y provoca vómitos intensos e incontrolados, aunque no fiebre. Es una intoxicación leve y desaparece en 24 horas. El responsable del problema es una toxina de carácter termoestable, lo que permite que en alimentos cocinados se mantenga la toxina, aún cuando no esté presente el microorganismo. Por ello, el control exclusivo de la presencia de la bacteria no es suficiente, sobre todo si el alimento se ha cocinado previamente. En estos casos hay que proceder a controlar la toxina, ya que en caso contrario podría no localizarse un riesgo que hay que calificar de moderado a alto.

Esta bacteria se encuentra en la piel de los animales, pero también de las personas, así como en su garganta y fosas nasales, hasta el punto que la casi totalidad de la población humana podrá ser portadora del microorganismo a lo largo de su vida. Por ello, la probabilidad de contaminar los alimentos es muy alta, no sólo por los manipuladores, también por los clientes al tocar u oler los alimentos.

METODOS

MATERIALES

- muestras de alimentos

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- placas Petri film

- Matraz

- Tubos de ensayo

METODO

Para determinar la presencia de staphylococcus en alimentos se hizo cultivo en placas petri film que es un medio de cultivo listo con el requerimiento nutricional especialmente para esta bacteria.

Staphylococcus

- Se preparo la muestra a analizar tomando 90ml de agua destilada a la cual se incorporo 16.2g de arroz.

- Luego de homogenizar la muestra se tomo 5ml aproximadamente de esta se puso en el petri film

- Luego fue llevado a la incubadora.

Mohos y levaduras

- En la preparación de la segunda muestra se tomo también 90ml de agua destilada, se incorporo 10ml de agua de aceitunas y se homogenizo.

- Posteriormente se tomo 2ml de aproximadamente de la muestra la cual se puso en la placa petri film para luego ser llevado a la incubadora.

RESULTADOS

- Al cavo de 7 días en la incubadora de las placas petri film las bacterias se desarrollaron los cuales dieron como resultado:

- En la placa con la muestra de arroz destinado para identificar staphylococcus si se noto la presencia de este microorganismo en la placa, esta bacteria se identifica por los puntos azules que apareció en la placa

- En la placa destinada para determinar mohos y levaduras con muestra de agua de aceitunas dio como resultado que si existe la presencia de mohos y levaduras en este alimento, se pudo identificar porque en la placa notamos puntos azules obscuros, color característico de estos microorganismos

CONCLUCIONES

- Los staphylococcus se pueden determinar por medios de cultivo selectivo en este caso fue las placas petri film.

- Los mohos y levaduras también se pueden determinar mediante cultivos selectivos.

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- En el arroz y aceitunas existe gran presencia de estos microorganismos.

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