Practicas de Microbiologia Genera1

M.ª LUISA MALIAÑO TOCA PROFESORA TECNICA DE FP I ES CANTABRIA GRADO DE LICENCIADA EN MEDICINA DIPLOMADA EN SANIDAD TSS

Manual de prácticas

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LA SECCIÓN DE

MICROBIOLOGÍA

Ciclo de Técnico Superior de Diagnostico

Clínico (TSS)

En Google: -“Microbiología para Técnicos”-

http://sites.google.com/site/microbiologiaparatss/

http://sites.google.com/site/microbiologiaparatss/

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MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Previo:- Diseño y Seguridad en el Laboratorio de Microbiología (http://www.elsevier.es/sites/default/files/elsevier/eop/S0213-005X(09)00408-X.pdf) y

Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo

-Responsabilidad del TSS en el laboratorio

Temas:

1. ESTERILIZACIÓN, DESINFECCIÓN Y CONSERVACIÓN

2. EL MICROSCOPIO

3. OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS 4. TÉCNICAS DE TINCIÓN 5. TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS

6. MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

7. MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE SIEMBRA

8. DESCRIPCIÓN DE LAS PRINCIPALES PRUEBAS BIOQUÍMICAS UTILIZADAS EN LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS 9. ANTIBIOGRAMA

10. TÉCNICAS EN MICOLOGIA

11. TÉCNICAS EN PARASICOLOGÍA

12. INFECCIONES POR APARATOS Y SISTEMAS

http://www.elsevier.es/sites/default/files/elsevier/eop/S0213-005X(09)00408-X.pdf)

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Normas de laboratorio 1. Es obligatorio el uso de bata larga de algodón con puños, destinada exclusivamente para el

Laboratorio de Microbiología. (Solo podrá retirarse para su aseo protegiéndola en una bolsa de

plástico. Se recomienda lavar individualmente con jabón).

NO PODRÁ USARSE EN OTRAS ÁREAS DEL CENTRO

2.-Cuando la profesora lo indique, se deberá usar guantes y/o mascarilla y al iniciar y finalizar la

práctica el alumnado lavara sus manos escrupulosamente con agua y jabón.

3.-El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Al inicio y al finalizar cada práctica es

conveniente desinfectar la superficie de trabajo con lejía al 10 %, alcohol de 70, solución de fenol...

4.-Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el Laboratorio.

5.-Los microorganismos deben manejarse cerca de la flama del mechero y con el pelo recogido.

6.-Está prohibido comer, beber, fumar y maquillarse. Cuando se manipulen microorganismos evita

hablar sin necesidad o llevarte las manos a la nariz, boca, ojos etc.

7.-Utilice los recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos biológicos infecciosos que

se generen en la realización de la práctica. No tirar nada en los lavabos. El material de desecho no

contaminado como papeles de envoltura depositarlos en los recipientes de basura común.

8.-Cuando se utilice luz ultravioleta debe tenerse en cuenta que la exposición a esta radiación es

peligrosa.

9.-En caso de contaminación bacteriología o accidentes en el Laboratorio notificar inmediatamente a

la profesora o al personal técnico para tomar las medidas higiénicas y de seguridad apropiadas, así

como su registro en la hoja de incidencias.

10.- No almacenar material en el refrigerador. Esta estrictamente prohibido retirar del Laboratorio

cultivos o cepas a menos que así lo indique la profesora. Al finalizar la práctica entregar el material

empleado debidamente separado.

11.- Si se sale del laboratorio se hará notificándoselo a la coordinadora/or de mesa y siempre sin

bata y previo lavado de manos.

Recuerda: dispones del manual de seguridad que se te entrega y debes

firmar, asumir y cumplir

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MATERIAL GENERAL DE LA SECCIÓN DE MICROBIOLOGIA. RECONOCE:

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO.

1. Compruebe que los lentes OCULARES Y OBJETIVOS estén limpios, de no ser así límpielos cuidadosamente con papel especial para lentes. NO toque los lentes con los dedos.

2 Coloque la preparación que se le proporcione sobre la PLATINA, sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe previamente que el objetivo de menor aumento este en posición de empleo.

3. Para Bacteriología ilumine la preparación bajando casi totalmente el Condensador, con el DIAFRAGMA abierto totalmente. 4 Coloque el OBJETIVO 10 X y enfoque, acercando al máximo la lente a la preparación, empleando el tornillo MACROMÉTRICO (NO haga esta operación mirando por el ocular, correría el riesgo de destruir la preparación). Suba el tubo lentamente observando por el ocular hasta que obtenga un enfoque nítido.

4. Pase al OBJETIVO 40x. Suba ligeramente el CONDENSADOR, la imagen debe estar casi enfocada,

afine el foco con el tornillo MICROMÉTRICO.

Bacteriología:

Empleo del OBJETIVO DE INMERSIÓN. a) Gire el revolver hacia el OBJETIVO DE INMERSIÓN dejándolo a medio camino entre este

y el objetivo 40X. b) Coloque una gota mínima de ACEITE DE INMERSIÓN sobre el punto de luz. b) Termine de girar suavemente el REVOLVER hasta la posición del objeto de inmersión,

asegurándose que este no toca la preparación pero sí la gota de aceite.

c) Enfoque cuidadosamente con el MICROMÉTRICO. La preparación debería estar prácticamente enfocada si se ha realizado un enfoque cuidadoso con el OBJETIVO 40x. (De no ser así es preferible volver a enfocar de nuevo un campo distinto partiendo del objetivo 10 X, OJO: quitar el aceite de inmersión).La distancia de trabajo desde el lente

1.-Placas Petri con medio

de cultivo sólido. 2.- Tubos

de ensayo con medio de

cultivo líquido. 3.- Tubos de

ensayo con medio de cultivo

sólido inclinado. 4.-Matraz

para turbidimetria. 5.-

Mechero Bunsen. 6.-

Pipetas. 7.-Microplacas. 8.-

Asas de siembra. 9.- Asa de

Digralsky. 10.- Micropipeta

automática. 11.- Pipeteador

manual. 12.- Puntas de

pipeta automática. 13.-

Placas Petri. 14.- Jarra de

anaerobios. 15.- Placas de

contacto Rodac. 16.-

Lámina para análisis de

superficies.

Material general en el Laboratorio de Microbiología.

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes

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frontal del OBJETIVO DE INMERSIÓN a la preparación es mínima por lo que el riesgo de accidente es ahora máximo.

d) Una vez que haya colocado aceite de inmersión sobre la preparación, ya no puede

volver a colocar el OBJETIVO 40X sobre este campo, correría el riesgo de mancharlo de aceite. Por tanto si desea enfocar otro campo, debe retirar el OBJETIVO DE INMERSIÓN girando el revolver hacia el OBJETIVO 10 X.

e) Finalizada la observación de una preparación, BAJAR LA PLATINA , retirar la preparación de la PLATINA y coloca el objetivo de menor aumento. NUNCA RETIRE LA PREPARACIÓN CON EL OBJETIVO DE INMERSIÓN EN POSICIÓN DE OBSERVACIÓN.

f) Retire la preparación y limpie el OBJETIVO DE INMERSIÓN cuidadosamente empleando un papel especial para óptica Compruebe también que el OBJETIVO 40X esta perfectamente limpio. Evite el alcohol acetona

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Si no esta utilizando el MICROSCOPIO este debe estar guardado y cubierto con una funda. Evite que se genere humedad si es de plástico

2. NO se deben tocar nunca los lentes con las manos. Cuando se necesite use papel especial para óptica para su limpieza. 3. Nunca deje una preparación sobre la platina cuando no esta utilizando el microscopio.

4. Después de utilizar el objetivo de inmersión, limpie el aceite que queda en el objetivo con papel especial. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo se debe limpiar cuidadosamente con una mezcla de alcohol/H2O2 (1:3) (los disolventes pueden dañar las lentes). 5. NO fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio. (REVOLVER, CONDENSADOR,

MACROMETRICO, MICROMÉTRICO). 6. NO cambie nunca de objetivo mientras está observando a través del ocular. Dirija su mirada a la preparación y evite el rozamiento del lente con la muestra. 7. Cuando finalice el trabajo ponga el Objetivo de menor aumento en posición de observación. 8. Es conveniente limpiar, revisar y cubrir los microscopios al finalizar la sesión práctica.

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Tema 2

OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS -Para poder observar los microorganismos al microscopio hay que utilizar una serie de técnicas adecuadas a cada tipo de microscopía, teniendo en cuenta qué es lo que deseamos observar.

-Estas técnicas son muy distintas dependiendo de que se trate de microscopía óptica o electrónica, siendo mucho más complejas las utilizadas en el segundo caso. -Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios ópticos, por lo que sólo describiremos las técnicas más comúnmente usadas para realizar preparaciones para este tipo de microscopios.

Preparación en fresco

-Para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado; suspendiéndolo en una gota de agua colocada en un portaobjetos, tomado directamente de la muestra o medio de cultivo, y cubriéndolo, sin formar burbujas de aire, con un cubreobjetos. Se observa preferentemente al microscopio de

contraste de fases.

Tinción vital

-Es una preparación en fresco en la que, en lugar de agua, se utiliza una solución de colorante diluida que, sin matar al microorganismo, hace que aumente el contraste. -Con este tipo de preparaciones sólo se puede observar la movilidad y la forma. Se han utilizado para observar protozoos móviles como el patógeno Trichomonas vaginalis. Para poder poner de manifiesto otras características celulares, es necesario el uso de tinciones que precisan una fijación previa del microorganismo.

-En general, el proceso seguido en todas las tinciones, conlleva las siguientes etapas: extensión,

desecación, fijación, tratamiento con colorantes, desecación y observación.

-La extensión se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio y desengrasado –El ac.

Acético, va muy bien como desengrasante- (si es de un producto biológico se denomina frotis), si la muestra es líquida se hace directamente y si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de agua o SSF

-La desecación, que tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos, se realiza a temperatura ambiente o

pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama de un mechero.

-La fijación: desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante, se puede llevar a cabo con

distintos agentes: calor, compuestos inorgánicos (tetróxido de osmio), compuestos orgánicos (formol, alcohol metílico, etc.) o sales metálicas.

-El tratamiento con colorantes, o tinción propiamente dicha, se realiza sobre microorganismos sometidos a los

procesos anteriores, y puede ser de distintos tipos: Simple, compuesta, diferencial, estructural, contraste (“negativa”)…

-Los colorantes son sustancias orgánicas capaces de teñir estructuras, generalmente orgánicas, cuando se ponen en contacto con ellas. Constan de un grupo cromóforo, que porta el color pero no tiñe, y otro auxocromo, que comunica color.

-NATURALEZA DE LOS COLORANTES -Los colorantes están compuestos generalmente por uno o más anillos bencénicos conectados por uniones

químicas bien definidas (cromóforos) que están asociadas con la producción del color.

-Se teoriza que ciertos radicales químicos poseen la propiedad de absorber luz de diferentes longitudes de onda. -Algunos de los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O y NO2. -La intensidad de coloración de un colorante es proporcional al número de radicales cromòforos del compuesto. -La mayor parte de los colorantes empleados en microbiología pueden considerarse como sales de dos clases:

1. ÁCIDOS: Aquellos en los cuales el ión portados del color (cromóforo) es el anión; por ej.: sodio + eosinato (el colorante eosina); 2. BÁSICOS: Aquellos cuyo cromóforo es el catión, por ej.: cloruro de azul de metileno (el colorante azul de metileno). El primer tipo de colorantes es ácido en el sentido de que el cromóforo,

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con un ácido, se combina con una base para formar la sal colorante; el segundo es básico, porque el cromóforo actúa como una base, combinándose con un ácido para formar una sal colorante .

-En general los colorantes ácidos se combinan mas fuertemente con los elementos citoplàsmicos (básicos) de

las células, los colorantes básicos se combinan mejor con los elementos nucleares (ácidos) de las células. -Algunos colorantes no dependen de la formación de sales o de las combinaciones químicas con el material teñido, simplemente recubren la superficie por un proceso de adsorción o se limitan a disolverse o precipitarse en el material circundante.

-Los colorantes más utilizados en microbiología son colorantes básicos, la parte que proporciona el color está

cargada positivamente. Se utilizan estos colorantes porque las células bacterianas contienen ADN (un cromosoma) en el citosol y están débilmente cargadas en su superficie con cargas negativas. Los más utilizados son el Cristal Violeta, el Azul de Metileno y la Safranina.

-En ocasiones, los colorantes necesitan el concurso de mordientes, que son sustancias no colorantes que refuerzan la acción de un colorante mediante el ataque a componentes celulares que facilitan la acción de éste

(lugol, fenol, etc.). Los mordientes pueden ir incorporados, o no, a la solución del colorante .Se preparan en solución hidroalcohólica.

-La observación al microscopio se realiza con objetivo de inmersión, con el fin de aumentar el poder de resolución y obtener una imagen correcta.

Anexo-curiosidad -La industria química BASF, que en 1878 se encontraba en pleno auge de patentes de nuevos

colorantes, suministro al laboratorio de Koch una serie de derivados de anilina que teñían las bacterias permitiendo su fácil visualización al microscopio en frotis de tejidos infectados. -En 1875 Carl Weigert tiñó bacterias con pirocarmín, un colorante que ya venía siendo usado desde hacía unos años en estudios zoológicos. En años sucesivos se fueron introduciendo el azul de metileno (Koch, 1877), la fuchsina, y el violeta cristal. En 1882-1883 Ziehl y Neelsen desarrollan su método de ácido-alcohol resistencia para teñir Mycobacterium tuberculosis.

-En 1884 el patólogo danés Christian Gram establece una tinción de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en función de sus reacción diferencial de tinción y que, como se vería mucho más tarde, reflejaba la existencia de dos grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos.

-En 1890 Loeffler logra visualizar flagelos bacterianos por medio de su técnica de impregnación argéntica. La misma industria de colorantes alemana que previa a la primera guerra mundial fue decisiva también para los comienzos de la quimioterapia.

TÉCNICAS DE TINCIÓN

1. Tinción negativa

-Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. Puede haber alguna diferencia en los pasos explicados con anterioridad. (nigrosina, tinta china…)

-Reactivo: nigrosina, tinta china, etc.

-Método: Poner una gota del colorante en el portaobjetos - Extensión del microorganismo sobre la gota del colorante, que debe formar al final una capa fina, pero no transparente - Desecación al aire, sin pasar por la llama del mechero – ( Se “cuartea”).

-Observación con objetivo de inmersión.

-Observar el espacio “claro” alrededor del germen:

cápsulas

-Observar la morfología del germen

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2. Tinción simple: -En las tinciones simples se usa un único colorante de carácter básico. Todas las células de la preparación quedan teñidas y se observan del mismo color. Se realiza la fijación, por calor, de la muestra al portaobjetos. Se añade el colorante y se deja actuar el tiempo necesario para que se absorba. Posteriormente se retira el exceso de colorante y la preparación está lista para ser observada.

-Reactivo: azul de metileno, safranina, etc.

-Método: Extensión - Desecación - Fijación con calor y enfriar - Cubrir con azul de metileno durante 1 ó 2 min - Lavar con agua destilada - Secar - Observación con objetivo de inmersión. Tiempos estándar:

Observar morfología y agrupación

Cocos levaduras

3. TINCIONES DIFERENCIALES:

-Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose colorante de contraste. 3.1. Tinción de Gram -Reactivos: cristal violeta o violeta de genciana fenicados - lugol - alcohol de 96° - safranina o fucsina

diluídas -Método: Extensión - Desecación - Fijación al calor y enfriar - Cristal violeta durante 2 min - Retirar el cristal violeta (no lavar) - Añadir inmediatamente lugol durante 1 min - Lavar hasta decoloración con alcohol y luego con agua - Teñir con safranina durante 30 s a 1 min -Lavar con agua.- Secar –

-Observación con objetivo de inmersión.

Esta tinción distingue entre dos amplios grupos de bacterias, según la composición de la pared celular, las Gram (-), que no retienen el complejo cristal violeta-iodo después de la decoloración con alcohol, y aparecen teñidas de rojo, y las Gram (+), que sí lo retienen, y aparecen teñidas de azul oscuro o

morado.

- Existen bacterias que, en determinadas fases del crecimiento, son Gram variables y aparecen en la misma preparación unas células teñidas de azul y otras de rojo; esto ocurre en algunas especies del

Género Bacillus…

Violeta de Genciana 1 minuto Violeta

Fuchsina básica

diluida

3 minutos Rojo-rosado

Azul de Metileno 5 minutos Azul

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3.2. Tinción de esporas Material

Cultivos de Bacillus Portaobjetos Asa de platino Cristalizador Pinzas portaobjetos Algodón Varilla de vidrio

Mechero Microscopio Aceite de inmersión

Reactivos

Verde de Malaquita Fucsina básica

Objetivo -Técnica de tinción diferencial que permite distinguir las formas vegetativas de las esporas por su diferente coloración

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Técnica

1 Extensión. 2 Desecación.

3 Fijación (8-10 cortes a la llama del mechero). 4 Teñir con Verde de Malaquita en emisión de vapores durante 8-10 minutos. 5 Lavar con agua destilada. 6 Teñir con Fuchsina básica diluida durante 3 minutos. 7 Lavar, secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

Resultados

-Las esporas aparecen teñidas de color verde mientras que las formas vegetativas lo hacen en color rojo.

3.3. Tinción de ácido-alcohol resistencia de Ziehl-Neelsen -Esta tinción permite diferenciar micobacterias, bacterias con ácidos micólicos en su pared celular

pertenecientes a los géneros Mycobacterium y Nocardia. Los ácidos micólicos hacen que las microbacterias resistan, no sólo la decoloración con alcohol como las Gram positivas sino la decoloración con una mezcla de ácido y alcohol capaz e decolorar al resto de las Gram positivas.

-Reactivos: fucsina básica fenicada - solución de ácido-alcohol (3% de HCl en etanol de 95°) - azul de metileno -Método: Extensión - Desecación - Fijación con alcohol metílico y enfriar .

-Fucsina durante 5 min en caliente (hasta la emisión de vapores y sin que se deseque. No hervir) .Lavar.

-Decolorar hasta desaparición del color con ácido-alcohol - Lavar con agua – -Azul de metileno durante 1 min - Lavar con agua - Secar - Observación con objetivo de inmersión -BAAR: rojo. Otros: azul -La observación debe establecer en primer término si se encuentran BAAR en el extendido y si los hay, el número de ellos por campo microscópico.

-Cada campo microscópico debe observarse en superficie y profundidad, para esto se utilizó constantemente

el tornillo micrométrico. Los bacilos aparecen como bastoncillos delgados de color rojo y con gránulos en su interior, aislados, en pares o agrupados sobre un fondo azul claro de la tinción de contraste. La contabilidad debe seguir una pauta uniforme de observación leyendo de izquierda a derecha del extendido un mínimo de 100 campos útiles distribuidos en el total del extendido.

-El criterio a seguir en la baciloscopia es: el número de campos varía según la cantidad de bacilos encontrados: 1. Si no se encuentran bacilos debe examinarse por lo menos 100 campos útiles.

2. Si se encuentran de 1 a 10 bacilos por campo es suficiente observar 50 campos. 3. Si se encuentran más de 10 bacilos por campo es suficiente observar 20 campos.

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-Terminada la observación de la baciloscopia es requisito que se limpie con algodón el objetivo de inmersión para evitar que se transporten fragmentos de una baciloscopia a otra y dar falsos positivos.

INFORME DE RESULTADOS. Negativo: no se observan BAAR en 100 campos observados. Positivo +: se observan menos de un bacilo por campo en promedio en 100 campos observados.

Positivo ++: se observan de 1 a 10 bacilos por campo en promedio en 50 campos observados. Positivo +++: Se observan más de 10 bacilos por campo en promedio en 20 campos observados

3.4. COLORACIÓN ÁCIDO RESISTENTE DE KINYOUN (modificada)-variante para BAAR-

-CarboFucsina de Kinyoun:- 4 gr. carboFucsina básica en Alcohol etílico al 95% 20 ml -Dejar en reposo durante 24 hs. -Agregar: Fenol 8 ml. -Agua destilada. 100 ml -Agregar para teñir SO4H2 acuoso al 0,5%, en 100 ml. (se usa ácido sulfúrico 0,5 ml. en 99,5 ml de agua destilada.)

Solución Azul de metileno

Azul de metileno 0,3 gr. Alcohol etílico 30.0 ml Diluir hasta 100 ml. con agua destilada. PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN

1. Carbol fucsia de kinyoun. 2. Inundar el portaobjeto con el colorante durante 5 minutos a temperatura ambiente. No calor.

3. Enjuagar con agua. 4. Enjuagar con alcohol etílico al 50%, inundar y verter hasta quitar el exceso de tintura roja. 5. Enjuagar con agua. 6. Enjuagar con ácido sulfúrico acuoso al 0,5% durante 3 minutos aprox.

7. Contrateñir con azul de metileno durante un minuto. 8. Enjuagar con agua. Secar con papel secante y examinar con inmersión en aceite. Interpretación: los microorganismos positivos se colorean de rojo, los microorganismos de fondo y otros de azul.

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4. Tinciones Estructurales -Tinciones específicas revelan estructuras celulares. Se pueden teñir selectivamente las esporas, los flagelos o las cápsulas. 4.1 Tinción de Flagelos

-La tinción de flagelos de Leifson es una tinción simple que usa un colorante, la rosanilina y ácido tánico que engrosa los flagelos para que puedan verse.

1.Se fija químicamente la suspensión bacteriana, mediante formol, y se hace la extensión en un portaobjetos. 2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.(¡SE “ROMPEN” LOS FLAGELOS!)

3.Se cubre la preparación con una mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina, de preparación extemporánea. 4.Se retira el exceso de colorante con agua.

5. Por último, se deja secar al aire, antes de su

observación al microscopio.

4.2. Tinción de corpúsculos metacromáticos: -El género Lactobacillus, forma gránulos con características tintoriales diferentes a las del resto del citoplasma que se denominan corpúsculos metacromáticos.

1.-hacer un frotis con sobrenadante de yogurt 2.- Cubrir la preparación con Azul de Metileno 5’ 3.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

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Anexo a tinciones -Útil en Parasitologia: larvas, plasmodium, tripanosomas…

Preparación de colorantes

-AZUL DE METILENO ACUOSO Se prepara con: Azul de metileno 1 gr.

Agua destilada 100 ml Filtrar con papel y envasar en frascos gotero color caramelo. Como esta solución se comporta de manera irregular, se han creados soluciones que llevan sustancias que actúan como mordientes,como las siguientes.

-AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFFLER Azul de metileno 0,3 gr.

Alcohol etílico 30 ml Agua destilada 100 ml. -COLORACIÓN POR VIOLETA DE GENCIANA (solución de Nicolle) Violeta de genciana 1 gr. Alcohol 10 ml Fenol 2 gr.

Agua destilada 100 ml -COLORANTES PARA GRAM Cristal Violeta Violeta Cristal 2 gr. Alcohol metílico 100 ml Solución de Lugol

Cristal de yodo 1 gr.

Yoduro de potasio 2 gr. Agua destilada c.s.p. 300 ml Solución decolorante Acetona 40 ml Alcohol etílico 120 ml

Solución de contraste Safranina. 1 gr. Agua destilada 100 ml

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-COLORACIÓN ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE DE ZIEHL-NEELSEN: Colorante de carbolfucsina Fucsina básica 0,3 gr.

Alcohol etílico 95%. 10 ml

Cristal de fenol derretido 5 ml Agua destilada 95 ml. Disolver Solución de ácido-alcohol Alcohol etílico 95% 97 ml

Ácido clorhídrico concentrado 3 ml Contracolor azul de metileno Azul de metileno. 0,3 gr. en Agua destilada 100 ml

TINCION PARA FLAGELOS. (Método de Leifson) Colorante de Leifson*. Disolución acuosa saturada de AlK (SO4)2· 12H20 ó

AlNH4 (SO4)2· 12H2O.................................................. 20 mL Disolución acuosa al 20% de Acido tánico................. 10 mL

Agua destilada........................................................... 40 mL Alcohol etílico al 95%................................................. 15 mL Disolución saturada en alcohol etílico al 95% de fucsina básica....................................................... 3 mL Preparación:

- Mezclar los ingredientes en el orden citado. - Guardar en un frasco bien tapado. * Se encuentra en el comercio en forma de polvo. TINCION DE FLAGELOS. (Alternativa) Solución A:

Fucsina básica............................ 1.2 g Etanol (95%)............................... 100 mL - Disolver el colorante. - Filtrar y tapar perfectamente para evitar la evaporación. Solución B: Acido tánico......................................... 3 g

Agua destilada................................. 100 mL

- Disolver el reactivo. Si la mezcal no se usa pronto adicionar fenol al 0.2% para prevenir el desarrollo de hongos. Solución C: Cloruro de sodio......................... 1.5 g Agua destilada............................ 100 mL - Disolver el reactivo. Esta solución es estable a temperatura ambiente.

Preparación: - Mezclar cantidades iguales de las soluciones A, B y C. - Guardar en frasco de vidrio y mantener bien tapado. NOTA: La solución es estable por 5 semanas a temperatura ambiente y en refrigeración dura varios meses.

Colorante de contraste. p-rosa anilina o azul de metileno................... 1 g

Agua destilada........................................... 100 mL Preparación:- Disolver el colorante en el agua.

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Práctica 4: Preparación de medios de cultivo

Objetivos

-Para poder estudiar los microorganismos, estos deben cultivarse y así poder disponer de ellos en un número adecuado, cuando sea necesario y observarlos macroscópicamente como colonia.

-Aprender las técnicas de preparación de diferentes tipos de medios de cultivo, su esterilización y su almacenaje, así como la importancia de los diferentes medios de cultivo y su uso para el aislamiento e identificación de los microorganismos. Empleo de agentes espesantes: agar…

-Deben seguirse las siguientes reglas para recuperar e identificar los microorganismos presentes en medios de cultivo: 1. Se preparan medios de cultivos primarios apropiados para el tipo de muestra en particular. 2. Se determina la temperatura y atmósfera de incubación para recuperar todos los microorganismos de importancia. 3. Se determina cuál de los aislamientos recuperados en los medios primarios requiere una mayor

caracterización.

4. Se determina si son necesarias otras clases de pruebas, como ser susceptibilidad a antibióticos, fermentación de diferentes azucares, etc.., una vez conocido el microorganismos.

Desarrollo

-Preparación de medios de cultivo líquidos (caldos)

-Preparación de medios de cultivo sólidos: -Tubos de agar recto -Tubos de agar inclinado (agar en pico de flauta o "slant") -Placas

Clasificación de los medios de cultivo 1. SIMPLES: están formados solamente por compuestos químicos simples de fórmula química bien conocida. 2. COMPLEJOS: están formados por líquidos animales, jugos vegetales, extractos de carne, etc. También podemos clasificarlos en: electivos, selectivos, diferenciales y enriquecidos. 2.1. Medios electivos

-En algunos casos, especialmente en el aislamiento de organismos del suelo, un medio que satisfaga los

requerimientos nutricionales mínimos de los organismos que interesan, pueden ser más útiles. Por ejemplo, se pueden obtener cultivos de enriquecimiento conteniendo un gran número de bacterias del género Azitobacter, usando un medio libre de nitrógeno y que contenga una fuente orgánica de carbono e incubando aeróbicamente. 2.2.Medios selectivos -Otro importante método de separación de cultivos mixtos, es por medio del uso de un medio selectivo.

Este es un medio que ha sido modificado para incluir uno o más agentes inhibitorios. La elección de un medio selectivo debe ser apropiada para el aislamiento del organismo que interesa. Las sustancias inhibitorias pueden ser colorantes, antibióticos, sales biliares y sustancias que afecten el metabolismo enzimático de algunas especies. -Los medios selectivos para especies Gram- , pueden incluir cristal violeta, sales biliares que inhiben el crecimiento de muchas bacterias Gram+ . La penicilina con una concentración de 5,50 unidades/ml inhibe la mayoría de las bacterias Gram+ y por lo tanto el medio se hace selectivo para bacterias Gram-

-Los medios selectivos para bacterias Gram+, incluyen Telurito de Potasio, azida sódica, el citrato y el telurito de sodio, el laurisulfato y el selenito de sodio, el iodo y el feniletanol etc. que inhiben el crecimiento de

bacterias Gram-. Los antibioticos tambien confieren selectividad a los medios 2.3.Medios diferenciales

-Es aquel que tiene adicionado un reactivo que luego de la inoculación e incubación nos permite observar diferencias entre los distintos tipos de microorganismos que se han desarrollado. Ej.: que tenga agregado un indicador de pH que haga variar el color del medio. Estos indicadores se usan para demostrar la producción de ácido por un hidrato de carbono contenido en el medio y metabolizado por un microorganismo. -Los indicadores de pH más usados son rojo fenol, azul bromotimol, púrpura de bromocresol y rojo neutro. El azul de metileno y la resazurina son los indicadores de Eh (carga iónica) más usados actualmente.

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2.4. Medios enriquecidos

-Cuando se agrega una sustancia para enriquecerlo, aportando algún factor de crecimiento necesario

para el microorganismo que el medio no lo posea. Ej.: agar sangre. Procedimiento de enriquecimiento -Cuando se necesita obtener un cultivo de un organismo determinado es necesario una técnica de enriquecimiento adecuada para esa especie. Los métodos se basan en cualquier característica fisiológica del organismo deseado, por ejemplo, pH o temperatura óptima, requerimientos nutricionales o tolerancia a algunos inhibidores.

-En algunos casos se puede hacer un tratamiento térmico de suspensiones de suelo para el aislamiento de organismos esporulados y otros organismos termo-resistentes, seguido por un plaqueo en medio sólido. -Otras veces se puede usar diferentes temperaturas de incubación, de manera que el organismo deseado aumente su número en relación con el de los otros organismos presentes. El procedimiento de enriquecimiento en medio líquido es inadecuado para dar un cultivo puro, y el procedimiento final de aislamiento, comprende la obtención de colonias separadas en medio sólido.

ALGUNOS COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Peptonas

-Las características de una peptona dependen de la pureza y calidad del material proteico empleado y del método de hidrólisis. -La hidrólisis ácida y alcalina tienden a destruir el contenido de vitaminas de la proteína, y parte del contenido de aminoácidos también pueden perderse. La hidrólisis enzimática tiende a preservar las vitaminas y a

mantener intacto el contenido de aminoácidos. Por ej., la caseína pura no contiene hidratos de carbono y tiene gran contenido de triptofano y vitaminas. Una peptona de caseína preparada por hidrólisis ácida no tiene triptofano ni carbohidratos y puede usarse como ingrediente en medios para analizar el contenido vitamínico de sueros o de preparaciones farmacéuticas. -Casi todos los extractos de levadura microbiológicos son en realidad peptona de levadura, debiéndose la digestión de las células de levaduras a sus propias enzimas autolíticas.

Infusiones y extractos -Las infusiones y los extractos de carne y otros tejidos se usaron antes de conocerse las peptonas, hoy se los sigue usando en menor medida. Agentes solidificantes

-El agar es un polímero de la galactosa que es esterificado con ácido

sulfúrico y se extrae de ciertas algas marinas rojas, las Rhodophyceae, debe estar limpio y libre de desechos. Se agrega a la solución acuosa del 1,5 al 2%. El medio agarizado comienza a fundir a los 100°C, si bien se mantiene líquido hasta los 45°C, en donde se comienza a solidificar. Ventajas Desventajas prácticamente no es atacado o asimilado por los microorganismos, hay pocos

organismos que lo digieren. No es útil en medios ácidos -La gelatina es poco usada ya que a temperaturas altas se disuelve y por otra parte numerosos microorganismos lo digieren, se usa principalmente en microbiología de suelos.

-La agarosa es un polisacárido neutro que junto con la agaropectina es un producto de disociación del agar. Se usa en pruebas de difusión inmunoelectroforética, donde la claridad es especialmente importante. Otros componentes

Agentes reductores -Agentes reductores puede agregarse para promover la anaerobiosis. Uno o más compuestos como los

siguientes pueden usarse: ácido ascórbico, tiogilcolato de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, ácido tiomálico, hidrosulfito de sodio y cisteína. Muchos medios que no contienen agentes reductores y se usan normalmente para cultivar aerobios pueden emplearse para cultivar microorganismos de requerimientos especiales incubándolos en propano, hidrógeno, metano u otros gases.

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Preparación -La preparación de medios terminados a partir de materiales deshidratados debe hacerse de acuerdo a los instrucciones. -Sólo debe usarse equipos y cristalería química limpios. -El agua debe ser siempre destilada o desmineralizada, salvo indicación en contra. -La pesada exacta de los materiales y la medida correcta de agua son esenciales. -El calor debe ser directo o en baño de agua hirviendo o recipientes envueltos en vapor con agitación. -El calentamiento excesivo debe evitarse: desnaturaliza las proteínas. La homogeneidad también es esencial,

especialmente para medios que contienen agentes gelificantes. El mezclado debe ser suave para lograr homogeneidad sin espuma ni burbujas. MATERIAL: ●Balanza ●Infernillo eléctrico

●Probeta 500 ml ●Matraz ●Agitador ●Papel indicador ●Tubos de ensayo

●Algodón graso ●Vaso de precipitados

●Vidrio de reloj ●H Cl ●NaOH -Productos básicos para la preparación de un medio general. ●Peptona.......................5 g

●Extracto de carne.........10 g ●NaCl...........................5 g ●Agar-agar....................15/17g ●Agua...........................1000 ml MÉTODO:

-Pesar todos los productos, excepto el agar cuando seindique, y disolverlos en parte del agua en un vaso de precipitados tibio (pesar sobre un vidrio de reloj )

-Medir el pH y ajustarlo con NaOH o HCl a 7,3… -Añadir el agar si no se hizo y el resto del agua hasta 500 ml - Calentar en calefactor hasta que el agar esté fundido (100º,un par de minutos).(El medio adquiere un aspecto transparente)¡importante para que no queden “grumos -Antes de que se enfríe el medio (y por tanto solidifique) repartir

parte de él en tubos de ensayo, el resto ponerlo en un matraz de 0,5 l. o en botellas de la medida requerida. No exceder del litro, o no se garantiza el autoclavado en el centro el agar.

-Limpiar bien la boca de los tubos y demás material y tapar con algodón graso, u otro. ¡Si rosca, dejarla floja!

Esterilizar:- La esterilidad se hace de varias formas, generalmente por autoclave o filtración. Casi todos los

medios se esterilizan a 121°C durante 15 minutos para volúmenes de hasta 500 ml. Para volúmenes mayores el tiempo debe extenderse a 20, 30 ó más minutos según sea necesario.

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-Para verificar la esterilización placas y tubos con el medio se deben incubar a 20-25°C ó 30-35°C durante varios días o semanas o utilizar controles biológicos o químicos.

-Los medios deben guardarse en un refrigerador. Caducidad:4 semanas

TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS -En Microbiología, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo que se impida cualquier tipo de contaminación en el área de trabajo.

-Se aconseja que la siembra de todas las muestras a los medios de cultivos se realice bajo una cabina de flujo de aire laminar o en un gabinete de seguridad biológica, con los protectores de plástico o vidrio para el cuello y la cara, las muestras procesadas se las debe considerar como potencialmente infecciosas y manipularlos adecuadamente. -También se deben utilizar guantes de goma o latex de seguridad biológica -La mesada de trabajo debe estar equipada con todos los materiales necesarios para efectuar las siembras,

también se debe contar con todos los medios de cultivos necesarios para realizar las siembras. -Las asas deben esterilizarse antes de utilizarse y enfriarlas sobre el agar o el material de vidrio (en zonas estériles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor.

-Después de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar en todo su perímetro -Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, antes y después de la inoculación. -Durante la inoculación, los tapones se mantienen en la mano sujetándolos por la parte que no entra en

contacto con tubos y matraces. -Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada hacia el frente para que el riesgo de contaminación sea mínimo. -Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo boca arriba trabajando con bacterias.

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Los pasos de un proceso de aislamiento de una especie microbiana se pueden

resumir en los siguientes: -Siembra en placa de la muestra de partida. -Tomar una colonia de la placa una vez incubada y sembrar una segunda placa, en la que todas las colonias que crezcan deben ser idénticas. -A partir de la segunda placa se puede resuspender una de las colonias en medio líquido, consiguiéndose ya un

cultivo puro. -Para la conservación de los cultivos puros de un microorganismo existen diversos métodos, el más simple es la resiembra en tubos inclinados que se mantienen, normalmente refrigerados, durante 3-6 meses. -El equipo necesario para la inoculación es muy simple. Consta de un alambre, con una punta en ojal, recta o en gancho, y el otro extremo insertado en un mango cilíndrico (el conjunto es llamado asa u ansa). La inoculación primaria puede hacerse con un asa, hisopo u otro material sobre la superficie del medio

agarizado en la placa de petri o sobre caldos de cultivos. SIEMBRA Objetivos

- Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de aislamiento en placa de Petri.

- Obtener colonias separadas, utilizando uno o más métodos. - Estudiar la morfología de cada colonia. Material -Asa de siembra, Tubo con cultivo, placas de Petri con medio de cultivo sólido y cultivo de microorganismo.

Toma de muestras: 1.-Técnica de siembra para aislamiento: 1.1.-ESTRÍA MÚLTIPLE: -Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas,

pero sin hacer presión para no dañar el agar. -Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la

temperatura adecuada, siempre en posición invertida. -Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado

número de gérmenes.

Ejemplo de resultado con estría múltiple

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1.2-TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES:

-Se divide la placa en cuatro cuadrantes. -Se toma el inóculo y se siembra consecutivamente en 1-2-3-4.Incubar. -En el cuarto cuadrante, al menos, obtendríamos colonias aisladas.

1.3.- SIEMBRA POR AGOTAMIENTO (O EN SUPERFICIE)

-Se realiza una descarga y se realiza estría por toda la placa.

2.-SIEMBRA PARA RECUENTO:

2.1.--Técnica de Barry (“en césped”)

-En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y a continuación se añade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. -Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta forma los

microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

2.2.-de inoculo a dilución conocida y con asa de Dygraski (Barry modificada):

-Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo unas gotas ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con

ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco.

-Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de microorganismo. -La posición invertida evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas.

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-Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente la dilución (asas calibradas,las mas utilizadas las de 0,1µl, o

10µl.)

Resultado de “recuento”

Diferencia entre “aislar” y “extender”

SIEMBRA EN TUBO

-Con asa o hilo. En tubo con caldo, semisólido, o agar.

-Siembra en superficie y picadura: -El inóculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio

con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estría ondulada. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de la siembra. - Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón para evitar que los gases le expulsen.

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología

1.- Esterilizar el asa de

siembra a la llama del

mechero

2.- Destapar el tubo con

microorganismo y flamear la

boca, sin soltar el tapón

3.- Tomar muestra del

microorganismo con el

asa, flamear el tubo y tapar

5.- Introducir el asa con

el microorganismo hasta

el fondo y deslizar en

zig-zag

6.- Esterilizar el asa de

siembra a la llama del

mechero

7.- Flamear la boca

del tubo y tapar

4.- Tomar el tubo con

medio estéril, destapar

y flamear la boca

Lunes

L.2.- Resiembra de bacterias en tubo de agar inclinado

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Lectura de placas:

TÉCNICAS BÁSICAS DE IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

En el laboratorio las identificaciones se hacen en base a evaluar las siguientes características: 1. Reacción a la tinción de Gram 2. Morfología celular 3. Motilidad

4. Presencia o ausencia de esporas 5. Características de crecimiento: rapidez, morfología en medios de cultivos sólidos y líquidos, condiciones atmosféricas y temperatura de incubación óptimas. 6. Aspecto de las colonias 7. Reacciones bioquímicas diferenciales. 8. Pruebas serológicas, incluyendo detección directa de antígenos, así como anticuerpos séricos. 9. Productos metabólicos, cono análisis de ácidos grasos de cadena larga por medio de cromatografía en gas-

líquido -Aplicando estos criterios, los microorganismos se pueden clasificar en los grupos taxonómicos y obtener un nombre final de género y especie.

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Medios de cultivos más usados en microbiología 1.--Caldo nutriente -Es un medio empírico de uso general para el cultivo de la mayoría de las bacterias. Los ingredientes son: - Peptona 10 gr. - Extracto de levadura 10 gr. - Cloruro de sodio 5 gr.

- Agua destilada 1000 ml -Se pesan los ingredientes y se calientan hasta que se disuelven. Una vez que se ha enfriado, se ajusta el pH a 7-6. Se autoclava a 1 atmósfera durante 15 minutos para precipitar los fosfatos. Se filtra y se reparte en tubos tapados con algodón o con tapones a rosca (en esta último caso no se ajusta completamente las tapas). Se esteriliza a 1 atmósfera durante 20 minutos. Ajustar las tapas a roscar antes de retirar del autoclave. 2.- -El agar nutriente

-Es un medio con fines generales para la siembra y el crecimiento de la mayoría de los microorganismos poco exigentes. Su composición esta a base de 3 g de extracto de Carne de buey, 5 g de peptona trípsica de gelatina, 15 g de agar, y 5 gr. de cloruro sódico y glucosa .Agua destilada

hasta 1000 ml

3.--El agar Sangre

-Medio de cultivo con fines generales para una gran amenidad de

microorganismos circunscribiendo los exigentes. Con el añadido de sangre, viene bien en el empleo de las reacciones hemolíticas. Este medio esta libre de azucares reductores. En su composición por litro se le observa 15 g de digestivo pancreático, 5 g de peptona de soja, 5 de cloruro sódico y 15 g de agar.

-Es diferencial para hemolisis

4.--El Agar Salmonella-Shigella

-Es utilizado para el aislamiento de salmonelas y de Shigella de heces, de comestibles y de otros materiales. En su composición por litro se observa 5 g

de peptona de casina y carne, 5 g de extrato de buey, 10 g de lactosa, 8.5 g de citrato de sodio, 8.5 g tiosulfato sodico, 1 g de citrato de hierro, 8.5 g de sales Biliares, 0.025 g de rojo neutro- 0.025g 15 g de agar y 0.3 mg de verde brillante

INTERPRETACIÓN

-Salmonella, no fermenta la lactosa, sus colonias aparecen incoloras, transparentes, con o sin centro negro debido a la producción de sulfuro de hidrógeno. Shigella, aparece con colonias incoloras. Los coliformes que hayan conseguido crecer, formarán colonias rojas o rosadas.

5.--El agar McConkey

-Es un medio diferencial y selectivo utilizado para la detección, aislamiento y

enumeración de bacterias coniformes y patógenas intestinales en aguas, productos lácteos y muestras biológicas. Su acción diferencial radica en que las

bacterias hábiles de fermentar lactosa provocan un descenso de pH, junto con una absorción del colorante, surgiendo en la colonia el color rojo. Las colonias de bacterias que no fermentan la lactosa quedan incoloras.

-En cuanto a su composición por litro observamos 17 g de pancreático digestivo de gelatina; 1.5 g de pancreático digestivo de caseína, 1.5 de peptona

de tejido animal; 10 g de lactosa; 1.5 g de sales biliares; 5 g de cloruro Sódico; 0.03 g de rojo Neutro; 0.001g de cristal Violeta; 13.5 g de agar; y un pH de 7.1 (+ - 0.2º a 25º)

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-Los materiales que se usan son el polvo para la preparación de Agar McConkey, la balanza monoplato, el reloj de vidrio, la espátula, el matraz erlenmayer, agua destilada, la varilla de agitación, guantes de seguridad,

el mechero piezoelectrico, una parrilla, algodón hidrófobo, y el uso de la autoclave.

6.--El agar Levine

-Es un medio que se utiliza para el aislamiento y la diferenciación de los Escherichia coli y enterobacterias, fermentadores de lactosa y no fermentadores de

lactosa, así como para la identificación expedita de los albicans. En su composición por litro tenemos 10 g de peptona pancreática, 10 g de lactosa, 2 g de fosfato Dipotásico, 15 g de agar, 15 g de eosina, 0.065 g de azul de metileno y un pH de 7.1 (+ - 0.2º a 25º). Resultados:

7.--El agar Chapman

-Es un medio elegido para la detección de Staphylococcus patógenos en muestras. Selectivo y diferencial.

En su composición observamos extracto de carne de 1g, peptona trípsica de caseína de 5g, peptona de carne de 5g, cloruro sódico de 75g, D-manitol de 15g, rojo fenol de 25g y agar de 15g. Los estafilococos coagulasa + (Aureus) fermentan el manitol (amarillo) Los coagulasa – no fermentan (rosa)

8.--El agar Papa Dextrosa

-Es un buen medio para cultivar y enumerar levaduras y mohos partiendo de alimentos y demás materiales. Así tenemos como muy ricos

para el crecimiento de levaduras y mohos por su bajo rango de pH, los hidratos de carbono por ej. En cuanto a su composición observamos 15g de agar, 20 g de dextrosa y 4 g de infusión de patata.

9.--El agar Sabouraud

-Esgrimido en la localización y aislamiento de hongos en muestras por la técnica de filtración por membrana. Para que se de el crecimiento selectivo de hongos sobre bacterias en la muestra tiene que darse una reacción

ácida. En su composición por litro observamos 5 g de digestivo pancreático de caseína, 5 g de peptona tejido digestivo, 40 g de dextrosa y 15 g de agar.

Microorganismos Crecimiento Características de las colonias

Escherichia coli ATCC 25922 Bueno a excelente Verdosas con brillo metálico y centro negro

azulado

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Bueno a excelente Mucosas, rosa púrpura, confluentes

P. aeruginosa ATCC 27853 Bueno a excelente Incoloras

Proteus mirabilis ATCC 43071 Bueno a excelente Incoloras

S. aureus ATCC 25923 Pobre Incoloras, pequeñas, puntiformes

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Pobre Incoloras, pequeñas, puntiformes

Shigella flexneri ATCC 12022 Bueno a excelente Incoloras

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Bueno a excelente Incoloras

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TABLA MODIFICADA DE COWAN´S & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BATERIAS HETERÓTROFAS

tinción gram (cultivo fresco)

+ + + + + + + + – – – – –

forma coco coco coco coco bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón coco

agrupación racimo

s racimos

cadenas tetradas pares

crecimiento

aerobio + + + + + – + + + + + + +

crecimiento anaerobio

– + + + + + + – – – + + –

esporas – – – – – + + + – – – – –

movilidad – – – – – + o – + o – + o – + o – + o – + o - + –

catalase + + – – – – + + + + + + +

oxidase + + – + +

fermentación de glucosa a acido o a acido+gas

– + + + + + (o –

) + – – – + + –

O/F – O F F O

Micrococcus X

Staphylococcus X

Streptococcus X

Lactococcus X

Enterococcus X

Leuconostoc X

Pediococcus X X

Aerococcus X

Lactobacillus X

Clostridium X

Bacillus X X

Alcaligenes X

Pseudomonas X

Enterobacterias X

Aeromonas X

Chromobacterium

X

Neisseria X

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RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES.

- TÉCNICA DEL RECUENTO EN PLACA

Material

-Cultivo de 24 horas en caldo nutritivo de Escherichia coli -Pipetas estériles de 1 ml -8 Tubos de ensayo con 9 ml de agua estéril -8 Tubos con 20 ml de Agar Plate Count fundido

-8 Placas Petri estériles vacias Objetivo -Realizar el recuento de microorganismos viables a partir de una muestra problema. Técnica -Tomar 1 ml de la solución problema (cultivo de E. coli) y pasarlo a un tubo conteniendo 9 ml de agua estéril.

-La dilución obtenida será 1:10 respecto del original. -Homogeneizar bien y con otra pipeta pasar 1 ml de este tubo al siguiente. De este modo la dilución será

1:100. -Repetir estos mismos pasos hasta obtener con el último tubo la dilución 10-8 -De cada dilución tomar 1 ml y pasarlo a una Placa Petri estéril vacía, que estará rotulada previamente con la dilución correspondiente.

-Verter en cada placa un tubo de Agar Plate Count fundido. Mezclar con agitación suave dejando solidificar el agar. -Cuando todas las placas estén sólidas, llevarlas a incubar a 37ºC durante 24 horas. Cada ensayo debe comprender 8 placas Petri marcadas desde 10-1 a 10-8. Resultados -Contar el número de colonias

que aparecen en aquella placa que contenga entre 30 y 300 UFC. El resultado obtenido se multiplicará por el inverso de la dilución y se referirá como UFC/ml.

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-EN TUBO:

http://www.diversidadmicrobiana.com

-SOBRE FILTROS DE MEMBRANA-:

http://www.diversidadmicrobiana.com/

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ESTUDIO DE CRECIMIENTO E IDENTIFICACIÓN EN LOS DIFERENTES MEDIOS: CLED, MC CONKEY Y AGAR SANGRE

Material Cultivo de 24 horas en caldo nutritivo de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ,

Escherichia coli u otros. Placas con medio de CLED, Mc Conkey y Agar sangre Asa de Platino

Técnica 1. A partir del caldo nutritivo. inocular los

microorganismos en los diferentes medios de cultivo, empleando la técnica de siembra por el método que se indique

2. Incubar todas las placas a 37ºC durante 24 horas. Resultados -Anotar las variaciones de crecimiento que se producen en los distintos

medios de cultivo comprendiendo las características de cada uno de ellos. -Medio de CLED: Medio diferencial. No es selectivo pues crecen tanto gérmenes Gram + como Gram -. -Su nombre proviene de las siglas: Cistina. Lactosa, Electrolitos deficiente. -En este medio las bacterias que son capaces de utilizar la lactosa dan lugar a la aparición de colonias amarillas (al producir ácido de la lactosa

viran el indicador del pH que lleva el medio), frente a las Lactosa negativas que dan colonias incoloras. Por tanto es un medio DIFERENCIAL PARA EL CARACER LACTOSA. S. aureus: Cultivo positivo. Colonias amarillas, Gram +

Lactosa + E. coli: Cultivo positivo. Colonias amarillas Gram - Lactosa + P. aeruginosa: Cultivo positivo. Colonias incoloras Gram - Lactosa -

-Medio de Agar sangre: Medio enriquecido y diferencial para el carácter hemolítico. En su composición lleva un 5% de sangre de cordero lo cual favorece el crecimiento de algunos gérmenes patógenos exigentes como son los Streptococcus. -La presencia de sangre permite la demostración del carácter hemolítico que presentan ciertos microorganismos. Esta se manifiesta como la aparición alrededor de la colonia de un halo claro que indica la destrucción de los hematíes del medio de cultivo. - En el caso de los miembros del Género Streptococcus esta hemólisis puede clasificarse como alfa o beta,

según sea parcial o total, sin embargo en otros microorganismos solo se determina si el microorganismo es hemolítico o no. S. aureus: Crecimiento positivo. Aparición de un halo transparente alrededor de la colonia por lo que se demuestra que el microorganismo es hemolítico. En esta especie en concreto la destrucción de los hematíes se debe a la existencia en el microorganismo de hemolisinas que lisan completamente los glóbulos rojos.

E. coli: Crecimiento positivo. Microorganismo no hemolítico. El

color rojo del medio de cultivo llega hasta el mismo borde de la colonia. P. aeruginosa: Crecimiento positivo. Microorganismo no hemolítico Medio Mc Conkey: medio selectivo para Gram-,y diferencial para

lactosa.

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ESTUDIO DEL EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS

Introducción -En esta práctica se pretende que el alumnado tenga un primer contacto con el manejo de los cultivos en condiciones de asepsia. Incidir en la importancia de manejar los cultivos al lado de la llama del mechero. No todas las colonias bacterianas son pigmentadas; la pigmentación es más frecuente entre las bacterias atróficas. Debido a que la mayor parte de los pigmentos son sustancias carotenoides, las células pueden

aparecer de color rojo, anaranjado o amarillo. -De las patógenas S. aureus es una de las formas pigmentadas más importantes, cuyas colonias son de un color amarillo dorado. La pigmentación no es aparente en las células aisladas, porque los pigmentos se encuentran en gránulos intracelulares demasiado pequeños para ser observados con luz visible. Sin embargo si es visible en la forma colonial. -En el caso de Serratia marcescens es especialmente curioso este proceso, ya que a una temperatura de 28ºC las colonias son rojas, mientras que a 37ºC no presentan color. Este microorganismo produce

alteraciones en alimentos ya que suele pigmentar el pan de color rojizo cuando se mantiene en atmósfera húmeda y a temperatura media. Como curiosidad recordar que fue el verdadero productor del famoso milagro de la “Hostia sangrante” (Milagro de Padua).

Material

Cultivo de 24 horas en caldo nutritivo de Serratia marcescens Placas de Agar nutritivo

Asa de platino Objetivo -Estudiar la influencia de la temperatura de cultivo en la producción de pigmentos en algunos microorganismos, así como practicar el manejo de los mismos en condiciones de asepsia.

Técnica

1. Tomar el tubo que contiene el cultivo de 24 horas del microorganismo. 2. Inocular mediante el método de siembra por estrías dos placas de Agar

Nutritivo. 3. Incubar una placa a 25ºC y la otra a 37ºC durante 24 horas. 4. Lectura de resultados.

Resultados -Examinar las placas incubadas a las dos temperaturas y observar si el crecimiento es uniforme (cultivo puro, condiciones de asepsia correctas), así como la producción de pigmento en cada una de ellas. Anotar el resultado obtenido. -Las placas de 28ºC están pigmentadas en rojo, las de 37ºC sin pigmento

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ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN EN EL CRECIMIENTO BACTERIANO

Introducción -Las bacterias pueden crecer en un amplio rango de temperaturas. Cada especie sin embargo requiere un estrecho margen de temperaturas que esta determinado por la sensibilidad al calor de sus sistemas enzimáticos. Así se puede hablar de:

1 Temperatura mínima de crecimiento: la más baja temperatura a la cual un microorganismo puede crecer. Por debajo de esta temperatura la actividad enzimática se inhibe y las células son metabolicamente

inactivas por lo que el crecimiento es negativo. 2 Temperatura máxima de crecimiento: la temperatura más alta a la cual existe crecimiento. Por encima

de ella la mayoría de los enzimas se destruyen y el microorganismo muere. 3 Temperatura óptima de crecimiento: la temperatura a la cual la velocidad de crecimiento es mayor. Sin

embargo no es necesariamente la óptima o ideal para otras actividades enzimáticas de la célula. (Ejemplo: recordar la primera práctica de la producción de pigmentos, la temperatura óptima para Serratia es 37ºC pero sin embargo es a 28ºC cuando pigmenta)

-Atendiendo entonces a los diferentes requerimientos de temperaturas los microorganismo se pueden clasificar en:

Microorganismos psicrófilos: aquellos que tienen una temperatura óptima de crecimiento de 15ºC o más baja, comprendiendo su rango entre 0 y 20ºC.

Microorganismos psicrotrofos o psicrofilos facultativos: Aquellos que teniendo una temperatura óptima de 20-30ºC y una temperatura máxima de 35ºC, pueden crecer a 0ºC

Microorganismos mesófilos: aquellos que tienen una temperatura optima de 20-45ºC con un rango comprendido entre 48ºC y 15ºC

Microorganismos termófilos: aquellos que tienen una temperatura óptima de 55-65ºC, con un rango de crecimiento entre 45 y 80ºC.

Hipertermófilo: aquellos que tienen una temperatura óptima de 80ºC, pero no crecen por debajo de 55ºC ni por encima de 110ºC.

-Como ya hemos dicho, cuando las células se incuban a temperaturas próximas a sus óptimas de crecimiento se incrementa mucho la velocidad del cultivo. Es decir en poco tiempo se obtienen grandes cantidades de células. Según vamos alejándonos de este punto intermedio la velocidad se va ralentizando hasta que llega un momento en que la célula muere (generalmente a temperaturas superiores a la máxima) o simplemente queda latente a la espera de recobrar sus condiciones óptimas de cultivo. -En esta práctica se pretende observar el efecto de incubación a temperaturas diferentes en una especie

bacteriana Material

Cultivo en agar nutritivo de, Escherichia coli y Bacillus stearothermophilus. Otros Placas de Agar nutritivo Y/o tubo con caldo nutritivo Asa de platino

Objetivo Estudiar el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de algunos microorganismos. Técnica

-Rotular las placas Petri que contienen Agar Nutritivo con las temperaturas: 6ºC, 28ºC,

37ºC, y 55ºC.

-Sembrar a partir de los cultivos sólidos cada una de las placas con el método de siembra

por estrías.

-Incubar todas las placas a las temperaturas indicadas durante 7 días. Resultados

-Anotar las variaciones que se producen en el crecimiento de los cultivos, según la

temperatura de incubación. -Anotar la cantidad de crecimiento mediante un código de cruces: 0: ningún crecimiento +: poco crecimiento ++: crecimiento moderado +++: crecimiento muy bueno Escherichia coli: no crece a 6ºC ni a 55ºC, crece bien a 28ºC y 37ºC. Microorganismo mesófilo.

Bacillus stearothermophillus: no crece a temperaturas inferiores a 55ºC. Microorganismo termófilo.

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ESTUDIO DEL EFECTO DEL VALOR PH, EN EL CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS -Las bacterias tienen un PH óptimo de crecimiento. -Las patógenas suelen estar entre 7.3-7.4. -Hay excepciones como el Vibrión cholerae PH: 8 -Estudiaremos como afecta el PH en el crecimiento bacteriano

Material y Método: -Tres tubos con caldo nutritivo 5ml. A uno de los tubos le añadiremos CLH hasta PH 2. A otro NaOH hasta PH9. -El tercero tendrá PH 7.3. (actúa como control positivo de crecimiento). -Se inocula con asa el mismo germen en todos, procedente de una `placa crecida y aislada. Incubara 37º. -Valorar el resultado de turbidez por cruces.

0: ningún crecimiento +: poco crecimiento ++: crecimiento moderado

+++: crecimiento muy bueno

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METABOLISMO DE UN AZUCAR Y MOVILIDAD. AGAR H.Leifson MÉTODO DE LA SIEMBRA POR PICADURA

Introducción

Material

Cultivo de 24 horas en caldo nutritivo de Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa y

Escherichia coli Tubos de medio Agar Hugh-Leifson Hilo de Platino

Objetivo -Estudiar la movilidad de los microorganismos mediante la técnica de cultivo en agar semisólido, así como comprobar el tipo de metabolismo que tienen los microorganismos.

Técnica

1. Inocular por cada microorganismo a analizar 2 tubos de Agar Hugh-Leifson, mediante la técnica de siembra por picadura central hasta el fondo del tubo.

2. En uno de los tubos poner una pequeña cantidad de parafina líquida hasta que cubra la superficie y se evite el contacto con el oxígeno.

3. Incubar todos los tubos a 37ºC durante 24 horas. Resultados -Anotar las variaciones que se producen en la línea de siembra, así como el cambio de color que se pudiera producir en los tubos con y sin parafina. -El medio Hugh Leifson es un medio base que permite la adición de un azúcar para estudiar el tipo de metabolismo que tiene el microorganismo en cuestión.

-En este caso concreto se ha incorporado glucosa. Por lo que se estudiara el tipo de reacción frente a este azúcar, así como la movilidad del microorganismo. Si el microorganismo es capaz de utilizar el azúcar producirá ácidos y por tanto virará el indicador de pH del medio de cultivo a color amarillo. -Si el microorganismo tiene un metabolismo oxidativo solo virará el tubo sin parafina, pero si tiene metabolismo fermentativo virara el indicador en ambos tubos.

S. aureus: Tubo con y sin parafina de

color amarillo. Metabolismo fermentativo en la utilización de la

glucosa. Línea de crecimiento sin desplazamiento, por lo tanto microorganismo inmóvil.

E. coli: Tubo con y sin parafina de color amarillo. Metabolismo fermentativo en la utilización de la glucosa. Línea de crecimiento desplazada: microorganismo móvil.

Pseudomonas aeruginosa: Tubo sin parafina de color amarillo, tubo con parafina de color verde. Metabolismo oxidativo. Línea de crecimiento desplazada: microorganismo móvil.

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PRUEBA DE HUGH LEIFSON (Gram. negativos)

Metabolismo Fermentativo Metabolismo Oxidativo

ENTEROBACTERIACEAE PSEUDOMONADACEAE

PRUEBA DE HUGH LEIFSON (Gram positivos)

Metabolismo Fermentativo Metabolismo Oxidativo STAPHYLOCOCCACEAE MICROCOCCACEAE STREPTOCOCCACEAE

CATALASA

POSITIVO NEGATIVO

STAPHYLOCOCCACEAE STREPTOCOCCACEAE

UNA FERMENTANCIÓN MIXTA.

-El kefir es una bebida alcohólica, a base de leche fermentada, de origen balcánico. Se fabrica con un cultivo mixto de bacterias y levaduras capaces de fermentar la lactosa. Las bacterias son similares a las del yogur, las levaduras producen CO2 y una pequeña cantidad de alcohol. Algunas bacterias

producen una goma viscosa que atrapa a los microorganismos formando grumos. - Estos grumos son los granos de Kefir que se separan y se reutilizan para reiniciar otra fermentación. La bebida es un "yogur" chispeante y refrescante. OBJETIVOS: Observar una fermentación mixta (láctico-alcohólica).

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MATERIALES.

Papel pH.

Leche UHT. Granos de Kefir y un colador. PROTOCOLO

1. Poner 40 ml de leche en los tubos "falcon". Cubrirlos e incubarlos 10 min. a 43º C (no necesario). 2. Añadir una cucharadita de granos de Kefir.

3. Incubar a temperatura ambiente y en oscuridad hasta el día siguiente. 4. Agitar el producto. Tomar muestras para medir el pH final. Realizar tinciones gram al kefir líquido y al

grano. Para teñir el grano aplastarlo una pequeña muestra entre dos portas.

Coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la Fibrina del plasma.

Los Staphylococcus aureus patógenos dan una reacción postiva y los no patógenos negativa Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeño con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa

DNasa (Agar DNA) Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA Se hace una estría gruesa una placa conteniendo DNA en su composición. Se revela después de incubar a 37-24h , con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado.

ESTAFILOCOCO AUREUS es positivo para ambas (coagulasa y DNasa)

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Prueba de la catalasa: -A partir de las colonias crecidas en medio de Cled. Tomar un porta limpio y añadir un gota de H2O2 al 3%. Tomar el asa y cargar microorganismo a partir del CLED. Emulsionar con el agua oxigenada. La aparición de burbujas indica la presencia del enzima catalasa en el

microorganismo ya que descompone el agua oxigenada en agua y oxígeno que se vislumbra en forma de burbujeo.

OXIDASA -La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.

-El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno

(ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.

- El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de

diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.

-La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para:

-Identificar todas las especies de Neisseria (+)

-Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias y de Legionella + PROCEDIMIENTO

-Esta reacción se puede realizar de cualquiera de las 2 formas siguientes: -Coloque en una placa un disco de papel impregnado con para-aminodimetilanilina clorhidrato (Taxo N) al 6%, humedezca el disco con agua

destilada y aplique sobre él una porción del cultivo.

-Coloque una gota grande de agua destilada estéril en una placa de Petri, suspenda en la gota de agua una buena porción del cultivo a ensayar. -Coloque sobre la gota de la suspensión un disco impregnado con el reactivo para la oxidasa. RESULTADOS -La aparición de una coloración púrpura constituye una reacción positiva.

Nota: En el segundo caso el cambio de color ocurre rápidamente y puede ser acelerado por incubación a 35°C por 3 a 5 minutos.

Fórmula (en gramos por litro)

Peptona de carne 13.0

Cloruro de sodio 5.0

Lactosa 10.0

Tripteina 10.0

Glucosa 1.0

Citrato de hierro y amonio

0.5

Tiosulfato de sodio 0.3

Rojo de fenol 0.025

Agar 15.0

pH final: 7.3 ± 0.2

http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/catalasa.htm

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METABOLISMO. MOVILIDAD. MEDIO TIOGLICOLATO

-Este medio se usa para determinar el efecto del oxígeno sobre el crecimiento microbiano y la movilidad -Un tubo con medio semisólido contiene tioglicolato y cisteina para reducir el potencial redox del medio. Así sólo hay oxígeno en la superficie y no en el resto del tubo. -Un indicador redox puede añadirse, resazurina, indicaria si hay oxígeno (rojo) o no (incoloro).

-El medio de cultivo, tiene por sus componentes la calidad nutricional del caldo tripteína soja. que permite el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricionalmente exigentes. -Debido a los grupos -SH- de los reductores, se neutralizan los efectos bacteriostáticos de los derivados mercuriales, arsenicales y de otros metales pesados. -La presencia de una baja cantidad de agar, retarda la dispersión de CO2 y O2.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Tripteína 17.0

Suspender 30 g del polvo por litro de

agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta disolución total. Distribuir y esterilizar a 121°C por 15 minutos.

Peptona de soya 3.0

Glucosa 6.0

Cloruro de sodio 2.5

Tioglicolato de sodio 0.5

Agar 0.7

L-cistina 0.25

Sulfito de sodio 0.1

pH final: 7.0 ± 0.2

-La mayoría de las bacterias móviles se desplazan mediante flagelos, que son apéndices locomotores con forma de hilo que se extienden hacia fuera de la membrana plasmática y de la pared celular. -Los flagelos son tan delgados que no pueden observarse directamente con un microscopio de campo claro sino

que deben teñirse con técnicas especiales para aumentar su grosor. Estas técnicas son complicadas y por ello a veces se prefieren métodos alternativos para comprobar la movilidad de los microorganismos. Entre estas técnicas encontramos la siembra en medios específicos y la observación en cámara húmeda que será objeto de otra práctica posterior. -En el método de siembra en medios específicos lo que se estudia es la aparición de un desplazamiento a partir de la línea de crecimiento central.

-Estos agares especiales son semisólidos lo cual permite al microorganismo móvil vencer la resistencia que

supone el uso de un agar convencional. Generalmente están asociados al estudio de otras propiedades del microorganismo, pudiendo así estudiar dos o tres características al mismo tiempo.

-Siembra El tubo se inocula con un asa de punta y se incuba hasta que se produce su crecimiento

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Kligler Hierro Agar:

Fundamento -En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo

bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente

solidificante. -Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el

cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Siembra -A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar el medio de cultivo, picando el

fondo y extendiendo sobre la superficie del medio

Incubación -A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis

Resultados

1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.

4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

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-ácida/ácida: Bacterias fermentadoras de lactosa: E. coli, Klebsiella,

Citrobacter, Enterobacter, etc - alcalina/ácida: Bacterias no fermentadoras de lactosa. Salmonella (H2S+), Shigella (H2S -),

Yersinia.

Prueba del Citrato -Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.

-Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Material -Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. -Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes

de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. -Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación

del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. Siembra -En superficie -Incubar a 37/24h.

Microorganismo Pico/Fondo Producción de gas Producción de

ácido

sulfhídrico

E. coli ATCC 25922 A/A + -

K. pneumoniae ATCC700603 A/A + -

P. mirabilis ATCC 43071 K/A + +

S. typhimurium ATCC 14028 K/A - +

S. enteritidis ATCC 13076 K/A + +

S. flexneri ATCC 12022 K/A - -

P. aeruginosa ATCC 27853 K/K - -

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Prueba del Indol -Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa.

-Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes: Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g

HCl (concentrado).........................................................................50ml -Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos.

- Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-).

-Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. -Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.

-Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él asépticamente.

Rojo de Metilo/Voges-Proskauer -Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. -Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la

metabolizarán aerobiamente (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de dos tipos: Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio.

-Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4. Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo

aerógenes). - Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como

intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo característico. -Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días como mínimo y 5 como máximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirán para cada uno de los

ensayos.

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Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. - Se agita para homogeneizar y se observa la coloración.

- Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo.

Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:

0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso. 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.

-Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violáceo, más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. -Si la prueba es negativa no aparece coloración

alguna.

Prueba de la Ureasa

-Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa.

- Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. -Se cultiva el microorganismo en slant (superficie) en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea.

-Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. -Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa. -Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en

cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus

resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.

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Fenilalanina Desaminasa -Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la

consiguiente acidez resultante. - Esta actividad enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias -Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando

la superficie del slant con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba

positiva) se manifiesta por la aparición de un color

característico verde oscuro o verde-azulado.

INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS LACTOSA POSITIVAS

(COLIFORMES) -Las Enterobacterias lactosa positivas o grupo coli-aerógenes pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación de 30-37ºC. -Son bacilos Gram negativos, aerobios y anerobios facultativos, no esporulados, y comprenden los siguientes géneros: Escherichia

Enterobacter Klebsiella Citrobacter -Investigación y recuento en medio líquido -Para su detección se emplean ciertas características que las diferencian de otras Enterobacterias, como es su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas en presencia de sales biliares.

Material Agua problema. -Tubos de ensayo con medio de cultivo apropiado y campana Durham Pipetas estériles de 1 ml Medio de cultivo

-Caldo lactosado biliado verde brillante (BGBL) Técnica --Se preparan tres series de tres tubos cada una que contienen 10 ml de BGBL adicionados con una campana

Durham para recogida de gases. A partir Se realizan diluciones seriadas 10-1, 10-2 y 10-3 de la muestra problema. - Añadir en cada uno de los tres tubos de la primera serie 1 ml de la dilución 1/10

-En cada uno de los tubos de la segunda serie 1 ml de la dilución 1/100 -En cada uno de los tubos de la tercera serie 1 ml de la dilución 1/1000 -Incubar las tres series a 31ºC, haciendo lecturas a las 24 y 48 horas. -La reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gases recogidos en la campana Durham. -Con el número de tubos positivos de cada serie, se recurre a la Tabla del Número Más Probable (NMP), donde se obtendrá el recuento por gramo o mililitro de muestra.

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INVESTIGACION Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI Material Tubos de ensayo con BGBL adicionado de campana Durham Placas Petri con agar EMB de Levine

Tubos con agua de Triptona (TW) Tubos con Medio de Clark y Lubs (MR-VP) Tubos con agar citrato de Simmons Tubos con agar Kliger Técnica -Se parte de los resultados obtenidos en la investigación de las Enterobacterias lactosa-positivas.

-Con asa de siembra se subcultivan todos los tubos positivos (con gas) que se hayan detectado en la determinación anterior, sobre Agar EMB de Levine empleando el método de los tres giros, con el fin de obtener colonias aisladas tras su incubación a 37ºC, y con lecturas a las 24 y 48 horas. Realizar un Gram para confirmar morfología y coloración. Otras pruebas de confirmación

-Siembra de la atería IMVIC y un tubo de Kliger: conjunto de pruebas bioquímicas diferentes que tienen como objetivo conseguir la identificación del microorganismo Prueba del Indol: -A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el asa de platino un tubo de agua de peptona. -Incubar y leer a las 24 horas a 37ºC. Prueba del Rojo de metilo: -A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el asa de platino un tubo de medio Clark y Lubs.

-Incubar a 37ºC leyendo el resultado después de 1 a 4 días. Prueba de Voges-Proskauer: -A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el asa de platino un tubo de medio Clark y Lubs. Incubar a 37ºC leyendo el resultado después de 1 a 4 días. - Prueba del citrato -A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el asa de platino un tubo de Agar Citrato de Simmons por el método de estrias sobre su superficie. Incubar a 37ºC durante 24 horas.

-Siembra del medio de Kliger -A partir de una colonia aislada en el medio EMB, sembrar con el asa de platino un tubo de medio de Kliger por estrias la superficie y por picadura central hasta el fondo del tubo. Incubar a 37ºC durante 24 horas.

Lecturas -Las colonias de E. coli en el medio EMB miden de 2-3 mm, son planas o ligeramente cóncavas, con centros

oscuros o casi negros (violeta). Con luz reflejada, se observa un brillo metálico verdoso característico, aunque a veces puede no manifestarse. Medio de cultivo selectivo y diferencial para gérmenes Gram negativos debido a la presencia de eosina y azul de metileno que inhiben a los gérmenes Gram positivos. Lleva lactosa en su composición y un indicador de pH que hace que podamos identificar los microorganismos que fermentan dicho azúcar de los que no lo hacen. -Añadir 1 ml del reactivo de Kovac´s al tubo del indol, agitar, dejar reposar. Aparición de anillo rojo: reacción

positiva, aparición de anillo amarillo: reacción negativa. Producción de indol a partir del agua de peptona (triptófano). -Añadir 2 gotas del reactivo rojo de metilo a uno de los tubos con medio Clark y Lubs. Aparición de color rojo en el tubo: reacción positiva, aparición de color amarillo: reacción negativa. Producción de ácido a partir de la glucosa (F. Ácido-mixta)

-Añadir 0.5 ml de KOH al 40% y 0.5 ml de alfa-naftol al otro tubo restante de medio de Clark y Lubs. Aparición

de color rojo: reacción positiva, aparición de color amarillo: reacción negativa. Producción de acetil-metil-carbinol a partir de la glucosa (F. Butilén-glicólica). -Observar el tubo de citrato de Simmons: crecimiento en superficie y color azul: reacción positiva, sin crecimiento y color verde: reacción negativa. Utilización del citrato como única fuente de carbono.

-Leer los resultados de la utilización de azúcares en el medio de Kliger tanto en superficie como en profundidad. Utilización de glucosa, lactosa, producción de SH2 y gas por los microorganismos en aerobiosis y anaerobiosis.

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Escherichia coli - Bacilo Gram negativo

Crecimiento a 44.5ºC en BGBL: POSITIVO-GAS

EMB: Colonias lactosa positivas (violetas) con brillo metálico Indol: POSITIVO Rojo de Metilo: POSITIVO Voges-Proskauer: NEGATIVO Citrato de Simmons: NEGATIVO Glucosa: POSITIVO

Lactosa: POSITIVO Gas: POSITIVO SH2: NEGATIVO Hidrólisis del almidón: -Se utilizan placas con medio de cultivo que contiene almidón al 0,1% que se incuban durante 48 h.

-Se revelan con lugol o mejor con alcohol etílico de 95° durante 30 a 60 min. -La reacción es positiva cuando aparece un halo más claro que el resto de la placa alrededor de la zona de crecimiento.

Sensibilidad a bacitracina: -Se utiliza en la identificación presuntiva de los estreptococos ß-hemolíticos del grupo A de Lancefield que

suelen ser sensibles a bajas concentraciones de este antibiótico. - Se realiza sobre placas de agar sangre de carnero al 5% inoculadas en superficie, colocando discos con 0,04 U de bacitracina.

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Microbiota Saprofita Objetivos -Estudiar la presencia de microorganismos en diferentes nichos ecológicos para resaltar su distribución y la gran variedad de especies presentes. Especialmente se estudiará el cuerpo humano como nicho ecológico en el

que se desarrolla una gran variedad de microorganismos. Contenido -En esta práctica se pretende conocer la gran diversidad de microorganismos que habitan diferentes nichos ecológicos con especial atención al cuerpo humano (piel, tracto respiratorio…). Desarrollo -Cultivo de microorganismos procedentes de diferentes nichos y examinar los diferentes tipos de colonias obtenidas.

ESTUDIO DE LA FLORA CUTÁNEA. Introducción -Aunque estamos acostumbrados en Microbiología a estudiar cultivos puros, esto es una situación artefactual en la Naturaleza. La mayoría de los ambientes contienen una gran variedad de microorganismos que se

interrelacionan unos con otros en la lucha por crecer y sobrevivir. -Un ejemplo de esta mezcla de poblaciones la tenemos en nuestro propio cuerpo. La especificidad encontrada en cada zona depende de numerosos factores entre los que se encuentran: el pH, la concentración de oxígeno, la humedad presente y el tipo de secreción asociada. -En la piel se encuentran generalmente estafilococos (predominantemente S. epidermidis), estreptococos (alfa hemolíticos, no hemolíticos y enterococos), bacilos difteroides, levaduras y hongos. Por lo tanto es un buen

ejemplo para el estudio de poblaciones mixtas. Por otra parte es importante diferenciar entre la flora propia que tiene un ser humano y que se define como aquella que coloniza la piel en el momento del nacimiento y que nos acompaña hasta la muerte, y la flora transitoria que es la que vamos adquiriendo a partir del contacto con el medio ambiente y conseguimos eliminar tras el lavado de la zona con agua y jabón. -Con la finalidad de comprobar tanto la existencia de poblaciones mixtas, como la diferencia entre la flora propia y transitoria se ha diseñado la práctica que reseñamos a continuación, con la salvedad de que sólo se

investigarán las colonias aparecidas a las 24 horas de incubación. - Se ha de entender entonces que si el tiempo fuera más prolongado, el número y diversidad de microorganismos sería mucho mas alto, ya que los hongos por ejemplo son mucho más lentos en su

crecimiento que las bacterias o levaduras. Material -Placas de Agar Mueller-Hinton

Objetivo -Estudiar la flora cutánea propia diferenciando entre la flora permanente y la transitoria, así como la existencia de poblaciones mixtas en la Naturaleza. Técnica -Tomar una placa de Agar Mueller-Hinton y rotularla en dos sectores como antes y después. (Se emplea el

agar Mueller-Hinton ya que es un medio rico que no inhibe el crecimiento de ninguna especie). -Con el dedo de la mano imitando un escobillón, pasarlo suavemente sobre la superficie del agar en el sector rotulado como antes. - Lavarse las manos con agua y jabón y volver a repetir la operación anterior en el sector marcado como después. -Incubar las placas a 37ºC durante 24-48.

Resultados

-Observar las diferencias que existen tanto en número como en tipo de colonias en los sectores marcados antes y después. - Realizar un Gram de cada tipo de colonia diferente y anotar la coloración obtenida y la forma del microorganismo. -Observar que en la Naturaleza es normal la existencia de flora mixta más que cultivos puros.

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FLORA OROFARINGEA SAPROFITA

Estreptococos viridans (α hemoliticos)

Micrococos spp

Estafilococos coagulasa-

Difteroides

Neisseria spp

Actinomices

Anaerobios: Bacteroides spp,fusobacterium spp,…

PATOGENOS Estreptococo neumoniae, Pyogenes. Estafilococo aureus

Haemophilus influenza, parainfluenza Klebsiella neumoniae

Mycobacterium tuberculosis Enterobacterias Pseudomona Moraxella

Candida albicans -Por parejas nos tomaremos una muestra de amígdalas palatinas con hisopo seco en SSF Sembrar por estría múltiple en agar Mueller Hilton y en agar sangre. Incubar a 37- 24h. -Observar crecimiento y describir. -Utilizar tinciones y pruebas necesarias para identificar la flora crecida. Dibujar morfología y agrupación.

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Antibiograma

-Objetivo

-Estudiar como se realiza la valoración de la actividad antimicrobiana de un compuesto químico (antibiótico) mediante la técnica de Kirby-Bauer.

-Contenido

-En esta práctica se pretende examinar la capacidad antimicrobiana de un agente quimioterapeutico -como son los antibióticos.

-Los antibióticos son compuestos orgánicos que inhiben el crecimiento bacteriano. Sin embargo, no todas las bacterias son igual de sensibles frente a un mismo antibiótico, de ahí que antes de usar cualquier antibiótico sea necesario probar la sensibilidad de la bacteria frente a diferentes antibióticos para escoger aquel para el

cual la bacteria sea más sensible y con una dosis menor, lo que permitirá reducir los posibles efectos secundarios cuando ese antibiótico se use terapéuticamente.

-La técnica in vitro más usada para realizar estas pruebas de sensibilidad o antibiogramas es la técnica de Kirby-Bauer.

Desarrollo

Sembrar en “césped” la bacteria problema sobre una placa de Mueller-Hinton.

Colocar discos conteniendo una cantidad conocida de un antibiótico sobre la placa sembrada.

Incubar a 37ºC durante 24 h.

Medir el diámetro de los halos formados por cada antibiótico sobre la placa.

-Consultar las tablas con los datos obtenidos para saber el grado de sensibilidad y escoger el antibiótico más adecuado de los ensayados sobre esa bacteria.

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ANTIBIÓTICOS: Diámetro de los halos en mm.

Antibiótico Resistente Intermedia Susceptible

Ampicilina ≤ 13 14 - 16 ≥ 17

Amikacina ≤ 14 15 – 16 ≥ 17

Sulfisoxasol ≤ 12 13 - 16 ≥ 17

Gentamicina ≤ 12 13 – 14 ≥ 15

Cloranfenicol ≤ 12 13 - 17 ≥ 18

Ceftriaxona ≤ 12 14 – 20 ≥ 21

Ciprofloxacina ≤ 15 16 - 20 ≥ 21

Tetraciclina ≤ 14 15 - 18 ≥ 19

Acido Nalidixico

≤ 13 14 – 18 ≥ 19

Estrptomicina ≤ 11 12 – 14 ≥ 15

Kanamicina ≤ 13 14 - 17 ≥ 18

Trimetroprim/ Sulfametoxasol

≤ 10 11 – 15 ≥ 16

-Tablas de referencia a modo de ejemplo. Consultar siempre las de la casa comercial utilizadas

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RECUENTO DE BACTERIOFAGOS Material

Cultivo líquido de Escherichia coli Diluciones seriadas de bacteriofagos Tubos estériles vacíos Placas con medio NM Tubos con medio NM fundido Pipetas estériles

Objetivo

Conocer el número de partículas víricas que hay en una suspensión problema basándose en el ciclo lítico que presentan determinados virus Técnica

1 Añadir en un tubo vacío estéril 0.1 ml de la dilución de fago asignada.

2 En el mismo tubo añadir 0.2 ml del caldo de E. Coli. 3 Mantener 10 minutos a 37ºC en la estufa de cultivo para que se produzca la interacción virus-bacteria. 4 Sacar el tubo de la estufa y añadirle el contenido de un tubo de medio NM fundido. 5 Rápidamente verter el contenido del tubo con el virus + bacteria + medio fundido sobre una placa Petri

que lleva medio NM sólido. Homogeneizar suavemente y dejar solidificar. 6 Una vez sólido el medio, incubar a 37ºC durante 24 horas.

Resultados -Contar el número de calvas que aparezcan en aquella placa que contenga entre 30 y 300 UFP. El resultado obtenido se multiplicará por el inverso de la dilución y se referirá como UFP/ml. Anexos

Practicas de Microbiologia Genera1

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