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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 1

    ApndiceGua de trabajos prcticos

    CONTENIDO

    1. Medios de cultivo y esterilizacin

    2. Aislamiento y cultivo de microorganismos

    3. Fijacin simbitica de N 2en leguminosas

    4. Microorganismos del suelo

    5. Inhibidores y desinfectantes

    6. Digestin anaerbica de residuos agrcolas

    7. Morfologa microscpica de hongos

    8. Identificacin de mohos toxignicos

    9. Micorrizas

    10. Microorganismos del agua

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice2

    TRABAJO N 1. Medios de cultivo y esterilizacin

    Objetivo.Preparar los substratos o medios de cultivo, cuya composicin varia segn el tipo de

    organismos y la selectividad esperada, para estudiar los microorganismos en el laboratorio.Esterilizar estos materiales para eliminar los microorganismos que pudieran alterarlos antes del

    uso.

    Introduccin

    NutricinLos microorganismos toman del ambiente circundante los materiales o nutrientes que son el

    punto de partida para las reacciones metablicas que los convierten en constituyentes celulares.Hay nutrientes necesarios sin los cuales una clula no puede crecer, y otros tiles pero no

    indispensables.La primera divisin en las categoras nutricionales tiene en cuenta dos parmetros: la

    naturaleza de la fuente de energa y la naturaleza de la fuente principal de carbono. Losorganismos que usan la luz como fuente de energa se denominan fottrofos y los que utilizanfuentes de energa qumica se denominan quimitrofos. Los que emplean CO 2 como principal

    fuente de carbono se definen como auttrofos, pero los que utilizan compuestos orgnicos parael mismo fin se llaman hetertrofos. Los microorganismos necesitan una diversidad de

    minerales para su crecimiento, y los ms comunes son el potasio, sodio, magnesio, calcio ehierro. Los factores de crecimiento son compuestos orgnicos especficos requeridos en muypequeas cantidades y no puede ser sintetizados por la clula.

    Diseo de un medio de cultivoEn el cuadro siguiente se consideran tres medios de distinta complejidad.

    Medio 1 Medio 2 Medio 3

    agua 1 L agua 1 L agua 1 Lcloruro de amonio 1 g peptona o triptona 5 g peptona de soja 10 gfosfato dipotsico 1 g extracto de carne 3 g glucosa 10 gcarbonato de calcio 1 g agar 15 g extracto de levadura 2,5 gsulfato de magnesio 10 mg agar 15 gsulfato ferroso 10 mg

    cloruro de calcio 10 mgsales inorgnicas de 0,02 mg

    Mn, Mo, Cu, Co, Zn de cada uno

    Al elaborar un medio de cultivo para un organismo cualquiera, el objetivo pricipal consiste enproporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, en concentraciones que

    permitan un buen crecimiento. El punto de arranque es componer una base mineral queproporcione las sales inorgnicas que pueden suministrarse a cualquier organismo. Estasolucin puede suplementarse luego, si es necesario, con una fuente de carbono, una de energa,una de nitrgeno y algn factor de crecimiento requerido.

    El medio 1 puede permitir el crecimiento de bacterias nitritantes auttrofas que usan eldixido de carbono como fuente de carbono y oxidan amonio para obtener energa. El medio 2es un medio complejo que favorece el desarrollo de muchas bacterias hetertrofas que obtienenenerga y tambin carbono de aminocidos y pptidos, pero no requieren factores decrecimiento. El 3 contiene glucosa, varios constituyentes nitrogenados orgnicos y factores decrecimiento como para cubrir las necesidades nutricionales de mohos y levaduras.

    Cualquier medio adecuado para el crecimiento de un organismo especfico es, en cierto modo,selectivo para l. Los microorganismos deseados pueden obtenerse de los ambientes naturales

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    tales como el suelo, empleando medios selectivos.Como agente gelificante de los medios de cultivo se utiliza comnmente el agar que es

    obtenido de algas pero no es nutriente para la mayora de los microorganismos. El gel de agar

    es firme a las temperaturas de incubacin pero se convierte en lquido (sol) cuando se calienta ala temperatura de ebullicin del agua, gelificando nuevamente cuando se enfria a 45C. Otramanera de proporcionar una superficie nutritiva es utilizar un filtro de membrana de esteres decelulosa depositado sobre un disco de absorbente embebido con el medio de cultivo. El medio

    traspasa los poros permitiendo el desarrollo de los microorganismos que estn en la superficie.El extracto de carne es un extracto acuoso de msculo de bovino, concentrado hasta una

    consistencia pastosa o desecada hasta polvo, que contiene compuestos solubles tales comoazcares, aminocidos y sales. El hidrolizado de protena se obtiene por digestin de msculo

    con pepsina (peptona) o tripsina (triptona) o de casena (casitona, tripticase) o de proteina desoja (peptona de soja). Los medios complejos deshidratados contienen algunos componentes

    cuya concentracin vara con cada partida y suelen tener una baja capacidad reguladora del pH.

    Esterilizacin

    Esterilizar significa eliminar toda clase de microorganismos. Esto puede realizarse dediferentes modos. Pueden eliminarse las bacterias del aire por filtracin, como en las cmaras deflujo laminar estril, y de los lquido a travs de membranas fltrantes u otro filtro. Ladestruccin de las bacterias puede hacerse mediante calor seco o hmedo para el tratamiento dela mayora de los materiales, o rayos ultravioletas para el caso de superficies, o con radiaciones

    ionizantes para esterilizar plsticos deseartables.El calor seco se utiliza en estufa de aire caliente, pero

    no es un mtodo eficaz de calentamiento porque elaire es un mal conductor del calor. En ausencia de

    humedad las formas ms resistentes (endosporosbacterianos) requieren temperaturas por sobre 160C

    durante una hora y media para morir.

    El vapor a presin es el procedimiento ms efectivode esterilizacin por calor hmedo. El vapor a unapresin absoluta de 2,066 kg/cm2 proporciona unatemperatura de 120,6C que es mortal para losendosporos bacterianos en pocos minutos, pero eltiempo de aplicacin vara segn el tiempo necesariopara homogeneizar la temperatura en el material

    tratado.La presin absoluta a la que est sometido el

    material dentro del autoclave es igual a la presinleda en el manmetro sumada a la presin

    atmosfrica del lugar. Como esta ltima varia con laaltura sobre el nivel del mar, debe calcularse lapresin manomtrica necesaria para llevar a cabo laesterilizacin en cada localidad, haciendo caso omisode las graduaciones en temperaturas adicionadas al

    manmetro por los fabricantes a nivel del mar. En la figura 1 seven las curvas de temperaturasalcanzadas en funcin del tiempo en un autoclave con distinto grado de purgado del aire. La

    figura 2 muestra el tiempo requerido para esterilizar distintos volmenes a 120,6C.La temperatura de ebullicin del agua puede ser usada para esterilizar materiales nutritivos

    que se alteraran a temperaturas mayores, mediante el siguiente artilugio: el material es tratadodurante 30 minutos el primer da e incubado a la temperatura ambiente, vuelto a calentar 30

    minutos el segundo da y otra vez incubado, para finalmente calentarla otros 30 minutos eltercer da. El tratamiento durante el primer da destruye las formas vegetativas, el perodo de

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    incubacin permite lagerminacin de muchosendosporos y las formas sensibles

    originadas mueren con elsegundo calentamiento. Losendosporos que persistierongerminarn durante el segundo

    perodo de incubacin y lasclulas formadas morirn con el

    tercer calentamiento. Como se ve,la tindalizacin es efectiva

    nicamente cuando el medio aesterilizar es favorable para la

    germinacin de los esporos. Nodestruir los endosporos de

    anaerobios si la incubacin no selleva a cabo en condiciones deanaerobisis y tampoco destruir alos endosporos del grupotermoflico.

    Teniendo en cuenta la cinticamicrobiana el fin prctico de laesterilizacin mediante un agente

    letal es lograr que la probabilidadde que el material tratado

    contenga tan slo unsuperviviente, sea muy

    pequea. Los procedimientos habituales de esterilizacin se proyectan siempre de forma que

    proporcionen un amplio margen de seguridad.

    FiltracinLos microorganismos quedan retenidos por el pequeo tamao de los poros del filtro y con

    algunos tipos de materiales filtrantes por adsorcin sobre los mismos, adems de la influenciadel pH del lquido sobre las cargas de los microorganismos y el filtro. Comnmente en el

    laboratorio se usan membranas de esteres de celulosa con porosidades de 0,45 m 0,2 m,pero tambin suelen usarse en otros casos unos filtros de porcelana o vidrio fritado(sinterizado).

    Procedimiento

    Preparacin del material de vidrioObturar con algodn la extremidad no aguzada de las pipetas con la ayuda de un punzn.

    Colocar dos o tres de ellas en un sobre de papel y cerrarlo con broches metlicos, o bienenvolverlas separadamente en una tira de papel. Envolver con papel cada caja de Petri cerrada.Tapar los tubos de ensayo con algodn prensado de tal modo que, se pueda quitar y colocar eltapn sin deformarlo. Reunir unos diez tubos en un paquete.

    Esterilizacin por aire calienteEl material limpio y bien seco, una vez tapado con algodn y/o envuelto con papel, se ubica

    en el interior de la estufa (horno o esterilizador). Luego se calienta hasta que la temperatura

    alcance 170C y se la mantiene durante 30 a 60 minutos enfriar segn la carga. Se deja enfriar elaparato antes de abrir, para evitar la rotura del vidrio por el contacto brusco con el aire fro. Al

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    terminar la operacin, el algodn y/o el papel de diario tendrn un color tostado plido. Desdelos 150C ambos comienzan a amarillear, pero a los 180C pierden la propiedad de detener lasbacterias y se forman residuos carbonosos ms o menos antispticos.

    Control de la eficacia de la esterilizacinSe coloca en la estufa, junto con el material de vidrio, un tubo con endosporos bacterianos

    (cultivo seco o suelo tamizado). Una vez sometido al tratamiento trmico, se le agrega un medionutritivo lquido y se incuba a 30C durante 48 horas. Si se ha logrado la esterilizacin, no habrdesarrollo bacteriano.

    Preparacin de medios de cultivoLa mayora de las bacterias hetertrafas pueden multiplicarse en el medio 2 denominado "

    agar nutritivo". Para disolver el agar se calienta el recipiente en un bao de agua hirviente o enel autoclave a vapor fluente. El pH del medio debe estar prximo a 7. Si se prepara sin agar se

    obtiene el medio llamado "caldo nutritivo".Los hongos suelen crecer ms lento que las bacterias y toleran mejor la acidez, por lo que suele

    usarse para su cultivo el medio 3 conocido como "agar micolgico" cuyo pH esaproximadamente 5,6, al que se le aadi extracto de levadura para que desarrollen aun los

    organismos exigentes en vitaminas.Los medios se distribuyen en tubos de ensayo o en matraces de Erlenmeyer ocupando slo un

    tercio de su capacidad. Tanto los tubos como los matraces llevan tapones de algodn, exceptocuando tienen tapa a rosca esterilizable. Los tubos se renen en cestos y se los cubre con dos otres hojas de papel poroso donde se escribe con lpiz el nombre del contenido. Se cubren losmatraces con un capuchn de papel y un hilo atado de tal forma que pueda quitarse fcilmente.Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave.

    Esterilizacin por vapor de agua a presinEn el autoclave se logra que la temperatura del vapor de agua sea superior a la ebullicin

    (96C a 1300 m s.n.m.) por medio de un aumento de la presin, luego de la eliminacin del aire

    por la espita o vlvula de purga. Si funciona a 1,18 kg/cm2por sobre la presin atmosfricapromedio local (0,88 kg/cm2= 884 HPa), el agua hervir a 121C.

    Al mantener esta temperatura durante 15 minutos se logra la destruccin de toda forma de

    vida en volmenes menores a 100 mL. El mismo resultado se alcanza prcticamente enmateriales poco contaminados, calentando a 115C (0,84 kg/cm2 de presin manomtrica)

    durante 20 minutos. Los slidos o liquidos muy viscosos deben ser calentandos a 121C durante30 minutos. Si el autoclave est muy cargado, o los volmenes son mayores, es necesarioprolongar el tiempo de calentamiento.

    Con estas condiciones de tratamiento pueden sobrevivir los endosporos de bacteriastermoflicas, pero stas no crecen a las temperaturas comunes de incubacin (25 - 37C).

    Colocar agua hasta la rejilla, ubicar los recipientes y cerrar el autoclave, ajustando lasmariposas opuestas para que la tapa quede bien apoyada sobre la junta de goma. Encender el

    mechero. Cerrar la espita, o vlvula de purga, recin cuando sale un chorro de vapor continuopues entonces se ha logrado purgar el aparato. A partir de este momento comienza a aumentarla presin, la que se regula y mantiene con la altura de la llama. Vigilar el autoclave durante laesterilizacin.

    Cumplido el tiempo, cerrar la llave de gas y esperar hasta que la aguja del manmetro vuelvaa cero, antes de abrir la espita para igualar las presiones, interna y externa. Luego abrir la tapa.Si se abriera la espita durante el enfriamiento, la brusca descompresin producirla la ebullicinviolenta de los lquidos y los proyectarla fuera de los recipientes. Por otra parte si se abre

    demasido tarde, el vapor se habr condensado sobre los papeles y algodones, y se habracelerado el deterioro de la junta de goma por el vacio formado.

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    Control de la temperatura de esterilizacinSe coloca un tubito con cido benzoico en polvo (p.f. 121C) junto al material a esterilizar.. Si

    se alcanza la temperatura de fusin durante el proceso de esterilizacin, luego del enfriamiento

    quedar una masa homognea de cido benzoico.Tambin se usan mezclas indicadoras adheridas sobre cartn u otro material, tal como la

    compuesta por carbonato de plomo + azufre precipitado + carbonato de litio (10 + 1+ 3). Estamezcla vira al gris despus de 30 minutos a 100C, en 3 4 minutos a 110C y en 30 segundos a

    121C. Toma color negro si est expuesta ms de 30 minutos a 110C yen 5 minutos a 121C.

    Esterilizacin por filtracinSe eliminan los bacterias de las soluciones que se descomponen o

    inactivan al someterlas a la temperatura del autoclave, pasndolas a

    travs de membranas con poros de 0,2 0,45 m u otros filtros. Lamembrana o disco filtrante se coloca sobre una superficie porosa rgida,

    en una suerte de embudo desmontable adaptado a un matraz de

    Kitasato (ver figura 3) mediante un tapn de goma, para poder hacer unvacio parcial con una bomba o una trompa de agua. La tubuladuralateral del matraz se conecta a un tubo engrosado en su parte media,donde se coloca algodn. Se envuelve el conjunto con papel y seesteriliza en el autoclave. Despus se ubica el disco filtrante en elembudo desmontable cumpliendo con las reglas de asepsia y se conectael matraz de Kitasato a la trompa de agua o la bomba de vaco.

    Control de la eficiencia de la filtracinDos porciones del material nutritivo filtrado se transfieren en condiciones de asepsia arecipientes estriles y se incuban, uno a 30C y otro a 45C, durante 48 horas. Si se logr la

    esterilizacin no debe haber desarrollo microbiano.

    Bibliografiao Madigan TM et al. Brock- Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998o Stanier RY et al. Microbiologa. Revert, Barcelona, 1984o Carpenter P, Microbiologa, Interamericana, Mxico, 1979o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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    TRABAJO N 2. Aislamiento y cultivo de microorganismos

    Objetivo.Separar por mtodos fsicos los microrganismos, provenientes de un ambiente natural,

    de tal manera que al multiplicarse sobre un substrato nutritivo se obtenga una poblacin (en elcaso de bacterias o levaduras) o un individuo (en el caso de un moho).

    Reconocer al microscopio las caractersticas generales de los microorganismos mediantepreparaciones en fresco o coloraciones de extendidos del material.

    Introduccin

    Microbios uni y pluricelularesLos organismos ms sencillos son aqullos que estn constituidos por una sola clula. Como

    las clulas se miden en micrmetros (m) estos organismos unicelulares caen dentro de lacategora general de microbios o microorganismos. La organizacin unicelular se observa enprotozoos, algunas algas, levaduras y la mayora de las bacterias. Un tipo ms complejo de

    organizacin biolgica es la de los organismos pluricelulares. Aunque surgen en general a partirde una sola clula, en estado maduro constan de varias clulas permanentemente unidas unas aotras de un modo caracterstico, lo cual le confiere una forma tpica al organismo. As un mohoesta compuesto por filamentos ramificados. Cada filamento se denomina hifa y al conjunto dehifas se lo llama micelio.

    Aislamiento, cultivoDos clases de operaciones fundamentales en la microbiologa clsica son el aislamiento o

    separacin de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en lanaturaleza, y el cultivo o crecimiento del microorganismo en medios artificiales bajocondiciones de laboratorio. Estas operaciones son bsicamente iguales para el estudio de lasbacterias, los hongos, las algas, los protozoos y las lineas de clulas vegetales o animales (cultivode tejidos).

    Para el aislamiento directo se emplean medios gelificados. Cuando un inoculo mixto quecontiene una cierta variedad de organismos diferentes se extiende directamente sobre lasuperficie de un medio gelificado, todos aqullos que puedan crecer sobre el mismo producirncolonias. La dispersin de los microbios sobre el medio elimina gran parte de la competencia

    por los nutrientes y por ello algunos que crecen lentamente son capaces de multiplicarse en elmismo ambiente de los que crecen rpidamente.

    Como consecuencia del aislamiento aparecen luego de la incubacin, poblaciones de bacteriasy levaduras e individuos fngicos sobre la placadel medio de cultivo. Se los puede mantener

    vivos en el laboratorio mediante transplantes a otros medios de cultivo.

    AmbienteLos principales ambientes naturales de los microorganismos son el suelo y el agua. Muchos

    organismos se encuentran en una capa delgada de suelo de algunos decmetros de espesor. Losmicrorganismos de las masas de agua, por ejemplo lagos, estn concentrados en la superficie yen el fondo por encima del cieno. Los microorganismos transportados por el aire son seres queaccidentalmente se encuentran en este medio y provienen del suelo, agua u otros organismosvivos.

    Es necesario que haya ciertas condiciones en el ambiente para que sirva como reservorio de los

    microorganismos. El crecimiento depende del abastecimiento adecuado del agua y lassubstancias nutritivas, el pH conveniente, la tensin de oxigeno suficiente, la temperatura

    necesaria y otros factores.

    OxgenoMuchos organismos requieren oxigeno molecular pues dependen de la respiracin aerobia

    para cubrir sus necesidades energticas y se los denomina aerobios obligados. Entre stos,

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    algunos crecen mejor a presiones parciales de oxigeno menores que la presente en el aire y se losconoce como microaerfilos. Hay microorganismos son anaerobios facultativos, pues puedencrecer tanto en presencia como en ausencia de aire. Comprende dos subgrupos: uno, el de las

    bacterias que tienen un metabolismo productor de energia exclusivamente fermentativo pero nolos afecta la presencia de aire; otro, el de las levaduras o bacterias que pueden pasar delmetabolismo respiratorio al fermentativo. En cambio los anaerobios estrictos slo fermentan yson sensibles al oxigeno.

    Crecimiento, coloniaEn cualquier sistema biolgico el crecimiento puede definirse como el aumento ordenado de

    todos los constituyentes qumicos de un organismo. El crecimiento determina la multiplicacincelular y en los organismos unicelulares motiva un aumento del nmero de individuos,

    mientras que en losmulticelulares lleva alaumento del tamaodel individuo.

    En el aislamiento setom una pequeacantidad de clulasmicrobianas y aldeslizar el asa sobre el

    agar se las distribuypor la superficie.

    Durante la incubacinla clula aislada se

    dividi repetidamente hasta formar una masa visible llamada colonia sobre el medio de cultivo.El crecimiento de las poblaciones bacterianas est normalmente limitado por la desaparicin de

    los nutrientes accesibles o por la acumulacin de productos metablicos txicos. Al describir

    una colonia se usan distintos vocablos para describir forma, elevacin y borde de la mismacomo se muestra en la figura 4.

    BacteriasLa mayora son organismos unicelulares que se multiplican por escisin binaria transversal. Se

    distinguen varios tipos respecto a su forma y agrupacin como se esquematiza en la figura 5.Algunas bacterias forman clulas de reposo, conocidas como endosporos, que tienen bajo

    contenido de agua, son muy refringentes y se tien con dificultad.

    Los endosporos soportan el calor, la desecacin y algunas substancias qumicas, muchosresisten a 100.C durante unas 20 horas, otros slo unos minutos a 90CLas bacterias mviles tienen uno o varios flagelos. Para verlos con el microscopio ptico se los

    debe engrosar mediante un mordiente antes de la coloracin. Suele obs ervarse el movimientobacteriano cuando se coloca una gota de un cultivo en medio lquido entre cubre y portaobjetos.

    Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, ramificadas, que forman un miceliodelgado y en la mayora de los casos clulas de multiplicacin llamadas esporos.

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    ColoracionesEl tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resulta difcil de ver con el

    microscopio ptico. La principal dificultad es el poco contraste entre la clula y el medio que la

    rodea, y la manera ms simple de aumentarlo es utilizando colorantes.Las clulas generalmente son tratadas de diversa manera, antes de teirlas, para coagular el

    protoplasma en un proceso que se llama fijacin. En el caso de las bacterias, la fijacin por calores lo ms corriente, aunque tambin puede emplearse formaldehido, metanol o cidos. La

    fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos. Luego lesigue la tincin.

    La mayora de los colorantes usados son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidadespecifica con los materiales celulares. El azul de metileno es un buen colorante que actarpidamente sobre las bacterias y es til para detectar bacterias en medios naturales, puesto queno tie la mayor parte del material extrao.

    Tincin de GramEs un mtodo diferencial de tincin para bacterias. Luego del tratamiento con cristal violeta

    todas las clulas estn coloreadas. Al agregar iodo se forma un complejo con el colorante en elinterior de las mismas. Despus de aadir etanol o acetona algunos organismos se decoloran(Gram-negativos) y otros no (Gram-positivos) segn la estructura fsica de la pared, no por los

    constituyentes qumicos pues las levaduras son gram-positivas aunque tienen una paredqumicamente distinta a las de las bacterias.

    Para poner de manifiesto las clulas incoloras se utiliza una coloracin de contraste, tal comosafranina o fucsina bsica que tien de rojo a las clulas gram-negativas mientras las gram-

    positivas permanecen violetas.

    Procedimiento

    Aislamiento de microorganismos del polvo ambiental

    La tcnica depende del material a partir del cual se intenta aislar los microorganismos y de lascaractersticas de estos ltimos. Vertir unos 15 mL de agar nutritivo, licuado en bao da agua

    hirviente, en una caja de Petri e igual cantidad de agar deSabouraud licuado en otra. Dejar gelificar y luego exponer las placas

    al aire dejando sedimentar el polvo ambiental durante 30 minutos.Incubar a 2730C durante 48 horas la caja con agar nutritivo y a25-27C por 5 das la del agar de Sabouraud. Al cabo de ese tiempoexaminar las colonias microbianas presentes.

    Aislamiento de bacterias esporuladasdel suelo

    Calentar una suspensin de suelo por 10

    minutos en un bao de agua a 80C.Flamear el asa hasta que tenga color rojo

    brillante y dejar que se enfre dentro de lazona de conveccin del mechero. Tomar

    una gota de la suspensin y extenderla sobre la superficie de una placa de agar nutritivo

    haciendo las primeras estras como se muestra en la figura 6. Flamear el asa y hacer la segundaserie de estrias con el asa vacia. Flamear otra vez el asa y hacer la tercera serie de estras con el

    asa vaca. Incubar las cajas con la tapa hacia abajo (invertidas) a 25-30C durante 48 horas.

    Aislamiento de rizobios de ndulos radicales de leguminosas

    Lavar la raz para quitar el suelo adherido. Elegir los nodulos de mayor tamao, separarlos ycolocarlos en un tubo o frasquito. Lavarlos nuevamente, agitando con fuerza para eliminar la

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    mayor parte de los residuos. Poner los nodulos durante 30 segundos en etanol 95% y luegosumergir en lavandina concentrada diluida al 1/10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatroveces, agitando enrgicamente, en sendos tubos de agua estril. Para transferir los nodulos de

    un recipiente a otro usar una pinza con la punta previamente mojada en alcohol y flameada.Tomar un nodulo y colocarlo entre dos portaobjetos cuyas caras enfrentadas haban sido

    flameadas. Aplastarlo y tomar el material del nodulo con el asa para hacer estras sobre la placadel medio de cultivo especifico como se muestra en la figura 6. Incubar a 25-30C.

    El medio de cultivo para rizobios contiene manitol 10 g, extracto de levadura 4 g, carbonato decalcio 3 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,l g, agar 15 g,

    rojo Congo 25 ppm o verde brillante 125 ppm, agua 1 litro; pH 7,0. Se esteriliza a 115C durante20 minutos.

    Observacin de las placas de aislamientoEl inoculo fue diluido progresivamente en cada estra sucesiva de tal manera que, despus de

    la incubacin en la estufa, el crecimiento es confluente en los trazos iniciales y las colonias estnbien aisladas a lo largo de las ltimas estras. Observar las caractersticas macromorfolgicas de

    las colonias y registrarlas en la planilla de informes correspondiente. Tomar con un asa materialde una colonia y hacer un extendido sobre un portaobjetos. Luego de secar y fijar por calor,hacer una coloracin de Gram para observar las clulas somticas o de Wirtz para ver losendosporos.

    Tincin de GramPoner el portaobjetos sobre un soporte y cubrirlo con una solucin de violeta cristal. Luego de

    1 minuto agregar solucin de iodo. Despus de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar con alcohol96. Lavar con agua y cubrir con una solucin de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua ysecar. Colocar una gota de aceite para inmersin. Llevar el portaobjetos a la platina de unmicroscopio. Mirar a travs del objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto

    colocar el objetivo de inmersin en aceite (100x) moviendo el revlver. Levantar el condensadorpues la intensidad de la luz debe ser mayor con los objetivos de mayor aumento. Ajustar el

    enfoque mediante el tornillo micromtrico. Regular la cantidad de luz por medio del diafragma.Las bacterias Gram-negativas se tien de rojo anaranjado y las Gram-positivas adquieren color

    violeta. Dibujar lo observado manteniendo la proporcin respecto al campo microscpico .La solucin de violeta cristal contiene 1 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96 y 80

    mL de agua. La de safranina se prepara de igual manera usando 0,25 g de colorante. La solucinde iodo segn Lugol contiene 1 g de iodo y 2 g de ioduro de potasio en 100 mL de agua.

    Coloracin de endosporosCubrir el extendido con solucin de verde de malaquita. Encender un hisopo embebido en

    alcohol y calentar el portaobjetos por debajo del soporte. Apagar y repetir la operacin luego de

    un minuto. Repetir el calentamiento dos vecesms. Lavar con agua. Cubrir con solucin de

    safranina durante 1 minuto. Lavar con agua ysecar. Colocar una gota de aceite parainmersin. Los endosporos se vern verdes y lasclulas somticas de color rojo anaranjado.Dibujar lo observado.

    La solucin de verde de malaquita contiene 2 gde colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96 y80 mL de agua.

    Seleccin y transplantes de coloniasElegir colonias de bacterias y hongos en las

    placas anteriores y repicarlas como se muestra

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 11

    en la figura 7. Incubar los cultivos de bacterias a 30-35C en la obscuridad, si se trata de hongoscolocarlos a 25-27C preferentemente donde reciban una iluminacin diurna difusa parafavorecer la esporulacin.

    a) cultivo de bacterias en aerobiosissobre medios gelificados . Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante. Tomar el tubo con

    la mano izquierda. Quitar el tapn de algodn sostenindolo con el dedo meique de la manoderecha. Pasar la boca del tubo por la llamadel mechero. Introducir el asa, estril y fra, enel tubo y extraer un poco de materialmicrobiano. Volver a flamear la boca del tuboy colocar el tapn. Tomar el tubo con medioestril, destapar y flamear como el anterior.Introducir el asa y depositar losmicroorganismos rayando en zig-zag lasuperficie del medio gelificado, con mucha

    suavidad. Sacar el asa, flamear la boca deltubo y tapar. Flamear el asa.

    en medios lquidos. Proceder igual que en elcaso anterior y depositar losorganismos dentro del medio

    lquido.

    b) cultivo de hongosEl procedimiento para sembrar

    levaduras es similar al empleadopara bacterias. Para cultivar

    hongos se emplea un gancho,inserto en el mango de Kolle, que

    permite tomar los filamentos paratransferirlos al nuevo medio.

    microcultivo.Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado yenfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 a 3 mm deespesor, tomado de una placa estril. Sembrar en los bordes libres deltrozo de agar como se muestra en la figura 8. Colocar un

    cubreobjetos, tambin flameado y enfriado. Incubar los microcultivosen una cmara hmeda, lograda poniendo algodn mojado bajo el

    soporte de los portaobjetos dentro de un recipiente cerrado.

    Observacin de los cultivos en tubos

    macroscpica

    Despus de la incubacin observar los cultivos a simple vista o conayuda de la lupa y registrar en el informe las caractersticas

    morfolgicas (ver figura 9). Evitar la agitacin del medio lquidopues si ha crecido una pelcula superficial, esta puede caer

    confundindose con el sedimento.

    microscpicaHacer un preparado de las bacterias (ver figura 10), fijar por calor en

    la llama o microondas, y colorearlo segn el mtodo de Gram.Suspender los hongos en agua, lquido de Patterson o colorante deGuegun al hacer el preparado en fresco y con ayuda de dos agujasseparar los filamentos.

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice12

    El colorante de Guegun contiene 0,1 g de azul de algodn y 0,1 g de Sudn III en 100 g decido lctico, adems de 10 gotas de tintura de iodo. El lquido de Patterson se preparamezclando 50 mL de solucin acuosa de acetato de potasio al 2%, con 20 mL de glicerina y 30

    mL de etanol 96Observar el microcultivo con el objetivo de menor aumento, luego de enfocar un objeto

    adherido a la cara inferior del cubreobjetos se podr utilizar el siguiente objetivo.

    Medida del tamao de los microorganismosEl mtodo ms prctico usa un ocular

    autoenfocable, con una escala arbitrariadividida en cien pequeas partes iguales, aveces numeradas, la que debe calibrarse con laescala de 1 mm con cien divisiones de diezmicrmetros cada una, grabada en unportaobjetos llamado micro-mtrico (ver figura11). Enfocar al portaobjetos y mover ste de

    modo que su escala quede paralela a la delocular.

    Observar cual nmero de las pequeas

    divisiones de 10 m grabadas en el portaobjetoscoincide con un nmero entero de lascontenidas en el ocular. Calcular el valor enmicrmetros correspondiente a una divisinpequea de la escala del ocular mediante laregla de tres simple.

    Calibrar la escala del ocular para cadaaumento del microscopio. Tener en cuenta que

    las rayas del ocular siempre tendrn el mismo

    espesor mientras que las del portaobjetos irnengrosndose al cambiar los objetivos.

    Bibliografiao Hall GS et al. Methods for the Examination of Organismal Diversity in Soils and Sediments. CAB International,

    Wallingford, 1996o Seeley HW & Van Demarck PJ. Microbios en Accin. Blume, Madrid, 1973o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 13

    TRABAJO N 3. Fijacin simbitica de N 2en leguminosas

    Objetivo. Observar las caractersticas macro y micromorfolgicas de los ndulos radicales de

    leguminosas. Comprobar la capacidad de nodular de la cepa de rizobio aislada.

    Introduccin

    Fijacin simbitica del nitrgeno molecularUna de las simbiosis ms importantes es la que se da entre

    leguminosas y bacterias de los gneros Rhizobiumy Bradyrhizobium .La infeccin de las races con una cepa adecuada de la bacteria (hay

    especificidad de husped) conduce a la formacin de ndulosradicales que tienen distinta forma segn la planta hospedadora

    (figura 12).Los rizobios especficos entran en la raz por el extremo de los

    pelos absorbentes que se retuercen en forma de bculo. Se forma enel pelo uno o varios tubos de infeccin dentro de los cuales losrizobios se hallan dispuestos en fila. El tubo de infeccin penetra en

    las clulas del crtex de la raz. Algunas clulas de la raz sedividen activamente produciendo un meristema.

    Los rizobios contenidos en el tubo de infeccin son liberados en elcitoplasma de estas clulas meristemticas donde adquieren unaforma distinta al rizobio de vida libre y se los llama bacteroides.stos son capaces de fijar el nitrgeno molecular. En los ndulos lapresin parcial de oxgeno es muy baja, si se eleva la enzima

    nitrogenasa quedara inhibida y no se producira la fijacin. Sin embargo el ndulo consumeoxigeno provisto por la leghemoglobina, una molcula transportadora de O2que contiene grupo

    hemo y da a los ndulos color rojizo.Nodulacin de leguminosas

    Ndulos efectivoso pocos y situados sobretodo en la raz primariao voluminosos, con superficie lisa o rugosao actividad meristematica y nodular prolongadao infeccin generalizada, zona bacteriana grande con muchos bacteroideso interior pigmentado de rojo por la leghemoglobina.

    Nodulos inefectivos

    o numerosos y repartidos en todo el sistema radicularo pequeos con superficie lisa

    o actividad meristematica y nodular cortao pocas clulas infectadas, pocos o sin bacteroides y granulos de almidn

    o interior no coloreado de rojo.

    Inoculante para leguminosasLa bsqueda y seleccin de buenas cepas de rizobios puede resultar intil si las leguminosas

    nodulan eficientemente con las cepas nativas, situacin frecuente en especies tropicales. Pero, enmuchos suelos el nivel y la eficiencia de las cepas nativas pueden no ser los adecuados y lanodulacin y la fijacin de nitrgeno resultan insuficientes para satisfacer las demandas delcultivo.

    La inoculacin artificial resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas,sobre todo si son hospedadores de alta especificidad o cuando la deficiencia en nitrgeno limita

    Fi ura 12

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice14

    el desarrollo vegetal. El mtodo y las condiciones de inoculacin deben permitir lasupervivencia de los rizobios, adems la semilla inoculada debe poseer la especie de rizobioadecuada y en nmero suficiente. Las condiciones del suelo prximo a la semilla deben

    favorecer la colonizacin de la rizsfera por la bacteria para lograr la formacin de los nodulos ysu funcionamiento efectivo.

    Para determinar la necesidad deinoculacin se suele emplear un ensayo

    simple de tres tratamientos:- la inoculacin con una cepa de rizobio

    conocida para saber si es efectiva en elhospedador,

    - la fertilizacin para asegurar un buendesarrollo del hospedador si no hay

    inhibidores en el suelo,- el control no inoculado para observar la

    presencia o ausencia de rizobios nativosy su efectividad.

    Las cepas usadas en los inoculantesdeben ser cuidadosamente seleccionadasy mantenidas, y probarse anualmentepara minimizar la posibilidad de cambioen las propiedades simbiticas.

    La eficencia de la fijacin se evala por

    el nmero de ndulos, la masa nodular,el peso seco de la planta y el contenido de nitrgeno de la parte area. Son bacterias eficaces las

    que, por intermedio de los ndulos radicales, aportan nitrgeno reducido a la plantahospedadora produciendo un aumento de peso de la misma.

    Procedimiento

    Examen de los ndulos y bacteroidesTomar un ndulo de la raz de una leguminosa, medirlo y dibujar su forma. Cortarlo y

    observar el color. Si la fijacin de nitrgeno era efectiva se lo ver rosado o rojo, a veces pardo.Aplastarlo entre dos portaobjetos. Extender el material interno mezclado con una gota de agua,

    haciendo movimientos circulares con el asa. Secar cerca de una llama. Fijar pasando tres veces elportaobjetos por dentro de la llama.

    Colocar el portaobjetos sobre un soporte colocado en una bandeja o la pileta. Cubrirlo lasolucin colorante (fucsina bsica 0,3 g, etanol 96 10 mL, fenol 5 g, agua destilada 90 mL).Luego de un minuto lavar con agua. Secar cerca de una llama. Depositar una gota de aceite deinmersin, apoyar un cubreobjetos y sobre ste poner otra gota de ese aceite.

    Observar al microscopio los bacteroides coloreados y dibujarlos tratando de mantener laproporcin respecto al campo microscpico. Anotar el aumento.

    Germinacin de semillas de leguminosasColocar las semillas necesarias, de buen poder germinativo, en un matraz de Erlemeyer con

    etanol al 70% v/v y agitar durante 3 a 5 minutos. Volcar y aadir agua lavandina al 10% v/v,

    agitando por igual tiempo. Lavar varias veces con agua destilada estril. Depositarlas sobreagar-agua estril y dejar germinar.

    Preparacin del inoculanteSembrar en matraces con 50 mL de medio de cultivo con la cepa aislada de ndulos durante el

    desarrollo del trabajo n2. El medio de cultivo contiene: fosfato monopotsico 0,5 g, fosfato

    Testi o

    Ensa o

    Figura 13

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 15

    dipotsico 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, nitrato de potasio 0,8 g, sulfato de magnesio 0,2 g,extracto de levadura 4 g, fosfato diamnico 0,3 g, glicerol 10 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a121C durante 15 minutos.

    Inoculacin de leguminosasEscoger de las placas de germinacin las dieciseis plntulas de mejor aspecto y trasladarlas al

    medio mineral inclinado en tubos grandes. Dejar en lugar iluminado y ventilado. Uno o dosdas despus verter 1 mL del cultivo homogeneizado de rizobio sobre la radcula de ochoplntulas cultivadas.

    El medio mineral contiene: fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, clorurode sodio 0,1 g, cloruro frrico 0,01 g, fosfato triclcico 2 g, agua 1 L, agar 15 g, pH 7. Esterilizara 110C durante 20 minutos.

    Control de las leguminosas inoculadasMedir la longitud de las plantas inoculadas y las testigo. Observar y registrar la ubicacin,

    tamao y forma de los ndulos. Controlar la humedad del substrato.

    Bibliografao Balatti AP & Jardim Freire JR. Legume Inoculants. Selection and Characterization of Strains. Production, Use and

    Management. Kingraf, La Plata, 1996o Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990

    o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice16

    TRABAJO N 4. Microorganismos del suelo

    Objetivo. Demostrar la biodiversidad de los grupos fisiolgicos de microorganismos del suelo

    mediante cultivos selectivos que provean las condiciones ambientales y disponibilidad denutrientes adecuadas.

    Introduccin

    Los microoganismos juegan un papel significativo en la mayora de los procesos naturales queafectan al ambiente. Un ejemplo es la fijacin del nitrgeno molecular por los organismos devida libre y los simbiticos, otro es el reciclado de materiales orgnicos. La materia orgnica quellega al suelo a travs de residuos de cosechas, la cada del follaje, las races y sus productos dedescamacin y exudacin, los restos animales y microbianos sufren una serie de procesos dedegradacin que asegura la continuidad de los ciclos biogeoqumicos.

    Empleando medios selectivos se puede lograr cultivos enriquecidos en microorganismos con

    una caracterstica fisiolgica determinada, por ejemplo si carece de una fuente de nitrgenosoluble slo crecern las bacterias capaces de reducir el nitrgeno gaseoso disuelto, procedente

    de la atmsfera.

    AmonificacinEl nitrgeno orgnico de los productos de hidrlisis de protenas y polinucletidos, se

    convierte en amonaco por el proceso de desaminacin. La urea se hidroliza rpidamente aamonaco y dixido de carbono por la enzima ureasa producida por muchos microorganismos.La evolucin de la microbiota vara segn la materia nitrogenada transformada. En general,primero aparecen bacilos, esporulados o no, y cocos. Despus se observan actinomicetos y mstarde mohos.

    La demostracin de la amonificacin se basa en investigar amonaco mediante el reactivo deNessler en el medio acuoso con aminocidos (peptona, etc). La solucin de yodo-mercuriato

    potsico alcalinizada origina desde un color amarillo hasta un precipitado rojo ladrillo segn lacantidad de amoniaco presente.El amoniaco formado puede ser asimilado directamente por otros microrganismos o ser

    convertido en nitrato por las bacterias especficas. Si se aade a un suelo materiales tales comoestircol, aumenta en consecuencia la velocidad de nitrificacin.

    NitrificacinEl nitrgeno tiene tres formas estables de oxidacin en la naturaleza (nitrgeno molecular,

    amonaco, nitrato) cuya interconversin est dada casi exclusivamente por bacterias. Algunosorganismos pueden usar directamente amonio para sintetizar sus aminocidos y otrasmolculas nitrogenadas de la clula, pero otros, incluyendo las plantas, prefieren nitrato. Laoxidacin del amonio a nitrato se denomina nitrificacin y unas bacterias auttrofas aerobias lasllevan a cabo en dos etapas:

    1) oxidacin del amonio por Nitrosomonas, Nitrosococcus2) oxidacin del nitrito por Nitrobacter, Nitrococcus

    Tanto la formacin de nitrito como la de nitrato por los microorganismos quimioauttrofosconstituyen procesos metablicos aerbicos generadores de energa. Ocurre rpidamente en

    suelos bien drenados a pH neutro. Aunque el nitrato es fcilmente asimilado por las plantas,como es muy soluble en agua resulta rpidamente lavado de los suelos que reciben una gran

    cantidad de lluvia. Por el contrario, el amonio queda fuertemente adsorbido a las arcillas.

    DesnitrificacinEs el proceso en el cual algunos organismos que pueden usar el nitrato como aceptor final de

    electrones durante la respiracin anaerbica producen molculas reducidas gaseosas (xido dedinitrgeno, nitrgeno molecular) que desaparecen del ecosistema. Existen otros

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    microorganismos que pueden reducir nitrato hasta amonio, manteniendo el nitrgeno en elecosistema (reduccin asimilatoria del nitrato).

    Si un suelo queda anegado se producen condiciones anaerbicas y ocurre la desnitrificacin,

    principalmente si es rico en materia orgnica. Tambin sucede cuando se originan puntos deanaerobiosis por otras causas. Como los productos de la desnitrificacin son gaseosos seescapan del suelo disminuyendo el contenido en nitrgeno del mismo. En el laboratorio talesgases quedan atrapados en la campanita del medio de cultivo.

    Fijacin de nitrgeno molecularLa utilizacin de este como fuente de nitrgeno es una propiedad que poseen ciertas bacterias

    y cianobacteras. A continuacin se da una lista abreviada de organismos fijadores de nitrgenode vida libre.

    Algunos gneros de bacterias con especies fijadoras de nitrgenoAerobios Anaerobios

    Heterotrficos Fotosintetizadores Heterotrficos Fotosintetizadores

    Azotobacter cianobacterias Clostridium ChromatiumKlebsiella ChlorobiumBeijerinckia Rhodospirillum

    Bacillus Heliobacterium

    Azomonas

    Azospirillum(microaerfilo)

    El nitrgeno es reducido a amonio en el proceso de fijacin catalizado por el complejonitrogenasa, uno de cuyos componentes protenicos contiene molibdeno, los otros hierro. La

    enzima es inactivada por el oxgeno. El nitrgeno molecular es muy inerte y su reduccinrequiere mucha energa.

    Azotobacter crece en un medio liquido sin agitacin, en forma de una pelcula superficial. Es

    bastante sensible a la acidez pues no suele crecer por debajo de pH 6. Al microscopio seobservan bacilos gram-negativos, grandes, de 4 a 6 m de largo, acompaados de clulas demayor tamao con paredes gruesas y apariencia de levadura, conocidas como cistos. Esta

    bacteria tiene una gran capacidad respiratoria, medida como velocidad de consumo de oxigeno,para proveer la energa requerida por la fijacin.

    Los clostridios fijadores no slo son incapaces de crecer en presencia de aire sino quegeneralmente son muertos por el oxgeno, a menos que se encuentren en forma de endosporos,pero pueden crecer por debajo de la pelcula de Azotobacter, generando burbujas de gas por lafermentacin de azcares.

    Sulfo-oxidacinEl sulfuro de hidrgeno, el azufre elemental y el ion sulfato son tres formas estables

    importantes del azufre. El sulfuro de hidrgeno es txico para la mayora de los organismos y

    los sulfuros son oxidados a sulfato por bacterias aerobias del gnero Thiobacillus y azufreelemental por bacterias fotosintetizadoras anaerobias de ambientes acuticos, el que se acumula

    en la clula, sufriendo una posterior oxidacin en algunos casos. La mayora de losmicroorganismos oxidantes del azufre son auttrofos obligados.

    Sulfato-reduccinEl sulfato y otros compuestos oxigenados del azufre, pueden ser reducidos a sulfuro de

    hidrgeno por bacterias heterotrficas anaerobias. Esta actividad microbiana es muy evidenteen los barros del fondo de estanques y lagos. Suelen usar hexosas, alcoholes o cidos orgnicoscomo fuente de carbono, pero algunas especies crecen autotrficamente con hidrgenomolecular y tiosulfato, por ej. Desulfovibrio.

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    Celulolisis, amilolisisEl almidn y la celulosa estn compuestos por unidades de glucosa, pero conectadas de

    diferente manera: uniones 1,4 - y 1,4 -glucosidicas respectivamente, lo que afecta a sus

    propiedades. La celulosa es insoluble y se digiere a mucho menor velocidad que el almidnsoluble. La celulosa forma largas fibrillas a las que se encuentran intimamente asociados losmicroorganismos que la degradan. Muchos hongos son celulolticos, pero entre las bacteriasesta propiedad est restringida a unos pocos grupos: mixobacterias, clostridios y actinomicetos.El almidn, en cambio, es hidrolizado por muchos hongos y bacterias.

    Las bacterias celulolticas predominan en la zona radicular y su densidad decrece en

    muestras tomadas a cierta distancia de la planta. Por otra parte, es el proceso fundamentalque ocurre durante el compostaje de residuos agrcolas, donde predominan los

    microorganismos termfilos.

    Solubilizacin de fosfatosAlgunos mohos comunes, por ej. Penicillium, Aspergillus, Fusarium, pueden solubilizar fosfatos

    insolubles como polvo de huesos y apatita. Aproximadamente un dcimo de las bacterias del

    suelo tambin los solubilizan. La solubilizacin de fosfato de calcio se aprecia como zonas clarasque rodean las colonias y generalmente se produce cuando los microorganismos forman cidosorgnicos tales como cido 2-ceto-glucnico (bacterias), c. citrico u oxlico (hongos), pero stosson rpidamente degradados por otros organismos del suelo. Los fosfatos de hierro y aluminiopueden ser solubilizados por los microorganismos productores de sulfuro de hidrgeno.

    Procedimiento

    Fijacin de nitrgeno molecularEl medio contiene: manitol 10 g, carbonato de calcio 0,5 g, solucin salina 50 mL, solucin de

    oigoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL decapacidad, a razn de 50 mL en cada uno y se esteriliza a 110C durante 20 minutos. Sembrar

    unos granulos de suelo e incubar a 25-27C durante 7 das.La solucin salina contiene: fosfato dipotsico 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2,5 g,

    cloruro de sodio 2,5 g, sulfato ferroso heptahidrato 0,05 g, agua 1 L, pH 7 - 7,5.La solucin de oigoelementos contiene 0,05 g/L de las sales siguientes: molibdato de potasio,

    borato de sodio, nitrato de cobalto, sulfato de cadmio, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfatode manganeso, cloruro frrico.

    Hacia el tercer da el medio se enturbia ligeramente y en la superfiie aparece un velo grisceo.Los das siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve

    parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del liquido. A su vez el liquido se enturbiacada vez ms y suelen aparecer burbujas en el fondo. La observacin microscpica del velo

    muestra clulas bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esfricos, mientras que el materialtomado del fondo permite ver bacilos esporulados Gram-positivo o variable.

    Medio paraAzotobacter: sacarosa 20 g, fosfato dipotsico 0,05 g, fosfato monopotsico 0,15g, cloruro de calcio 0,01 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, molibdato de sodio 0,002 g,cloruro frrico 0,01 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 2 mL, carbonato de calcio 1 g,agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 110C durante 20 minutos.

    Medio para Derxia:Reemplazar la sacarosa por almidn o glucosa y omitir el carbonato decalcio.

    Medio para Azospirillum: cido mlico 5 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesioheptahidrato 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro de calcio 0,02 g, molibdato de sodio 0,002 g,sulfato de manganeso 0,01 g, etiln -diamino-tetra-acetato frrico (al 1,64% p/v) 4 mL, azul de

    bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 3 mL, biotina 0,1 mg, agua 1 L, p H 6,8.Medio para Clostridium pasteurianum : glucosa 10 g, fosfato monopotsico 0,75 g, solucin

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 19

    salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Distribuir en tubos con campanita deDurham. Luego de sembrar cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina estril.

    DesnitrificacinEl medio de cultivo contiene: nitrato de potasio 2 g, carbonato de calcio 5 g, glucosa 10 g,

    solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Los tubos llevan dentro una

    campanita de vidrio y se esterilizan a 110C durante 20 minutos. Inocular unos grnulos desuelo sin agitar e incubar una semana a 25-27C.

    Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrgeno molecular u xido de nitrgenoquedarn retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formacin de nitritos se compruebaagregando 1 mL del reactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecer un color rosado si haynitritos.

    Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de lassoluciones siguientes:

    o Disolver 0,05 g de naftilamina en 100 mL de cido actico al 30% (v/v) en agua.o Disolver 0,32 g de cido sulfanilico en 100 mL de cido actico al 30% (v/v) en agua.

    NitrificacinEl medio de cultivo para formadores de nitritos contiene: sulfato de amonio 0,5 g, carbonato

    de calcio 1 g, solucin salina 50 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250

    mL de capacidad, a razn de 50 mL en cada uno.El medio para productores de nitratos contiene 1 g de nitrito de sodio en lugar del sulfato de

    amonio. Esterilizar a 110C durante 20 minutos.Sembrar unos grnulos de suelo en ambos matraces e incubar a 25-27C durante dos semanas.Formadores de nitritos. Volcar 5 mL del cultivo en un tubo de ensayo y agregar 1 mL del

    reactivo de Griess recien preparado. Aparecer un color rosado si se han formado nitritos poraccin microbiana.

    Formadores de nitratos.Transferir unos 5 mL del cultivo a un tubo de ensayo y agregar 1 mLdel reactivo de Griess. Si esta reaccin da negativa los microorganismos han oxidado los nitritos

    a nitratos. Colocar otros 5 mL de cultivo en un tubo, agregar unos 50 mg de urea y 10 gotas deacido sulfrico. Calentar para eliminar los nitritos. Luego aadir 1 mL de reactivo difenilaminapor las paredes del tubo. Si en la zona de contacto aparece un color azul hay nitratos formadospor accin microbiana.

    El reactivo difenilamina contiene: difenilamina 1 g, agua destilada 20 mL, cido sulfrico 100mL. Colocar en frasco obscuro.

    AmonificacinEl medio de cultivo contiene peptona 0,2 g, solucin salina 50 mL, solucin de

    oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos y se esteriliza a 110C durante 20

    minutos. Sembrar unos grnulos de suelo e incubar una semana a 25 -27C.Despus agregar 1 mL de reactivo de Nessler a cada tubo a ensayar. La aparicin de un color

    ladrillo indica la presencia de amoniaco.El reactivo de Nessler consta de dos soluciones que se mezclan en partes iguales en elmomento de usar.

    o Colocar en un mortero 5 g de ioduro mercrico y 3,65 g de ioduro de potasio, aadir unpoco de agua destilada y triturar hasta disolver. Completar a 100 mL con agua.

    o Disolver 15 g de hidroxido de potasio en lentejas en 100 mL de agua destilada.

    CelulolisisEl medio de cultivo contiene: nitrato de amonio 1 g, solucin salina 50 mL, solucin de

    oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza

    a 110C durante 20 minutos. Sembrar unas gotas de una suspensin de suelo, que haya sidoabonado con estircol, e incubar dos a tres semanas a 25-27C.

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice20

    Donde el papel sobresale del lquido se acumulan las bacterias celulolticas aerobias y suelencolorearlo. Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque de lasfibras bajo la lupa. Comprobar si se disgrega con facilidad al tocarla con el asa.

    Medio para clostridios : sulfato de amonio 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, fosfato dipotsico 0,7g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, cloruro de calcio 0,05 g, celulosa en polvo 3 g,carboximetilcelulosa 1 g, extracto de levadura 1 g, azul de metileno (0,005% p/v) 1 mL, agar 15g, agua 1 L, pH 7,0; esterilizar a 121C durante 15 minutos. Agregar 0,5 mL de clorhidrato decistena (al 1% p/v) a cada tubo con 10 mL de medio estril fundido, sembrar de inmediato conunas gotas de la suspensin de suelo y colocar en agua fra para una rpida gelificacin.

    AmilolisisEl medio de cultivo contiene: almidn soluble 2 g, nitrato de amonio 1 g, solucin salina 50

    mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agar 15 g, agua 1 L. Esterilizar a 110C durante 20

    minutos. Distribuir en cajas de Petri. Sembrar con unos grnulos de suelo e incubar a 25-27C.Cubrir la superficie con solucin acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La zona de

    hidrlisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre un fondo azul.

    Sulfato-reduccinEl medio de cultivo contiene: cloruro de amonio 1 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de

    magnesio heptahidrato 2 g, sulfato de sodio 0,5 g, cloruro de calcio 0,1 g, lactato de sodio (al

    60% p/v) 6 mL, extracto de levadura 1 g, tioglicolato de sodio 1 g, agua 1 L. Repartir en tuboscolocando 10 mL en cada uno. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Sembrar con unosgrnulos de suelo e introducir un clavo previamente pasado por la llama y enfriado. Cubrir conagar al 1,5% fundido o vaselina. Incubar dos o tres semanas a 25-27C. Ver si el clavo se haennegrecido por la formacin de sulfuro de hierro debido a los microorganismos.

    Sulfo-oxidacinEl medio de cultivo contiene: fosfato dipotsico 0,25 g, cloruro de magnesio 0,1 g, cloruro de

    sodio 0, 1 g, nitrato de amonio 2 g, carbonato de calcio 5 g, agua destilada 1 L. Repartir en tubos

    a razn de 5 mL en cada uno y esterilizar 20 minutos a 110C. Agregar a cada tubo 1 mL de unasolucin a 10% de monosulfuro de sodio y sembrar unos grnulos de suelo. Incubar a 25-27Cdurante dos a tres semanas.

    Volcar 2 mL del cultivo en otro tubo, acidificar con dos gotas de cido clorhdrico concentradoy aadir 5 gotas de solucin acuosa de cloruro de bario al 5%. p/v. La aparicin de una

    opalescencia indica que se han formado sulfatos por la actividad microbiana.

    Solubilizacin de fosfatosEl medio de cultivo contiene: extracto de levadura 2 g, glucosa 20 g, agar 15 g, agua 1 L,

    fosfato triclcico 2 g. Se esteriliza a 110C durante 20 minutos y se distribuye en caja de Petri.Sembrar unos grnulos e incubar a 25-27C.

    Observar la formacin de una zona transparente alrededor de las colonias.

    Bibliografao Fenchel T et al. Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral Cycling. Academic Press, San Diego,

    1998.

    o Alef K & Nannipieri P. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, London, 1995.o Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990.

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 21

    TRABAJO N 5. Inhibidores y desinfectantes

    Objetivo.Determinar la concentracin inhibitoria mnima y la concentracin letal mnima de

    productos comerciales usados en el campo.

    Introduccin

    Los agentes que producen efectos reversibles causan inhibicin sinaccin mortal inmediata. Los bacteriostticos actan sobre lasbacterias y los fungistticos sobre los hongos. Los compuestos deaccin irreversible causan la muerte rpida. Los bactericidas yfungicidas matan bacterias y hongos, respectivamente (figura 14).La diferencia es cuantitativa ms que cualitativa. La adicin de 0,3%de fenol impide el crecimiento de Escherichia coli, pero no mata lasclulas en varias horas mientras que 1% las elimina en minutos

    (figura 15).La palabra desinfeccin se emple para expresar la

    eliminacin de cualquier agente que pudiera causarinfeccin o enfermedad. Los desinfectantes son agentes de esterilizacin. Las

    clulas activas jvenes tienen una notable sensibilidad a estas substancias. Ladesinfeccin es ms rpida al aumentar la temperatura del sistema. El medio en

    que se encuentran los microrganismos puede alterar la eficacia de ladesinfeccin, por combinacin del material orgnico con el agente activo.Tambin el pH modifica los mecanismos de desinfeccin.

    Los endosporos bacterianos son ms difciles de destruir que las clulasvegetativas. Tambin presentan cierta resistencia los organismos encapsulados.Otro factor que posibilita la desinfeccin es un contacto eficaz. La humedad esesencial y los agentes tensoactivos mejoran dicho contacto.

    Las pruebas de la concentracin inhibitoria mnima (CIM) y la concentracin letal mnima(CLM) son tiles para comparar la eficacia de diversos productos qumicos contra un organismodeterminado, o la sensibilidad de diferentes organismos a un mismo producto.

    Los microorganismos comnmente usados son cepas de coleccin de Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, para establecer la accinfrente a organismos coliformes, seudomnadas, clostridios y otros aerobios, respectivamente.El tamao del inculo suele ser de 104 a 106/mL, segn el microorganismo y la substanciaestudiada.

    Procedimiento

    Concentracin inhibitoria mnima

    Preparar una solucin al 1/10 p/v v/v del compuesto en agua destilada estril. Si se trata deun curasemillas con un principio activo poco soluble, usar alcohol o acetona al 1/2 v/v en esta

    primera dilucin.Poner 1 mL de la solucin 1/10 en cada uno de los 9 tubos de ensayo estriles. Aadir al

    primer tubo 1 mL de agua destilada estril, al segundo 2 mL, al tercero 3 mL y assucesivamente hasta agregar al noveno 9 mL, obteniendo diluciones que van desde 1/20 a1/100.

    Transferir 1 mL de la dilucin original al 1/10, y 1 mL de cada una de las otras diluciones asendos tubos con 9 mL de caldo nutritivo (en el caso del desinfectante) o agua estril (en caso

    del curasemillas), comenzando por la ms diluida.. Las diluciones obtenidas van de 1/100 a1/1000.

    Figura 15

    Figura 14

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice22

    BacteriasAadir 0,1 a 0,2 mL de un cultivo de 24 hs en caldo, de Staphylococcus aureus o Escherichia coli, a

    un tubo con 9 mL de caldo nutritivo de tal manera que se obtenga un suspensin de turbiedad

    poco apreciable a simple vista. Luego transferir 0,2 mL de esta suspensin bacteriana a cada unode los tubos con diluciones de desinfectante en caldo. Incubar a 35C durante 48 hs.

    HongosAgregar agua estril (con 0,05% v/v de Tween 80) al tubo de cultivo de 5 das a 25C en medio

    de Czapek o Sabouraud, de Penicillium expansum, Aspergillus flavus o Cladosporiumcladosporioides , agitando para suspender los esporos. Aadir 0,5 a 1 mL de la suspensin de

    esporos a un matraz con 50 mL de agar de Sabouraud, fundido y enfriado a 45-50C. Mezclar yvolcar en cuatro cajas de Petri estriles.

    Una vez gelificado, se depositan discos de papel de filtro de 4 mm de dimetro previamentehumedecidos con las diluciones del producto, a razn de tres discos por placa. Se incuba a 25-28C durante 5 das.

    Concentracin letal mnimaPreparar, como se indic arriba, una serie de tubos con 10 mL de cada una de las dilucionesdel compuesto, que van desde 1/100 a 1/1000, utilizando agua estril en lugar de caldo.

    Adicionar a cada dilucin 0,2 mL de una suspensin bacteriana preparada como se describiarriba. Anotar la hora a la cual se agreg al primer tubo, y a intervalos de 2, 5, 10 y 15 minutoscargar un asa (con un dimetro interno de 4 mm) de cada dilucin y llevar a un tubo de caldonutritivo que contiene 0,1 % p/v de cido tiogliclico para neutralizar la accin deldesinfectante remanente. Incubar a 35C durante 48 hs.

    Bibliografao Collins CH, Lyne PM, Grange JM. Collins and Lynes Microbiological Methods. 7 ed. Butterworth Heinemann,

    Oxford, 1999o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 23

    TRABAJO N 6. Digestin anaerbica de residuos agrcolas

    Objetivo. Transformar los residuos agrcolas en biogas y un lodo til como fertilizante.

    Introduccin

    Se emplea estircol, paja y lodo procedente de otro digestor. El gas formado en la

    fermentacin metanica es una mezcla de metano y dixido de carbono. Las denominadasbacterias metnicas implicadas pertenecen a los gneros Methanococcus, Methanobacterium,

    Methanosarcina y otros. Dependiendo de la composicin del material de partida, se puedeproducir biogas con alrededor de 70%. de metano. Estas bacterias son anaerobias estrictas yreducen al dixido de carbono.

    Las bacterias metnicas se diferencian de las dems debido a su peculiar estructura de lapared y la membrana celular, y forman parte de las arqueobacterias junto a las termfilas y lashalfilas. Se encuentran en el rumen, los sedimentos de aguas estancadas y en los digestores de

    las depuradoras de aguas residuales.Las metanobacterias slo podrn desarrollarse cuando por accin de las bacterias facultativas

    se haya consumido todo el oxgeno, y las fermentadoras hayan producido suficiente dixido decarbono e hidrgeno a partir de almidn, celulosa o aminocidos.

    Las bacterias metnicas son sensibles al descenso del pH producido por los cidos orgnicosformados por los clostridios. Pero en un sistema en equilibrio consumen los cidos a medida

    que aparecen manteniendo un ambiente neutro.Las instalaciones pequeas de biogs permiten la obtencin de energa en zonas rurales.

    Procedimiento

    Equipo de digestin:1 fermentador, 2 mecanismo de agitacin con varilla, 3 material a fermentar, 4 baode agua, 5 acuario, 6 calentador conectado a una bomba de circulacin, 7 termmetro y termostato, 8depsito de gas (neumtico de bicicleta), 9 frasco lavador (indicador de gas y lavado de CO2), 10 frasco

    lavador abierto (para equilibrar la presin), 11 llave de triple va, 12 tubo de vidrio con virutas de hierro(arrestallamas), 13 mechero.

    Colocar en un frasco de 1 L, unos 200 g de estircol fresco de vaca, 25 g de paja cortada en

    trozos pequeos y agua hasta unos 5 cm de la boca. Poner un tapn atravesado por un agitadory un tubo para la salida de los gases.

    Instalar el fermentador en un bao de agua a 37C. Unir la salida a un frasco lavador y ste aotro frasco abierto para equilibrar la presin, y a una llave de triple via que est conectada al

    Fi ura 16

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    depsito de gas y al mechero. Entre el mechero y la llave de triple via se coloca un tubo devidrio lleno con virutas de hierro para evitar el retroceso de la llama. Controlar la hermeticidadde todos los cierres.

    Agitar diariamente la mezcla en descomposicin. Luego de uno o dos das vaciar la cmarapara eliminar la mezcla explosiva de biogs y aire. Dejar hasta que se llene nuevamente eldepsito y comprobar cmo arde el biogs a la salida del mechero. Controlar diariamente elnivel de agua del bao, la temperatura y la cantidad de gas.

    Bibliografao Madigan TM et al. Brock- Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998o Jagnow G, Dawid W. Biotecnologa. Acribia, Zaragoza, 1991

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    TRABAJO N 7. Morfologa microscpica de hongos

    Objetivo. Conocer las estructuras microscpicas de mohos, levaduras y setas.

    Introduccin

    Micelio es el cuerpo filamentoso de un hongo y un trozo del mismo se denomina hifa. Las

    hifas pueden presentar septos y entonces el micelio est tabicado. Si los tabiques estn ausenteses un micelio contnuo. Rizoides son las hifas de succin que penetran en el substrato.Apresorios son unas hifas achatadas de sostn que se adhieren al hospedador o substrato.

    Cuando el cuerpo del hongo es una sola clula se lo llama levadura. Los cortos filamentosformados por las clulas brotantes de la levadura se conocen como pseudomicelio.Plectnquima es un conjunto de hifas que se asemeja a un tejido. Esclerocio es un plectnquimageneralmente macroscpico que puede permanecer largo tiempo con vida latente.Clamidospora es una clula de resistencia, terminal o intehifal, con pared gruesa y substancias

    de reserva. Las esporas son los elementos de multiplicacin de los hongos. De acuerdo a suforma y origen reciben distinto nombre como se observa en la figura 17 .

    Anamorfo es el hongo con reproduccin asexuada o mitosprica. Los conidios son mitosporasque se hallan ssiles o sobre un

    conidiforo (simple o ramificado), odentro del plectnquima de un picnidio.

    Un esporangio contiene numerososmitosporas dentro de una membranaperidial simple.

    Teleomorfo es el hongo conreproduccin sexuada o meiosprica.Las ascosporas son meiosporas que seencuentran dentro de los ascos libres de

    las levaduras, o los ascos encerrados enel plectnquima de un ascoma o sobre elmismo. Las basidiosporas surgen de losesterigmas del basidio donde ocurri lameiosis. Los basidios generalmente seencuentran sobre laminillas, tubos oespinas del basidioma.

    Las figuras 17 y 18a muestran

    esquemas de diversas estructurasfngicas. Los conidiforos simples son cortos filamentos que generalmente nacen

    perpendiculares a la hifa y originan en su extremo el o los conidios. Los ramificados suelenterminar en ramas con forma de botelln (filides) de donde surgen los conidios. Algunas

    estructuras son tpicas de gneros comunes y llevan su nombre: cabeza aspergilar, penicilio.Tambin los conidiforos simples o ramificados suelen estar reunidos en: coremio (como un

    fsforo), esporodoquio (como una almohadilla), picnidio (dentro de un plectnquima con formade pera).

    Un esporangio contiene innumerables esporas, pero un esporangiolo slo contiene tres ocuatro y se encuentra en el pice de una rama lateral del esporangiforo. La columela es lapunta dilatada del esporangiforo y est dentro de la esfera del esporangio. En algunos casos,unas pocas esporas estn reunidas en merosporangios (bolsitas como dedos de guante) que seasientan sobre la columela.

    Los ascomas tienen distinta forma: cleistotecio (cerrado) que se rompe al madurar las esporas,peritecio (forma de pera) con abertura u ostolo por donde salen las esporas maduras, apotecio(forma de copa) con los ascos expuestos.

    Fi ura 17

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    Los basidiomas ms conocidosson: el champin con laminillasen la parte inferior del sombrero

    donde se originan las esporas, elboleto con poros en vez delaminillas, la bola de nieve que alromperse libera las esporas

    maduras (figura 18b). Hay otrasformas como el basidioma

    excntrico de los pleurotos, losestantes rgidos que crecen sobre

    troncos, las formas gelatinosas.

    Procedimiento

    Microcultivos

    Observar los microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocada una estructura prxima alcubreobjetos o adherida al mismo, pasar al objetivo 10x. Luego para ver detalles se puede pasaral objetivo seco de mayor aumento, si la distancia focal de la lente lo permite.

    PreparacionesHacer preparaciones en fresco colocando un trozo de micelio en una gota de lactofenol, o

    colorante de Guegun, y desagregar con ayuda de dos agujas, montadas en sendos mangos .Poner un cubreobjetos y observar al microscopio. Dibujar las estructuras vistas.

    El lactofenol contiene: cido lctico 100 mL, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 mL.

    Bibliografao Deacon JW . Introduccin a la Micologa Moderna. Limusa-Noriega, Mxico, 1993o Alexopoulos CJ. Introduccin a la Micologa. EUDEBA, Buenos Aires, 1966

    Figura 18a

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    TRABAJO N 8. Mohos toxignicos

    Objetivo. Reconocer los mohos comunes que deterioran los granos y forrajes almacenados pues

    suelen producir toxinas que afectan al hombre y los animales.

    Introduccin

    Los problemas causados por los hongos en alimentos y forrajes son numerosos. Los causadospor micotoxinas son, con frecuencia, costosos debido a que se descubren muy tarde paraprevenir las prdidas econmicas.

    Una herramienta importante en el control micolgico de cereales y especias, es el uso demtodos simples de identificacin especfica que se realiza en base al aspecto de las colonias y la

    micromorfologa en varios medios de cultivo a distintas condiciones de incubacin.

    Procedimiento

    Hacer repiques de un cultivo puro en tres puntos equidistantes de cada placa con los medios:agar malta, agar Czapeck, agar Czapeck glicerol, agar papa sacarosa, e incubar a 25C durante 7

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    dias. Adems repicar en estras sobre dos tubos de agar malta o Czapeck e incubar uno a 5C yel otro a 37C. El cultivo en agar papa sacarosa se incuba a la temperatura ambiente con luzsolar indirecta.

    La composicin de los medios de cultivo es la siguiente:Agar malta: extracto de malta 20 g, peptona 1 g, glucosa 20 g, agar 20 g, agua destilada 1 litro;

    esterilzar a 121C durante 15 minutos.

    Solucin concentrada de Czapeck: nitrato de sodio 30 g, cloruro de potasio 5 g, sulfato demagnesio 5 g, sulfato ferroso 0 , l g, agua destilada 100 mL; mantener a la temperatura ambiente.

    Agar Czapeck: fosfato dipotasico 1 g, solucin de Czapeck 10 mL, extracto de levadura 5 g,sacarosa 30 g, agar 15 g, agua destilada 1 litro; esterilizar a 121C durante 15 minutos.Agar Czapeck glicerol: disolver las sales y extracto, como el anterior, en una mezcla de 250

    mL de glicerol y 750 mL de agua destilada; esterilizar de igual manera.Agar papa sacarosa: hervir 200g de papa rallada en 1 L de agua, durante media hora, y

    completar el volumen a un litro, aadir 10 g de sacarosa y 15 g de agar, esterilizar a 110Cdurante 20 minutos.

    Observar y registrar el aspecto macromorfolgico de las colonias. Hacer preparaciones enfresco con lquido de Patterson o colorante de Guegun. Observar al microscopio y dibujar las

    estructuras. Si es necesario prolongar la incubacin.Consultar las claves de la bibliografa para identificar el gnero (si es posible la especie) y

    cules son las micotoxinas que producen.

    Bibliografao Pitt JI, Hocking AD. Fungi and food spoilage. Blackie A&P, London, 1997

    o Carrillo L. Los hongos de los Alimentos y Forrajes. 2002 http://www.unsa.edu.ar (materialbibliogrfico)

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    Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 29

    TRABAJO N 9. Micorrizas

    Objetivo. Observar los hongos asociados con plantas herbceas y rboles constituyendo las

    micorrizas. Preparar un inoculante para ectomicorrizas.

    Introduccin

    Las plantas parecen totalmente autnomas, pero la mayora estn asociadas con hongos, ensus races formando micorrizas o, endfitos dentro del tallo.

    EndomicorrizasCuando el hongo penetra en el interior de las clulas de la raz, formando minsculas

    arborescencia y vesculas, se las llama endomicorrizas vesculo - arbusculares. Los arbsculossuelen tener una vida efmera, de algunos das a pocas semanas, siendo luego digeridos por el

    hospedador. Los hongos de este tipo de micorrizas, generalmente presente en la vegetacinherbcea, pertenecen a la familia de la endogonceas.

    Hay otros tipos de endomicorrizas como las que forman ovillos intracelulares en las orqudeasCada una de las diferentes especies de orqudeas tiene una alta especificidad por un hongoparticular que generalmente es un zigomiceto. El grado de interdependencia es tal que en

    muchos casos ninguno de los asociados puede ser cultivado sin el otro, pues forman unaverdadera simbiosis.

    Las races se infectan con hongos de las micorrizas vesculo-arbusculares por las hifasdesarrolladas a partir de propgulos presentes en el suelo, los que pueden ser esporos oestructuras de resistencia presentes en las races muertas.

    EctomicorrizasEn ellas el hongo rodea la raz con un manto de filamentos y una red miceliar penetra entre las

    clulas radicales pero no dentro de ellas. Los hongos que forman ectomicorrizas en rboles sonmacrocrpicos y tpicamente basidiomicetos superiores, por ejemplo Amanita, Boletus, Pisolithus,

    Suillus. Ms raramente los ascomicetos forman micorrizas, por ejemplo Tuber. Es poca laespecificidad de estas asociaciones ya que varios rboles pueden formar micorrizas con un

    hongo dado y viceversa. Algunas especies de rboles, por ej. los eucaliptos, poseen a la vez ecto-y endo-micorrizas.

    InoculacinLa falta de micorrizacin acarrea problemas en el transplante de las plntulas de rboles y

    plantas ornamentales, excepto en los casos en que el suelo contenga especies fngicas. Parainocular con cultivos puros, el substrato (suelo, turba) debe ser previamente pasterizado con el

    fin de disminuir la poblacin fngica nativa competitiva.Los hongos son incorporados al substrato de siembra como trozos de races micorrizadas,

    pedazos de ascoma o basidioma, o micelio obtenido in vitro. El agregado de micelio ofrecemayores garantas en el caso de hongos que se desarrollan bien en cultivo axnico. El primerpaso de toda inoculacin consiste en la seleccin del hongo. Los siguientes obtener el cultivo y

    multiplicarlo para aadirlo al suelo donde se coloca la plntula crecida en condiciones aspticas.

    Procedimiento

    Observacin de micorrizasLavar la raz con agua corriente. Observar su aspecto y seleccionar un trozo. Cortar en

    porciones de un centmetro de largo y colocarlos en solucin de hidrxido de sodio o potasio al10% p/v. Calentar a 90C durante 30 minutos o ms si es necesario. Cuando el material es

    obscuro sumergirlo en agua oxigenada de 10 volmenes durante 15 minutos, sino omitir estepaso. Lavar 4 veces con agua corriente. Poner los trozos en solucin de cido clorhdrico 0,1 N

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    durante 10 minutos. Colorear con azul-lactofenol a 90C por 5 minutos. Pasar a lactofenol.Colocar un trozo de la raz tratada entre dos portaobjetos y aplastarla. Observar almicroscopio entre porta y cubreobjetos.

    El lactofenol contiene: cido lctico 100 ml, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 ml. Lasolucin colorante se prepara mezclando 5 mL de solucin acuosa de azul de algodn o azultripn o azul de metilo al 1% p/v, con 95 mL de lactofenol.

    Preparacin del inoculante para ectomicorrizasCortar el basidioma con un instrumento previamente mojado en alcohol y encendido. Con un

    gancho o pinza estril tomar porciones del interior del sombrero y depositarlas sobre lasuperficie de una placa de agar malta levadura. Incubar a 25-27C, dos o ms semanas en laobscuridad.

    El agar malta levadura contiene: extracto de malta 20 g, extracto de levadura 2 g, agar 20 g,agua 1 L. Se esteriliza a 121C durante 15 minutos.

    Repicar en 50 ml de medio lquido de Melin Norkrins modificado en un matraz de Erlenmeyerde 250 mL e incubar a 25-27C con una agitacin de 100 rpm y en la obscuridad, el tiempo

    requerido para un buen crecimiento.El medio lquido de Melin Norkins modificado contiene cloruro de calcio 0,05 g, cloruro desodio 0,025 g, fosfato monopotsico 0,5 g, fosfato diamnico 0,25 g, sulfato de magnesioheptahidrato 0,15 g, cloruro frrico (al 1% p/v) 1,2 mL, extracto de malta 1,5 g, sacarosa 10 g,agua 1 litro. Esterilizar a 110C durante 20 minutos.

    Homogeinizar el cultivo, mezclar con suelo pasterizado previamente con vapor de agua a60C. Llenar unas macetas pequeas y colocar los plantines. Llevarlos al invernculo.

    Bibliografao Deacon JW Introduccin a la Micologa Moderna. Limusa-Noriega, Mxico, 1993o Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990

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    TRABAJO N 10. Microorganismos del agua

    Objetivo.Conocer la probable contaminacin del agua con patgenos, a travs de la bsqueda de

    microorganismos indicadores y otros.

    Introduccin

    El agua es un sistema ecolgico en equilibrio que constituye la base de todas las comunidadesvivas. Como es indispensable se procura aumentar sus recursos, especialmente almacenndola,y mejorar su calidad mediante purificacin. El anlisis biolgico del agua para determinar lacalidad sanitaria utiliza mtodos que indican el grado de contaminacin con excrementos. Seemplean tcnicas para la deteccin y recuento de organismos indicadores, porque

    principalmente interesa conocer el peligro potencial de la transmisin de patgenos a travs delagua, antes que la bsqueda de stos.

    ColiformesLos coliformes son bacterias de origen entrico que son capaces de fermentar la lactosa con

    produccin de gas. Los gneros de enterobacterias incluidos en el grupo de los coliformes aefectos de anlisis de aguas son Citrobacter, Enterobacter, Escherichiay Klebsiella . Este grupo es elprincipal indicador de la conveniencia del agua para uso domstico, industrial u otro.

    La prueba de fermentacin en una serie de tubos (caldo bilis lactosa verde brillante, caldoMcConkey, etc.) con determinacin del nmero ms probable (NMP) fue la primera usada,luego se incorpor la tcnica de filtracin por membrana que, con algunas limitaciones, escomparable a la anterior, y finalmente se introdujo el substrato cromognico ONPG (o-

    nitrofenil--D- galactopiransido) al medio liquido para NMP. Comnmente para determinarel NMP se realiza una prueba presuntiva basada en la fermentacin de la lactosa conproduccin de gas que queda atrapado en la campanita. La ausencia de gas se interpreta comoausencia de coliformes, pero su presencia es una posibilidad de presuncin pero no deseguridad puesto que algunas bacterias lcticas suelen producir gas. El medio de cultivo liquidolleva un indicador de pH para facilitar la lectura y sales biliares para inhibir el desarrollo de lasbacterias no entricas. Los coliformes presentes en el intestino y las heces de animales de sangrecaliente, incluido el hombre, son capaces de producir gas al f ermentar lactosa a 44,5C.

    Ms especifica es la bsqueda de Escherichia coli por cultivo sobre placas de medios quepermiten la deteccin en 7 horas (m-7hFC) o en 2448 horas (EMB, Endo y otros), o bien un

    medio liquido con el substrato fluorognico MUG (4-metilumberiferil--D-glucurnido)especifico para bacterias con la enzima -glucuronidasa (24 hs a 44,5C). En los casos que serequiere confirmar la presencia de E. coli se emplean las pruebas de: fermentacin de lactosa,sorbitol y celobiosa, hidrlisis de ONPG, produccin de indol, viraje del rojo de metilo,produccin de acetona, uso del citrato, motilidad, descarboxilacin de lisina y ornitina, oxidasay formacin de pigmento amarillo; las que permiten clasificar las especies de enterobacterias

    presentes en aguas.El significado de estos anlisis se basa en que la falta de coliformes implica una ausencia de

    contaminacin fecal prxima o remota,mientras que su presencia no certifica una contaminacinde aguas con materias fecales. En cambio, la presencia de Escherichia coli demuestra unacontaminacin fecal reciente.

    EnterococosConstituyen un grupo de estreptococos fecales que incluye S. faecalis, S. faecium , S.gallinarumy

    S. avium. Se diferencian de los otros estreptococos por su capacidad para crecer en presencia de6,5% cloruro de sodio, a pH 9,6, entre 10 y 45C. Son bacterias esfricas, gram positivas,

    fisiolgicamente relacionadas con las bacterias lcticas que dan negativa la prueba de catalasa.Como tienen requerimientos nutricionales ms complejos que otras bacterias difcilmente se

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    multiplican en el agua aunque resisten mejor la cloracin que Escherichia coli.Los enterococos tambin son indicadores fecales, y para su anlisis se emplean pruebas de

    cultivo en una serie de tubos de medio selectivo (caldo glucosa azida) para determinar el NMP

    y la filtracin por membrana (agar mE, etc), siendo confirmado por repiques en agar bilisesculina u otro medio especial, adems de la prueba de catalasa y la coloracin de Gram.

    Los enterococos son indicadores que permiten determinar el grado de la contaminacin fecal.Una relacin entre el nmero de coliformes fecales al nmero de enterococos, mayor que cuatro

    indica contaminacin fecal humana, mientras que si es menor que uno sugiere otra fuente.

    ClostridiosClostridium perfringens tiene el mismo significado que los enterococos y una supervivencia

    mucho mayor que cualquier otro indicador bacteriano de polucin fecal, debido a su capacidadformadora de endosporos. En aguas naturales superficiales, no contaminadas, no se sueledetectar la presencia de estos microorganismos ni en grandes volmenes de muestra, aunque selo pueda observar en agua profundas.

    La proporcin de clostridios frente a otros indicadores fecales es muy reducida. La deteccin

    simultnea de Cl. perfringens y coliformes o E. coli constituye una clara evidencia del origenfecal de la contaminacin. En cambio la presencia exclusiva de los clostridios debe interpretarsecomo un indicio de contaminacin fecal remota. La existencia de endosporos de clostridios enaguas tratadas carece de significado.

    El ensayo se funda en el sistema enzimtico de la sulfito-reductasa que en el caso de Cl.

    perfringens es estrictamente endocelular, y la reduccin de sulfito a cido sulfhdrico solo tienelugar en contacto con la colonia y el ennegrecimiento en una zona muy prxima ella, si en el

    medio existen sales solubles de hierro. Otros esporulados tambin suelen reducir el sulfito.

    Pseudomonasspp.En las aguas se suele buscar Pseudomonas aeruginosa , un organismo asociado al tracto

    respiratorio superior o la piel, que se comporta como patgeno oportunista. Su presencia espoco favorable para la calidad del agua.. Es un indicador primario de la eficiencia de la

    desinfeccin, mientras que los coliformes son indicadores de la contaminacin de lassuperficies.

    Se emplea tanto el mtodo de siembra en una serie de tubos de medio lquido (caldoasparagina u otro) para determinar el NMP, como la tcnica de filtracin por membrana (agarM-PA). Para la confirmacin se suele usar caldo acetamida, agar leche, agar King A y B, agarKing A- cetrimida. El bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (Cetrimide) es un agente

    antibacteriano de amplio espectro que no afecta a la especie citada por lo que se adiciona encantidades de 0,1 - 0,3 g/L de medio King A para el aislamiento.

    Las colonias tpicas de estos bacilos Gram negativos son de bordes generalmente irregularesque tiene tendencia a difundirse, las cepas no pigmentadas dan colonias translcidas, las otras

    pueden estar teidas de verde o parduzco. El pigmento colorea a la porcin del medio querodea a la colonia.

    Pseudomonas aeruginosa forma piocianina que tiene un color azul-verdoso y difunde en elmedio cuya produccin se ve favorecida en un medio (King A) que contiene sulfato de potasio,cloruro de magnesio y glicerol y no incluye nitratos ni sales de sodio pues actan comoinhibidores. Este pigmento es soluble en agua y cloroformo. La solucin azulada se colorea derojo por el agregado de cidos.

    La produccin de un compuesto fluorescente por especies de Pseudomonas se favorece en unmedio que contiene fosfatos y sulfatos (King B). Es soluble en agua y cido actico e insoluble encloroformo. La solucin acida es incolora y no fluorescente; la neutra alcalina es amarillenta a

    parda y fluorescente.

    Otros microorganismosEn las aguas industriales suele ser conveniente conoer la incidencia de bacterias del azufre y el

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    hierro, debido a que intervienen en los procesos de corrosin.Los olores desagradables, como a moho, que ocasionalmente suelen presentarse en aguas

    potabilizadas pueden deberse a la presencia de geosmina y 2-metilisoborneol producidos por

    actinomicetos en aguas su