MANUAL DE PRACTICAS

MICROBIOLOGIA DE

ALIMENTOS

Ph.D Claudia Milena Amorocho Cruz

Programa Ingeniera Agrcola

Facultad de Ingeniera

Universidad Surcolombiana

Neiva, Huila

2013

1. Seguridad en el laboratorio y manejo del material de laboratorio.

INTRODUCCION

Es imprescindible en Microbiologa la limpieza de todo el material que se va a emplear con el fin

de evitar problemas de contaminacin. El material sucio, los medios de cultivo que se han

sembrado y que no van a ser utilizados, se recomienda recogerlos en recipientes adecuados con el

fin de prevenir la contaminacin del laboratorio y del personal que trabaja en las instalaciones

(Hernndez E., et al, 2006).

El material contaminado e inservible se debe esterilizar en autoclave durante 20 minutos y a una

temperatura de 121 C. Despus, se lava con detergente, se enjuaga con agua destilada y se deja

secar a temperatura ambiente. En el caso de cubreobjetos, portas, pipetas y dems material de

vidrio, una vez que han sido lavados adecuadamente, se sumergen en mezcla crmica durante 24-

48 horas. Transcurrido dicho tiempo, se procede a lavar con agua destilada y se secan para

utilizarlos posteriormente (Hernndez E., et al, 2006).

En cuanto al manejo de los tubos de ensayo, se tapan con algodn graso y papel aluminio en la

zona del tapn o se utiliza tapn metlico y se colocan en gradillas, se esterilizan en autoclave con

el medio de cultivo (Hernndez E., et al, 2006).

Los frascos erlenmeyer matraces se taponan con algodn graso y se envuelve con papel

aluminio. Los morteros, embudos, pipetas se envuelven totalmente (Hernndez E., et al, 2006).

Antes de esterilizar las pipetas, se recomienda colocar tapones de algodn.

Operaciones como toma de muestras, siembras, resiembras, diluciones, aislamientos deben

realizarse de tal manera que se evite toda contaminacin, para ello es imprescindible trabajar en

las proximidades del mechero o en cmara estril.

Los hilos y asas de platino o micrn sirven para las siembras e inoculaciones y deben esterilizarse

antes y despus de su uso, calentndolos a la llama del mechero hasta el rojo. Este material se

introduce gradualmente en la llama con el fin de prevenir salpicaduras de material. Es

recomendable abrir las placas de petri el tiempo mnimo requerido (Hernndez E., et al, 2006).

En el momento de trabajar con tubos de ensayo con medios de cultivo, se mantiene inclinado y se

abre con ayuda de la otra mano, que a la vez sujeta el asa como un lpiz. El tapn se toma con el

dedo meique y la boca del tubo se lleva por unos segundos a la llama. Luego, una vez tomada la

muestra o realizada la siembra, se vuelve a flamear la boca del tubo de ensayo antes de tapar con

el tapn de metal o el algodn. Durante este tiempo, el tapn se mantendr sujeto con el dedo

meique evitando el contacto con otras reas potencialmente contaminadas (Hernndez E., et al,

2006).

En el proceso de preparacin y manejo del material de laboratorio se requiere adquirir destrezas

como la rapidez y automatismo, las cuales son fundamentales para una buena labor en estas

manipulaciones (Hernndez E., et al, 2006).

En el momento de trabajar con agentes qumicos, es recomendable trabajar en zonas con buena

ventilacin, emplear campanas con extraccin de gases, equipos de proteccin (Buesa, 2008), con

el fin de evitar riesgos qumicos debido a que estas sustancias son irritantes, nocivas, corrosivas,

txicas y muchas cancergenas (Daz, et al., 2007). Adems, el material de desecho debe

disponerse en contenedores apropiados que sern posteriormente gestionados por la entidad

encargada (Buesa, 2008).

De otro lado, los riesgos fsicos estn relacionados por la probabilidad de sufrir quemaduras en el

manejo del autoclave, mecheros, adems existe el riesgo de tener cadas o choques. Se hace

necesario que los trabajadores reciban capacitacin en bioseguridad y calidad para evitar riesgos,

tener mejor desempeo en el laboratorio y garantizar el derecho que tiene toda persona a la salud

(Daz, et al., 2007)(Sandoval L., y Gmora E., 2005). En el laboratorio es fundamental mantener

condiciones de higiene, seguridad y proteccin del ambiente en sus instalaciones y tomar medidas

con el fin de evitar accidentes y enfermedades ocupacionales (Sandoval L., y Gmora E., 2005). Los

programas de seguridad e higiene son prioritarios ya que se siguen una serie de actividades

previamente planeadas que contribuyen para crear un ambiente y actitudes psicolgicas que

promuevan la seguridad (Feo R.J., 2011). Es necesario identificar todos los riesgos presentes en el

laboratorio y trabajar para superar dichas deficiencias.

Los anlisis microbiolgicos requieren tcnicas avanzadas para asegurar la calidad de los

resultados obtenidos, y es esta una forma de disminuir los riesgos a los que pueden estar

expuestos los trabajadores y el medio ambiente (Daz, et al., 2007).

Precauciones en el Laboratorio de Microbiologa de Alimentos

Antes de empezar a trabajar es fundamental lavarse bien las manos. En el caso que haya

heridas o rasguos en la piel se recomienda cubrirlas con una cura o algo apropiado.

Usar siempre bata de laboratorio.

Est prohibido comer, beber, fumar en el laboratorio.

Las superficies de las mesas de trabajo deben ser lisas para facilitar la limpieza y

desinfeccin antes y despus de terminar el trabajo diario. La desinfeccin se puede

realizar con hipoclorito de sodio al 2%, fenol al 5%, jabn neutro, etanol al 70% o amonio.

Despus de que las pipetas han sido utilizadas, se dejan inmediatamente en una solucin

desinfectante (hipoclorito de sodio 2%).

Una vez se ha flameado el hilo o asa de siembra se deja airear de 10 a 15 segundos para

no crear aerosoles microbianos al introducirla caliente a los cultivos y adems porque se

pueden matar las clulas microbianas.

Es vital colocar el material contaminado en un recipiente adecuado y llevarlo a autoclave

para esterilizar, previo al proceso de lavado.

En caso de verter material contaminado en alguna superficie, es recomendable agregar

hipoclorito de sodio al 2% sobre el rea contaminada y limpiar con toallas de papel

absorbente 15 minutos antes de limpiar.

Es necesario ser cuidadoso debido a que la mayora de los microorganismos que se

manejan en el laboratorio son patgenos.

Recomendaciones tcnicas previas a los anlisis

Una vez llegan las muestras al laboratorio, iniciar el anlisis lo ms pronto posible.

En caso de tener muestras perecederas, es necesario refrigerarlas entre 0-5C, solo

cuando no ha sido posible analizarlas en la primeras horas despus de recibidas.

Cuando las muestras llegan congeladas deben mantenerse en este estado hasta su anlisis

y procesarlas en un periodo no superior a 7 das.

Si las muestras estn congeladas es necesario dejarlas descongelar para su anlisis en su

envase original, en un refrigerador entre 2 a 5C durante un tiempo mximo de 18 horas.

El anlisis se inicia una vez la muestra est descongelada.

En caso que la muestra congelada sea fcilmente triturada como es el caso de helados, no

se hace necesario esperar a que se descongele.

Las muestras lquidas slidas han de mezclarse homogneamente antes de su anlisis.

Muestras no perecederas se almacenan en un lugar fresco, protegido de la luz, humedad,

contaminacin y se recomienda realizar su anlisis antes de 3 das.

El material empleado en el anlisis debe ser esterilizado antes de realizar el anlisis de

muestras.

Es necesario preparar los medios de cultivo de acuerdo con el nmero de muestras a

analizar.

Marcar las cajas y los tubos con el nmero correspondiente a cada muestra por analizar.

Trabajar cerca al mechero, flameando la boca de los frascos y tubos.

Emplear el alcohol antisptico para desinfectar el sitio donde se vaya a extraer la muestra

para la preparacin de las diluciones.

Utilizar pipeta por dilucin.

No calentar las pipetas en el mechero.

El tiempo empleado entre la preparacin de las diluciones y el vertido del medio no debe

superar los 20 minutos, ideal que sea inferior a los 10 minutos.

La temperatura del medio para verter en placa debe estar entre 45-50C, as al mezclarlo

con el alimento no se inactivan los microorganismos.

Realizar controles de esterilidad del medio de cultivo y del agua empleada en las

diluciones.

Condiciones que deben reunir los medios de cultivo y reactivos en su preparacin

Con el fin de que un mtodo analtico de alimentos tenga significado semejante en

cualquier lugar, es necesario que los medios de cultivo, los componentes y los reactivos

sean de caractersticas comparables.

Es recomendable usar los medios deshidratados que ofrecen las empresas comerciales, ya

que es conveniente y la preparacin es ms uniforme.

En caso, de no encontrar un medio de cultivo con las firmas comerciales, se puede

preparar dicho medio a partir de los componentes que lo constituyen y teniendo en

cuenta las siguiente recomendaciones:

o Aadir los componentes en las cantidades correctas con agua destilada a

temperatura ambiente, en un recipiente adecuado.

o Si los componentes estn en pequeas concentraciones, o son poco solubles, es

conveniente aadirlos en forma de soluciones acuosas filtradas o soluciones

alcohlicas o alcalinas.

o Algunos componentes, como los hidratos de carbono, suspensin de yema de

huevo y sulfito sdico es necesario prepararlas a parte del resto de los

componentes del medio y esterilizarse frecuentemente por filtracin para

adicionarlos posteriormente en condiciones aspticas al resto del medio que ha

sido esterilizado en su totalidad en autoclave. Este proceso es adecuado, debido a

que as se evitan degradaciones no deseables en el proceso de autoclavado.

o Los componentes se disuelven completamente por calentamiento hasta la

ebullicin, en especial si contiene el medio agar.

o Si el medio es agar se deja enfriar hasta 45-50C y en el caso de los caldos a la

temperatura ambiente.

o El pH del medio se ajusta con NaOH o HCL 0.1N despus de la esterilizacin.

o El medio se distribuye en tubos de ensayos, placas u otros recipientes en la forma

y cantidad necesarias.

o En algunos casos, el medio una vez est preparado y esterilizado se distribuye en

cajas de petri para su empleo en cultivos en superficie. Es fundamental, dejar

secar y solidificar las placas antes de su inoculacin para evitar la difusin y

confluencia de las colonias.

o El secado de los medios de cultivo se puede realizar en cabinas de flujo laminar,

con las cajas destapadas o en incubadora a 37C durante 4 horas con las tapas en

su lugar y la superficie del agar hacia arriba.

o Los frascos o tubos de dilucin se esterilizan a 121C durante 15 minutos. Debido

a la evaporacin del diluyente en el proceso de esterilizacin, es necesario aadir

un volumen adicional de tal forma que se garantice la cantidad deseada al final del

proceso (2%).

MATERIAL Y METODOS

Medio de cultivo Papel aluminio Cajas de petri

Agua destilada Vaso de precipitado Refrigerador 4C

Esptula o cuchara Mechero Rotulador

Autoclave Cinta de autoclave Dosificador

Matraz 1000, 500 ml Gradillas Balanza

Tubos de ensayo Agitador magntico Lmpido

Algodn graso Bao mara Alcohol 96

PROCEDIMIENTO

Preparacin medio de cultivo con agar.

- Tomar un medio de cultivo.

- Seguir las especificaciones indicadas.

- Pesar en una balanza la cantidad de medio requerida.

- Adicionar la cantidad pesada a un matraz de 100, 500 1000 ml.

- Adicionar la cantidad de agua destilada correspondiente.

- Mezclar manualmente o con un agitador magntico.

- Tapar con algodn graso y papel aluminio el matraz que contiene el medio de cultivo.

- Poner cinta de autoclave y marcar el matraz con el medio respectivo.

- Autoclavar 121C, durante 15 20 minutos.

- Verificar el cambio de color en la cinta de autoclave.

- Atemperar el medio a 45-50C.

- Verter en cajas de petri.

- Dejar solidificar.

- Almacenar placas petri con medio de cultivo a 4C.

- Inocular las muestras en siembra por superficie.

Preparacin medio de cultivo lquido

- Tomar el medio de cultivo o los componentes que lo conforman.

- Pesar en una balanza la cantidad de medio requerida.

- Adicionar la cantidad previamente pesada y aadirla a un vaso de precipitado.

- Agregar el agua correspondiente.

- Mezclar hasta homogenizar.

- Con el uso de un dosificador se adiciona la cantidad respectiva a cada tubo de ensayo.

- Tapar los tubos de ensayo con algodn graso tapones.

- Colocar los tubos con medio en una gradilla metlica.

- Marcar el medio que se est empleando.

- Poner la cinta de autoclave.

- Autoclavar a 121C, durante 15 20 minutos.

- Dejar enfriar a temperatura ambiente.

- Realizar las diluciones correspondientes almacenar a 4C hasta su uso.

PREGUNTAS

1. En la cuadro 5 del artculo de Buesa, 2008. Identificar las condiciones de trabajo riesgosas

que considere se presentan en un laboratorio de Microbiologa de Alimentos.

2. Realice un esquema de los procedimientos desarrollados en la prctica.

BIBLIOGRAFIA

Buesa, R. 2008. Caractersticas del trabajo de los laboratorios de patologa en Mxico. Patologa;

46(4):318-26.

Daz, A., Rodrguez A.G, Via S.J. 2007. Factibilidad de la integracin calidad-seguridad y salud en el

trabajo en laboratorios biolgicos. Industrial, Vol XXVIII, No 2.

Feo R.J., 2011. Estrategias de enseanza en el uso de normas de seguridad e higiene industrial del

laboratorio de turbomquinas de la Escuela de Ingeniera Mecnica de la Universidad Central de

Venezuela. Revista de Investigacin No 74 vol 35.

Hernndez E., Hernndez J., Ferrs M.A., Hernndez M., Montes R., Castillo M.A., Botella S.,

Moreno Y., Cuesta G., Jimnez A., Gonzlez A., Segarra R., Gonzlez R., Roig G., Garca J., Gmez

E.D. 2006. Manual de Prcticas. XXXVIII Curso de Anlisis microbiolgico de alimentos y control de

los procesos de fabricacin. Universidad Politcnica de Valencia.

INVIMA. Manual de tcnicas de anlisis para control de calidad microbiolgico de alimentos para

consumo humano.

Sandoval L., Gmora E., Reglas de Seguridad, higiene y cuidado del ambiente en el laboratorio.

Revista Cubana de Qumica. Vol XVII, No 3, 2005.

2. Tcnicas de tincin.

INTRODUCCION

Por medio de un microscopio ptico se pueden examinar directamente los microorganismos, sin

embargo, conviene fijarlos y teirlos, ya que permite trabajar con diferentes resoluciones, y

conservarlo para posteriores estudios (Prescott, et al., 2002). Las tinciones nos permiten apreciar

el tamao, la morfologa y la organizacin de las clulas de los diferentes microorganismos que se

estn estudiando.

La fijacin es un proceso que permite conservar, fijar estructuras internas y externas de las clulas

de los microorganismos. Inactiva enzimas que podran alterar la morfologa celular y endurece las

estructuras celulares, as no van a cambiar durante la tincin y la observacin (Prescott, et al.,

2002). El uso de fijadores qumicos es til ya que penetran en la clula y reaccionan con

componentes celulares como protenas y lpidos, inactivndolos y convirtindolos en insolubles e

inmviles (Prescott, et al., 2002).

Los colorantes que se emplean para teir poseen grupos cromforos, con dobles enlaces

conjugados que dan el color al colorante. Adems, se unen a la clula por medio de enlaces

inicos, covalentes hidrfobo. Por ejemplo, un colorante cargado positivamente se une a

estructuras cargadas negativamente de la clula. Dentro de los colorantes se encuentran los

colorantes bsicos como el azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta, safranina, verde

malaquita, los cuales son catinicos o tienen grupos cargados positivamente. Estos colorantes

bsicos se unen a molculas cargadas negativamente, como los cidos nuclicos y protenas.

Mientras que los colorantes cidos con aninicos (Prescott, et al., 2002).

Las tinciones simples se hacen sobre preparaciones anteriormente secadas (Madigan M.T., et al,

2009).

La tincin de Gram fue desarrollado por el mdico dans Christian Gram en 1884. Es un mtodo

que permite clasificar las bacterias en Gram-positivas y Gram-negativas.

Los microorganismos Gram positivos aparecen de color violeta y los Gram negativos tien de color

rojo o rosa (Hernndez E., et al, 2006), en funcin de las caractersticas estructurales de la pared

(Madigan M.T., et al, 2009). Despus de teir con un colorante bsico, las clulas se tratan con

etanol ya que el alcohol decolora las clulas gram-negativas pero no las gran-positivas. Luego, se

realiza la tincin de contraste con otro colorante con el propsito de distinguir los dos tipos de

clula en el microscopio (Madigan M.T., et al, 2009). En esta tincin, dentro de las clulas se forma

un complejo insoluble cristal violeta-lugol que en el caso de las gram-negativas puede extraerse

con alcohol, pero no es posible en las gram-positivas. Debido a que las bacterias gram-positivas

tienen paredes celulares muy gruesas formadas por varias capas de peptidoglicano, estas se

deshidratan con el alcohol, ocasionando el cierre de los poros de las paredes e impiden la salida

del complejo cristal violeta-lugol. Mientras que en las gram-negativas el alcohol penetra

rpidamente en la capa externa que es rica en lpidos y la capa fina de peptidoglicano permite el

paso del alcohol y la salida del complejo. Luego del tratamiento con el alcohol, las bacterias gram-

negativas son prcticamente invisibles y es necesaria la tincin de contraste con otro colorante

para apreciarlas.

Cuando las clulas Gram positivas envejecen, no tien de violeta sino de fucsia (Prescott, et al.,

2002).

En el caso de trabajar con hongos que tiene formas vegetativas y esporas, se utiliza un protocolo

diferente de tincin, en el que las esporas aparecen teidas de color verde, mientras que las

formas vegetativas se observan de color rojo.

MATERIAL Y METODOS

Portaobjetos Mechero Azul de metileno Aceite de cedro

Asa de platino Microscopio Reactivo de lugol Cristalizador Violeta de genciana Verde de malaquita

Pinzas portaobjetos Fuchsina bsica Alcohol 96

PROCEDIMIENTO

Tincin Simple

1. En un portaobjetos bien limpio y desengrasado, depositar con un asa de platino una gota

del material a examinar en el centro. Luego, se extiende suavemente. En caso, que se

busque observar un microorganismo presente en un medio slido, previamente se coloca

una gota de agua destilada en el portaobjeto y despus se toma una muestra de la colonia

y se realiza la extensin.

2. La preparacin anterior se deja secar al aire con calor suave.

3. Fijar la preparacin, tomando el portaobjetos con las pinzas y se pasa de 3 a 4 veces por la

llama del mechero.

4. Se deja enfriar la preparacin, se adiciona el colorante y se deja actuar por un tiempo

determinado, de acuerdo a su naturaleza; en caso de usar violeta de genciana se deja

durante 1 minuto, para la fuchsina bsica diluida, durante 2 a 3 minutos y para el azul de

metileno durante 3 a 5 minutos.

5. Posteriormente, se lava con agua destilada con el fin de arrastrar el exceso de colorante.

6. La preparacin se deja secar al aire o con calor suave.

7. Se observa al microscopio con el objetivo de inmersin.

Tincin de Gram

1. La muestra a observar se extiende, deseca y se fija.

2. Se tie con violeta de genciana durante 1 minuto.

3. Sin lavar, se reemplaza el colorante por el reactivo del lugol, dejando que arrastre el

primero y dejndolo actuar durante 1 minuto.

4. Se lava con agua.

5. Luego, se tie con fuchsina bsica durante 3 minutos.

6. Lavar, secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

Tincin de esporas: Mtodo del Verde de Malaquita

1. Extender y desecar como se ha mencionado en el procedimiento de tincin simple.

2. Fijacin, 8 a 10 cortes a la llama del mechero.

3. Se tie con verde malaquita a emisin de vapores durante 8 a 10 minutos.

4. Se procede a lavar con agua destilada.

5. Luego, se tie con fuchsina bsica durante 3 minutos.

6. Lavar, secar y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin.

PREGUNTAS

1. Realice un esquema de la tincin gram.

2. Cul es la funcin de las porinas y su localizacin en una pared gram-negativa?

3. Por qu el alcohol decolora rpidamente las bacterias gram-negativas?

BIBLIOGRAFIA

Hernndez E., Hernndez J., Ferrs M.A., Hernndez M., Montes R., Castillo M.A., Botella S.,

Moreno Y., Cuesta G., Jimnez A., Gonzlez A., Segarra R., Gonzlez R., Roig G., Garca J., Gmez

E.D. 2006. Manual de Prcticas. XXXVIII Curso de Anlisis microbiolgico de alimentos y control de

los procesos de fabricacin. Universidad Politcnica de Valencia.

Madigan M.T., Martinko J.M., Dunlap P.V., Clark D.P. 2009. Brock Biologa de los microorganismos.

Pearson.

Prescott, Harley, Klein. 2002. Microbiologa. McGraw Hill. Quinta edicin.

3. Tcnicas de siembra de microorganismos.

INTRODUCCION

Es importante tener claro que cuando se trabaja en microbiologa, cualquier microbio usado o

estudiado en el laboratorio no debe ser contaminado con otros del ambiente o por el mismo

microbilogo. Por tanto, el personal que manipula los microorganismos debe garantizar

constantemente y asegurar su trabajo con un cultivo puro, es decir, cada microorganismo que

est en un tubo o en una placa debe ser exactamente el mismo (Pollack R.A., et al., 2012). En

algunas ocasiones, se tiene una mezcla de diferentes microorganismos y es necesario

implementar ciertas tcnicas para aislarlos. Una de estas tcnicas fue desarrollada por Robert

Koch, en donde se obtiene una colonia aislada, la cual es el crecimiento de un solo

microorganismo sobre la superficie del agar (Pollack R.A., et al., 2012).

Las tcnicas empleadas en la siembra de microorganismos son siembra por superficie, triple

estra y en profundidad. Cuando se siembra en placa por extensin y en estras, se extiende

una mezcla de clulas sobre una superficie de agar, cada clula aislada se multiplicar

formando una colonia independiente, cada colonia representa un cultivo puro. Dicha colonia

se toma y posteriormente se siembra por superficie haciendo la extensin uniforme de la

colonia por el medio de cultivo se toma una muestra lquida, la cual se adiciona a la placa

que contiene el medio de cultivo y luego se extiende con ayuda de un asa. Las clulas

diseminadas sobre la superficie desarrollaran colonias aisladas, el nmero de colonias que se

desarrollen corresponden al nmero de organismos viables de la muestra, siempre y cuando

se proporcionen las condiciones ptimas para su desarrollo (Prescott, et al., 2002). La siembra

por extensin es muy empleada para determinar en una muestra la concentracin bacteriana.

La siembra en estras facilita la obtencin de colonias aisladas. La cual consiste, en extender la

mezcla microbiana en un extremo de la placa en masa, luego se flamea el asa y se extiende un

estra que sale a partir de la extensin inicial, posteriormente se vuelve a flamear el asa y se

hace otra estra que sale de la anterior. Las colonias que crecen en la superficie de una placa

se pueden inocular en un medio fresco y preparar cultivos puros (Prescott, et al., 2002).

MATERIAL Y METODOS

Asa de platino Medio cultivo fundido Bao mara

Asa digralsky Estufa Termmetro

Mechero Pipeta pasteur

Placa petri Suspensin microbiana

PROCEDIMIENTO

Siembra por superficie

- Tomar una muestra de una suspensin microbiana o una colonia de una placa con

crecimiento microbiano.

- Extender homogneamente la suspensin o la colonia con asa de platino o asa de

digralsky en una placa de petri con medio de cultivo fresco y sin crecimiento microbiano.

- Incubar a la temperatura y tiempo ptimo para el microorganismo que se est trabajando.

- Observar el crecimiento en placa.

Siembra triple estra

- Tomar con el asa de platino una porcin de crecimiento microbiano

- Sembrar en la mitad de una placa nueva con medio de cultivo

- Flamear el asa de platino en el mechero hasta alcanzar el rojo vivo

- Dejar enfriar

- Realizar una estra a partir de la siembra anterior

- Flamear el asa de platino nuevamente

- Realizar una tercera estra a partir de la primera estra

- Incubar a temperatura y tiempo ptimo

- Observar el crecimiento microbiano

- Aislar una colonia y sembrar en masa

Siembra profundidad

- Adicionar 100 l 1 ml de una suspensin microbiana a una placa de petri estril.

- Verter 5 ml de medio de cultivo

- Mover la placa para homogeneizar la muestra microbiana con el medio de cultivo.

- Dejar solidificar.

- Incubar a temperatura y tiempo ptimo.

- Observar el crecimiento microbiano

Siembra doble capa

- Se sigue el procedimiento de siembra en profundidad

- Se adiciona una segunda capa de medio de cultivo

- Incubar a temperatura y tiempo ptimo

- Observar el crecimiento microbiano

PREGUNTAS

1. Cules son las ventajas de la siembra en profundidad?

2. Cules son los propsitos de la siembra en doble placa?

BIBLIOGRAFIA

Pollack R.A., Findlay L., Mondscheim W., Modesto R.R. 2012. Laboratory exercises in microbiology.

Fourth edition.

Prescott, Harley, Klein. 2002. Microbiologa. McGraw Hill. Quinta edicin.

4-Produccin de leches fermentadas

OBJETIVOS

Distinguir los procesos de elaboracin de yogur y kumis.

Comparar procesos de fermentacin con diferentes cepas lcticas.

Identificar las condiciones que deben cumplir las materias primas, los saborizantes, para

obtener un producto fermentado de buena calidad.

INTRODUCCION

Los derivados lcteos fermentados como las leches fermentadas o tambin denominada leche

cida, es el producto de una fermentacin lctica en la que se produce cido lctico, hay un

cambio en la textura y se da la produccin de aroma caracterstico de dichos productos. Este

proceso se debe a la accin de diferentes especies pertenecientes a las bacterias lcticas, las

cuales fermentan una parte de la lactosa y en ocasiones la sacarosa aadida en cido lctico, y en

menor proporcin, otros cidos orgnicos, sustancias aromticas. Adems, las protenas se

coagulan y sufren cierto grado de desdoblamiento.

La formacin del aroma es compleja y se atribuye a dos compuestos esenciales, diacetilo y

acetaldehdo.

El yogur es un producto lcteo coagulado en cuyo proceso de fermentacin intevienen las especies

Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus en un medio como la leche. En algunos

casos se adicionan aditivos como leche en polvo entera, descremada en polvo, suero en polvo). El

producto final contiene microorganismos viables y en mayor proporcin. Existen diferentes clases

de yogur, por ejemplo el yogur aflanado es fermentado directamente en el recipiente de venta y

as, el coagulo llega directamente al consumidor. Al yogur agitado, se rompe en coagulo a la

temperatura de incubacin y una vez envasado se refrigera en forma lenta con el fin de mejorar la

consistencia antes de ofrecerlo al consumidor. En el caso del yogur lquido el coagulo se rompe a la

temperatura de fermentacin y es homogenizado a 50-90 kg/cm2, para que su consistencia sea

lquida se refrigera rpidamente antes del envasado.

Algunas leches fermentadas son enriquecidas con calcio y vitamina D, siendo un alimento

apropiado en el aporte de calcio (Gonzlez M. E., et al., 2012). Otras son tratadas con gelatina e

inulina en leches fermentadas hipocalricas (Brito A & Perea J., 2009).

El kumis es una leche fermentada acido-alcohlica, el cultivo bacterianos lo conforman

Lactobacillus bulgaricus y la levadura Torula lactis, la cual tiene la capacidad de producir

concentraciones de alcohol de 0,7 a 2%. En algunos casos, se emplea Lactococcus lactis. Cada una

de estas especies tiene unas temperatura ptimas de crecimiento diferentes, por tanto, el cultivo

de kumis se produce en dos lotes, parte se incuba a 28-30C para favorecer el crecimiento de la

levadura y la otra parte a 37-38C para la bacteria (Casilimas F & Prez M., 2009).

MATERIALES Y EQUIPOS

Recipientes con tapa Kumis Papel aluminio Bureta

Leche entera 1 Litro Biobactro Toallitas de papel Pinza para bureta

Yogur Cucharas desechables Erlenmeyer 250 ml NaOH

Bao Mara Azcar Fenoftalena

PROCEDIMIENTO

Calentar la leche a una temperatura de 37C en el bao mara.

Mezclar un volumen de 250 ml de leche entera a 37C con 50 ml de yogur y 1 cucharada de azcar.

Mezclar 250 ml de leche entera a 37C con 50 ml de kumis y 1 cucharada de azcar.

Mezclar 250 ml de leche entera a 37C con una capsula de biobactro y 1 cucharada de azcar.

Dejar un control de leche sin cultivos y realizar el mismo procedimiento realizado en los ensayos

previos.

A cada una de las mezclas anteriores se les mide la acidez en el tiempo 0, 48 horas y 8 das.

Se realizan controles de pH a cada una de las muestras en los tiempo 0, 48 horas y 8 das.

Se realizan controles de temperatura ambiente en los tiempos 0, 48 horas y 8 das.

Se efectan controles organolpticos en los tiempos 0, 48 horas y 8 das.

En el tiempo 0 dejar las mezclas a temperatura ambiente, despus de 24 horas refrigerar hasta

completar los 8 das.

GUIA INFORME

- Complete la siguiente tabla

Parmetro\Da 0 2 8

Temperatura ambiente

pH

Viscosidad

Acidez expresada en g/cido lctico

- Realice los clculos correspondientes para expresar la acidez en gramos de cido lctico.

- Tenga en cuenta las cepas lcticas que actan en cada una de las mezclas.

- Proponer alternativas para saborizar y endulzar las leches fermentadas.

PREGUNTAS

1. Enumere y explique los pasos que se realizan para el tratamiento de la leche una vez es

ordeada.

2. Qu compuestos se forman durante la fermentacin del yogurt?

3. Seales tres condiciones fundamentales para producir una buena calidad de aromas y

fermentos a escala industrial.

4. Enumere tres tipos de productos diferentes al yogur y kumis, explique uno de ellos

mediante un diagrama de flujo.

BIBLIOGRAFA

Brito Ana Iris & Perea Julio. 2009. Evaluacin de la gelatina como estabilizador en una leche

fermentada con adicin de inulina. Ciencia y Tecnologa de Alimentos Vol 19, No 1.

Casilimas Parra Fabiola., Prez Delgado Milton. 2009. Gua de Laboratorio Fermentaciones.

Universidad Incca de Colombia.

Gonzlez Snchez M. E., Rivera Torres A., Moran Fagndez. 2012. Estudio nutricional para evaluar

el aporte de calcio sobre la dieta de una leche fermentada enriquecida en calcio y vitamina D

(Densia) en mujeres postmenopusicas. Nutricin Hospitalaria 27(2)537-541.

5- PRODUCCION DE VINOS

OBJETIVOS

Producir vino a partir de un zumo de uvas u otra fruta.

Realizar controles microbiolgicos y fisicoqumicos del producto elaborado.

INTRODUCCION

En el proceso de vinificacin, la fermentacin alcohlica es una etapa fundamental que permite

transformar el mosto de la uva en vino. La vinificacin es el conjunto de operaciones sucesivas en

donde se lleva control y se regula diferentes variables en un tiempo determinado, las cuales

afectan el buen desarrollo del proceso.

El producto obtenido despus de prensar los granos de uvas se denomina mosto de uvas y es un

medio de cultivo excelente para el crecimiento de levaduras. La variedad de uva define el tipo de

vino a obtener, los cuales pueden ser tintos, rosados o blancos.

El contenido de azcares fermentables puede ser protegido por chaptalizacin. La glucosa y la

fructosa, en cantidades similares representan la totalidad de estos azcares fermentables.

Adems, se conocen otras pentosas como la arabinosa, ramnosa y xilosa.

La riqueza en nitrgeno vara segn la composicin del terreno en el que se haya cultivado la uva y

segn su madurez. El nitrgeno asimilable comprende el nitrgeno amoniacal y los aminocidos

requeridos para el crecimiento de las levaduras al inicio de la fermentacin alcohlica.

Cuantitativamente los ms importantes son glutamina, prolina, alanina y arginina.

Los principales cidos del mosto son el cido L(+) tartrico, cido mlico y cido ctrico. El pH se

encuentra en un rango de 3-3,5. Las vitaminas presentes en el mosto son tiamina, riboflavina,

piridoxina, cido pantotnico, cido nicotnico, biotina e inositol. Los cationes predominantes son

potasio, calcio, magnesio, sodio, hierro, cobre, aluminio; los aniones presentes son sulfatos y

fosfatos. El contenido de estos compuestos depende de la naturaleza del terreno donde se cultiva

la vid.

Del grano de uva proceden diferentes compuestos fenlicos que son esenciales para la calidad del

vino, entre los que se encuentran las antocianinas en las uvas negras, las flavonas en la uva blanca

y los taninos que aportan al vino astringencia de acuerdo al grado de polimerizacin. Sin embargo,

ciertos tratamientos tecnolgicos pueden disminuir la riqueza nutritiva del mosto.

La clarificacin provoca una disminucin de la flora microbiana nativa, las sustancias nutritivas

adsorbidas sobre soportes coloidales, eliminadas por operaciones propias de la clarificacin, la

cual es ms intensa en los vinos blancos.

Los factores fisicoqumicos se deben evaluar en una fermentacin alcohlica entre los que se

encuentran la concentracin de azcares, grado de cidez y temperatura.

Las levaduras y bacterias presentes en el mosto o zumo de fruta son las encargadas del proceso de

fermentacin, por tanto es necesario evaluar el crecimiento microbiano a lo largo del proceso con

el fin de conocer la cintica microbiana. Las cepas utilizadas generalmente para la fermentacin

pertenecen esencialmente al gnero Saccharomyces, y la mayor parte a la especie Saccharomyces

cerevisae var elloipsoideus, caracterizadas por su capacidad de fermentar una cantidad importante

de azcar (200 g/litro) con finales de fermentacin en medios ricos en alcohol (10 a 13). Adems,

pueden estar presentes otras especies como Oenococcus Oeni.

De acuerdo al tipo de vino que se desea obtener, el jugo de uva puede pasar por varias

fermentaciones.

La fermentacin alcohlica: es una etapa esencial en toda vinificacin, se transforman los

azcares de la uva en alcohol, anhdrido carbnico y diferentes compuestos que

contribuirn al aroma del vino.

La fermentacin malolctica: no se busca sistemticamente, el fin es transformar el cido

mlico, un dicido en cido lctico, un monocido, permitiendo obtener vinos ms ligeros,

menos cidos.

La segunda fermentacin alcohlica, denominada toma de espuma, es necesaria para la

elaboracin de vinos espumosos. Se lleva a cabo a presin, bien en cuba, en botella, a

partir de vinos de base a los que se ha adicionado azcar de caa o de remolacha.

MATERIALES Y EQUIPOS

Zumo de frutas: uvas, mandarina, pia, fresa, maracuy

1 frasco boca ancha con tapa de capacidad de 5 litros

Tubo de fermentacin 1 Pipeta aforada de 10 ml

1 Termmetro 1 Probeta 250 ml 1 Embudo 2 vasos precipitados de 1 litro

1 Erlenmeyer 250 ml 1 vaso precipitado de 50 ml

2 licuadoras 1 Bureta

1 pinza para bureta Refractmetro Balanza pHmetro

Metabisulfito de sodio Solucin de Ca(OH)2 Soluciones buffer pH 4 y 7

Gasa-Algodn

Acetona NaOH 0.1N Fenolftaleina Bentonita

PROCEDIMIENTO

Adquirir 5 kg de uva negra madura de la fruta seleccionada. Se espera finalmente trabajar con 2

a 3 litros de mosto o zumo de fruta.

En caso de elaborar vino de uvas, separar los raspones o ramas, determinar el peso y registrarlo.

Retirar los granos de uva que se encuentren deteriorados, determinar el peso y registrarlo.

Lavar las uvas

Prensar cuidadosamente los racimos o frutos de uva por pequeas porciones en un trozo de tela

de franela, hacer presin fuerte con las manos y extraer la mayor cantidad posible de semillas.

Determinar el volumen del mosto recogido. Al extracto recogido en el recipiente de maceracin-

fermentacin, adicionar los hollejos y revolver fuertemente durante unos minutos, sin

desmenuzar las pieles.

En caso de elaborar el vino con frutas diferentes a la uva, obtener el zumo con la menor cantidad

de agua posible.

Tomar una muestra de mosto o zumo de fruta y determine el contenido de azcar y su acidez. En

este punto se debe operar con la mayor rapidez posible porque se puede iniciar la fermentacin

de manera instantnea.

Inocular en el mosto o zumo de fruta, 2 gramos/100 ml de la cepa Saccharomyces cerevisae,

previamente diluida en agua destilada y estril. Agitar y tapar el recipiente. El inicio de la

fermentacin se comprueba por el burbujeo de CO2 desprendido en la trampa de fermentacin.

Desde este momento se controla temperatura, grados Brix, acidez (expresada en gramos de cido

tartrico para el vino de uva), pH, crecimiento microbiano y tiempo.

Un control prctico de la fermentacin consiste en observar el borboteo del CO2 en el seno del

lquido. Cuando observe que disminuye ostensiblemente, destape el recipiente y con una cuchara

limpia sumerja el sombrero de orujos. Con este breve bazuqueo las levaduras vuelven a tomar

oxigeno y continan con su actividad fermentativa. Es importante no abusar del oxigeno teniendo

en cuenta que el proceso es anaerbico.

Al final del tercer da, realice el primer trasiego para separar el mosto-vino de las semillas y el

sombrero de orujos.

La fermentacin secundaria se inicia cuando el pH se estabiliza, por lo tanto se deben efectuar

controles diarios. El tiempo de esta fermentacin es de 3 semanas a temperatura ambiente.

GUIA INFORME

1. Realice los clculos correspondientes a la acidez (exprsela en gramos de cido tartrico

para el vino de uva, con las otras frutas definir el cido ms abundante), teniendo en

cuenta de anotar el volumen de NaOH 0.1 N (ml) y la alcuota tomada (ml).

2. Complete la siguiente tabla de datos y resultados

Parmetro/Da 1

2 3 4 5 28

Brix

pH

Acidez

UFC/ml

3. En el informe suministrar la siguiente informacin:

a. Volumen del mosto, nmero de trasiegos.

CUESTIONARIO

1. Cmo se clasifica el vino obtenido de acuerdo a su contenido de azcar, la intensidad y

tonalidad del color?

2. Elabore grficas de control de calidad as: Grados Brix Vs Tiempo, pH Vs Tiempo, Acidez Vs

Tiempo, UFC/ml Vs Tiempo.

3. Cules son las principales transformaciones que se producen naturalmente en el vino?

4. Cules son las enfermedades ms frecuentes de los vinos?

5. Evale el producto obtenido de acuerdo con sus caractersticas organolpticas.

BIBLIOGRAFIA

Casilimas Parra Fabiola., Prez Delgado Milton. 2009. Gua de Laboratorio Fermentaciones.

Universidad Incca de Colombia.

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